APOSTILA DE AULAS PRTICAS

Carina Agostinho Rodrigues Hamilton R. F. Bavutti Roberto Ferraboli Srgio Mengardo

BIOQ1 - NORMAS DE BIOSSEGURANA E RECOMENDAES PARA AS AULAS PRTICAS NO LABORATRIO DE BIOQUMICA

01. Habitue-se a fazer o seu plano de experincia. Saiba o que vai fazer. Verifique se dispe do material necessrio. 02. Veja se no se esqueceu de vestir o seu avental de laboratrio. 03. No fume durante os trabalhos prticos. 04. Mantenha a bancada de trabalho limpa e em ordem durante as experincias. 05. Habitue-se ao trabalho de equipe. Respeite o trabalho do seu colega. 06. Comunique imediatamente ao professor qualquer acidente. E tenha calma. 07. Tenha muita pacincia e bom senso. 08. Manuseie cuidadosamente o material, principalmente aparelhos e vidraria. No mexa nos aparelhos sem antes aprender a us-los ou receber instrues para isso. 09. Quando ligar um aparelho eltrico, certifique-se antes que estar usando a tomada de voltagem certa para o mesmo. 10. Certifique-se bem, antes de usar qualquer substncia: leia o rtulo, veja se pegou o frasco certo. 11. No devolva reagente ao frasco inicial. Principalmente em se tratando de substncia P.A. ou titulada. Habitue-se a tirar o necessrio do frasco. 12. Economize reagentes. Eles so caros! 13. Nunca prove substncias diludas ou no, a menos que seja orientado para isso. 14. Se precisar cheirar substncias, tenha muita cautela: cheire devagar, abanando com a mo a boca do frasco ou recipiente. 15. Acautele-se com qualquer material quente, especialmente substncias qumicas. Espere que resfriem suficientemente para o manuseio seguro, ou use luvas ou garras especiais. 16. Nas pipetagens, muito cuidado! desejvel o uso de pipetadores automticos ou peras (consulte o professor). 17. No misture as pipetas e frascos em uso. Rotule-os sempre com fita adesiva, pincel atmico ou lpis vidrogrfico.

18. No jogue na pia materiais slidos ou corrosivos. 19. Nos experimentos de espectrofotometria limpe bem as celas e os filtros de luz com leno de papel. Cuidado para no arranh-los. Depois de limpos, cuidado com o manuseio, principalmente com as mos gordurosas. 20. Muito cuidado com os eletrodos dos medidores de pH. Eles so extremamente frgeis. 21. Ao trmino da prtica, lave devidamente a vidraria usada. Cada equipe ser responsvel pela ordem e limpeza do local de trabalho, pela devoluo em perfeito estado do material e equipamentos. 22. Use o seu caderno de laboratrio (ou caderno de protocolo) para anotar planos de trabalho, resultados experimentais, discusses, concluses, etc. No deixe para depois as anotaes: voc pode esquecer. 23. Analise os resultados de cada experimento aps o trmino. Procure tirar concluses.

BIOQ2 - PRINCIPAIS VIDRARIAS DO LABORATRIO

As atividades em um laboratrio exigem do aluno no apenas o conhecimento das vidrarias e aparelhos disponveis, mas tambm a forma correta de utilizao de cada um deles.

1. Balo de fundo chato para aquecimento ou reaes com liberao de gases. chato: 2. Erlenmeyer: usado em titulaes, aquecimento, dissoluo de substncias e realizao de reaes. 3. Becker (Becher): apropriado para reaes, dissoluo de substncias, precipitaes e aquecimento de lquidos. 4. Funil e funil analtico: o funil utilizado para filtrao. Para filtraes mais delicadas, em anlises quantitativas, emprega-se o funil analtico que s vezes, possui estrias internas e haste maior. 5. Tubo de ensaio: para reaes em pequena escala. Pode ser aquecido diretamente na chama do bico de Bunsen, desde que manuseado cuidadosamente. 6. Condensador: usado na destilao para liqefazer vapores.

7. Basto de Vidro ou bagueta: haste macia de vidro com que se agitam misturas, facilitando reaes. 8. Proveta: mede e transfere volumes de lquidos. No oferece grande preciso e no deve ser aquecida. 9. Pipeta graduada (a) e pipeta volumtrica (b): so utilizadas para medir com exatido e transferir pequenos volumes de lquido. 10. Bico de Bunsen: a principal fonte de aquecimento usada em laboratrio. 11. Cadinho: pode ser feito de quartzo, platina ou de porcelana. usado na calcinao

(prolongado aquecimento a seco) de substncias. Pode ser colocado em contato direto com a chama do bico de Bunsen e em muflas sob altas temperaturas.

12. Suporte universal: empregado para sustentao de peas. 13. Vareta de vidro: cilindro oco de vidro de baixo p.f. Interliga peas como bales, condensadores, erlenmeyers, etc. 14. Trip de ferro: utilizado com a tela de amianto para aquecimento. 15. Tela de amianto: protege peas submetidas a aquecimento distribuindo uniformemente o calor. 16. Anel ou argola: usado para sustentar o funil quando preso haste do suporte universal. 17. Pina simples: espcie de braadeira para prender certas peas (bureta, termmetro e etc, ao suporte universal. 18. Garra para condensador: outro tipo de braadeira para prender o condensador ou outro tipo de vidraria cilndrica haste do suporte universal.

19. Estante para tubos de ensaio: usada para alojar os tubos durante testes qualitativos. 20. Pina de madeira: usada para segurar tubos de ensaio em aquecimento. 21. Cpsula de porcelana: recipiente para evaporar lquidos temperatura ambiente ou submet-los a aquecimento. 22. Vidro de relgio: usado para evaporao ou como tampa em anlises gravimtricas, evitando contaminao ou perdas de amostra. 23. Bureta: usada para medir volumes com exatido em titulaes volumtricas. 24. Tringulo de porcelana: suporte para cadinhos de porcelana colocados em contato direto com a chama do bico de Bunsen durante operaes de calcinao ou carbonizao.

25. Almofariz e Pistilo: usados para triturar slidos. 26. Kitassato: compe a aparelhagem das filtraes a vcuo, onde sua sada lateral conectada a uma trompa de vcuo. 27. Funil de Buchner: adaptado ao kitassato, usado nas filtraes a vcuo. 28. Funil de separao, decantao ou de bromo: utilizado na separao de mistura de lquidos imiscveis. 29. Dessecador: nele se guardam substncias slidas previamente secas para evitar contato com a umidade atmosfrica.

30. Pina de Mohr (a) e de Hofmann (b): usadas para reduzir ou obstruir a passagem de gases ou Pina lquidos em tubos flexveis. 31. Pina metlica ou tenaz: para manipular objetos aquecidos. 32. Pisseta: frasco para lavagem de materiais ou amostras slidas durante filtrao por meio de jatos de gua, lcool ou outros solventes. 33. Furador de rolhas: jogo de furadores utilizado para fazer orifcios de diferentes dimetros em rolhas de cortia ou borracha. 34. Espalhador de chama: adaptado ao bico e Bunsen, produz chama larga, apropriada para dobrar varetas de vidro. 35. Trompa de vcuo: equipamento que, ligado torneira, faz suco nas filtraes a vcuo.

BIOQ3 ESCALA DE pH E VARIAO FRENTE ADIO DE CIDOS E BASES

INTRODUO O organismo dispes de trs importantes mecanismos reguladores do pH, que atuam em sincronia, com a finalidade de preservar as condies timas para as funes celulares. O mecanismo respiratrio, de ao rpida, o mecanismo renal, de ao lenta e o mecanismo qumico, de ao imediata, representado por pares de substncias chamados sistemas "tampo", que podem reagir com cidos ou com bases em excesso nos lquidos do organismo. SISTEMAS TAMPO Os tampes, denominao traduzida do original ingls "buffer" (amortecedor), so as substncias que limitam as variaes do pH do sangue e demais lquidos orgnicos, ao se combinarem com os cidos ou as bases que alcanam aqueles lquidos. As substncias que constituem os tampes agem aos pares ou, menos comumente, em grupos, constituindo um sistema protetor.

