Anda di halaman 1dari 10

PROSEDUR STANDAR DALAM MIKROTEKNIK

D I S U S U N OLEH: NAMA NIM KELAS : FILDZA ADIBA SAUFI LUBIS : 4103141022 : BIOLOGI DIK A 2010

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI MEDAN 2010/2011

PROSEDUR STANDAR DALAM MIKROTEKNIK

Mikroteknik yaitu metode yang digunakan dalam pembuatan sampel penelitian dengan melalui beberapa tahapan dan tujuannya untuk mendapatkan sampel sel atau jaringan yang jelas sehingga mudah untuk diamati.

Tahapan-tahapan standar dalam mikroteknik : 1. Pembiusan (Narcose)


Pembiusan merupakan proses yang bertujuan khusus untuk preparat hewan yaitu untuk memudahkan pengambilan jaringan atau bagian jaringan pada hewan. Pembiusan tidak perlu dilakukan jika yang akan diambil atau diamati adalah jaringan yang menyangkut kelenjarkelenjar(endokrinologi), karena mungkin akan berpengaruh terhadap hormon-hormon yang terkandung di dalamnya. Senyawa kimia yang umumnya digunakan untuk pembiusan adalah: Eter, biasanya digunakan untuk membius tikus, kelinci, marmut, dan anjing Kloroform, biasanya digunakan untuk membius kucing dan kera.

Senyawa kimia lainnya yang dapat digunakan untuk pembiusan adalah prokain, asetonCHCl3, Morfin HCl, methane, alcohol, klereton, kloral hidrat, kokain, dan garam magnesium.

2. Pengambilan jaringan (Diseksi/Collecting)


Diseksi merupakan proses pengambilan jaringan atau bagian jaringan dari sumber alami baik berupa tumbuhan ataupun hewan yang akan digunakan sebagai bahan dasar dalam mikroteknik. Pada jaringan hewan setelah dilakukan pengambilan diperlukan proses pencucian (washing). Pencucian (washing) adalah suatu tahap yang membedakan metode paraffin hewan dengan tumbuhan. Percobaan ini perlu dilakukan karena jaringan yang diambil pada hewan dengan tumbuhan.pencucian ini perlu dilakukan karena jaringan yang diambil pada hewan sering kali dalam keaadaan kotor oleh darah atau kotoran seperti pada organ pencernaan. Selain itu jaringan hewan lebih cepat mengalami dehidrasi yang merusak jaringan, sehingga

perlu secepat mungkin dimasukan ke dalam larutan fisiologis sebagai fiksasi sementara. Pencucian pada pembuatan preparat hewan menggunakan larutan garam fisiologis. Larutan garam fisologis yang bisa dipakai: 1. NaCl 0.8-0.9% 2. Larutan Ringer, dapat digunakan untuk hewan berdarah panas dan dingin. Komposisi larutan ringer adalah: - NaCl, CaCl, KCl, K2CO3, air untuk hewan berdarah panas. - NaCl, CaCl, KCl, Na2CO3, air untuk hewan berdarah dingin. NaCl merupakan larutan fisologis yang umumnya digunakan, biasanya dalam waktu 15 menit. Perlu diperhatikan, jangan sekali-kali dicuci dengan air, karena akan menyebabkan pembengkakan sel. Syarat dalam pengambilan objek ini adalah sebagai berikut: 1. objek yang diambil dalam kondisi sehat 2. objek yang diambil tidak boleh rusak saat proses pengambilan

3. menggunakan pisau yang tajam 4. ukuran jaringan yang diambil kurang lebih 0.5 cm 5. langsung dicuci dan difiksasi.

