Anda di halaman 1dari 42

LAPORAN PRAKTIKUM ANALISIS SEDIAAN KOSMETIK

Kelompok A1: Rio Eka Putra Yulia Trisnawati Alvi Kusuma Wardhani Gilang Pramana Putra Revi Oktaviana Riang Pramulia Eka Ayu Murdyaningsih (062210101035) (072210101002) (072210101011) (072210101013) (072210101027) (072210101033) (072210101041)

Devi Tarius Agustina(072210101019)

LABORATORIUM KIMIA ANALISIS BAGIAN KIMIA FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS JEMBER 2010

VALIDASI METODE ANALISIS ASAM SALISILAT DALAM SAMPEL LOTION PEMBERSIH WAJAH SECARA KLT DENSITOMETRI 1. TUJUAN PRAKTIKUM Mahasiswa dapat mempraktekkan penilaian parameter spesifisitas/selektivitas, linieritas dan rentang, batas deteksi (Limit Of Detection) dan batas kuantitasi (Limit Of Quantitation), keseksamaan (precision), dan kecermatan (accuracy) dalam validasi metode analisis asam salisilat dalam sampel lotion pembersih wajah secara KLT Densitometri. 2. TINJAUAN PUSTAKA Tinjauan Tentang Asam Salisilat Asam salisilat merupakan senyawa kimia yang sering kita jumpai dalam berbagai produk kosmetik, salah satunya yaitu pembersih wajah dan produk anti acne. Dalam produk pembersih wajah maupun anti acne (anti jerawat) asam salisilat berperan sebagai anti fungi yang berfungsi dalam membunuh mikroba dan jamur dipermukaan kulit serta berfungsi sebagai keratolitikum yaitu dalam pengelupasan sel - sel kulit mati yang perlu dibersihkan dari kulit. Sifat Fisika Kimia Sinonim : 2-acetyloxybenzoic acid; acetylsalicylate; acetylsalicylic acid; Oacetylsalicylic acid Rumus Molekul : C7H6O3 Berat Molekul : 138,13 Pemerian : hablur putih, biasanya berbentuk jarum halus atau serbuk halus putih, rasa agak manis, tajam dan stabil di udara. Bentuk simetris warna putih dan tidak berbau. Jika dibuat dari metil salisilat alami dapat berwarna kekuningan atau merah jambu dan berbau lemah mirip mentol. Kelarutan : Sukar larut dalam air dan dalam benzena, mudah larut dalam ethanol dan dalam eter, larut dalam air mendidih, agak sukar larut dalam kloroform. Densitas : 1.40 g/cm Titik lebur : 135 C (275 F)

Titik didih : 140 C (284 F) (decomposes) Kelarutan dalam air : 3 mg/mL (20 C)

Struktur Asam Salisilat Penggunaan : asam salisilat memiliki efek bakteriostatik dan fungisida. Digunakan secara topikal sebagai 1-5% serbuk, lotion ,salep untuk pengobatan klonik ulcer, ketombe, eksim, pesoriasis, hiperotosis dan penyakit kulit karena parasit. Asam salisilat juga mempunyai efek keratolitik. Pemakaian luar menghasilkan deskripsi epitel cara lambat dan tanpa rasa sakit. Penggunaan asam salisilat dalm pelarut polar memiliki efek komedolitik sebagai anti acne. Metode analisis asam salisilat dengan cara titrasi: Larutkan 0,120 g dalam 30 mL alkohol R dan tambahkan 20 mL air R. Titrasi dengan 0,1 M sodium hiroksida menggunakan 0,1 mL larutan fenol red sebagai indikator. 1 mL 0,1 M sodium hidroksida ekuivalen dengan 13,81 mg asam salisilat Tinjauan Tentang Metode Analisis Analit Determinasi cepat terhadap asam salislilat pada tanaman menggunakan ChromatographyMass Spectrometry Pada analisis kali ini, dilakukan analisis asam salisilat (SA) dalam berbagai tanaman, yang memiliki pengaruh fisiologikal untuk pertahanan tanaman. Senyawa ini ditemukan dalam tembakau, mentimun, tomat dan beberapa tanaman. Meningkatnya asam salisilat ditemukan dalam daun tomat yang terifeksi virus (TMZ atau tomato mozaik viruses). Pada tanaman tembakau (Nicotiana tobaccum membawa gen N yang menghasilkan asam salisilat dan mengemisikan substansi lain yaitu metil salisilat (MeSA) setelah diinokulasi dengan TMV. Metode Analisis

1. Pembuatan standar asam salisilat Ditimbang standar GC larutan asam salisilat12,5 mg dilarutkan dalam 250 mL methanol.
2. Kondisi derivatisasi asam salisilat dengan BSTFA, dalam derivatisasi ini

digunakan asam mandelat sebagai internal standart.


3. Derivatisasi standar dan sampel daun (0,5 g daun segar) serta asam

mandelat, dari hasil inokulasi, dianalisis, dan tanaman tomat kontrol dibekukan dalam nitrogen cair.
4. Larutan asam mandelat (50 g/mL) ditambahkan ditiap tiap sampel lalu

diekstraksi dengan methanol-kloroform (9:1 v/v sebanyak 300 mL).


5. Hasil disentrifuse dengan kecepatan 15000 rpm selama 5 menit, supernatant

300 mL dipipet 1 mL dan dimasukkan dalam vial untuk diuapkan dibawah udara nitrogen pada 20oC selama 60 menit.
6. Hasil dibuat larutan kalibrasi pada GC (100 mL) asam salisilat pada rentang

konsentrasi 0,05 sampai 50 mg/L.


7. Dilakukan analisis GC-MS

Kondisi analisis Energi elektron Fase diam 25 mm Fase gerak Volume sampel Flow rate Temperatur Hasil Analisis Metode yang sensitive pada analisis asam salisilat dilakukan pada waktu berbeda. Metode yang sederhana untuk menganalisis asam salisilat dengan GCMS setelah diderivatisasi dengan BSTFA. Analisis ini untuk asam salisilat dalam tanaman, proses derivatisasi dilakukan pada kondisi optimum, dengan suhu 120oC selama 60 menit, sedangkan analisis total dilakukan selama kurang lebih 2 jam. : gas helium : 1 mL : 1mL/menit : 100C selama 2 menit lalu diprogram tiap 15 menit : 70 eV. : kolom kapiler HP-5Ms panjang 30mm; 0,25 mm;

Preparasi sampel juga sederhana. LOD yang sangat rendah untuk asam salisilat dan nilai RSD < 5,0 % juga berhasil. Metode ini sesuai untuk investigasi terhadap kecepatan respon dari pertahanan tanaman terhadap virus dan herbivora. Gas spektrofometri-mass spectrofotometri merupakan metode analisis yang sederhana, cepat dan termasuk teknik yang sensitive. Dalam analisis SA pada sel dan jaringan tanaman, khususnya tomat dan tembakau dilakukan secara GC-MS setelah sebelumnya diderivatisasi dengan diazometana. Agen sililasi digunakan untuk derivatisasi SA dengan HDMS (hexametildisilazan) dan pola fragmentasi derivate tersebut. Pengembangan Dan Validasi Langsung, Metode Kuantitatif NonDestruktif Untuk Asam Salisilat Dalam Preparasi Magistrally Krim Farmasi Menggunakan Spektroskopi FT-Raman Tujuan Untuk mengembangkan dan memvalidasi metode secara cepat untuk penentuan kuantitatif non-destruktif dari preparasi magistrally krim asam salisilat (20%, 30% dan 40% (w/ w)) menggunakan Spektroskopi FT-Raman. Metode Obat berisi 25 krim pertama kali ditentukan dengan spektroskopi FTRaman diikuti dengan analisis HPLC. Metode analisis Raman didasarkan pada model kalibrasi polinomial yang diperoleh dari serangkaian krim (standar) dengan konsentrasi asam salisilat diketahui. Tujuh standar disiapkan berkisar dari 15% menjadi 45% (w/w) dengan penambahan sebesar 5% (w/w). Standar yang digunakan tanpa persiapan sampel untuk pengembangan model kalibrasi FT-Raman. Tingkat kurva polinomial dievaluasi, tidak hanya untuk model fit, tapi juga untuk prediktif sifat. Ditemukan bahwa model tingkat kedua adalah yang terbaik. Akhirnya, standar yang sama yang digunakan setelah beberapa persiapan sampel untuk pengembangan model kalibrasi HPLC linier sederhana. Kedua model telah divalidasi menggunakan validasi silang leave-one-out. Hasil Hasil kuantifikasi yang diperoleh metode FT-Raman tidak secara signifikan berbeda dengan hasil KCKT, untuk sampel yang disiapkan dengan

ukuran partikel yang sama (90-180m) sebagai standar (p = 0,22> 0,05, = 0,05). Hasil kuantifikasi dari sampel disiapkan dengan ukuran partikel yang berbeda (<90m) dari standar secara signifikan berbeda dengan hasil HPLC (p = 0,01 <0,05, = 0,05). Kesimpulan Metode FT-Raman non-destruktif paling dapat diandalkan untuk penentuan kuantitatif asam salisilat dalam krim farmasi, dengan ketentuan bahwa sampel memiliki ukuran partikel yang sama dengan standar yang digunakan untuk pengembangan model kalibrasi. Tinjauan Tentang Validasi Metode Analisis Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Validasi metode analisis perlu dilakukan untuk mendapatkan suatu metode analisis yang dapat dipercaya dan hasil analisanya mendekati kebenaran/sahih. Validasi ulang perlu dilakukan meskipun validasi sebelumnya menghasilkan data yang reliable, karena metode yang dinyatakan valid pada kondisi tertentu belum tentu valid pada kondisi lain. Beberapa parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode analisis meliputi kecermatan (accuracy), keseksamaan (precision), selektivitas (spesifisitas), linieritas dan rentang, batas deteksi dan batas kuantitasi, ketangguhan metode (ruggedness), kekuatan (robustness) dan Tes SST (system suitability tests). Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil uraian, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan.