Um sistema tampo constitudo por um cido fraco e o seu sal, formado com uma base forte. O cido fraco e o sal do sistema tampo, em condies normais, existem em uma relao constante, que o organismo tende a preservar. Se gotejarmos continuamente cido clordrico em gua durante um intervalo de 90 minutos, verificamos que o pH da gua passa de 7 para 1,84. Se administrarmos proporcionalmente, a mesma quantidade de cido clordrico a um co no mesmo perodo de tempo, verificamos que o pH do sangue do animal passa de 7,44 para 7,14. A diferena de comportamento diante da mistura com o cido clordrico reflete a atuao dos sistemas tampo do plasma do animal, que impedem a variao mais acentuada do pH. O sistema tampo do bicarbonato e cido carbnico corresponde a cerca de 64% do total de tampes. Esse sistema essencial regulao do equilbrio cido-base, porque o metabolismo celular gera muito cido como produto final, sob a forma de cido carbnico. A Tabela 1 lista os sistemas tampo que existem no sangue (lquido intravascular), nos tecidos (lquido intersticial) e no interior das clulas (lquido intracelular).

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Tabela 1: Sistemas tampo do sangue.

Composio do Sistema Bicarbonato/cido Carbnico Hemoglobina/Oxihemoglobina Proteinas cidas/Proteinas bsicas Fosfato monocido/Fosfato dicido

Percentual 64% 28% 7% 1%

Quando um cido se acumula em maior quantidade no organismo, neutralizado no sangue, no lquido intersticial e no interior das clulas, em partes aproximadamente iguais, ou seja, 1/3 do cido neutralizado no sangue, 1/3 neutralizado no lquido intersticial e 1/3 no lquido intracelular. O processo intracelular mais lento e pode demorar cerca de duas horas, para compensar uma alterao.

Figura 1: Composio do principal sistema tampo do organismo. O sistema tampo bicarbonato/cido carbnico o mais importante na regulao do pH. O cido fraco do sistema o cido carbnico e a base forte o bicarbonato. A relao constante desse sistema tampo de 20:1, conforme representado na figura.

Quando um cido adicionado ao sangue, o bicarbonato do tampo prontamente reage com ele; a reao produz um sal, formado com o sdio do bicarbonato e cido carbnico. Essa reao diminui a quantidade de bases e altera a relao entre o bicarbonato e o cido carbnico. O cido carbnico produzido pela reao do bicarbonato do tampo, se dissocia em CO2 e gua; o CO2 eliminado nos pulmes, recompondo a relao de 20:1 do sistema protetor.Quando uma base invade o organismo, o cido carbnico prontamente reage com ela, produzindo bicarbonato e gua. O cido carbnico diminui. Os rins aumentam a eliminao de bicarbonato ao invs do on hidrognio, reduzindo a quantidade de bicarbonato no organismo, para preservar a relao do sistema tampo.

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Todos os sistemas tampo do organismo atuam da mesma forma que o sistema bicarbonato/cido carbnico. O sistema neutraliza o excesso de cidos ou de bases e em seguida o organismo tenta recompor a relao normal do tampo. O princpio fundamental da regulao do equilbrio cido-base a manuteno da relao constante entre o numerador e o denominador do sistema tampo. O bicarbonato total disponvel no organismo de aproximadamente 1.000 mEq, dos quais cerca de 450 mEq. esto imediatamente disponveis, distribuidos em 15 litros de lquido extracelular, sendo 3 litros de plasma e 12 litros de lquido intersticial. Nas alcaloses o organismo tolera a reduo dos ons hidrognio em cerca da metade do seu valor normal, at alcanar o pH incompatvel com a vida celular. Nas acidoses, o organismo tolera a elevao dos ons hidrognio 3 vezes acima do normal, at alcanar o pH incompatvel com a vida.

PARTE EXPERIMENTAL:

1.0) Preparo da escala colorimtrica de comparao: Procedimento: Montar os tubos de acordo com a tabela abaixo: Tubo Tampo pH 3,0 Tampo pH 4,0 Tampo pH 5,0 Tampo pH 6,0 Tampo pH 7,0 Tampo pH 8,0 Indicador Universal gua Destilada 1
1 mL 5gts 9 mL

2
1 mL 5gts 9 mL

3
1 mL 5gts 9 mL

4
1 mL 5gts 9 mL

5
1 mL 5gts 9 mL

6
1 mL 5gts 9 mL

Esta bateria de tubos servir para determinar o pH atravs da comparao das cores.

2.0) Determinao do pH Procedimento: Identificar os tubos de ensaio de 1 a 4. Completar os tubos conforme a tabela a seguir:

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Indicador Universal gua destilada Tampo Fostato 0,1N pH 7,0 Agitar os tubos.

Tubo 1 5 gotas 10 mL -

Tubo 2 5 gotas 8,0 mL 2,0 mL

Tubo 3 5 gotas 10 mL -

Tubo 4 5 gotas 8,0 mL 2,0 mL

NaOH 0,1 N

1 gota

1 gota

Agitar os tubos, observar, determinar o pH e explicar os resultados. Soprar com uma pipeta o ar expirado atravs da soluo do tubo 1 por 15 segundos. Determinar o pH comparando o tubo com a escala. Explicar. Soprar com uma pipeta ar expirado atravs da soluo do tubo 2 por 60 segundos. Determinar o pH comparando o tubo com a escala. Explicar. 2 gotas 2 gotas

HCl 0,1 N

Agitar os tubos, observar, determinar o pH e explicar os resultados. Continuar adicionando ao tubo 4 HCl 0,1 N, gota a gota, agitando sempre. Determinar quantas gotas so necessrias at que se obtenha a mesma colorao do tubo 3. Explicar.

Para os tcnicos:
Preparo do indicador universal: Segundo Bogen: Fenolftalena Vermelho de metila Dimetilaminoazobenzol Azul de bromotimol Azul de timol lcool absoluto q.s.p. 20 mg 40 mg 60 mg 80 mg 100 mg 100 mL

Dissolver e juntar soluo de NaOH 1N , gota a gota, at o desaparecimento da cor vermelha e substituio desta pela cor amarela. Se adicionar em excesso a soluo ficar azul, o que deve ser evitado.

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BIOQ4 - SISTEMA TAMPO

1. Titulao

Procedimento Adicionar cido e base gua destilada Colocar 20 mL de gua destilada em um Erlenmeyer e adicionar 2 gotas da soluo alcolica de fenolftalena a 1 %. Com auxlio de uma bureta, gotejar soluo de NaOH 0,1 N no Erlenmeyer at a viragem do indicador. Anotar o volume gasto. Colocar 20 mL de gua destilada em um Erlenmeyer e adicionar 2 gotas da soluo alcolica de fenolftalena a 1 %. Com auxlio de uma bureta, gotejar soluo de HCl 0,1 N no Erlenmeyer at a viragem do indicador. Anotar o volume gasto.

Adicionar cido e base soluo tampo fosfato de Sorensen pH 6,8 Colocar 20 mL da soluo tampo fosfato de Sorensen pH 6,8 em um Erlenmeyer e adicionar 2 gotas da soluo alcolica de fenolftalena a 1 %. Com auxlio de uma bureta, gotejar soluo de NaOH 0,1 N no Erlenmeyer at a viragem do indicador. Anotar o volume gasto. Colocar 20 mL da soluo tampo fosfato de Sorensen pH 6,8 em um Erlenmeyer e adicionar 2 gotas da soluo alcolica de fenolftalena a 1 %. Com auxlio de uma bureta, gotejar soluo de HCl 0,1 N no Erlenmeyer at a viragem do indicador. Anotar o volume gasto.

Obs: Ponto de viragem dos indicadores utilizados:

fenolftaleina = 8,2 < pH <10,0

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BIOQ5 CARACTERIZAO DE CARBOIDRATOS - Reao de Molisch Os carboidratos e algumas substncias, que se transformam em furfural ou seus derivados na presena de H2SO4, reagem com alta naftol, formando compostos de condensao, de cor violeta, e de estrutura incerta. Abaixo esto representadas as reaes de formao de furfural e de hidroximetilfurfural, respectivamente a partir de uma pentose e de uma hexose.

Procedimento experimental Preparar os seguintes 8 tubos de reao: Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 Amostra gua Glicose 1 % Frutose 1 % Sacarose 1 % Amido 0,1% Maltose 0,1% Aspartame 0,2% (*) Ciclamato/sacarina 1 % Volume mL 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Alfa-naftol 5% em etanol (gotas) 3 3 3 3 3 3 3 3 Resultado

Pela parede do tubo inclinado, adicionar lentamente, sem agitar, 1 mL de H2SO4 concentrado (CUIDADO CORROSIVO!!!). Anotar os resultados, usando o tubo 1 (branco, controle) como referncia. ( *) Aspartame = L aspartil-L fenilalanina metil ster.

