Anda di halaman 1dari 10

PENGUJIAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT) DAN PEWARNAAN 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH)

RIZKI SEPTIANI G44080028

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2011

Laporan Praktikum Kimia Bahan Alam

Hari/tanggal Waktu Asisten PJP

: Selasa/ 6 Desember 2011 : 09.00-12.00 WIB : Zulhan Arif, S.Si, M.Si. : Wulan Tri Wahyuni, S.Si, M.Si.

PENDAHULUAN
Latar Belakang Kemajuan ilmu pengetahuan menemukan bahwa banyak sekali faktor penyebab penyakit degeneratif seperti kanker, kardiovaskuler, dan penuaan dini. Penyakit-penyakit tersebut umumnya terjadi antara lain karena faktor genetik, gaya hidup, lingkungan, mutasi gen, rusaknya sistem kekebalan dan radikal bebas. Dari semua faktor penyebab tersebut, teori radikal bebas merupakan teori yang paling sering diungkapkan (Kosasih dkk. 2006). Radikal bebas adalah suatu atom atau molekul yang mempunyai satu elektron yang tidak berpasangan yang secara teoretis dapat terbentuk bila terjadi pemutusan ikatan kovalen. Radikal bebas dapat berasal dari polusi, debu maupun diproduksi secara kontinyu sebagai konsekuensi dari metabolisme normal (Giorgi 2000). Radikal bebas dianggap berbahaya karena menjadi sangat reaktif dalam upaya mendapatkan pasangan elektronnya. Selain itu, dapat pula terbentuk radikal bebas baru dari atom atau molekul yang elektronnya terambil untuk berpasangan dengan radikal bebas sebelumnya. Oleh karena sifatnya yang sangat reaktif dan gerakannya yang tidak beraturan, maka apabila terjadi di dalam tubuh makhluk hidup akan menimbulkan kerusakan di berbagai bagian sel. Oleh sebab itu, tubuh kita memerlukan suatu substansi penting yakni antioksidan yang dapat membantu melindungi tubuh dari serangan radikal bebas dengan meredam dampak negatif senyawa ini. Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menghambat oksigen reaktif dan radikal bebas dalam tubuh. Senyawa antioksidan ini akan menyerahkan satu atau lebih elektron kepada radikal bebas sehingga menjadi bentuk molekul yang normal kembali dan menghentikan berbagai kerusakan yang ditimbulkan (Nelson et al. 2003). Berdasarkan sumbernya antioksidan dibagi menjadi dua kelompok, yaitu antioksidan sintetik dan antioksidan alami. Antioksidan sintetik merupakan

anitoksidan yang diperoleh dari hasil sintesis reaksi kimia, sedangkan antioksidan alami merupakan antioksidan yang diperoleh dari ekstraksi bahan alam. Nutrisi antioksidan dapat diperoleh dari makanan sehari-hari seperti sayuran, buahbuahan, kacang-kacangan dan tanaman lainnya yang mengandung senyawa antioksidan bervitamin (seperti vitamin C, vitamin A, dan vitamin E), asam-asam fenolat (seperti asam ferulat, asam klorogerat, asam elagat dan asam kafeat) dan senyawa flavonoid. Diketahui hampir 80 % dari total antioksidan dalam buah dan sayuran berasal dari flavonoid, yang dapat berfungsi sebagai penangkap anion superoksida, lipid peroksida radikal, kuensing oksigen singlet, dan pengkelat logam (Giorgi 2000). Salah satu metode kualitatif yang dapat digunakan untuk menentukan potensi suatu senyawa sebagai antioksidan adalah KLT (kromatografi lapis tipis) bioautografi. KLT bioautografi merupakan uji kualitatif senyawa metabolit sekunder dengan penyemprotan menggunakan pereksi pewarna. Pereaksi pewarna yang digunakan pada percobaan ini adalah DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil), yaitu radikal bebas yang akan berekasi dengan antioksidan dan menghasilkan perubahan warna. Perubahan warna tersebut dapat dijadikan sebagai indikator potensi suatu senyawa sebagai antioksidan. Senyawa yang akan diuji potensinya sebagai antioksidan adalah yang terkandung dalam ekstrak etanol kunyit dan daun salam. Senyawa aktif yang terkandung pada tanaman kunyit adalah kurkuminoid (Araujo & Leon 2001), sedangkan yang terkandung dalam daun salam adalah saponin, triterpen, flavonoid, tanin, dan alkaloid (Haris 2006).

Tujuan Praktikum bertujuan melakukan uji aktivitas antioksidan senyawa metabolit sekunder kunyit dan daun salam menggunakan KLT dan pewarnaan DPPH.

BAHAN DAN METODE

Alat dan Bahan Alat yang digunakan adalah pelat KLT, chamber, lampu UV, pipa kapiler, dan alat gelas. Bahan yang digunakan adalah ekstrak sampel kunyit dan daun salam, metanol, kloroform, etil asetat, heksana, asam asetat, DPPH, dan asam askorbat.