Cara penentuan. Selektivitas metode ditentukan dengan membandingkan hasil antara sampel yang mengandung cemaran hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, atau pembawa placebo dengan hasil analisis sampel tanpa penambahan bahan-bahan tadi. Penyimpangan hasil jika ada merupakan selisih dari hasil uji keduanya. Jika cemaran dan hasil urai tidak dapat diidentifikasi atau tidak dapat diperoleh, maka selektivitas dapat ditunjukkan dengan cara menganalisis sampel yang mengandung cemaran atau hasil uji urai dengan metode yang hendak diuji lalu dibandigkan dengan metode lain untuk pengujian kemurnian seperti kromatografi, analisis kelarutan fase, dan differential scanning calorimetry. Derajat kesesuaian kedua hasil analisis tersebut merupakan ukuran selektivitas. Pada metode analisis yang melibatkan kromatografi, selektivitas ditentukan melalui perhitungan daya resolusinya. Linieritas merupakan kemampuan suatu metode analisis yang dapat menunjukkan bahwa area analit dalam larutan sampel berada dalam rentang konsentrasi tertentu, dimana respon yang diberikan sebanding dan proporsional dengan konsentrasi analit. Linieritas dinyatakan sebagai variasi atau simpangan sekitar slope dari garis regresi yang dihitung berdasar hubungan matematis dari hasil analisis analit (respon) dengan konsentrasi bervariasi. Penentuan linieritas minimal menggunakan 5 macam konsentrasi antara 0.25-2.00 dari kadar analit yang diperkirakan. Uji linieritas suatu metode analisis dilakukan untuk membuktikan adanya hubungan antara konsentrasi analit terhadap respon detektor. Hubungan tersebut dianggap linier apabila harga koefisien korelasi (r) dari perhitungan 1 bergantung pada arah garis kurva hubungan konsentrasi analit terhadap respon detektor. Sedangkan nilai a menunjukkan kepekaan analisis terutama instrumen yang digunakan. Parameter lain yang harus dihitung adalah simpangan baku residual (Sy). Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. Batas deteksi merupakan parameter uji batas. Batas kuantitasi merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitasi

terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. Cara penentuan : Penentuan batas deteksi suatu metode berbeda-beda tergantung pada metode analisis itu menggunakan instrumen atau tidak. Pada analisis yang tidak menggunakan instrumen batas tersebut ditentukan dengan mendeteksi analit dalam sampel pada pengenceran bertingkat. Pada analisis instrumen batas deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon blangko beberapa kali lalu dihitung simpangan baku respon blangko dan formula di bawah ini dapat digunakan untuk perhitungan.

Q k Sb Sl

= LOD (batas deteksi) atau LOQ (batas kuantitasi) = 3 untuk batas deteksi atau 10 untuk batas kuantitasi = simpangan baku respon analitik dari blangko = arah garis linier (kepekaan arah) dari kurva antara respon terhadap konsentrasi = slope (b pada persamaan garis y = a + bx) Batas deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis

regresi linier dari kurva kalibrasi. Nilai pengukuran akan sama dengan nilai b pada persamaaan garis linier y = a + bx, sedangkan simpangan baku blangko sama dengan simpangan baku residual ( a. Batas deteksi (Q) ).

Karena k = 3 atau 10 simpangan baku (Sb) = Sy /x, maka

b.

Batas kuantitas (Q)

Cara lain untuk menentukan batas deteksi dan kuantitasi adalah melalui penentuan rasio S/N (signal to noise ratio). Nilai simpangan baku blangko ditentukan dengan cara menghitung tinggi derau pada pengukuran blangko sebanyak 20 kali pada titik analit memberikan respon. Simpangan baku blangko juga dihitung dari tinggi derau puncak ke puncak, jika diambil dari tinggi

puncak derau atas dan bawah (Np-p) maka s0 = Np-p/5 sedangkan kalau dari puncak derau bawah saja (puncak negatif) maka s0 = Np/2, selanjutnya perhitungan seperti tersebut di atas. Presisi dari suatu metode analisis adalah derajat kesesuaian diantara masing-masing hasil uji, jika prosedur analisis diterapkan berulangkali pada sejumlah cuplikan yang diambil dari satu sampel homogen. Presisi dinyatakan sebagai deviasi standar atau deviasi standar relatif (koefisien variasi). Presisi dapat diartikan pula sebagai derajat reprodusibilitas (reproducibility) atau keterulangan (repeatibility) dari prosedur analisis pada kondisi kerja normal. Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif atau koefisien variasi 2% atau kurang. Akan tetapi kriteria ini sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah sampel, dan kondisi laboratorium. Konsep presisi diukur dengan simpangan baku. Presisi dapat dibagi lagi menjadi 2 atau 3 kategori. Komisi Eropa membagi presisi ke dalam keterulangan (repeatibility) dan ketertiruan. a. Keterulangan Merupakan ketepatan (precision) pada kondisi percobaan yang sama (berulang) baik orangnya, peralatannya, tempatnya, maupun waktunya. Dua pilihan pengujian telah diizinkan penggunaannya oleh ICH untuk mengamati keterulangan, yaitu:
1) Suatu pengukuran sebanyak 9 kali (minimal) yang mencakup

kisaran yang digunakan dalam prosedur analisis (misalkan dengan 3 konsentrasi yang berbeda pada kisaran konsentrasi; dengan masingmasing dilakukan replikasi sebanyak 3 kali), atau; 2) Suatu pengukuran sebanyak 6 kali (minimal) pada konsentrasi 100 % dari konsentrasi uji. b. Presisi antara Merupakan ketepatan (precision) pada kondisi percobaan yang salah satunya berbeda, baik orangnya, peralatannya, tempatnya, maupun waktunya. Banyaknya presisi antara yang akan dilakukan tergantung pada keadaan yang mana suatu prosedur akan diperluas. Parameter-parameter yang

diamati untuk presisi antara ini meliputi: variasi antar hari, variasi analis, dan variasi peralatan. Tergantung pada banyaknya studi, penggunaan desain percobaan seringkali didorong untuk dilakukan. Desain percobaan (experimental design) akan meminimalkan banyaknya percobaan yang harus dilakukan. Perlu untuk dicatat bahwa ICH memperbolehkan untuk tidak melakukan presisi antara jika analis dapat membuktikan presisi dengan data reprodusibilitas. Diharapkan pada presisi antara ini, variabilitasnya berada pada kisaran yang sama atau lebih kecil terhadap variabilitas keterulangan. Pada presisi antara ini, ICH juga merekomendasikan pelaporan data simpangan baku (SD), simpangan baku relatif (RSD atau CV), dan interval kepercayaan data. c. Reprodusibilitas Merupakan ketepatan (precision) pada kondisi percobaan yang berbeda, baik orangnya, peralatannya, tempatnya, maupun waktunya. Reprodusibilitas mengukur presisi antar laboratorium sebagaimana dalam studi-studi kolaboratif atau studi uji banding antar laboratorium dan atau uji profisiensi. Parameter ini harus dipertimbangkan dalam standardisasi prosedur analisis (termasuk juga prosedur-prosedur dalam Farmakope dan transfer metode antar laboratorium yang berbeda). Untuk melakukan uji reprodusibilitas ini, studi-studi yang sama harus dilakukan di laboratorium lain dengan menggunakan lot sampel homogen yang sama dan desain percobaan yang sama. Dalam kasus transfer (pemindahan) metode antar 2 laboratorium, pendekatan-pendekatan yang berbeda dapat dilakukan untuk suksesnya transfer prosedur analisis. Meskipun demikian, pendekatan yang paling umum adalah dengan transfer metode secara langsung dari laboratorium asal ke laboratorium penerima. Laboratorium asal didefinisikan sebagai laboratorium yang mengembangkan dan memvalidasi prosedur analisis atau laboratorium yang telah disertifikasi lebih dahulu dalam prosedur analisis yang dimaksud dan akan berpartisipasi dalam studi transfer metode. Laboratorium penerima adalah laboratorium yang mana prosedur analisis dipindahkan ke laboratorium tersebut dan akan berpartisipasi dalam studi transfer metode.