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O teste de Molisch serve para identificar carboidratos. Estes, pela ao desidratante do cido sulfrico, transformam-se em furfural no caso de pentoses, ou hidroximetilfurfural no caso de hexose. Estes, por sua vez, reagem com os fenis (timol, natol), dando origem a um composto de cor roxa. A colorao verde que s vezes se forma, deve ser desprezada. Para o bom xito desta reao necessrio que o tubo esteja seco, e que haja a menor agitao possvel.

Para os tcnicos:
Preparo do reativo de Molisch: 5,0g de alfa-naftol em 100 ml de cido actico (CH3COOH) concentrado (95%).

Anotaes:

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BIOQ6 CARACTERIZAO DE CARBOIDRATOS - Reao de Seliwanoff Essa prtica segue os mesmos princpios tericos que embasam a reao de Molisch, onde h formao de furfural e hidroximetilfurfural (HMF). Como vimos, esses dois produtos, isoladamente, so incolores. Assim, adiciona-se um composto fenlico ao meio para que seja desenvolvida colorao visvel (nesse caso, vermelha). A reao de Seliwanoff s diferenciase da reao de Molisch nos reagentes utilizados: o cido que causar a desidratao do carboidrato o cido clordrico (HCl) e o fenol que reage como o furfural e HMF o resorcinol. O teste permite diferenciar aldoses de cetoses porque a reao com a cetose mais rpida e mais intensa. Isso porque a formao do furfural mais fcil que a formao do hidroximetilfurfural.

Figura: Representao das formas aldose e cetose.

Na presena de HCl, as cetoses, mais rapidamente do que as aldoses, formam derivados de furfural que se condensam com o reagente de Seliwanoff, que contm resorcinol (1,3 bezenodiol), produzindo compostos avermelhados. A reao exige aquecimento em banho fervente, e positiva tambm para sacarose que, nas condies do teste, hidrolisada em glicose e frutose. Mesmo a glicose pode dar reao positiva, se o aquecimento for prolongado, porque na presena de HCl, ocorre a sua transformao em frutose. A concentrao do HCl na reao no deve ultrapassar 12 % (aproximadamente 4 N).

A reao que ocorre a seguinte:

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Furfural Cetose Resorcinol Composto Violeta

Procedimento experimental Preparar 8 tubos de ensaio: Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 Amostra gua Glicose 2 % Lactose 2 % Sacarose 2 % Frutose 0,1 % Frutose 1 % Frutose 2% Frutose 5% Volume mL 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Reag. Seliwanoff mL 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 Resultado

Aps misturar o contedo dos tubos, colocar em banho de gua fervente, e acompanhar o desenvolvimento da cor a cada 2 ou 3 minutos, at no mximo 15 minutos. Quando notar o aparecimento da cor vermelha acompanhada ou no de precipitado de cor marrom avermelhado, retirar o tubo do banho. Para dissolver o precipitado eventualmente formado, acrescente algumas gotas de etanol absoluto, agitando o tubo. Anotar os resultados obtidos, lembrando-se sempre de usar o tubo 1 (controle) como referncia.

Para os tcnicos:

Preparo do reagente de Seliwanoff: dissolver 0,025 g de resorcinol em 50 mL de cido clordrico (HCl) concentrado. Completar o volume para 100 mL.

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BIOQ7 CARACTERIZAO DE CARBOIDRATOS - Reao de Bial Esta reao especifica para pentoses e serve para diferenciar as pentoses das hexoses. Pentoses quando aquecidas com HCl concentrado ou outro cido forte produzem furfural que se condensa com o orcinol. O produto resultante, em presena do sal frrico, adquire uma cor azul ou verde-azulada caracterstica. O teste de Bial uma reao colorida especifica para as pentoses (Figura 1). Em condies controladas as pentoses desidratam rapidamente transformando em furfural. Na presena do ion frrico, o orcinol e o furfural condensam-se rapidamente dando produto azul.

Figura 1: Reao da pentose com o cido forte (1. parte da reao)

O hidroximetilfurfural formando adequadamente como os furfurais.

partir

das

cetohexoses

no

reagem

bem

As aldohexoses desidratam muito mais vagarosamente que as pentoses.

Procedimento experimental Preparar 7 tubos de ensaio: Tubos 1 2 3 4 5 6 7 Amostra gua Glicose 5 % Frutose 5 % Sacarose 5 % Xilose 5 % Amido 5 % Goma arbica 5 % Volume mL 1 1 1 1 1 1 1 Reag. de Bial mL 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 Resultado

Aps misturar o contedo dos tubos, colocar em banho maria a 75oC e acompanhar o desenvolvimento da cor a cada 2 ou 3 minutos, at o aparecimento da cor azul esverdeada.

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Para os tcnicos:
Reativo de Bial: dissoluo de 3 g de orcinol em 1 litro de cido clordrico concentrado e adio de 3mL de uma soluo de FeCl3 a 1 % p/v.

Anotaes:

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BIOQ8 CARACTERIZAO DE CARBOIDRATOS - Reao de Benedict Utilizada para identificao de carboidratos redutores. ons de metais como, cobre, prata, ferro, mercrio, etc, so reduzidos por grupos aldedos ou cetnicos livres de vrios carboidratos. Colocando-se hidrxido de cobre II, Cu (OH)2, de cor azul, em meio alcalino, forma-se uma suspenso que, sob aquecimento, se precipita como xido de cobre II, CuO de cor preta. Mas se compostos redutores forem acrescentados suspenso, o Cu (OH)2 reduzido a Cu2O, que se precipita e cuja cor se situa entre o amarelo e o vermelho. As reaes abaixo mostram o que ocorre o Cu (OH)2 na presena e na ausncia de agentes redutores, em meio alcalino e a quente. Ausncia de composto redutor: Meio alcalino Cu(OH)2 (azul) Aquecimento CuO + (preto) H2O

Presena de composto redutor: Meio Alcalino Cu (OH)2 (azul) Aquecimento Cu2O (amarelo/vermelho) + H2O

A reao abaixo esquematiza o princpio da prova de Benedict, baseada na reduo de ons Cu2+ a Cu+, com formao de um precipitado vermelho ou amarelo:

OH livre no C anomrico (1)

No h OH livre nos Cs anomricos (1 e 2)

Glicose

Sacarose OH livre no C anomrico (1) OH livre no C anomrico (1)

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Ribose Lactose Nessa reao , o aparecimento de um precipitado de colorao vermelho-tijolo indica que os ons Cu2+ do reagente de Benedict foram reduzidos a Cu+, indicando a presena de um acar redutor. Como no prtico utilizar uma suspenso de Cu2+, e tambm para evitar que o CuO (preto) mascare o resultado da reao, acrescenta-se ao meio da reao um composto orgnico solubilizador que, em meio alcalino adequado, reage com os ons metlicos, formando um complexo inico solvel. Este complexo se dissocia em grau suficiente para que haja, nomeio da reao, ons metlicos disponveis para se reduzirem. No caso do reagente de Felihling, emprega-se CuSO4 2%, solubilizado por tartarato de Na+ e de K+ 10%, dissolvido em NaOH 2 M; no caso de reagente de Benedict (qualitativo), emprega-se CuSO4 2% solubilizado por citrato de Na+ 20%, dissolvidos em Na2CO3 2 M. Os testes de carboidratos redutores so positivos para compostos com grupamento OH glicosdico livre, mas negativos para polmeros de cadeias longas. Assim, amido no d reao positiva, a no ser aps a sua hidrlise, e a reao tanto mais positiva quanto maior a extenso da hidrlise. At alguns anos atrs, o teste de substncias redutoras, sobretudo na urina, era empregado no diagnstico de pacientes diabticos, ou suspeito de s-lo, de modo rotineiro. Atualmente, h testes mais sensveis para dosagem rpida de glicose, baseadas em ensaio enzimtico (glicofita/glicose-oxidase) e que so muitos mais prticos, por no exigirem a disponibilidade dos reagentes mencionados. Procedimento experimental Identificao de substncias redutores com reagentes de Benedict (qualitativo) Preparar 8 tubos de ensaio: Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 Amostra gua Glicose 0,1 % Glicose 0,2 % Glicose 1 % Glicose 5 % Amido 2 % Ovoalbumina 1 % Casena 1 % Volume mL 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Reagente de Benedict 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 Resultado

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Aquecer todos os tubos em banho de gua fervente , durante 5 minutos. Anotar os resultados obtidos (se positivo, numa escala de 1 a 4 cruzes, + a ++++), comparando com o tubo 1 (controle). Explique os resultados.