Metode Eluen disiapkan dengan komposisi pelarut kloroform: n-heksana: etil asetat : asam asetat (5: 2.5: 2.5: 0.15) dengan total eluen sebanyak 10 ml. Eluen tersebut dijenuhkan selama 15 menit. Ekstrak metanol kunyit dan daun salam ditotolkan pada plat KLT yang masing-masing telah diberi garis batas 1 cm dari tepi atas dan bawah. Penotolan ekstrak dilakukan sebanyak minimal 10 kali. Ekstrak tersebut kemudian dielusi dengan menggunakan asam askorbat sebagai kontrol, hingga eluen mencapai garis batas. Setelah elusi selesai, plat KLT dikeringkan dan dilihat noda yang terbentuk di bawah sinar UV pada = 254 nm dan = 366 nm. Setelah dilihat di bawah sinar UV, plat tersebut disemprot dengan DPPH dilihat fraksi yang aktif sebagai antioksidan.

HASIL DAN PEMBAHASAN


Penentuan aktivitas antioksidan senyawa dalam ekstrak metanol kunyit dan daun salam dilakukan menggunakan metode KLT bioautografi dengan penyemprotan menggunakan larutan DPPH radikal dan sebagai standar digunakan larutan vitamin C (asam askorbat). KLT merupakan teknik yang dugunakan untuk memisahkan campuran komponen berdasarkan distribusi komponen tersebut di antara dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak (Khopkar 2002). Fase diam yang digunakan pada percobaan ini adalah silica gel dan fase gerak yang digunakan adalah campuran pelarut yang terdiri atas kloroform, n-heksana, etil asetat, dan asam asetat. Fase diam yang digunakan bersifat polar sedangkan fase geraknya bersifat sedikit polar. Fase gerak bekerja berdasarkan prinsip kapilaritas terhadap fase diam. Fase gerak menggerakkan komponen sampel pada berbagai laju karena perbedaan tingkat interaksi dari setiap komponen dengan matriks dan kelarutannya dalam pelarut (Khopkar 2002). Hasil pemisahan menggunakan KLT tidak terlalu jelas bila diamati secara langsung, terutama untuk asam askorbat karena larutannya tidak berwarna (Gambar 1). Oleh karena hasil pemisahan diamati di bawah sinar UV dan dapat dilihat pada gambar 2 dan Gambar 3. Spot yang terbentuk dapat ditandai dengan pensil dan dapat dilihat pada Gambar 4. Pemisahan yang baik di antara sampel yang digunakan adalah pada sampel daun salam (S1-S3) dengan spot yang terpisah dan jumlah spot yang dihasilkan paling banyak. Di sisi lain, pemisahan pada sampel kunyit (K1-K3) tidak bagus, karena spot yang dihasilkan tidak cukup terpisah. Hal ini dapat disebabkan ekstrak yang ditotolkan pada pelat KLT terlalu pekat sehingga proses elusi oleh fase gerak tidak berlangsung dengan baik. Pemisahan dengan KLT pada asam askorbat (V1-V3) menghasilkan spot yang sedikit dan tidak terpisah.

S1

S2

S3

K1

K2

K3

V1

V2

Gambar 1 Hasil pemisahan ekstrak metanol kunyit, daun salam, dan standar vitamin C dilihat secara langsung.
S3 K3 V1 S1 K1 S2 K2 V2

Gambar 2 Hasil pemisahan ekstrak metanol kunyit, daun salam, dan standar vitamin C dengan KLT dilihat di bawah lampu UV (254 nm).
S3 K3 V1 S1 K1 S2 K2 V2

Gambar 3 Hasil pemisahan ekstrak metanol kunyit, daun salam, dan standar vitamin C dengan KLT dilihat di bawah lampu UV (366 nm).
S1 S2 S3 K1 K2 K3 V1 V2

Gambar 4 Hasil pemisahan ekstrak metanol kunyit, daun salam, dan standar vitamin C dengan KLT yang ditandai dengan pensil.

DPPH adalah suatu radikal yang dapat bereaksi dengan radikal lain membentuk suatu senyawa yang stabil atau bereaksi dengan atom hidrogen (yang berasal dari suatu antioksidan) membentuk DPPH tereduksi (DPPH-H). Larutan DPPH radikal berwarna ungu, sedangkan DPPH tereduksi berwarna ungu pudar dan lama-kelamaan menjadi kuning atau tidak berwarna. Semakin kuat aktivitas antioksidan suatu senyawa, maka semakin pudar warna ungu yang dihasilkan.