Dalam transfer langsung ini, sangat disarankan untuk menulis protokol eksperimental secara detail serta kriteria keberterimaannya (misalnya perbedaan rata-rata antar 2 laboratorium yang masih dapat diterima). Dokumentasi Presisi Dokumentasi presisi seharusnya mencakup: simpangan baku, simpangan baku relative (RSD) atau koefisien variasi (CV), dan kisaran kepercayaan sebagaimana dipersyaratkan oleh ICH. Data untuk menguji presisi seringkali dikumpulkan sebagai bagian kajian-kajian lain yang berkaitan dengan presisi seperti linieritas atau akurasi. Biasanya replikasi 6-15 dilakukan pada sampel tunggal untuk tiap-tiap konsentrasi. Nilai RSD antara 1-2% biasanya dipersyaratkan untuk senyawasenyawa aktif dalam jumlah yang banyak; sedangkan untuk senyawa-senyawa dengan kadar sangat kecil, RSD berkisar antara 5-15%. Menghitung keseksamaan dapat dengan cara: 1. Hasil analisis x1,x2,x3,x4,....,xn maka simpangan bakunya; adalah :

2.

Simpangan baku relatif atau koefisien variasi (KV) adalah:

Kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Kecermatan hasil analis sangat tergantung kepada sebaran galat sistematik di dalam keseluruhan tahapan analisis. Oleh karena itu, untuk mencapai kecermatan yang tinggi hanya dapat dilakukan dengan cara mengurangi galat sistematik tersebut seperti menggunakan peralatan yang telah dikalibrasi, menggunakan pereaksi dan pelarut yang baik, pengontrolan suhu, dan pelaksanaannya yang cermat, taat asas sesuai prosedur. Cara penentuan :

Kecermatan ditentukan dengan dua cara, yaitu metode stimulasi (spikedplacebo recovery) atau metode penambahan baku (standard addition method). Dalam metode simulasi sejumlah analit bahan murni ditambahkan ke dalam campuran bahan pembawa sediaan farmasi (plasebo) lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar analit yang ditambahkan (kadar yang sebenarnya). Dalam metode penambahan baku, sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit yang diperiksa ditambahkan ke dalam sampel dicampur dan dianalisis lagi. Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya (hasil yang diharapkan). Dalam kedua metode tersebut, persen peroleh kembali dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya. Persen perolehan kembali dapat ditentukan denga cara membuat sampel plasebo (eksipien obat, cairan biologis) kemudian ditambah analit dengan konsentrasi tertentu (biasanya 80% sampai 120% dari kadar analit yang diperkirakan), kemudian dianalisis dengan metode yang akan divalidasi. Tetapi bila tidak memungkinkan membuat sampel plasebo karena matriknya tidak diketahui seperti obat-obatan paten, atau karena analitnya berupa suatu senyawa endogen misalnya, metabolit sekunder pada kultur kalus, maka dapat dipakai metode adisi. Metode adisi dapat dilakukan dengan menambahkan sejumlah analit dengan konsentrasi tertentu pada sampel yang diperiksa, lalu dianalisis dengan metode tersebut. Persen perolehan kembali ditentukan dengan menentukan berapa persen analit yang ditambahkan tadi dapat ditemukan. Kriteria kecermatan sangat tergantung kepada konsentrasi analit dalam matriks sampel dan pada keseksamaan metode (RSD). Vanderwielen, menyatakan bahwa selisih kadar pada berbagai penentuan (Xd) harus 5% atau kurang pada setiap konsentrasi analit pada mana prosedur dilakukan. Harga rata-rata selisih secara statistik harus 1,5% atau kurang. Kriteria tersebut dinyatakan secara matematik sebagai berikut : Xd = Xi Xo Xi : hasil analisis Xo : hasil yang sebenarnya I : nilai t pada table t student pada atas 95 % S : simpangan baku relatif dari semua pengujian

n : jumlah sampel yang dianalisis

C = kadar analit dalam sampel S = kadar analit yang ditambahkan pada sampel R1 = respon yang diberikan sampel R2 = respon yang diberikan campuran sampel dengan tambahan analit Perhitungan perolehan kembali dapat juga ditetapkan dengan rumus sebagai berikut :
% Perolehan kembali = ( C F C
A

) C *A

x 100

CF = konsentrasi total sample yang diperoleh dari pengukuran CA = konsentrasi sampel sebenarnya C* A = konsentrasi analit yang ditambahkan Pada metode penambahan baku, pengukuran blanko tidak diperlukan lagi. Metode ini tidak dapat digunakan jika penambahan analit dapat mengganggu pengukuran, misalnya analit yang ditambahkan menyebabkan kekurangan pereaksi, mengubah pH atau kapasitas dapar, dan lain-lain. Kriteria kecermatan dilakukan sama seperti pada metode simulasi. Pada percobaan penetapan kecermatan, sedikitnya lima sampel yang mengandung analit dan plasebo yang harus disiapkan dengan kadar antara 50% sampai 150% dari kandungan yang diharapkan. Persen perolehan kembali seharusnya tidak melebihi nilai presisi RSD. Dari persen rekoveri yang didapat diuji kesalahan sistematiknya dengan membuat kurva regresi linier konsentrasi teoritis (Xt) vs konsentrasi percobaan (Xp). Xp = ap + bp Xt uji rentang signifikan (Cr) dari ap dan bp Jika ap tidak > 0 maka kesalahan sistematis konstan Jika bp tidak > 1 kesalahan sistematis tergantung konsentrasi

3. KONDISI ANALISIS Pelarut Fase gerak/Eluen Fase Diam Panjang Gelombang 4. ALAT DAN BAHAN

: Alkohol 70% : Toluen : Asam Asetat (8:3) : Silica Gel F254 : 310 nm

Densitometer Camag TLC Scanner 3 Lempeng KLT Silica Gel F254 Labu ukur Pipet volume Ultrasonic Chamber KLT Sampel Face Toner Clean & Clear Alkohol 70% Standar Asam Salisilat Toluen Asam Asetat

5. METODE PELAKSANAAN a. Uji Spesifisitas/Selektivitas Preparasi standar. Larutan standar asam salisilat konsentrasi 1200 ppm dibuat dengan menimbang 12 mg asam salisilat kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL. Tambahkan dengan sedikit alkohol 70% sambil dilarutkan sampai tepat larut. Larutan kemudian distirer selama 10 menit. Setelah itu ditambah lagi dengan pelarut alkohol 70% sampai tepat tanda. Preparasi eluen dan penjenuhan bejana atau chamber. Penjenuhan bejana atau chamber diawali dengan memasukkan potongan kertas saring sesuai ukuran chamber kemudian dimasukkan ke dalam chamber. Setelah itu pembuatan eluen, eluen yang akan dibuat menggunakan campuran toluen

dan asam asetat (8:3). 4,5 mL asam asetat dipipet kemudian dimasukkan erlenmeyer tertutup setelah itu ditambahkan 12 mL toluene lalu campur sampai homogen. Masukkan eluen ke dalam chamber kemudian tutup chamber dan tunggu sampai chamber jenuh yang ditandai dengan terbasahinya seluruh kertas saring. Preparasi sampel. Sampel yang akan digunakan dipipet sebanyak 3 mL (replikasi 1 x) kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL. Tambahkan dengan pelarut alkohol 70% sampai tepat tanda kemudian kocok sampai homogen. Penotolan larutan standard dan larutan sampel. Lempeng yang akan digunakan adalah Silica Gel F254 dengan ukuran 4 x 10 cm disiapkan terlebih dulu. Lempeng ditandai lebih dulu dengan ketentuan batas atas dan bawah masing-masing 1 cm lalu jarak antara totolan juga 1 cm. Kemudian dengan hati-hati larutan standar asam salisilat dan larutan sampel ditotolkan sebanyak masing-masing 2 L menggunakan mikropipet. Elusi standard dan larutan sampel. Setelah larutan standar asam salisilat dan sampel ditotolkan pada lempeng kemudian dilakukan elusi. Setelah chamber jenuh masukkan lempeng yang sudah ditotoli tegak lurus ke dalam chamber dengan menggunakan pinset. Lalu tutup chamber dan biarkan sampai proses elusi selesai. Setelah elusi mencapai tanda batas pada lempeng, angkat lempeng dengan pinset kemudian keringkan dengan drier dalam lemari asam. Analisis kualitatif noda analit pada lempeng KLT. Setelah lempeng kering periksa nodanya di bawah sinar UV untuk melihat ada tidaknya noda totolan. Setelah itu masukkan lempeng ke dalam Densitometer Camag TLC Scanner 3. Kemudian dilakukan pengaturan kondisi analisis, posisi totolan awal, jarak antara totolan pada alat. Setelah itu dilakukan scanning lempeng pada panjang gelombang 200 400 nm. Kromatogram yang terbentuk diamati dan dibandingkan antara korelasi purity dan identity puncak standar dengan sampel. Selain itu, pada kromatogram sampel, dihitung resolusi puncak satu terhadap puncak yang lain.