Para os tcnicos:
Reativo de Benedict: dissoluo de 173 g de Na3C6H5O7.2H2O citrato de sdio e 100 g de carbonato de sdio anidro em gua e diluio a cerca de 850 ml, adio a esta soluo de uma outra soluo preparada por dissoluo de 17,4 g de CuSO4.5H2O em 100 ml de gua e diluio a 1 litro. Anotaes:

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BIOQ9 CARACTERIZAO DE CARBOIDRATOS - Reao de Tollens Nesta atividade laboratorial explora-se a reduo do on prata (Ag+) a prata slida pela glicose, com a finalidade de produzir um espelho de prata. Para tal, comea-se por preparar o reagente de Tollens. O reagente de Tollens consiste numa soluo amoniacal de nitrato de prata obtida a partir de uma reao entre as solues de nitrato de prata e hidrxido de amnia com formao de xido de prata, que, por sua vez, reage com o amonaco originando o on complexo diaminoprata [Ag(NH3)2]+. O reativo de Tollens utilizado para identificar a presena de acares redutores. Os acares redutores produzem um precipitado de prata metlica nas paredes do frasco, formando um espelho de prata. As cetonas reagem mais fracamente com reativo de Tollens. As reaes que ocorrem na preparao no reagente de Tollens podem ser traduzidas pelas seguintes equaes qumicas:

O ction Ag+ reduzido pelo aldedo prata metlica. O aldedo oxidado a cido carboxlico.

Procedimento experimental Preparar 8 tubos de ensaio: Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 Amostra 1,0 mL de gua 1,0 mL de Glicose 2 % 1,0 mL de Frutose 2 % 1,0 mL de Sacarose 2 % 1,0 mL de Amido 2 % 1,0 mL de Lactose 2% 1,0 mL de Ovoalbumina 1 % 1,0- mL de Casena 1 % AgNO3 2% mL 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 NH4OH 5% mL 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Resultado

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Aquecer todos os tubos em banho de gua fervente , durante 5 minutos. Anotar os resultados obtidos. O resultado positivo surge como uma camada espelhada no interior do tubo de ensaio. Anotaes:

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BIOQ10 CARACTERIZAO DE CARBOIDRATOS - Reao de Barfed Atravs desta reao se distingue um monossacardeo de um dissacardeo, pela velocidade com que se forma Cu2O, a partir da reao entre acetato cprico e o carboidrato. O reativo de Barfoed oxida os monossacardeos (a mono-cidos) mais rapidamente que os dissacardeos permitindo, portanto, a diferenciao entre ambos (mono e dissacardeos). Cu+2 (aq) + CH3COO- (aq) + carboidrato

Cu2O (prec.) + CH3COO- (aq) + carboidrato oxidado

Procedimento experimental Preparar 8 tubos de ensaio: Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 Amostra Glicose 2 % Sacarose 2 % Maltose 2 % Lactose 2 % Frutose 2 % Xilose 2 % Ovoalbumina 1 % Casena 1 % Volume mL 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Reagente de Barfoed 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 Resultado

Aquecer os tubos de ensaio em banho de gua fervente atentando para a velocidade de formao de precipitado avermelhado em cada tubo.

Para os tcnicos:
Reativo de Barfoed: dissoluo de 66 g de CuC4H6O4 acetato de cobre (II) em 10 mL de cido actico glacial e e diluio em gua a 1 litro.

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BIOQ11 CARACTERIZAO DE CARBOIDRATOS - Reao de Fehling Os monossacardeos podem ser oxidados por agentes oxidantes relativamente suaves tais como os ons frrico e cprico . O carbono do grupo carbonila oxidado a cido carboxlico. A glicose e outros acares capazes de reduzir os on frrico ou cprico so chamados acares redutores. Esta propriedade til na anlise dos acares; ela base da reao de Fehling, um teste qualitativo para a presena de acares redutores.

Procedimento experimental Preparar 8 tubos de ensaio: Tubo Amostra Volume mL Reag. A Fehling mL 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Reag. B Fehling mL 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Resultado

1 2 3 4 5 6 7 8

Glicose 2 % Sacarose 2 % Maltose 2 % Lactose 2 % Frutose 2 % Xilose 2 % Ovoalbumina 1 % Casena 1 %

1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Aquecer aproximadamente cinco minutos, em banho-maria fervente. Observar. Explicar.

Para os tcnicos:
Reagente de Fehling A: 70 g de CuSO4.5H2O em 1 litro de gua. Reagente de Fehling B: 346 g de tartarato de sdio e potssio e 100 g de NaOH em 1 litro de gua.

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BIOQ12 EXTRAO E CARACTERIZAO DO AMIDO

OBJETIVOS Demonstrar a extrao e caracterizao do amido da batata. Identificar o amido como carboidrato. Evidenciar o amido atravs de reaes de precipitao e colorao. Verificar a atividade da -amilase na degradao do amido.

PRINCPIOS TERICOS Reao de Molisch: Os monossacardeos mais importantes so os formados por cinco ou seis tomos de carbono (pentoses e hexoses, respectivamente). Por serem molculas muito ricas em grupamentos hidroxila (-OH), os monossacardeos podem ser facilmente desidratados por ao de cidos fortes concentrados, como o cido sulfrico (H2SO4). O cido rompe facilmente as ligaes glicosdicas presentes em molculas de polissacardeos, quebrando-os e fornecendo seus monossacardeos. Esses, por sua vez, so desidratados e podemos ter como produto: o furfural, quando o monossacardeo desidratado for uma pentose, e o hidroximetilfurfural (HMF), quando for uma hexose. Tanto o furfural quanto o HMF so substncias incolores, impedindo que a reao seja visualizada. Para resolver esse problema, adiciona-se um composto fenlico ao meio (naftol, conhecido como reativo de Molisch). O fenol reage como os produtos incolores, e provoca o aparecimento de um anel de colorao lils.

Reao de Benedict: Alguns carboidratos possuem um grupamento -OH (hidroxila) livre no carbono funcional (anomrico) de suas molculas, enquanto outros no. Observa-se que os acares que apresentam a hidroxila livre no C anomrico so bons agentes redutores. Por esse motivo a extremidade que contm o -OH passa a ser chamada extremidade redutora e o

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acar, de acar redutor. A capacidade que esses compostos apresentam de reduzir ons metlicos em solues alcalinas um bom mtodo de identificao desses compostos. A reao abaixo esquematiza o princpio da prova de Benedict, baseada na reduo de ons Cu2+ a Cu+, com formao de um precipitado vermelho ou amarelo:

OH livre no C anomrico (1)

No h OH livre nos Cs anomricos (1 e 2)

Glicose

Sacarose OH livre no C anomrico (1) OH livre no C anomrico (1)

Ribose Lactose Nessa reao , o aparecimento de um precipitado de colorao vermelho-tijolo indica que os ons Cu2+ do reagente de Benedict foram reduzidos a Cu+, indicando a presena de um acar redutor.

Procedimentos: Tcnica para extrao do amido: Raspar 1/2 batata com faca e transferir as raspas para um bquer de 250 mL. Adicionar 100 mL de gua destilada e agitar vigorosamente com um basto de vidro. Filtrar o material atravs de uma gaze, recolhendo o filtrado para um bquer de 250 mL e espremer

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delicadamente a gaze. Deixar em repouso por 10 minutos e, a seguir, remover cuidadosamente o lquido sobrenadante, ficando com o depsito.

Preparo de soluo de amido para trabalho: Diluir o depsito que ficou no bquer com aproximadamente 20 a 30 mL de gua, deixando uma soluo branco opalescente.

Reao com lugol: Pegar dois tubos de ensaio. Em um tubo pipetar 2 mL de gua e em outro tubo pipetar 2 mL da soluo de amido. Aos dois tubos adicionar 2 gotas de lugol. Observar a colorao aparente dos tubos. Aquecer o tubo com amido e observar a colorao. Resfriar novamente sob gua corrente e observar a colorao.