Gambar 5

Struktur DPPH dan reaksinya dengan antioksidan (Yuhernita & Juniarti 2011 ).
S1 S2 S3 V1 V2 K1 K2 K3

Gambar 5 Hasil pemisahan ekstrak metanol kunyit, daun salam, dan standar vitamin C dengan KLT setelah disemprot dengan larutan DPPH. Berdasarkan Gambar 5 terlihat bahwa pada bagian pelat yang terdapat spot hasil pemisahan menggunakan KLT, terjadi pemudaran warna ungu larutan DPPH. Hal ini terjadi karena adanya aktivitas antioksidan. Antioksidan yang terdapat pada ekstrak daun salam maupun kunyit mampu bereaksi dengan radikal DPPH sehingga menyebabkan radikal tersebut berubah menjadi bentuk tereduksinya (DPPH-H) dan perubahan itulah yang menyebabkan terjadinya pemudaran warna ungu. Pemudaran warna ungu terlihat sangat jelas pada ekstrak kunyit (K1-K3) yaitu pada bagian yang berwarna kuning (warna ekstrak). Hal ini berarti aktivitas antioksidan ekstrak metanol kunyit sangat kuat. Pada ekstrak

daun salam (S1-S3) warna ungu yang memudar terlihat jelas pada titik penotolan sampel, sedangkan pada vitamin C pemudaran warna ungu tidak terlihat. Hal ini dapat disebabkan oleh kerusakan vitamin C yang digunakan dalam percobaan ini. Ekstrak metanol daun salam (Syzygium polyanthum Wight.) mempunyai aktivitas antioksidan karena mengandung senyawa flavonoid. Salah satu senyawa flavonoid yang terdapat di dalam daun salam adalah kuersetin (Studiawan 2004). Aktivitas antioksidan senyawa flavonoid dikaitkan dengan adanya gugus hidroksil fenolik yang menempel pada struktur kerangkanya. Sifat antioksidan dari flavonoid berasal dari kemampuan untuk mentransfer sebuah elektron ke senyawa radikal bebas (Gambar 6) dan juga membentuk kompleks dengan logam. Kedua mekanisme itu membuat flavonoid memiliki beberapa efek, diantaranya menghambat peroksidasi lipid, menekan kerusakan jaringan oleh radikal bebas dan menghambat aktivitas beberapa enzim. Senyawa flavonoid terbukti dapat meredam radikal bebas 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Aktivitas antioksidan ekstrak daun salam pada percobaan ini lebih tinggi daripada vitamin C. Hal ini diduga karena vitamin C yang digunakan telah mengalami kerusakan sehingga aktivitas antioksidannya menurun.

Gambar 6

Penangkapan radikal bebas oleh flavonoid. (A) struktur dasar flavonoid dan (B) proses peredaman radikal bebas oleh flavonoid (Yuhernita dan Juniarti 2011).

SIMPULAN
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa penentuan aktivitas antioksidan senyawa bahan alam dapat dilakukan dengan metode KLT dengan penyemprotan menggunakan larutan DPPH. Semakin tinggi aktivitas antioksidan suatu bahan, maka warna ungu larutan DPPH semakin memudar. Ekstrak metanol kunyit memiliki aktivitas yang paling tinggi, selanjutnya ekstrak daun salam dan yang terakhir adalah vitamin C (asam askorbat). Aktivitas antioksidan yang dimiliki oleh ekstrak daun salam maupun kunyit ini disebabkan adanya kandungan flavonoid dan kurkuminoid yang dapat menangkap radikal DPPH.

DAFTAR PUSTAKA
Araujo CAC, Leon LL. 2001. Biological activities of Curcuma longa L. Oswaldo Cruz, Rio de Janero. 96(5)723-728. Giorgi P. 2000. Flavonoid an antioxidant. Journal National Product (63): 10351045. Haris. 2006. Tanaman Minyak Atsiri. Jakarta: Penebar Swadaya.
Khopkar SM. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI-Press.

Kosasih EN, Tony S, dan Hendro H. 2006. Peran antioksidan pada lanjut usia. Jakarta: Pusat Kajian Nasional Masalah Lanjut Usia. Lestari TA. 2010. Profil kimiawi ekstrak ramuan kunyit, temulawak, dan meniran berdasarkan aktivitas antioksidan [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Nelson JL, Bernstein PS, Schmidt MC, Von Tress MS, dan Askew EW. 2003. Dietary modification and moderate antioxidant supplementation defferently affect serum carotenoids, antioxidants level and marker of oxidative stress in older humans. J. Nutr. 133: 3117-3123. Studiawan H. 2004. Uji aktivitas penurunan kadar glukosa darah ekstrak daun Eugenia polyantha pada mencit yang diinduksi dengan aloksan. Jurnal Penelitian Medika Eksata 5: 3. Yuhernita dan Juniarti. 2011. Analisis senyawa metabolit sekunder dari ekstrak metanol daun surian yang berpotensi sebagai antioksidan. Makara Sains 15(1): 48-52.

Ekstrak kunyit (Curcuma domestica

Vahl) mempunyai

aktivitas

antioksidan karena mengandung senyawa kurkuminoid, senyawa fenolik yang dapat menangkap radikal bebas sehingga dapat meredamnya. Kandungan utama kurkuminoid adalah kurkumin (diferuloilmetana), demetoksikurkumin

(hidroksisinamoil feruloilmetan), dan bisdemetoksikurkumin (hidroksisinamoil metana). Senyawa-senyawa tersebut berfungsi sebagai antioksidan, antimikroba, antikolesterol, antiHIV dan antitumor (Lestari 2010).

Gambar

Struktur senyawa kurkumin, demetoksikurkumin, bisdemetoksikurkumin (Lestyari 2010).

dan