b. Uji Linieritas dan Rentang Preparasi standar asam salisilat. Dilakukan pembuatan larutan standar asam salisilat dalam alkohol 70%, baku induk I 2400 ppm, dan baku induk II 2000 ppm, baku induk I diencerkan menjadi 240 pm, 720 ppm, 960 ppm, dan 1200 ppm, dan diambil juga 2000 ppm, sedangkan baku induk II diencerkan 400 ppm, 600 ppm, dan 1600 ppm. Selanjutnya dilakukan preparasi eluen dan penjenuhan bejana atau chamber. Eluen dibuat dari memipet 4,5 mL asam asetat, toluene 12 mL. keduanya dicampur pada labu Erlenmeyer. Eluen ini perbandingannya 8: 3. Selanjutnya eluen dimasukkan dalam chamber dan menggunakan kertas saring yang diletakkan tegak lurus. Eluen akan naik ke atas kertas melalui gaya kapilaritas. Kertas saring ini sebagai indikasi bahwa chamber telah jenuh dan siap untuk eluasi lempeng. Penotolan larutan standar 8 standar kerja hasil pengenceran standar induk ditotolkan pada lempeng 10 x 20 cm. Penotolan tiap-tiap standar sebanyak 2 L menggunakan mikropipet. Selanjutnya dilakukan eluasi larutan standar. Chamber yang sudah jenuh dimasukkan Lempeng KLT yang telah berisi totolan standar asam salisilat berbagai konsentrasi. Selanjutnya dieluasi 45 menit sampai eluen tepat pada garis atas batas lempeng KLT. Langkah terakhir adalah analisis kualitatif noda analit. Dilakukan analisis dengan melihat spektra serta linieritasnya menggunakan densitometri. Pada proses ini, pastikan dilihat jarak antar totolan (nilai Rf). Kemudian dilakukan scanning lempeng pada panjang gelombang 310 nm. Panjang gelombang ini dipilih karena memberikan absorbansi maksimum pada tiap noda. Kemudian dilihat spektra dan dianalisis linieritas dari standar yang telah dibuat pada berbagai konsentrasi (dilakukan program validasi). c. Uji Sensitivitas (Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi) Pada praktikum kali ini akan dilakukan validasi metode analisis dengan parameter batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ). Untuk

memvalidasi asam salisilat langkah pertama yang dilakukan adalah preparasi standar asam salisilat. Penimbangan ini dilakukan untuk membuat larutan standar induk I dan larutan standar induk II. Untuk penimbangan larutan standar induk I, asam salisilat yang ditimbang sebanyak 25 mg dan dilarutkan dalam 25 mL alkohol 70%, didapatkan konsentrasi 1000 ppm. Sedangkan untuk larutan standar induk II, asam salisilat yang ditimbang sebanyak 60 mg dan dilarutkan dalam alkohol 70%, didapatkan konsentrasi 2400 ppm. Kedua larutan tersebut distirer terlebih dahulu agar asam salisilat dapat larut sempurna dalam alkohol 70%. Kemudian larutan standar induk tersebut dilakukan pengenceran untuk mendapatkan konsentrasi yang diinginkan, yaitu 24 ppm, 40 ppm, 80 ppm, 96 ppm, 120 ppm, 144 ppm, 160 ppm, 200 ppm, dan 240 ppm. Untuk larutan standar induk I, dilakukan dua kali pengenceran yaitu dengan memipet 1 mL yang dilarutkan dalam 10 mL alkohol 70%, didapatkan konsentrasi 200 ppm dan memipet 4 mL yang dilarutkan dalam 10 mL alkohol 70%, didapatkan konsentrasi 400 ppm. Larutan dengan konsentrasi 400 ppm dilakukan empat kali pemipetan, yaitu dipipet 1 mL untuk mendapatkan konsentrasi 40 ppm, 2 mL untuk 80 ppm, 3 mL untuk 120 ppm, 4 mL untuk 160 ppm, dan untuk konsentrasi 200 ppm dipipet dari larutan standar induk I sebanyak 2 mL. Masing-masing larutan yang telah dipipet dilarutkan dalam 10 mL alkohol 70%. Selanjutnya dilakukan pengenceran pada larutan standar induk II, yaitu dengan mengambil 1 mL dilarutkan dalam 10 mL alkohol 70% didapat konsentrasi 240 ppm, dan mengambil 2 mL dilarutkan dalam 10 mL alkohol 70% didapat konsentrasi 480 ppm. Dari larutan 240 ppm, dipipet 1 mL untuk mendapatkan konsentasi 24 ppm, dipipet 4 mL untuk 96 ppm, dan yang terakhir dipipet dari larutan 480 ppm sebanyak 3 mL untuk konsentrasi 144 ppm. Langkah kedua yaitu preparasi eluen dan penjenuhan chamber. Pertama-tama memotong kertas saring sesuai ukuran chamber, lalu kertas saring direkatkan pada sisi dalam chamber dengan selotip. Selanjutnya membuat eluen yang terdiri dari 4,5 mL asam asetat dan 12 mL toluene

yang dimasukkan dalam Erlenmeyer. Setelah tercampur, lalu tuang eluen ke dalam chamber dan tutup rapat chamber. Kertas saring yang telah terbasahi semua menandakan bahwa chamber telah jenuh. Langkah ketiga yaitu penotolan larutan standar. Totolkan larutan standar yang telah dibuat sebelumnya pada lempeng KLT Silica Gel F254. Larutan standar yang ditotolkan pada lempeng sebanyak 2 L menggunakan mikropipet. Langkah keempat yaitu eluasi larutan standar. Lempeng KLT yang telah diberi totolan masing-masing standar dimasukkan ke dalam chamber yang telah jenuh. Eluasi dilakukan sampai eluen mencapai tanda batas lempeng KLT. Lalu angkat lempeng KLT dan keringkan dengan alat pengering. Langkah terakhir yaitu menganalisis noda analit pada lempeng KLT. Lempeng KLT yang telah kering dimasukkan ke dalam Densitometer Camag TLC Scanner 3 dengan kondisi analisis yang sudah di atur posisi totolan awal dan jarak antar totolan pada alat. Lalu scanning lempeng KLT pada panjang gelombang 310 nm, selanjutnya dihitung parameter batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) dari data hasil scanning yang didapat menggunakan program validasi.
d. Uji Keseksamaan (precision)

Pada uji keseksamaan dibuat larutan standart asam salisilat dengan konsentrasi 800 ppm, 1200 ppm, 1400 ppm, 1600 ppm dan 2000 ppm. Standart dibuat dengan cara membuat 2 buah larutan baku induk 1600 ppm dan 2000 ppm. Untuk larutan baku induk 1600 ppm di buat dengan melarutkan 40 mg asam salisilat dengan alkohol 70% pada labu ukur 25 mL, sedangkan untuk larutan standart induk 2000 ppm dibuat dengan melarutkan 50 mg asam salisilat dengan alkohol 70% pada labu ukur 25 mL ad tanda. Larutan standart induk 2000 ppm kemudian diencerkan untuk mendapatkan konsentrasi 800 ppm, 1200 ppm dan 1400 ppm. Untuk konsentrasi 800 ppm larutan standart induk 2000 ppm dipipet 4 mL kemudian dencerkan dengan alkohol 70% pada labu 10 mL ad tanda. Untuk

konsentrasi 1200 ppm dibuat dengan mengencerkan 6 mL larutan standart induk 2000 ppm dengan alkohol 70% dalam labu 10 mL. Dan untuk konsentrasi 1400 ppm dibuat dengan memipet 7 mL larutan standart induk dan tambah alkohol 70% ad tanda pada labu ukur 10 mL. Cara eluasi dan penjenuhan chamber sama dengan uji selektivitas. Preparasi sampel dilakukan dengan memipet 2,0 mL sampel yang direplikasi sebanyak 6 kali dan dimasukkan pada labu ukur 10 mL. Labu tersebut kemudian ditambahkan alkohol 70% sampai tepat tanda dan di kocok sampai homogen. Sampel dan standart yang telah tersedia selanjutnya ditotolkan pada pada lempeng KLT Silica Gel F254 (ukuran 13 x 10 cm) masing masing sebanyak 2 L dengan menggunakan mikropipet. Setelah penotolan, lempeng di eluasi pada chamber seperti pada uji selektivitas. Setelah lempeng tereluasi secara sempurna lempeng diambil dan dikeringkan pada lemari asam. Noda yang ada pada lempeng di analisis dengan memasukkan lempeng KLT pada alat Densitometer Camag TLC Scanner 3 dengan kondisi analisis telah diatur posisi totolan awal dan jarak antar totolan pada alat. Lempeng di Scanning pada panjang gelombang 310 nm. Hasil yang diperoleh dihitung parameter presisi dari data hasil scanning dengan program validasi.
e. Uji Kecermatan (accuracy)