Reao de Molisch: Pegar dois tubos de ensaio. Em um tubo pipetar 2 mL de gua e em outro tubo

pipetar 2 mL da soluo de amido. Aos dois tubos adicionar 3 gotas do reativo de Molish e misturar. Inclinar os tubos e deixar escorrer pela parede 1 mL de cido sulfrico concentrado em cada um dos tubos, com o cuidado para que os lquidos no se misturem. Observar a colorao na interfase dos lquidos. Atividade da -amilase: Coletar a saliva dos alunos do grupo em copinhos plsticos at completar 2 mL de volume de saliva. Pegar 3 tubos e numer-los de 1 a 3. Adicionar a cada um dos 3 tubos 2 mL da soluo de amido. Ao primeiro tubo adicionar 1 mL de saliva, ao segundo tubo adicionar 1 mL de saliva e ao terceiro tubo adicionar 1 mL de gua. Incubar os 3 tubos em banho maria a 35 - 36,5 oC por 10 minutos. Aps os 10 minutos retirar os tubos do banho maria. Continuando o experimento, no tubo nmero 1 goteje 2 gotas de lugol e anote a colorao. Compare com o tubo da reao com lugol feita anteriormente.

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Com os tubos 2 e 3 realizar o experimento a seguir. Reao de Benedict: Pegar os dois tubos que sobraram da reao anterior (2 e 3). Adicionar aos dois tubos 2 mL de reagente de Benedict. Levar ao banho maria fervente por 2 minutos. Observar a colorao resultante.

Para os tcnicos:
Preparo do reativo de Molisch: 5,0g de alfa-naftol em 100 ml de cido actico (CH3COOH) concentrado (95%). Preparo do reativo de Benedict: inicialmente, devem ser preparadas duas solues, em separado, a saber: Soluo A
173g de citrato de sdio (Na3C6H5O7.2H2O)*** 90 g de carbonato de sdio (Na2CO3) 600 ml de gua destilada quente (~80C)

*** O on Cu2+ tambm reage com o meio alcalino, segundo o esquema abaixo:

Para evitar que essa reao acontea, mascarando o teste para acares redutores, adicionado o citrato de sdio, que mantm o Cu2+ em soluo, atravs da formao de um complexo.

Soluo B - Soluo 17,3% de sulfato de cobre (CuSO4) em gua destilada. Dissolver por agitao. Para preparar o regente de Benedict, coloque a soluo A em um balo volumtrico de 1000ml; em seguida, adicione a soluo B sob agitao constante e complete o volume com gua destilada.

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BIOQ13 CARACTERIZAO DE LIPDEOS - Reao de Saponificao, ndice de Iodo OBJETIVOS: Pesquisar a presena de ligaes do tipo ster nas molculas dos leos e gorduras; Conhecer a reao de produo de sabo a partir de leos e gorduras; Pesquisar o comportamento dos sabes em solues aquosas contendo ou no leos e gorduras; Reconhecer as caractersticas de uma emulso e sua importncia na produo de alimentos. Pesquisar a presena de insaturaes nas molculas dos leos e gorduras.

PRINCPIOS TERICOS Saponificao: Dentre os lipdeos mais abundantes na natureza encontramos os leos e as gorduras. Essas substncias so formadas a partir da associao de uma molcula de glicerol com trs unidades de cidos graxos (AG). Por esse motivo, os leos e as gorduras so steres de glicerol ou, ainda, triglicerdeos (TG) e triacilglicerdeos.

Se os triglicerdeos so formados por cido graxos, fcil concluir que o processo inverso, a hidrlise de um TG origina uma mistura de cidos graxos. A hidrlise do leo de soja, por exemplo fornece uma mistura de diferentes cidos graxos:
CIDO GRAXO cido mirstico (C14:0) cido palmtico (C16:0) cido esterico (C18:0) cido olico (C18:1 9) cido linolico (C18:2 6) cido linolnico (C18:3 3) cido araqudico (C20:0) % 0,1 10,5 3,2 22,3 54,5 8,3 1,1

Uma maneira de conseguir a "quebra" da molcula do TG em seus cidos graxos atravs do tratamento com solues alcalinas concentradas a quente. Essa reao tem como resultado a liberao do glicerol e formao de sais de cidos graxos, originados pela incorporao do sdio molcula de cido graxo. Esses sais so os SABES e a reao, que

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denominada

SAPONIFICAO,

via

de

fabricao

dos

sabes

encontrados

comercialmente.

O exemplo anterior demonstra a formao de um sal de sdio. Os sabes constitudos por sais de sdio (Na+) e de potssio (K+) so solveis. Em contrapartida, os sais de clcio (Ca2+) e magnsio (Mg2+), formados a partir da reao do lipdeo com Ca(OH)2 e Mg(OH)2, respectivamente, so insolveis e precipitam. A precipitao muito til no processo de purificao dos sabes e tambm pode ser feita por adio de cido forte (como o HCl) ou NaCl. Qual a importncia dos sabes para a nossa vida diria?? Se observarmos bem molcula de uma sabo, veremos que ela constituda por duas pores que apresentam caractersticas distintas:

Por ser formada por ons, a extremidade carboxlica do sabo altamente polar e, por esse motivo, tende a se dissolver em gua. Podemos dizer que essa poro da molcula possui carter hidroflico (que significa vido por gua). Em contrapartida, a longa cadeia carbnica (a unidade -CH2 se repete 14 vezes!!!) apresenta acentuado carter apolar, sendo denominada poro hidrofbica da molcula (hidrofbico significa "avesso" gua). A essas molculas, que apresentam carter hidroflico e hidrofbico, polar e apolar, ao mesmo tempo, d-se o nome de anfteras. Elas podem ser representadas da seguinte forma:

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Quando um sabo entra em contato com a gua, as pores hidrofbicas de suas molculas assumem uma conformao que as protege do contato com as molculas de gua (altamente polares). A essa conformao d-se o nome de MICELA. As molculas que apresentam carter anftero, ento, podem interagir

simultaneamente com a gua e com substncias de carter hidrofbico, como as gorduras e os leos. ndice de Iodo: Os cidos graxos (AG) insaturados podem fixar oxignio, hidrognio e halognios nas suas duplas ligaes, atravs de uma reao de adio, conforme demonstra o esquema abaixo:

Hidrogenao

Halogenao

Essa reao pode ser visualizada utilizando-se o amido como indicador da presena de iodo livre em soluo. O iodo ligado ao cido graxo incapaz de reagir com o amido. ATENO: esse teste deve ser realizado com cuidado, pois a adio de uma quantidade de iodo que ultrapasse a capacidade de fixao pelo cido graxo insaturado levar a iodo livre em soluo, podendo ocasionar interpretao errnea.

Procedimento Experimental Reao de Saponificao 1. Colocar, em um bquer pequeno de 100 mL, 2 ml de leo de soja; 2. Adicionar 10 ml da soluo alcolica de NaOH 10%;

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3. Aquecer em banho a 80oC at que a fase lquida desaparea e seja formada uma camada levemente endurecida; 4. Acrescentar 20ml de gua destilada e agitar at a completa dissoluo do sabo (talvez seja preciso aquecer levemente a mistura). 5. Observe e anote os resultados.

Formao de sabo insolvel

1. Numerar trs tubos de ensaio e proceder de acordo com a tabela abaixo:

TUBO 1 soluo de sabo* soluo de NaCl 35% soluo de HCl 0,1 N soluo de CaCl2 10% 2 ml 5 gotas -

TUBO 2 2 ml 5 gotas -

TUBO 3 2 ml 5 gotas

2. * Se necessrio, leve a mistura (sabo) obtida na reao anterior novamente ao banhomaria para dissoluo. 3. Misturar por agitao e deixar em repouso por alguns minutos; 4. Observe os resultados.

Estabilizao de uma emulso: 1. Numerar dois tubos de ensaio e proceder de acordo com a tabela abaixo: TUBO 1 0,5 ml 10 ml TUBO 2 0,5 ml 10 ml

leo de soja gua destilada soluo de sabo

2. Agitar vigorosamente os tubos por inverso; 3. Observe os resultados imediatamente; 4. Deixar em repouso por 10 minutos e anotar os resultados.

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Pesquisa de insaturaes: 1. Numerar dois tubos de ensaio e proceder de acordo com o que segue:

(1) 5 mL de leo de soja (2) 5 mL de manteiga fundida

2. Adicionar 10 gotas de lugol a cada tubo; 3. Ferver os tubos em banho-maria at o desaparecimento da colorao provocada pelo lugol; 4. Aps resfriamento a temperatura ambiente, adicionar 3 gotas de soluo de amido 1% a cada tubo; 5. Observar os resultados. 6. Se desejar, adicione mais algumas gotas de lugol, como contraprova; 7. Anote suas observaes. Como a pesquisa de insaturaes baseada numa reao que envolve a formao de compostos coloridos, a disponibilidade de um espectrofotmetro permite conhecer a quantidade de insaturaes que um determinado leo ou gordura possui. Assim, tambm possvel falar de ndice de Iodo (I.I), que corresponde massa de iodo absorvida por 100 partes (em massa) de leo ou gordura. Mas qual a importncia do ndice de Iodo (I.I)? Atravs dele podemos: - Determinao do teor de cidos graxos insaturados. - Medida da susceptibilidade rancidez oxidativa. - Controlar o processo de hidrogenao. - Verificar adulterao no leo / gordura.