3. Fiksasi (Fixation)
Fiksasi artinya membuat menjadi tetap (to fix). Fiksasi adalah tahap pertama yang paling kritis dalam prosesing preparat histology. Tahap ini menjadi kritis karena begitu dikoleksi (dipisahkan dari tubuh asalnya), sel-sel jaringan akan segera mengalami perubahan baik karena aktivitas bakteri maupun karena proses autolysis (self-digestion) oleh enzim-enzim yang terdapat di dalam sel. Aktivitas enzim autolysis arahnya terbalik disbanding dengan kondisi sel hidup, bukan mensintesis protein tetapi memecahnya menjadi asam-asam amino. Asam amino ini selanjutnya akan berdifusi keluar dari sel dan pada akhirnya tidak akan bisa lagi dikoagulasi oleh bahan kimia atau reagen tertentu. Tujuan dari fiksasi adalah sebagai berikut : 1) Menghentikan proses-proses metabolik sel secara tepat 2) Mencegah terjadinya perubahan-perubahan yang bersifat regresif 3) Mengawetkan bahan-bahan sitologis dan histologis

4) Mempertahankan bentuk aktual bahan biologis 5) Mengeraskan, atau akan memberi konsistensi kepada bahan-bahan yang lembut, karena terjadinya koagulasi protoplasma atau bahan-bahan pembentuk

protoplasma 6) Memberi kemungkinan adanya perbedaan optik di antara jaringan

Untuk dapat mencapai tujuan tersebut di atas, suatu bahan fiksatif harus memiliki sifat-sifat sebagai berikut : 1. Memiliki daya penetrasi yang baik ke dalam jaringan. Suatu fiksatif harus dapat menembus jaringan dengan cepat untuk mencegah terjadinya perubahan-perubahan postmortem 2. Mampu mengkoagulasi isi sel dengan baik. Daya koagulasi ini akan membuat isi sel menjadi substansi yang tidak larut (insoluble) dalam larutan kimia yang akan dilaluinya pada tahap selanjutnya, seperti alcohol, xylol, dan lain-lain. 3. Mampu melindungi jaringan terhadap terjadinya penyusutan atau distorsi yang mungkin akan terjadi selama dehidrasi, embedding, dan penyayatan. 4. Mampu membuat isi sel atau bagian sel menjadi tampak berbeda (to differentiate) satu sama lain sehingga masing-masing bagian dapat diamati dengan jelas.

Fiksatif Bahan kimia yang digunakan untuk memfiksasi jaringan dinamakan fiksatif. Fiksatif adalah senyawa yang memiliki seluruh kemampuan seperti diuraikan di atas. Sayangnya fiksatif yang ideal sangat sulit didekati karena jaringan dan bagian-bagiannya sangat berbeda baik dalam organisasi fisik maupun dalam sifat kimianya satu sama lain. Suatu fiksatif yang dapat mengawetkan suatu bahan sel tertentu dengan baik dapat menjadi pelarut bagi bahan sel yang lain, atau fiksatif yang bersifat mordant terhadap bagian sel tertentu dapat mengganggu pewarnaan bagian lain dari sel tersebut. Fiksatif yang paling efektif adalah kombinasi koagulan dan nonkoagulan protein. Tetapi perlu pula ditekankan kembali bahwa tidak pernah ada fiksatif yang ideal, yang dapat mengatasi seluruh persoalan yang baik, semua bahan kimia akan menimbulkan perubahan struktur protein sel. Dengan demikian, pemilihan fiksatif dalam suatu pekerjaan sepenuhnya

tergantung kepada jenis dan tujuan pengamatan yang akan dilakukan terhadap jaringan. Sehingga segala upaya harus pula dilakukan untuk mengetahui secara persis bagaimana efek negative yang ditimbulkan oleh setiap bahan fiksatif yang digunakan.