Hal pertama yang dilakukan dalam praktikum kali ini adalah pembuatan sampel adisi sediaan clean and clear yang dibuat dengan metode penambahan adisi sebanyak 30%, 45%, dan 60% yang dilakukan sebanyak 2 kali replikasi. Setelah dilakukan pembuatan sampel adisi kemudian dilakukan preparasi sampel dengan cara masing masing sampel yang telah di adisi dipipet 2 mL dan dilakukan replikasi sebanyak 2 kali kemudian

dimasukkan labu ukur 10 mL, dan ditambahkan alkohol 70% ad tepat tanda dan dikocok hingga homogen. Kemudian dilakukan preparasi standart yaitu dengan cara

menimbang sejumlah standart asam salisilat yaitu 40,1 mg (standart 1) dan 50,1 mg (standart 2). Kemudian standart 1 dilarutkan pada labu 25 mL untuk mendapatkan konsentrasi 1604 ppm dan dilakukan ultrasonic agar standart asam salisilat dapat larut sempurna. Sedangkan pada standart 2 diencerkan juga pada labu ukur 25 mL sehingga didapat konsentrasi 2004 ppm dan dilakukan ultrasonic agar standart asam salisilat dapat larut sempurna. Dari konsentrasi 2004 ppm tersebut dipipet 4 mL, 6 mL dan 7 mL yang kemudian ketiga hasil pipet tersebut dimasukkan dalam labu ukur 10 mL sehingga didapatkan konsentrasi berturut turut yaitu 801.6 ppm, 1202.4 ppm, dan 1402.8 ppm. Setelah dilakukan preparasi sampel dan standart dilakukan penjenuhan chamber yang diisi dengan eluen campuran dari toluene 12 mL dan asam asetat 4.5 mL. Tunggu sekitar 20 menit kemudian lempeng KLT

yang telah ditotoli larutan standart dan sampel masing masing sebanyak 2 uL dengan mikropipet dimasukkan dalam chamber yang telah jenuh. Tunggu sekitar 40 menit kemudian setelah lempeng telah terbasahi seluruhnya ambil lempeng dan keringkan dalam lemari asam dengan cara diangin anginkan. Setelah itu dilakukan pengamatan dengan menggunakan sinar UV dan analisis kualitatif noda analit pada KLT dengan menggunakan densitometer camag TLC Scanner 3 dengan kondisi analisis yang telah di atur posisi totolan awal dan jarak antar totolan pada alat, kemudian scanning pada panjang gelombang 310 nm. Lalu dihitung parameter akurasi dengan menggunakan software program validai dari data hasil scanning.

6. HASIL DAN PEMBAHASAN a. Uji Spesifisitas/Selektivitas Hasil Pengamatan Larutan standar asam salisilat 1200 ppm

Ditotolkan 2 L maka jumlah konsentrasi asam salisilat : 1207 ppm = 1207 ng/L x 2 L = 2414 ng

Pembahasan Pada praktikum ini dilakukan uji spesifisitas dan selektivitas asam salisilat dalam sampel face toner Clean & Clear. Dalam uji spesifisitas dan selektivitas ini dilakukan bersamaan dengan uji presisi. Oleh karena itu, data yang didapatkan data gabungan dengan uji presisi. Dalam uji ini digunakan lima larutan standar asam salisilat dengan konsentrasi 1610 ng, 2414 ng, 2817 ng, 3208 ng, 4024 ng. Atau jika dalam satuan ppm : 805 ppm, 1207 ppm, 1408,5 ppm, 2012 ppm. Sedangkan sampel yang digunakan dibuat enam kali totolan dengan satu macam konsentrasi. Urutan penotolan yaitu lima larutan standar terlebih dahulu dari yang terkecil ke yang terbesar setelah itu diikuti penotolan sampel sebanyak enam kali totolan. Data hasilnya bisa dilihat di gambar 7.1 di bawah ini

Gambar 7.1

Spesifisitas suatu metode adalah kemampuan metode tersebut untuk mengukur suatu zat tertentu tanpa adanya pengaruh dari komponen lain. Kespesifikan suatu metode analisis terhadap analit ditentukan berdasarkan pengamatan identitas (identity) dan kemurnian (purity) analit dalam sampel. Pada hasil uji identitas dan kemurnian praktikum ini didapatkan hasil yang gagal (gambar 7.2 ). Namun hal ini bukan berarti senyawa yang ada di

dalam sampel bukan murni senyawa asam salisilat, bila dilihat dari nilai Rf sampel dan standar, memiliki nilai Rf yang sama atau hampir sama yaitu 0,42; 0,41; 0,41; 0,40; 0,40; 0,40dst (gambar 7.1 atau gambar 7.2 ).

Gambar 7.2

Selain itu, jika diamati dari bentuk spektranya (gambar 7.3) bisa dinyatakan bahwa spectra sampel memiliki bentuk yang sama dengan spectra standar hanya saja untuk menghasilkan data kemurnian dan identitas tinggi spectra sampel seharusnya berhimpit dengan spectra standar. Oleh karena itu, dalam data ini terjadi kegagalan dalam hal kemurnian (purity). Pergeseran spectra yang terjadi sehingga menimbulkan ketidakcocokan antara spectra sampel dengan spectra standar ini kemungkinan disebabkan pemisahan oleh eluen yang tidak sempurna serta posisi elusi yang miring (antara sisi kanan dan kiri lempeng saat elusi tidak sama).

Gambar 7.3

Selektivitas suatu metode adalah kemampuan metode tersebut untuk mengukur analit yang terdapat dalam sampel dengan adanya komponenkomponen lain yang ada dalam matriks. Selektivitas suatu metode terhadap analit yang ditentukan dalam sampel ditentukan melalui perhitungan daya resolusinya (Rs). Rumus untuk menentukan nilai Rs dengan analisis menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis yaitu:

Keterangan: d1 d2 w1 w2 : panjang jarak yang ditempuh noda 1 (Rf1) : panjang jarak yang ditempuh noda 2 (Rf2) : lebar noda 1 (area) : lebar noda 2 (area) Nilai resolusi tidak dapat dihitung karena data yang dihasilkan jelek. Namun profil kromatogram antara pengotor dengan asam salisilat dalam sampel bisa dilihat pada gambar 7.4. Dalam gambar tersebut terdapat dua buah peak, peak pertama merupakan pengotor dan peak kedua merupakan senyawa asam salisilat karena terletak pada Rf 0,4. Jika diamati pada gambar 7.4 terlihat jelas bahwa tidak ada pemisahan yang baik antara peak pengotor dengan peak asam salisilat sehingga bisa diperkirakan resolusinya

jelek. Peak senyawa asam salisilat bisa dilihat lebih jelas pada gambar 7.5 dan nilai Rf serta areanya bisa dilihat pada gambar 7.6. Sedangkan pengotornya bisa dilihat lebih jelas pada gambar 7.7 dan nilai Rf dan areanya bisa dilihat di gambar 7.8.

Gambar 7.4 profil kromatogram sampel (totolan ke-6 pada lempeng)

Gambar 7.5 profil kromatogram asam salisilat

Gambar 7.6 data asam salisilat dalam sampel (totolan ke-6)

Gambar 7.7 profil kromatogram pengotor dalam sampel (totolan ke-6)

Gambar 7.8 data pengotor dalam sampel (totolan ke-6)

Kesalahan-kesalahan yang bisa terjadi dan akhirnya mempengaruhi hasil praktikum yang dilakukan berasal dari praktikan dan peralatan serta bahan yang diperlukan. Dari segi praktikan misalnya kesalahan dalam membaca meniscus alat sehingga bisa mempengaruhi jumlah konsentrasi bahan-bahan yang dipreparasi, dalam memasukkan lempeng yang sudah ditotoli tidak tegak lurus atau bersamaan sehingga hasil elusi bisa miring. Dari segi peralatan dan bahan bisa berasal dari eluen yang sudah lama atau terkontaminasi dengan senyawa lain sehingga tidak bisa memisahkan sampel dengan baik, lempeng KLT yang digunakan sudah lama sehingga sifat-sifat bahan lempeng sudah mengalami perubahan, peralatan yang digunakan kurang bersih. b. Uji Linieritas dan Rentang

Hasil Pengamatan Perhitungan standar asam salisilat Pembuatan baku induk 2400 ppm
1.

60 mg/ 25 mL = 2400 ppm

Pengenceran 240 ppm Pengenceran 720 ppm Pengenceran 960 ppm Pengenceran 1200 ppm Standar 2000 ppm
2.