Para os tcnicos:

Preparo da soluo alcolica de NaOH a 10%: dissolver 100g de NaOH em uma quantidade mnima de gua destilada. Em seguida, adicionar etanol (CH3CH2OH) 95% at completar o volume de 100ml.

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Preparo da soluo de amido a 1%:

Como o amido de difcil dissoluo, proceder ao

preparo dessa soluo da seguinte maneira: misturar 1 g de amido com 10 ml de gua. Derramar a pasta em um recipiente que contenha 100 ml de gua fervente. Cessar a ebulio e deixar esfriar e sedimentar. Separar e pegar a parte sobrenadante (sem grumos) por decantao. A soluo ganha maior estabilidade se for adicionada de 1g de cido saliclico (1%).

Preparo do lugol: 5 g de iodo + 10 g de iodeto de potssio (KI). Completar o volume para 100 ml com gua destilada. Diluir 1:10 no momento da utilizao. Anotaes:

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BIOQ14 - EXTRAO E CARACTERIZAO DE COLESTEROL DE GEMA DE OVO UTILIZANDO MTODO DE LIEBERMANN-BURCHARD

OBJETIVO Determinar a presena de colesterol na gema de ovos e discorrer sobre a importncia de se evitar o excesso de consumo de colesterol proveniente da alimentao.

INTRODUO O colesterol um tipo de lipdeo (Figura 1) encontrado naturalmente em nosso organismo, fundamental para o seu funcionamento normal. O colesterol o componente estrutural das membranas celulares em todo nosso corpo e est presente no crebro, nervos, msculos, pele, fgado, intestinos e corao. Nosso corpo usa o colesterol para produzir vrios hormnios, vitamina D e cidos biliares que ajudam na digesto das gorduras. 70% do colesterol fabricado pelo nosso prprio organismo, no fgado, enquanto que os outros 30% vm da dieta.

Figura 1: Estrutura do colesterol

Por que importante entender o colesterol? Quando em excesso (hipercolesterolemia), o colesterol pode se depositar nas paredes das artrias, que so os vasos que levam sangue para os rgos e tecidos, determinando um processo conhecido com arteriosclerose. Se esse depsito ocorre nas artrias coronrias,

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pode ocorrer angina (dor no peito) e infarto do miocrdio. Se ocorre nas artrias cerebrais pode provocar acidente vascular cerebral. Portanto o colesterol alto um fator de risco para o desenvolvimento de doenas cardiovasculares. O COLESTEROL E OS ALIMENTOS O colesterol do organismo tem duas origens: a produo endgena do seu prprio corpo e o colesterol proveniente da alimentao. O corpo produz colesterol no fgado e esse colesterol produzido capaz de suprir quase toda necessidade do organismo. O restante necessrio deve ser proveniente do que voc come. O colesterol est presente em carnes, leites e derivados, manteiga e gema de ovo. Comer muitos alimentos com colesterol pode fazer seus nveis de colesterol no corpo subirem, o que conhecido por hipercolesterolemia. Frutas, vegetais, e cereais no tem colesterol. No entanto, alguns alimentos que no contm colesterol podem conter gorduras trans, que fazem o seu corpo produzir mais colesterol. Alimentos com gorduras saturadas tambm fazem o seu corpo produzir mais colesterol. Mtodo de Liebermann-Burchard A reao se processa quando o cido sulfrico concentrado adicionado uma soluo de colesterol em anidrido actico. As cores produzidas variam do vermelho ao violeta e ao azul esverdeado. A cor esverdeada devida a formao de um derivado sulfnico do colesterol (Figura 2).

Figura 2: Formao do derivado sulfnico na reao de Liebermann-Burchard. PARTE EXPERIMENTAL

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Extrao do colesterol da gema do ovo: Colocar a gema do ovo num bquer com capacidade para 200 mL e adicionar 50 mL de uma mistura 1:1 de ter e clorofrmio. Agitar com um basto de vidro por cerca de 3 minutos e filtrar em aparato prprio. Identificao do colesterol pelo mtodo de Liebermann-Burchard: Preparar os tubos da tabela a seguir: Tubo 1 Quantidades 2 mL de soluo clorofrmica de colesterol extrado da gema do ovo Reag. Cromognico 5 gotas de anidrido actico + 1 gota de cido sulfrico 2 2 mL de soluo clorofrmica de triglicerdeos 5 gotas de anidrido actico + 1 gota de cido sulfrico 3 2 mL de soluo clorofrmica de amido 5 gotas de anidrido actico + 1 gota de cido sulfrico 4 2 mL de soluo clorofrmica de glicose 5 gotas de anidrido actico + 1 gota de cido sulfrico

Levar todos os tubos para aquecer em Banho Maria a 37oC por 20 minutos.

Para os tcnicos:

Materiais (POR BANCADA) 05 tubos de ensaio Estante para tubos de ensaio 2 bqueres de 200 mL de capacidade 1 basto de vidro 1 suporte com funil

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soluo de leo de soja 50 ml/100 mL cido actico glacial soluo de amido 50 mg/100 mL cido actico glacial soluo de glicose 50 mg/100 mL cido actico glacial Anidrido actico com pipeta de vidro cido sulfrico com pipeta de vidro Pipetadores automticos de 1 mL Ponteiras azuis

Material (GERAL) Gaze

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BIOQ15 - CARACTERIZAO DE AMINOCIDOS E PROTENAS - Reao da Ninhidrina -

OBJETIVO Com estes testes pretende-se observar reaes caracteristicamente coradas devido presena de certos grupos qumicos nos aminocidos e existncia de ligaes peptdicas nas protenas.

INTRODUO

As protenas podem desdobrar-se por hidrlise em aproximadamente 20 aminocidos. Utilizando reagentes que coram aminocidos de modo caracterstico possvel identificar a presena de alguns desses aminocidos.

Os aminocidos apresentam todas as reaes qumicas caractersticas de compostos que possuem grupos amina e carboxila (Fig. 1), mas isso deixa de acontecer, no entanto, quando os aminocidos se unem por ligaes peptdicas (Fig. 2).

Figura 1: Frmula geral de um aminocido

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Figura 2: Ligao peptdica

As protenas so polipeptdios constitudos por cinquenta ou mais resduos de L-aminocidos, sendo constituintes fundamentais da clula onde desempenham funes diversas.

Podem ser caracterizadas a diferentes nveis. Fisicamente podem ser, globulares (se solveis na gua) ou fibrosas (se insolveis na gua). Podem ser classificadas

estruturalmente como primrias, secundrias, tercirias ou quaternrias. Quanto ao seu estado de associao podem ser consideradas conjugadas se estiverem associadas a substncias no proticas, ou simples se no estiverem associadas a essas substncias no proticas.

O fato de a maioria das protenas ser solvel em gua poder ser atribudo s interaes que se estabelecem entre as molculas de gua e os grupos polares e/ou ionizados das molculas proticas. Qualquer agente que altere a constante dieltrica ou fora inica de uma soluo aquosa influencia a solubilidade das protenas, resultando na precipitao quando as foras de atrao protena-gua so excedidas pelas foras de coeso entre as diferentes molculas proticas.

No intuito de caracterizar aminocidos e protenas podem realizar-se vrias reaes coradas.

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A reao da ninhidrina usada na deteco de aminocidos por ser caracterstica da funo amina primria. A ninhidrina (Fig. 3) um poderoso agente oxidante que reage com

-aminocidos, entre pH 4 e 8, originando um composto prpura, que no apresenta sempre

a mesma intensidade de colorao.

Figura 3: Complexo formado na reao da ninhidrina.