Fiksatif tunggal Bahan pembuatan fiksatif campuran Bahan-bahan kimia di bawah ini pada awalnya digunakan sebagai fiksatif tunggal. Tetapi pada perkembangan selanjutnya bahan-bahan tersebut, kecuali beberapa bahan tertentu, sudah jarang digunakan secara sendirian tetapi dijadikan sebagai salah satu komponen dari fiksatif campuran. 1. Asam asetat 2. Aseton 3. Kromium trioksida (CrO3), asam kormat 4. Alkohol 5. Aldehida (HCHO) 6. Merkuri klorida (HgCl2) 7. Osmium tetroksida (OsO4), asam osmat 8. Asam pikrat (C6H2(NO2)3OH) 9. Kalium dikromat (K2Cr2O7) 10. Asam trikloroasetat (CCl3COOH) Fiksatif campuran-Kombinasi beberapa fiksatif tunggal 1. Larutan Mueller 2. Larutan Orth 3. Larutan Zenker 4. Larutan Helly (Formol Zenker) 5. Larutan Heidenhain 6. Larutan Lavdowsky 7. Formalin 8. Larutan Mann 9. Larutan Bouin 10. Larutan Allen B 11. Larutan Gilson 12. Larutan Bensey AOB 13. Larutan Regaud 14. Larutan Bianco 15. Larutan Gate 16. Larutan Navashin 17. Larutan Carnoy 18. Larutan Alkohol-Formalin-Asetat (A-F-A) 19. Larutan Kolmer 20. Larutan Petrunkewitsch

4. Dehidarasi (Dehydration)
Tujuan dehidrasi adalah untuk menarik air yang terdapat dalam jaringan setelah fiksasi. Dehidrasi juga memiliki fungsi mencuci (washing) dan malah bisa membuat jaringan menjadi kokoh dan mungkin menjadi keras dan rapuh. Proses dehidrasi dilakukan dengan cara melewatkan jaringan melalui satu seri larutan yang mengandung bahan penarik air dengan konsentrasi naik dan air dengan konsentrasi menurun. Bahan penarik air (dehydrator) yang digunakan harus mampu menarik molekul air dari jaringan dan kemudian menempati tempat yang ditinggalkan molekul air tersebut. Larutan Pendehidrasi (Dehydrating Agent) Alkohol Dioksan (kombinasi dehidrasi dan infiltrasi) n-Butil Alkohol (kombinasi dehidrasi dan penjernihan)

5. Penjernihan (clearing)
Pada metode parafin, tahap penjernihan (clearing) merupakan tahap transisi dari alkohol ke parafin dalam metode parafin. Larutan yang digunakan akan menghilangkan opasitas atau membuat menjadi jernih jaringan yang baru didehidrasi, sehingga jaringan tampak transparan. Bahan penjernih yang paling umum digunakan merupakan bahan hidrokarbon, seperti xylol (xylene) dan toluol (toluene), serta kloroform. Xilol, bahan penjernih yang paling banyak digunakan memiliki kecxenderungan mengeraskan jaringan yang paling tinggi, sehingga harus dihindarkan penggunaannya. Untuk jaringan yang terdehidrasi sebagian, bahan lain seperti minyak cedar atau metal salisilat sering digunakan untuk menjernihkan, kemudian diikuti denagn xilol, sehingga proses transisi menuju parafin lebih mudah dilakukan.

6. Infiltrasi (Infiltration)
Infiltrasi adalah tahap yang sangat penting dan kritis, karena tahap ini sangat menentukan kualitas hasil penyayatan (sectioning). Dalam proses ini, medium imbedding diinfiltrasikan ke dalam seluruh bagian jaringan.

Jika parafin akan digunakan sebagai medium embedding, maka infiltrasi jaringan dilakukan dengan cara memindahkannya secara berturut-turut ke dalam parafin lembut (soft parafin) dengan titik leleh 480C, parafin menengah (medium parafin) dengan titik leleh 52540C, dan terakhir ke dalam parafin keras (hard parafin), dengan titik leleh 560C masingmasing selama 5 menit. Proses ini dilakukan di dalam oven. Jika laboratorium hanya memiliki satu jenis parafin, maka infiltrasi tetap harus dialkukan seperti dikemukakan di atas, yaitu dengan tiga kali pemindahan tetapi dengan parafin yang sama jenisnya.