50,1 mg/ 25 mL = 200,4ppm

Pengenceran 400,8 ppm Pengenceran 601,2 ppm Pengenceran 1603,2 ppm

Penotolan standar Standar 1 2 3 4 5 6 7 8 Pembahasan Dalam praktikum kali ini, dilakukan validasi metode asam salisilat dalam sampel kosmetik (clean & clear). Tujuan validasi adalah sebagai tindakan pembuktian bahwa metode yang digunakan benar-benar valid sebagai analisis kandungan suatu zat dalam sampel. Analisis dilakukan menggunakan KLT Densitometri. KLT Densitometri merupakan suatu Konsentrasi (ppm) 240 400,8 601,2 720 960 1200 1603,2 2000 Penotolan (uL) 2 2 2 2 2 2 2 2 Konsentrasi (ng) 480 801,6 1202,4 1440 1920 2400 3206,4 4000

teknik analisis. Hal ini dilihat dari beberapa parameter validasi antara lain liniaritas & rentang, limit of detection (LOD) dan limit of quantitation (LOQ), presisi & seletivitas/sensitivitas, akurasi. Penentuan validasi metode untuk analisis asama salisilat pertama kali dilakukan validasi linieritas dan rentang. Linieritas merupakan kemampuan suatu metode analisis yang dapat menunjukkan bahwa area analit dalam larutan sampel berada dalam rentang konsentrasi tertentu, dimana respon yang diberikan sebanding dan proporsional dengan konsentrasi analit. Pada penetuan linieritas minimal menggunakan 5 konsentrasi antara 0,25- 2,00 dari kadar asam salisilat yang diperkirakan. Sehingga, dilakukan preparasi standar menggunakan 2 standar induk untuk membuat 8 standar baku kerja dengan konsentrasi berbedabeda. Standar induk yang dibuat yaitu pada induk I sebesar 2400 ppm dengan menimbang 60 mg asam salisilat yang dilarutkan dalam 25 mL, pelarut yang digunakan adalah alkohol 70%, pada standar induk II 2000 ppm dtimbang 50 mg asam salisilat yang dilarutkan kedalam 25 mL alkohol 70 %. Standar induk I diencerkan dengan memipet 1 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, yang masing masing 240 ppm, 720 ppm, 960 ppm, 1200 ppm, dan 2400 ppm. Untuk standar induk 2 diambil 1mL, 2mL, dan 8 mL yang masing masing diencerkan dalam 10 mL labu ukur untuk mendapatkan konsentrasi 400, 600, dan 1200 ppm. Kemudian masing masing konsentrasi ditotolkan pada empeng KLT 10 x 20 cm ; 2 L yaitu 480; 801,6; 1202,4; 1440; 1920; 2400; 3206,4; 4000 ng dieluasi dengan toluene : asam asetat (8:3). Lama eluasi kurang lebih 35 menit. Pemilihan kondisi analisis didasarkan pada absorbansi maksimum asam salisilat, memberikan hasil analisis yang maksimal. Uji linieritas pada analisis asam salisilat menunjukkan hubungan antara konsentrasi analit dan respon detektor. Hubungan tersebut dianggap linier jika harga koefisien korelasi (r). Nilai r yaitu 0< r <1. Selain nilar r, dihitung juga simpangan baku residual (Sy). Hasil penentuan linieritas, standar salisilat yang telah dibuat tidak menunjukkan hubungan konsntrasi dan area yang linier karena pada saat

analisis menggunakan KLT Densitometri, lempeng KLT tidak terbaca oleh alat. Hal ini dapat dilihat dari spektra asam salisilat tiap track, sehingga didapat hipotesa bahwa metode validasi yang dilakukan tidak linier untuk asam salisilat. Kesalahan yang terjadi pada validasi metode dikarenakan berbagai faktor, antara lain: 1. Preparasi standar yang kurang baik, meliputi penimbangan dan pengenceran standar; 2. Penotolan lempeng yang kurang tepat, ini terlihat pada jarak penotolan tiap tiap noda yang tidak tepat; 3. Eluasi yang tidak tepat, yaitu pada saat eluasi tidak sejajar. Ada bagian yang miring yang ini mempengaruhi nilai X dan Y pada densitometri. c. Uji Sensitivitas (Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi) Hasil Pengamatan Preparasi Standar Asam Salisilat Penimbangan Larutan Standar Induk I = 25.1 mg/25 mL 1000 = 1004 ppm Penimbangan Larutan Standar Induk II= 60,7 mg/25 mL 1000= 2428 ppm Konsentrasi Larutan Standar Asam Salisilat setelah ditotolkan Konsentrasi larutan standar induk I 25.1 mg/25 mL 1000 = 1004 ppm
2 mL/10 mL 1004 = 200,8 ppm 4 mL/10 mL 1004 = 401,6 ppm

Pengenceran larutan standar induk I 1 mL/10 mL 401,6 ppm = 40,16 ppm = 40,16 ng/l 2L = 80,32 ng 2 mL/10 mL 401,6 ppm = 80,32 ppm = 80,32 ng/l 2L = 160,64 ng 3 mL/10 mL 401,6 ppm = 120.48 ppm = 120,48 ng/l 2L = 240,96 ng 4 mL/10 mL 401,6 ppm = 160.64 ppm = 160,64 ng/l 2L = 321,28 ng 2 mL/10 mL 1004 ppm = 200.8 ppm = 200,8 ng/l 2L = 401,6 ng Konsentrasi larutan standar induk II

60,7 mg/25 mL 1000 = 2428 ppm


1 mL/10 mL 2428 = 242,8 ppm 2 mL/10 mL 2428 = 485,6 ppm

Pengenceran larutan standar induk II 1 mL/10 mL 242,8 ppm = 24,28 ppm = 24,28 ng/l 2L = 48,56 ng 4 mL/10 mL 242,8 ppm = 97,12 ppm = 97,12 ng/l 2L = 194,24 ng 3 ml/10 ml 485,6 ppm = 145,68 ppm = 145,68 ng/l 2l = 291,36 ng 10 ml/10 ml 242,8 ppm = 242,8 ppm = 242,8 ng/l 2l = 485,6 ng Pembahasan Pada praktikum kali ini membahas tentang penentuan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) sampel Clean & Clear. Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. Batas deteksi merupakan parameter uji batas. Batas kuantitasi merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. Metode analisis yang kami lakukan adalah dengan KLTDensitometri. KLT merupakan suatu metode pemisahan komponenkomponen atas dasar perbedaan absorbsi atau partisi oleh fase diam dibawah gerakan pelarut pengembang. Sedangkan Densitometri merupakan metode analisis instrumental yang mendasarkan pada interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan bercak pada KLT. Densitometri lebih dititikberatkan untuk analisis kuantitatif analit-analit dengan kadar kecil, yang mana diperlukan pemisahan terlebih dahulu dengan KLT. Pada praktikum kali ini juga dilakukan perhitungan nilai LOD dan LOQ dengan program validasi. Validasi adalah kerja yang dicatat dalam dokumen, untuk membuktikan bahwa prosedur analisis yang diuji dapat memenuhi fungsi sesuai dengan tujuannya dengan konsisten dan memberikan hasil seperti yang diharapkan. Tujuan validasi adalah agar

metode analisis yang dipakai diketahui kespesifikan, keakuratan, kelinieran, kepresisian, kepekaannya. Secara statistik batas deteksi dan batas kuantitasi dapat dihitung melalui garis linier dari kurva kalibrasi. Kurva diperoleh dari hasil scanning KLT Densitometri pada 9 larutan standar dengan konsentrasi 48.56 ng, 80.32 ng, 160.64 ng, 194.24 ng, 240.96 ng, 291.36 ng, 321.28 ng, 401.6 ng, 485.6 ng yang dieluasi dengan fase gerak (Toluen : Asam asetat = 8 : 3 yaitu 4,5 mL asam asetat dan 10 mL toluena) dan selanjutnya diukur dengan KLT densitometri pada panjang gelombang 310 nm. Namun pada praktikum kali ini tidak didapatkan nilai LOD dan LOQ. Hal ini karena hasil scanning yang didapat menghasilkan spectra yang bertumpuk sehingga tidak dapat diketahui nilai area larutan standar. Seharusnya nilai LOD & LOQ dapat diketahui jika spectra yang didapat tidak bertumpuk. Adanya ketidaksesuaian tersebut dapat disebabkan karena beberapa faktor teknis ketika melakukan percobaan seperti kesalahan dalam penimbangan bahan, pengenceran, pemipetan dan ketika analisis atau karena faktor ketelitian perhitungan. Kesalahan yang terjadi dalam praktikum yang didapat tidak sesuai dengan yang dipersyaratkan antara lain disebabkan karena : a. Preparasi sampel kurang sempurna Pada saat preparasi sampel, sampel tidak dapat larut dengan sempurna. Hal ini disebabkan karena didalam sampel terdapat bahan-bahan tambahan lain yang mungkin tidak larut dalam alkohol 70%. Akibat sampel tidak dapat larut dengan sempurna, maka akan mempengaruhi hasil analisis. b. Chamber yang digunakan tidak jenuh Eluasi yang menggunakan chamber yang tidak jenuh menyebabkan noda yang didapat akan tailing. Hal ini akan mempengaruhi hasil analisis densitometer. Adanya tailing pada noda menyebabkan bahanbahan lain yang mempunyai nilai Rf hampir sama dengan bahan yang akan dianalisis akan ikut terukur pula kadarnya, sehingga dapat menyebabkan bertambahnya kadar bahan yang dianalisis.

c.