PARTE EXPERIMENTAL Reao da ninhidrina Procedimento: Identificar os 5 tubos de ensaio. Adicionar 2,0 mL de gua destilada no tubo 1; 2,0 mL de soluo de glicina 0,1% no tubo 2; 2,0 mL de soluo de casena 2,0 % no tubo 3; 2,0 mL de soluo de fenilalanina 0,1 % no tubo 4; e, 2,0 mL de soluo de glicose 1 % no tubo 5. Acrescentar em cada tubo de 5 a 10 gotas de soluo de ninhidrina 0,2 % em acetona. Aquecer em Banho-Maria 60C, se necessrio. Observar as cores formadas e anotar os resultados.

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Materiais (POR BANCADA) 12 tubos de ensaio Estante para tubos de ensaio Soluo de glicose a 1 % Soluo de fenilalanina 0,1 % Soluo de glicina a 0,1 % Soluo de gelatina a 1,0 % Soluo de casena a 2,0 % Soluo de ovoalbumina a 2,0 % Soluo de ninhidrina 0,2 % em acetona (10 mL) em frasco conta-gotas.

BANCADA GERAL: Banho Maria a 60oC 200 mL Leite Tubos excedentes

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BIOQ16 - CARACTERIZAO DE AMINOCIDOS E PROTENAS - Reao de Biureto No que se refere reao do Biureto (Fig. 1) este detecta a presena de ligaes peptdicas. Os compostos com duas ou mais ligaes peptdicas tomam uma colorao violeta, devido ao complexo entre cada on de cobre e quatro tomos de nitrognio (dois de cada ligao). A intensidade da cor varia com a concentrao de protenas.

Figura 1: Complexo formado na reao do biureto.

As protenas na sua forma natural so chamadas de nativas. Qualquer alterao na sua estrutura original designa-se de desnaturao. Esta pode ocorrer com uma extenso varivel, e se resultar numa alterao profunda de configurao haver perda da sua atividade pois a funo de uma protena depende das suas caractersticas conformacionais especficas. Reao do biureto Procedimento: Identificar os tubos Adicionar 1 mL de soluo de glicina a 0,1 % no tubo 1, 1 mL soluo de gelatina a 1,0 % no tubo 2, 1 mL de soluo de casena a 2,0 % no tubo 3, 1 mL de Leite no tubo 4, 1 mL de soluo de ovoalbumina a 2,0 % no tubo 5. Acrescentar em cada tubo 1 mL do reagente de biureto, agitando continuamente. Observar aps alguns minutos. Explicar.

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BIOQ17 CARACTERIZAO DE AMINOCIDOS - Reao XantoproticaOBJETIVO Caracterizar os aminocidos aromticos. INTRODUO O benzeno reage lentamente com o cido ntrico (HNO3) concentrado para dar o nitrobenzeno. Essa reao pode ser acelerada mediante aquecimento. Assim, aminocidos que apresentem anel benznico em sua cadeia lateral (assim como protenas ou peptdeos que possuam esses aminocidos em sua constituio) podem reagir com o cido ntrico originando um composto amarelo.

Figura 1: Alguns aminocidos aromticos.

Observao: a colorao amarela existe em meio cido. Se deixarmos o meio mais alcalino, ser observada uma colorao vermelho-alaranjada.

Figura 2: Desenvolvimento da reao xantoprotica.

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PARTE EXPERIMENTAL - Numerar os tubos de ensaio e preparar a seguinte bateria: (1) (2) (3) (4) (5) (6) 2 2 2 2 2 2 mL mL mL mL mL mL da da da da da de soluo soluo soluo soluo soluo soluo de ovoalbumina 2% de fenilalanina 1% de tirosina 1% de triptofano 1% de glicina 1% problema

- A cada tubo de ensaio adicionar 10 gotas de cido ntrico (HNO3) concentrado. - Ferver, com cuidado, por dois minutos em banho-maria 80 oC; - Aps esfriar, adicione, gota a gota, 2 mL da soluo de NaOH 12M; - Misture, observe e anote os resultados. O desenvolvimento de colorao amarela em meio cido e vermelho-alaranjada em meio alcalino indica que os aminocidos da amostra apresentam o anel benznico em sua estrutura.

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BIOQ18 REAES DE PRECIPITAO DE PROTENAS

OBJETIVO Caracterizar a estrutura tridimensional das protenas. INTRODUO As protenas possuem uma estrutura tridimensional bem definida que est relacionada com suas propriedades fsicas e biolgicas. A modificao na estrutura tridimensional nativa de uma protena, com a conseqente alterao de suas propriedades conhecida como desnaturao. A desnaturao envolve alteraes nas estruturas quaternria, terciria e secundria de protenas, mas no da primria.

Figura 1: Estrutura tridimensional de uma enzima, a hexoquinase.

A desnaturao, usualmente decresce a solubilidade das protenas. A diminuio da solubilidade pode ser explicada pela exposio de radicais hidrofbicos e outros que prejudiquem a interao protena-gua e favoream a interao protena-protena. A desnaturao o evento primrio e importante. A floculao e a coagulao, que muitas vezes so confundidos com desnaturao de protenas, so simplesmente manifestaes visveis das alteraes estruturais causadas pelos agentes desnaturantes.

Existem vrios agentes desnaturantes de protenas, tais como: calor, cidos, lcalis, solventes orgnicos, solues concentradas de uria e guanidina, detergentes, sais de metais pesados, etc.

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Entre as alteraes que se observam em decorrncia da desnaturao protica, podese citar: diminuio da solubilidade, perda de atividade biolgica (por exemplo, da ao enzimtica, da ao hormonal), aumento da reatividade de radicais da cadeia polipeptdica, alteraes na viscosidade e coeficiente de sedimentao, etc.

As precipitaes, alm de serem utilizadas para caraterizar a presena de protenas em soluo, tambm so teis para proceder a desprotenizao de lquidos biolgicos para anlise de componentes no proticos.

01) Precipitao por Ao do Calor

A estrutura terciria de uma protena mantida por interaes hidrofbicas entre os radicais apolares que se abrigam no meio aquoso, procurando se agruparem no interior do glbulo protico, pelas atraes inicas entre os radicais carregados com cargas opostas, pelas pontes dissulfeto, pontes de hidrognio, interaes hidrofbicas ou ainda pelas Foras de Van der Waals.

Ao fornecer energia a um meio aquoso contendo protenas, atraes entre os radicais so desfeitas e a protena "desenrolada", expondo, ao meio aquoso seus radicais apolares que estavam contidos no seu interior. Isto que leva desnaturao.

02) Precipitao por reao com os reagentes para alcalides

Determinados agentes, como os reagentes para alcalides podem ser usados na precipitao de protenas, o que til na desproteinizao de materiais biolgicos, como o sangue: nions de cidos complexos (tricloroactico, tnico, fosfotngstico) formam sais insolveis onde a protena funciona como ction.

03) Precipitao por Reao com Sais de Metais Pesados

A adio de sais de metais pesados, tais como mercrio, chumbo, cobre e zinco, levam formao de sais denominados "quelatos" entre os aminocidos cidos e estes metais. A protena precipita porque estes sais so insolveis em gua e tambm porque, com a quebra das ligaes inicas, os aminocidos hidrofbicos ficam mais expostos ao meio aquoso.

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04) Precipitao por Ao de Solventes Orgnicos

A adio de solventes orgnicos, como o etanol, ter etlico e acetona, s solues aquosas de protenas pode levar precipitao das mesmas. Isto pode ser explicado pelo fato destes solventes apresentarem uma constante dieltrica inferior da gua. Solventes orgnicos em baixas temperaturas (0 C ou menos) so teis para a separao de misturas proticas, porque as protenas podem ser precipitadas sem sofrerem desnaturao.

Entretanto, a temperatura mais elevada, os solventes orgnicos podem levar desnaturao por romperem pontes de hidrognio e interaes apolares, importantes na manuteno da conformao protica.

A gua tem uma alta constante dieltrica, assim a fora de atrao entre molculas proticas contendo radicais com cargas opostas baixa, predominando a interao protenagua em vez da interao protena-protena. A adio de solventes, pode inverter esta situao, levando agregao e precipitao das molculas proticas.

05) Solubilizao (Salting In)

A capacidade dos sais neutros de influenciar a solubilidade das protenas, uma funo de sua fora inica, que tanto depende de sua concentrao como na valncia de ctions e nions que formam o sal.

Em concentrao reduzida, os sais aumentam a solubilidade de muitas protenas, um fenmeno denominado salting-in, provavelmente devido interao da protena com os sais causando diminuio da interao protena-protena e, portanto, aumentando a solubilidade.