7. Penanaman (Embedding atau Blocking)


Setelah infiltrasi, jaringan sekarang siap untuk ditanam dalam blok parafin. Tahap penanaman ini disebut juga dengan blocking (membuat blok). Untuk membuat blok diperlukan suatu cetakan (template). Ukuran blok yang terbentuk ditentukan oleh ukuran cetakan yang digunakan. Pemilihan jenis parafin yang akan digunakan untuk menanam jaringan sangat tergantung kepada ketebalan jaringan yang dibuat. Jika sayatan yang hendak dibuat relatif tebal, 10m atau lebih, sebaiknya digunakan parafin lembut karena jika digunakan parafin keras maka hasil sayatan akan terlepas dan tidak akan pernah membentuk pita. Sayatan demikian akan sangat sulit untuk ditangani. Untuk sayatan yang lebih tipis, misalnya 5-7 m, digunakan parafin dengan titik leleh antara 56-580C. Untuk sayatan lebih tipis lagi, contohnya 5 m, sebaiknya digunakan parafin yang lebih keras; hasil yang sangat baik sering diperoleh dengan parafin 60-680C.

8. Penyayatan (Sectioning)
Metode parafin Sebelum disayat, blok parafin terlebih dahulu harus dipangkas menjadi berbentuk kubus atau persegi sampai sebagian besar bagian blok parafin yang tidak berguna di sekitar jaringan terbuang. Blok yang sudah dipangkas sebelumnya ditempelkan pada meja mikrotom dengan cara : a) Ambil meja mikrotom dan bersihkan dari parafin yang menempel padanya dan letakkan pada mulut botol, dengan cakram meja menghadap ke atas, dengan cara menyelipkan meja mikrotom tersebut pada leher botol.

b) Panaskan ujung pisau spatula c) Pegang pisau tersebut dengan salah satu tangan dan blok parafin pada tangan yang lain. d) Letakkan pisau spatula menyentuh permukaan atas cakram meja dan pada saat yang sama tekan blok parafin dengan kuat di atas pisau spatula e) Tarik spatula sambil menekan dengan kuat blok parafin pada permukaan cakram meja mikrotom. Jika pekerjaan ini dilakukan dengan benar, blok parafin akan tertempel dengan ketat pada permukaan cakram meja mikrotom. Sekarang blok siap untuk disayat. Blok yang sudah tertempel pada meja mikrotom ini disiapkan untuk disayat dengan mikrotom putar (rotary microtome), suatu alat penyayat yang memiliki presisi tinggi. Untuk menyayat meja mikrotom terlebih dahulu harus dijepitkan pada pemegang objek (object holder) mikrotom. Setelah itu pasang mikrotom pada pegangannya, atur pisau sedemikian sehingga diperoleh kemiringan yang tepat lalu kunci seluruh sekrup dengan ketat. Selanjutnya gerakkan pemegang pisau secara perlahan mendekati blok parafin dan atur sedemikian rupa sehingga terdapat sedikit ruang kosong (clearance) antara mata pisau dengan blok parafin. Posisi blok dalam memegang blok kemudian disesuaikan dengan membuat mata pisau sebagai acuan. Kelebihan dan kekurangan metode parafin Metode parafin adalah metode umum yang paling baik untuk menyayat jaringan yang telah difiksasi. Metode ini sangat cocok diadopsi untuk produksi slide secara besar-besaran di laboratorium pendidikan, sangat bagus untuk membuat sayatan serial atau untuk pengamatan dan rekonstruksi struktur mikroskopis. Metode ini memiliki presisi dan akurasi yang sangat tinggi, ketebalan sayatan akan konstan pada ketebalan yang telah diset sebelumnya sepanjang alatnya tidak mengalami kerusakan. Walau metode parafin dapat digunakan untuk memproduksi sayatan yang banyak secara tepat, tetapi metode ini masih tergolong cukup lambat untuk keperluan pekerjaan pada laboratorium patologi di tempat mana pada umumnya hanya dibutuhkan beberapa sayatan saja. Di samping itu, metode ini mengharuskan jaringan terdedah terhadap panas yang pada hakekatnya harus dihindari jika jaringan ingin dipertahankan tetap dalam struktur idealnya. Jaringan lemak dan jaringan kelenjar tertentu serta berbagai inklusi sel akan menjadi terlalu rapuh jika diproses dengan metode ini akibat adanya panas tadi.