Eluen yang digunakan tidak tepat perbandingannya (toluene dan asam asetat glacial tidak tepat 8:3)

d. Uji Keseksamaan (precision)

Hasil Pengamatan Preparasi standar asam salisilat Penimbangan larutan standar induk I= 50,3 mg / 25 mL Penimbangan larutan standar induk II= 40,1 mg / 25 mL Konsentrasi larutan standar asam salisilat setelah ditotolkan Konsentrasi larutan standar induk I: x 1000 = 2012 ppm Pengenceran larutan standar induk 1 x 2012 ppm x 2012 ppm x 2012 ppm 2012 ppm Konsentrasi larutan standar induk 2 x 1000 = 1604 ppm Pengenceran larutan standar induk 2 1604 ppm 1604 x 2 = 3208 ng 804,8 x 2 = 1609 ng 1207,2 x 2 = 2414,4 ng 1408,4 x 2 = 2816,8 ng 2012 x 2 = 4024 ng standar induk 1A

Penimbangan sampel dan konsentrasi sampel teoritis; Identifikasi sampel Sampel replikasi 1 Sampel replikasi 2 Sampel replikasi 3 Sampel replikasi 4 Sampel replikasi 5 Sampel replikasi 6 Penimbangan (mg) 2 ml = 10 mg 2 ml = 10 mg 2 ml = 10 mg 2 ml = 10 mg 2 ml = 10 mg 2 ml = 10 mg Konsentrasi teoritis (ppm) 1000 ppm = 2000 ng 1000ppm= 2000 ng 1000ppm= 2000 ng 1000ppm= 2000 ng 1000 ppm= 2000 ng 1000 ppm= 2000 ng

Perhitungan konsentrasi sampel dari hasil percobaan

Y = 4105 + 1027x Identifikasi sampel Sampel replikasi 1 Sampel replikasi 2 Sampel replikasi 3 Sampel replikasi 4 Sampel replikasi 5 Sampel replikasi 6

r = 0,86624 Konsentrasi hasil percobaan (ng) 1996 3,6 ??? 98 393 1234 Kadar % b/v 0,499% 0,0009% ???% 0,0245% 0,09825% 0,3085%

Perhitungan nilai parameter presisi dengan program validasi Konsentrasi teoritis (ng) 2000 2000 2000 2000 2000 2000 Hasil perhitungan a. Preparasi Standar Asam Salisilat Penimbangan Larutan Standar Induk 1 Penimbangan Larutan Standar Induk 2 b. Konsentrasi Larutan Standar Induk I Konsentrasi larutan standar induk I: x 1000 = 2012 ppm Pengenceran larutan standar induk 1 x 2012 ppm x 2012 ppm x 2012 ppm 2012 ppm 804,8 x 2 = 1609 ng 1207,2 x 2 = 2414,4 ng 1408,4 x 2 = 2816,8 ng 2012 x 2 = 4024 ng standar induk 1A = = = 2012 ppm = 1604 ppm Konsentrasi hasil percobaan (ng)
1996 3,6 ??? 98 393 1234

% Rekoveri 99,8 % 0,18 % ??? %


4,9 %

Kadar % b/v
0,499% 0,0009% ???% 0,0245% 0,09825% 0,3085%

19,65 % 61,7 %

Konsentrasi larutan standar induk 2 x 1000 = 1604 ppm

Pengenceran larutan standar induk 2 1604 ppm 1604 x 2 = 3208 ng

Persamaan Regresi Konsentrasi vs Area Sampel Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5 Replikasi 6 Y = 4105 + 1027x S1 S2 S3 = 6154,82 = 4105 + 1027x X = 1,9959 g = 1996 ng = 4108,74 = 4105 + 1027x X = 0.0036 g = 3,6 ng = 4021,92 = 4105 + 1027x X = -0,0808 g = ??? ng Sampel Konsentrasi teoritis = 0.5 % x 2 = 0.5 g/100 mL x 2 mL = 0.01 g = 10 mg = 10 mg/10 mL = 1000 ppm = 1000 ppm x 2 = 2000 ng S1 = 1996 ng/2000 ng x 100% = 99,8% S2 = 3,6 ng/2000 ng x 100% = 0,18 % S3 = ??? ng / 2000 ng x 100 % = ??? % S4 = 98 ng/2000 ng x 100% = 4,9% S5 = 393 ng/2000 ng x 100% = 19,65% S6 S5 Area (Y) 6154,82 4108,74 4021,92 4205,94 4508,39 5372,14 r = 0,86624 S4 = 4205,944 = 4105 + 1027x X = 0.0982 g = 98 ng = 4508,39 = 4105 + 1027x X = 0,3927 g = 393 ng = 5372,14 = 4105 + 1027x X = 1,2338 g = 1234 ng

S6 = 1234 ng/2000 ng x 100% = 61,7 % Pembahasan Pada praktikum ini, dilakukan uji selektifitas dan presisi secara bersamaan, sebab nilai selektivitas dapat diambil dari data perolehan uji presisi. Pembuatan larutan standartnya dilakukan dengan membuat standar asam salisilat dengan kosentrasi 800 ppm, 1200 ppm, 1600 ppm, dan 2000 ppm. Sedangkan kosentrasi sampel yang dibuat adalah 2000 ppm. Dalam percobaan dibuat 2 larutan induk 1600 ppm dan 2000 ppm. Untuk larutan baku induk 1600 ppm di buat dengan melarutkan 40 mg asam salisilat dengan alkohol 70% pada labu ukur 25 mL, sedangkan untuk larutan standart induk 2000 ppm dibuat dengan melarutkan 50 mg asam salisilat dengan alkohol 70% pada labu ukur 25 mL ad tanda. Larutan standart induk 2000 ppm kemudian diencerkan untuk mendapatkan konsentrasi 800 ppm, 1200 ppm dan 1400 ppm. Untuk konsentrasi 800 ppm larutan standart induk 2000 ppm dipipet 4 mL kemudian dencerkan dengan alkohol 70% pada labu 10 mL ad tanda. Untuk konsentrasi 1200 ppm dibuat dengan mengencerkan 6 mL larutan standart induk 2000 ppm dengan alkohol 70% dalam labu 10 mL. Dan untuk konsentrasi 1400 ppm dibuat dengan memipet 7 mL larutan standart induk dan tambah alkohol 70% ad tanda pada labu ukur 10 mL. Penilaian parameter kecermatan pada validasi metode analisis asam salisilat ini menggunakan metode penambahan baku. Dalam metode ini, sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit yang diperiksa ditambahkan ke dalam sampel dicampur dan dianalisis lagi. Tetapi karena matriksnya tidak diketahui (asam salisilat merupakan produk paten) sehingga tidak memungkinkan membuat sampel placebo (bahan pembawa sediaan farmasi) maka dapat dipakai metode adisi. Metode adisi dapat dilakukan dengan menambahkan sejumlah analit dengan konsentrasi tertentu (sampel adisi) pada sampel yang diperiksa, lalu dianalisis dengan metode tersebut. Sampel adisi dibuat dengan penambahan bahan aktif (standar asam salisilat) sebanyak 30%, 45% dan 60% pada sediaan clean&clear dengan nomor batch tertentu.

Kriteria seksama atau presisi dinyatakan memenuhi jika memberikan simpangan baku relative atau koefisien variasi sebesar 2 % atau kurang. Setelah dilakukan analisa data, maka dalam perobaan yang dilakukan pada analisis asam salisilat secara Densitometri belum dapat dinyatakan presisi atau seksama. Dari hasil scaning didapatkan persamaan Y = 4105 + 1027x dengan nilai R = 0,86624. Kecermatan dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Persen perolehan kembali ditentukan dengan menentukan berapa persen analit yang ditambahkan tadi dapat ditemukan. Kecermatan sangat tergantung pada konsentrasi analit dalam matriks sampel dan pada keseksamaan metode (RSD) dari nilia RSD percobaan di didapatkan 114,2307%. Nilai ini tidak memenui rentang kepresisien dari validasi rentang kepresisian dari validasi adalah > 2%. Pada analisis menggunakan program validasi Funk et all, didapatkan bahwa pada metode ini belum dapat dinyatakan memenuhi syarat kepresisian. Dari perhitungan penilaian parameter presisi tersebut didapatkan hasil tidak memenuhi. Hal ini mungkin saja bisa terjadi karena terdapat kesalahan dalam preparasi sampel, standart maupun eluen. Adapun kesalahan yang mungkin saja telah dilakukan adalah
Kurang tepat dalam menimbang sampel, memipet standart dan

mengencerkannya sehingga konsentrasinya tidak benar;


Peralatan yang kurang bersih; Tidak teliti dalam melarutkan standart maupun sampel sehingga

standart dan sampel belum terlarut seluruhnya;


Kurang tepat dalam pembuatan eluan atau pun eluannya tercemar

sehingga kerja eluen tidak optimal;


Chamber

yang

belum

atau

tidak

terlalu

jenuh,

sehingga

mempengaruhi proses eluasi.


