ISOLASI RNA CARA DEUBEL & DEPRESS YANG SUDAH DIMODIFIKASI

ALAT : 1. Conicle. 2. Grinder dan pellet pestle. 3. Eppendorf 1.5 ml dan 0.5 ml 4. Oven. 5. Mikropipet. 6. Autoclave. 7. Sentifuse. 8. Yellow tipe dan white tip. 9. Glove.

BAHAN : 1. DEPC water. 2. Aquadest. 3. TrisHcl pH 6.4 0.1 M 4. Guanidine isothiocyanate. 5. EDTA pH 8.0 0.2 M 6. Triton X-100. 7. Silica. 8. HCL 10 N. 9. TrisHcl pH 7.5 1 M. 10. RNAsin 400 unit/ml TE buffer. 11. Proteinase K 20mg/ml. 12. Ice pack.

CARA KERJA : 1. Pembuatan DEPC Water. a. Siapkan 0.2 ml DEPC. b. Kemudian tambahkan Aquadest sampai dengan 100 ml.

c. Campur sampai merata (kocok dengan kuat). d. Autoclave larutan tersebut untuk menginaktifkan DEPC. e. Simpan dalam kulkas 4oC.

2. Pembuatan Larutan Dapar L-6. a. Siapkan larutan TrisHcl yang sudah dilarutkan dalam DEPC water dengan konsentrasi 0.1 M pH 6.4 sebanyak 12.5 ml. b. Timbang Guanidin isothiocyanate sebanyak 15 gram. c. Campur kedua bahan tersebut kedalam conicle 45 ml dan larutkan pada suhu 65oC (conicle dalam keadaan tertutup). d. Kemudian tambahkan EDTA yang sudah dilarutkan kedalam DEPC water dengan konsentrasi 0.2 M pH 8.0 sebanyak 2.75 ml, campur secara merata. e. Tambahkan Triton X-100 sebanyak 0.325 ml, campur secara merata. f. Larutan ini kemudian disimpan selama 3-4 minggu pada suhu kamar dalam keadaan gelap.

3. Pembuatan Larutan Dapar L-2. a. Siapkan larutan TrisHcl yang sudah dilarutkan dalam DEPC water dengan konsentrasi 0.1 M pH 6.4 sebanyak 12.5 ml. b. Timbang Guanidin isothiocyanate sebanyak 15 gram. c. Campur kedua bahan tersebut kedalam conicle 45 ml dan larutkan pada suhu 65oC (conicle dalam keadaan tertutup). d. Larutan ini kemudian disimpan selama 3-4 minggu pada suhu kamar dalam keadaan gelap.

4. Pembuatan Larutan Silica. a. Timbang tepung Silica sebanyak 1.2 gram kemudian larutkan kedalam DEPC water sampai dengan 10 ml. b. Larutan Silica kemudian diendapkan selama 1 malam pada suhu kamar dan dalam keadaan gelap.

c. Ambil supernatan larutan Silica sebanyak 430 mikroliter, kemudian tambahkan DEPC water sebanyak 430 mikroliter dan kocok larutan tersebut. d. Endapkan larutan Silica selama 5 jam pada suhu kamar dengan keadaaan gelap, kemudian ambil lagi supernatant larutan tersebut sebanyak 440 mikroliter. e. Kemudian tambahkan HCL 10 N sampai dengan pH akhir larutan Silica menjadi 2. f. Sterilkan larutan Silica dengan autoclave, lalu simpan pada suhu kamar dalam keadaan gelap (dapat disimpan sampai 6 bulan).

5. Pembuatan TE buffer. a. Siapkan 97 l DEPC water. b. Tambahkan larutan TrisHcl yang sudah dilarutkan dalam DEPC water dengan konsentrasi 1 M pH 7.5 sebanyak 20 l. c. Tambahkan EDTA yang sudah dilarutkan kedalam DEPC water dengan konsentrasi 0.2 M pH 8.0 sebanyak 10 l, campur secara merata. d. Larutan TE buffer kemudian disimpan dalam kulkas 4oC. e. Kemudian siapkan larutan RNAsin 400 unit/ml TE buffer, simpan dalam -20oC.

6. Isolasi RNA. a. Thorax atau caput nyamuk yang sudah dimasukkan kedalam eppendorf 1.5 ml ditambah dengan DEPC water 100 l kemudian digerus dengan grinder. b. Kedalam tabung eppendorf steril masukkan 80-85 l sampel ditambah dengan 400 l larutan Dapar L-6, Proteinase K 20 mg/ml sebanyak 10 l, campur secara merata. c. Kemudian inkubasi pada suhu 56oC selama 1 jam. d. Tambahkan 30 l larutan Silica, campur secara merata, biarkan selama 10 menit pada suhu kamar. e. Sentrifuse larutan tersebut selama 20 detik pada 10.000 rpm. f. Kemudian tambahkan larutan Dapar L-2 sebanyak 300 l, campur rata dan sentrifuse selama 20 detik pada 10.000 rpm. g. Buang supernatan, tambahkan pellet dengan larutan Dapar L-2 sebanyak 200 l, campur rata dan sentrifuse selama 20 detik pada 10.000 rpm.

h. Buang supernatan, tambahkan pellet dengan larutan Ethanol 70% 300 l, campur rata dan sentrifuse selama 20 detik pada 10.000 rpm. i. Buang supernatan, tambahkan pellet dengan larutan Ethanol 70% 300 l, campur rata dan sentrifuse selama 20 detik pada 10.000 rpm. j. Buang supernatan, tambahkan pellet dengan larutan Aseton 300 l, campur rata dan sentrifuse selama 20 detik pada 10.000 rpm. k. Buang supernatant, pellet kemudian dikeringkan dengan heat block pada suhu 56oC selama 10 menit (tabung dalam keadaan terbuka). l. Tambahkan RNAsin 20-25 l, campur rata, lalu inkubasi pada suhu 56oC selama 10 menit (tabung dalam keadaan tertutup). m. Campur kembali pellet dengan RNAsin, kemudian sentrifuse selama 1 menit pada 10.000 rpm. n. Ambil secara hati-hati supernatan RNA dan pindahkan kedalam eppendorf 0.2 ml (usahakan pellet/silica tidak terambil). o. Simpan larutan RNA didalam -70oC.