9. Penempelan (Affixing)
Setelah blok disayat, kini pita sayatan siap ditempelkan pada permukaan slide. Untuk slide konvensional, agar pita sayatan dapat menempel dengan erta dibutuhkan suatu reagen tertentu yang berfungsi sebagai lem yang meletakkan pita pada permukaan slide. Tanpa reagen tersebut pita-pita beresiko akan terlepas dari slide selama tahap pewarnaan dan/atau tahap selanjutnya. Bahan lem yang paling popular pada kebanyakan laboratorium histology adalah reagen yang pertama sekali diperkenalkan oleh Mayer, yang terdiri dari campuran albumen (putih telur) dan gliserol dengan perbandingan 1:1. Namun saat ini telah tersedia pula slide yang salah satu permukaannya sudah dilapisi dengan lem fabrikan.

10. Pewarnaan (Staining)


Bahan pewarna dapat dikelompokkan atas dua, yakni : pewarna alamiah (natural dyes) dan pewarna sintetik (synthetic dyes). Pewarna alamiah Pewarna alamiah diperoleh dari bahan-bahan alamiah, baik hewan maupun tumbuhan. Diantara pewarna alamiah tersebut, yang paling banyak dikenal adalah kokineal, carmine, dan hematoksilin. Hematoksilin Hematoksilin diekstraksi dari kayu gelondongan sejenis tanaman polong-polongan yang mirip dengan pohon akasia. Bahan baku ini kemudian diekstraksi dengan eter secara kontiniu, kemudian diuapkan, dilarutkan kembali dalam air lalu disaring dan akhirnya dikristalisasi. Jiak dioksidasi secara sempurna, hematoksilin merupakan pewarna yang sangat kuat dengan warna bervariasi dari ungu sampai biru atau sampai biru hitam. Pewarna sintetik Pewarna sintetik memiliki kelebihan jika dibandingkan dengan pewarna alamiah. Kelebihan utamanya adalah bahwa pewarna ini dapat digunakan untuk pewarnaan ganda atau triple, yaitu penggunaan dua jenis pewarna atau lebih pada satu slide. Pewarna ini akan mewarnai

secara histologist; dalam arti bahwa masing-masing pewarna, karena spesifitasnya sudah diketahui sebelumnya, hanya akan mewarnai bagian tertentu dari sel.

11. Cover Slipping (penutupan)


Penutupan dapat dilakukan dengan cara sebagai berikut : 1. Bentangkan satu kajang kertas filter di atas meja tempat anda bekerja 2. Ambil satu slide dari xilol II kemudian diletakkan di atas kertas filter (permukaan yang mengandung jaringan menghadap ke atas). 3. Teteskan satu Canada balsam tepat di atas jaringan sebelum jaringan kering dari xilol. 4. Ambil satu kaca penutup di antara jari telunjuk dengan jempol tangan kiri sementara tangan kanan memegang sebuah jarum. 5. Turunkan kaca penutup sampai menyentuh slide dekat jaringan lalu miringkan ke arah kanan dan tahan ujungnya yang lain dengan jarum. 6. Turunkan kaca penutup dengan caara menarik ujung jarum secara perlahan. 7. Biarkan Canada balsam menyebar secar merata di bawah kaca penutup untuk mendesak gelembung udara dari bawah kaca penutup tersebut. 8. Biarkan slide mengering dan jangan lagi disentuh. Canada balsam harus dibuat setipis mungkin, kaca penutup dapat ditekan (secar perlahan) dengan bagian penghapus dari pensil untuk menipiskan Canada balsam. Pada hari berikutnya, kelebihan Canada balsam dapat dibuang dengan cara mengeriknya dengan scalpel.