e. Uji Kecermatan (accuracy)

Hasil Pengamatan Preparasi Standar Asam Salisilat

Penimbangan larutan standar induk 1 = 40,1 mg / 25 mL Penimbangan larutan standar induk 2 = 50,1 mg/ 25 mL

Konsentrasi larutan standar induk Konsentrasi larutan standar induk 1


40,1 mg ug 1000 = 1604 ppm = 3208 ng (4) 25 ml mg

Konsentrasi larutan standar induk 2


50.1 mg ug 1000 = 2004 ppm = 4008 ng (5) 25 ml mg

Pengenceran larutan standar induk 2


4 ml 2004 ppm = 801.6 ppm ditotolkan 2 uL = 1603.2 ng (1) 10 ml 6 ml 2004 ppm = 1202 .4 ppm ditotolkan 2 uL = 2404.8 ng (2) 10 ml 7 ml 2004 ppm = 1402 .8 ppm ditotolkan 2 uL = 2805.6 ng (3) 10 ml

Penimbangan sampel Penimbangan Sampel Sampel asam salisilat mengandung 0,5% (0,5 g/100mL) Sampel Adisi 30% dari 0,5 g/100mL

= ( 30% 0,5 g ) + 0,5 g = 0,65 g


Dalam 2 mL, maka: = 2ml 100ml

100ml

0,65 g = 0,013 g = 13mg

Sampel Adisi 45% dari 0,5 g/100mL

= ( 45% 0,5 g ) + 0,5 g = 0,725 g


Dalam 2 mL, maka: = 2ml 100 ml

100ml

0,725 g = 0,0145 g = 14,5mg

Sampel Adisi 60% dari 0,5 g/100mL

= ( 60% 0,5 g ) + 0,5 g = 0,80 g


Dalam 2 mL, maka: = 2ml 100 ml

100ml

0,80 g = 0,016 g = 16mg

Konsentrasi Teoritis Sampel Adisi 30%


= 13mg 1000 = 1300 ppm 2 l = 2600 ng 10ml 14,5mg 1000 = 1450 ppm 2 l = 2900 ng 10 ml

Sampel Adisi 45%


=

Sampel Adisi 30%


= 16 mg 1000 = 1600 ppm 2 l = 3200 ng 10ml

Replikasi 1 Identitas sampel Sampel adisi 30% Sampel adisi 45% Sampel adisi 60% Pembahasan Penimbangan (mg) 13 14.5 16 Konsentrasi teoritis 1300 ppm 1450 ppm 1600 ppm

Replikasi 2 Penimbangan (mg) 13 14.5 16 Konsentrasi teoritis 1300 ppm 1450 ppm 1600ppm

Pada praktikum kali ini dilakukan penilaian parameter akurasi metode analisis asam salisilat dalam sampel lotion pembersih wajah secara KLT dennsitometri. Akurasi adalah kedekatan hasil dengan harga sebenarnya. Penilaian parameter akurasi yang digunakan adalah dengan cara penambahan standar atau pembanding (standard addition method). Penambahan analit ditentukan dengan menggunakan tiga macam konsentrasi antara 0,3-0,6 dari kadar analit yang diperkirakan. Dalam praktikum kali ini digunakan penambahan standar sebesar 30%, 45% dan 60%. Dan sampel Clean & Clear yang digunakan diketahui mengandung asam salisilat sebesar 0,5% atau

dalam 100 mL sediaan mengandung asam salisilat sebanyak 0,5 g. Pengambilan sampel dilakukan dengan menggunakan replikasi 2 kali. Nilai akurasi sering dinyatakan dalam persen perolehan kembali (% rekoveri). Persen perolehan kembali (% rekoveri) dapat ditentukan dengan rumus matematik sebagai berikut:
% perolehan kembali = (CF C A ) 100% C A

Dimana: CF = konsentrasi total sampel yang telah dianalisi CA = konsentrasi sampel yang sebenarnya C*A = Konsentrasi analit yang ditambahkan Dari hasil percobaan kali ini kelompok kami tidak mendapatkan hasil setelah dilakukan scanning dengan menggunakan Densitometer Camag. Adanya kesalahan-kesalahan yang terjadi ini dapat disebabkan dari berbagai hal, antara lain:
1.

Kekurang telitian pengambilan bahan Kesalahan dalam penotolan sampel Kurang homogen dalam mencampur bahan Alat dan bahan yang digunakan terkontaminasi bahan yang lain Kesalahan dalam pemipetan sampel Kesalahan dalam penganceran standart atau sampel

2. 3. 4. 5.
6.

7. KESIMPULAN
1. Hasil uji spesifisitas dan selektivitas yang dilakukan didapatkan hasil yang

tidak baik. Kemurnian analit dan identitas analit sebagai penentuan dalam parameter uji spesifisitas tidak dapat diukur karena kesalahan-kesalahan yang terjadi selama praktikum. Begitu juga dengan nilai Rs yang merupakan penentu dalam parameter uji selektivitas. Kesalahan-kesalahan yang bisa mempengaruhi hasil praktikum adalah kesalahan dalam membaca meniscus alat, dalam memasukkan lempeng yang sudah ditotoli tidak tegak lurus atau bersamaan sehingga hasil elusi bisa miring, eluen yang sudah lama atau terkontaminasi, lempeng KLT yang digunakan sudah lama sehingga sifatsifat bahan lempeng sudah mengalami perubahan, peralatan yang digunakan kurang bersih.
2. Linieritas merupakan kemampuan suatu metode analisis yang dapat

menunjukkan bahwa area analit dalam larutan sampel berada dalam rentang konsentrasi tertentu, dimana respon yang diberikan sebanding dan proporsional dengan konsentrasi analit. Hasil penentuan linieritas, standar salisilat yang telah dibuat tidak menunjukkan hubungan konsentrasi dan area yang linier karena pada saat analisis menggunakan KLT-Densitometri, lempeng KLT tidak terbaca oleh alat. Hal ini dapat dilihat dari spektra asam salisilat tiap track, sehingga didapat hipotesa bahwa metode validasi yang dilakukan tidak linier untuk asam salisilat.
3. Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat

dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. Batas deteksi merupakan parameter uji batas. Batas kuantitasi merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. Pada praktikum kali ini tidak didapatkan nilai LOD dan LOQ. Hal ini karena hasil scanning yang didapat menghasilkan spectra yang bertumpuk sehingga tidak dapat diketahui nilai area larutan standar.
4. Pada praktikum ini, dilakukan uji selektifitas dan presisi secara bersamaan,

sebab nilai selektivitas dapat diambil dari data perolehan uji presisi. Penilaian parameter kecermatan pada validasi metode analisis asam salisilat

ini menggunakan metode penambahan baku. Dari hasil scaning didapatkan persamaan Y = 4105 + 1027x dengan nilai R = 0,86624.
5. Dari hasil percobaan kali ini kelompok kami tidak mendapatkan hasil

akurasi setelah dilakukan scanning dengan menggunakan Densitometer Camag. Adanya kesalahan-kesalahan yang terjadi ini dapat disebabkan dari berbagai hal, antara lain:
1.

Kekurang telitian pengambilan bahan. 2. 3. 4. 5.


6.

Kesalahan dalam penotolan sampel Kurang homogen dalam mencampur bahan Alat dan bahan yang digunakan terkontaminasi bahan yang lain Kesalahan dalam pemipetan sampel Kesalahan dalam penganceran standart atau sampel.

DAFTAR PUSTAKA A.O., Barel., M. Paye, 2002, Handbook of Cosmetic Science and Technology, Marcel Dekker, New York. Ahmad, Iqbal dan vaid, Faiyaz HM. Determination of Benzoic Acid and Salicylic Acid In Comercial Benzoic and Salicylic Acids Ointments By Spectrophotometric Method. Pak. J. Pharma. Sci., Vol.22, No. 1, January 2009, pp. 18-22. Anonim, 2003, Camag Bibliography Service, Cumulative CD Version 1.09, Camag Muttenz. Deng , Chunhui., Xiangmin Zhang.,Jie Zhang.,Ji Qian., Weimin Zhu. 2003. Rapid Determination of Salicylic Acid in Plant Materials by Gas Chromatography Mass Spectrometry. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV.. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Harmita, 2004, Petunjuk Validasi Metode dan Cara Perhitungannya, Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol I, No.3, Jakarta: UI Press. Huber, L. 2007. Validation and Qualification in Analytical Laboratories 2nd edition. New York: Informa Healthcare USA, Inc. Hal144-160. Indrayanto, A., Indrayanto, G., & Muhammad, M. 2003. Validation Method of Analysis. Surabaya : Airlangga University Press.(Software). Kennedy, 1990, Analytical Chemistry:Principles second edition, Santa Barbara: University of California. Mulja dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Surabaya: Airlangga University Press. Satiadarma, Mulja, Tjahjono, & Kartasasmita. 2004. Asas Pengembangan Prosedur Analisis. Surabaya : Airlangga University Press.