06) Precipitao (Salting Out)

As protenas podem ser precipitadas sem sofrer desnaturao por ao de solventes orgnicos, como foi explicado anteriormente, variao do pH e por alteraes da fora inica do meio. A variao do pH pode ser usada para precipitar protenas no seu ponto isoeltrico,

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pH no qual a repulso eletrosttica entre as molculas mnima. Este efeito denominado de salting- out.

As protenas podem ser ressolubilizadas mantendo as suas caractersticas estruturais nativas por uma variao de pH acima ou abaixo do ponto isoeltrico.

PARTE EXPERIMENTAL

Reaes de precipitao de protenas com desnaturao

01) Reao de precipitao por aquecimento

Preparar os 3 tubos de ensaio a seguir:

TUBO 1 - 2 mL de soluo de ovoalbumina 10 % TUBO 2 - 2 mL de glicose 5% TUBO 3 - 1 ponta de esptula de ovoalbumina em p.

Aquecer os tubos de ensaio, um a um, diretamente na chama e observar os resultados.

02) Reao de precipitao com reagentes para alcalides

Preparar os 3 tubos de ensaio a seguir:

TUBO 1 - 2 mL de soluo de ovoalbumina 10 % TUBO 2 - 2 mL de glicose 5% TUBO 3 - 2 mL de soluo de casena 0,5%

Adicionar a cada um dos tubos, 1 mL de cido tricloroactico (TCA) a 10%. Agitar brevemente e deixar os tubos em repouso. Observar.

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03) Reao de precipitao com sais de metais pesados

Preparar os 3 tubos de ensaio a seguir:

TUBO 1 - 2 mL de soluo de ovoalbumina 10 % TUBO 2 - 2 mL de glicose 5% TUBO 3 - 2 mL de soluo de casena 0,5%

Adicionar 1ml de acetato de chumbo a 5% a cada tubo de ensaio. Observar.

04) Reao de precipitao por ao de solventes orgnicos

Preparar os 3 tubos de ensaio a seguir:

TUBO 1 - 2 mL de soluo de ovoalbumina 10 % TUBO 2 - 2 mL de glicose 5% TUBO 3 - 2 mL de soluo de casena 0,5%

Adicionar 2 mL de lcool etlico a cada tubo de ensaio. Observar. Se necessrio refazer os tubos e adicionar 2 mL de xilol a cada tubo. Observar.

05) Efeito da fora inica sobre a solubilidade da ovoglobulina - Salting in

Colocar 5 mL de soluo de ovoalbumina 10% juntamente com 2 mL de gua destilada em um bquer pequeno. Agitar esta soluo com um basto de vidro at o aparecimento de um precipitado .

Em seguida adicionar soluo de cloreto de sdio 2% cerca de 2 mL - at redissoluo do precipitado.

06) Salting out

Com o auxlio de uma pipeta adicionar 2mL da soluo anterior (salting in) em um tubo de ensaio. Posteriormente, acrescentar 2 mL de soluo saturada de sulfato de amnio (NH4)2SO4 at a percepo de um precipitado de protenas. Ento juntar 4 a 6 mL de gua destilada e observar os resultados.

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MATERIAL

a) Reagentes: Soluo de ovoalbumina 10% em gua. Soluo de casena 0,5 % em gua. Soluo de glicose 5% em gua. Ovoalbumina em p. cido tricloroactico 10%. Acetato de chumbo 5%. lcool etlico. Xilol. Cloreto de sdio 2%. Soluo saturada de (NH4)2SO4 (Sulfato de amnio).

b) Equipamentos e vidrarias (por bancada) - Estante para tubos de ensaio com 12 tubos de 15 cm - Tubos de ensaio para reposio - Basto de vidro - Pipetador automtico de 1 mL - Ponteiras azuis - Bicos de Bunsen conectados ao gs - Caixa de fsforos - Bquer de 50 a 100 mL de capacidade

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BIOQ19 - CURVA DE TITULAO DE AMINOCIDOS - GLICINA

OBJETIVO Identificao do aminocido glicina, atravs dos valores de pKas obtidos numa curva de titulao. INTRODUO A titulao de um aminocido (Fig. 1) consiste na adio gradual de uma base a uma soluo cida at atingir um pH bsico ou na adio gradual de um cido a uma soluo bsica at atingir um pH cido.

Figura 1: Titulao de aminocido.

A glicina (Fig.2) o mais simples dos aminocidos, apresentado R=H. O aminocido glicina possui dois grupos ionizveis com capacidade tamponante: -COOH/-COO- em pH cido e -NH3+/-NH2 em pH alcalino e duas zonas de tamponamento entre os pHs 1,3 e 3,3 (dependente do grupo carboxila) e entre os pHs 8,6 e 10,6 (dependente do grupamento amino). No pH 2,3, 50% das estruturas moleculares da glicina apresentam o grupo carboxila protonado (-COOH) e 50% apresentam o grupo carboxila desprotonado (-COO-).

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Figura 2: Estrutura da glicina no ionizada.

Nestas condies, o pK igual ao pH (pK1 da glicina igual a 2,3). Da mesma forma, no pH 9,6, 50% das estruturas moleculares da glicina apresentam o grupo amino protonado (-NH3+) e 50% apresentam o grupo amino desprotonado (-NH2). Nestas condies, o pK tambm igual ao pH (pK2 da glicina igual a 9,6). No pH 5,9, eqidistante das duas zonas de tamponamento, h um grande predomnio da forma isoeltrica, caracterizando o ponto isoeltrico (pI) da glicina.

PARTE EXPERIMENTAL

1. Colocar 50 mL da soluo do aminocido glicina (0,10 M) em pH 1,0 em um bquer e titular com soluo 0,5 M de KOH medindo o pH aps cada adio de 1 mL at atingir pH 12,0. Traar as curvas de titulao, colocando nas ordenadas os valores de pH medidos e nas abscissas os volumes correspondentes. Indicar as zonas de tamponamento, pK1 e pK2.

2. Demonstrar as estruturas inicas predominantes da glicina nos pHs 1,9; 5,5 e 10 (utilize os valores tericos).

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13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

Quantidade de NaOH adicionado.

MATERIAL a) Reagentes 800 mL de glicina 0,1 M por laboratrio 1000 mL de KOH 0,5 M por laboratrio

b) Equipamentos e vidrarias (por bancada) 1 1 1 1 bureta 25 mL montada em suporte universal agitador magntico com peixinho pHmetro montado em suporte para titulao bquer 200 mL

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BIOQ20 - SEPARAO DE AMINOCIDOS POR CROMATOGRAFIA EM PAPEL

OBJETIVO Apresentar o mtodo cromatogrfico em papel para separao de aminocidos.

INTRODUO

Os aminocidos so compostos orgnicos constitudos por nitrognio, oxignio, hidrognio e carbono (podendo haver enxofre). Em um aminocido podese evidenciar um grupamento amina (NH2), um grupamento carboxila (COOH), o carbono alfa, o

hidrognio e o grupo R, chamado radical, que caracteriza os aminocidos, ou seja, determina suas propriedades e os classifica. A classificao dos aminocidos dse principalmente pela sua polaridade/apolaridade assim duas e sua interao de com a gua os

hidrofila/hidrofobia,

formando

classes

principais

aminocidos:

apolares (hidrofbicos) e os polares (hidroflicos).

Uma

maneira

prtica

de

separar

aminocidos

cromatografia

em

papel

ascendente, este mtodo consiste na separao dos componentes de uma mistura, tendo por base a distribuio destes em duas fases, uma estacionria e outra mvel, que esto em contato, dessa forma pode-se classificar os aminocidos de acordo com suas propriedades. Procedimento Pegar um retngulo de papel de filtro (15 X 25). Fazer um risco a lpis, a 2 cm da base do comprimento do papel. 2 cm de uma das extremidades desenhar um crculo de 3 mm de dimetro. Aplicar a soluo de aminocidos cuidadosamente na linha desenhada na tira de papel com auxlio de uma pipeta pasteur. Secar com o secador de cabelos. Colocar fase mvel butanol, cido actico e gua na relao 4:1:1em um bquer de 1000 mL, at formar uma camada de 1,5 mL no fundo do mesmo. Colocar o papel de filtro, com as solues de aminocidos j aplicadas. Tampar o bquer com papel alumnio. Esperar que a fase mvel chegue perto da outra extremidade. Remover o papel, abri-lo e marcar a frente do solvente. Pendurar o papel no varal para secar. Borrifar o papel com ninhidrina e aquece-lo at o aparecimento das manchas coloridas. Calcular o Rf dos dois aminocidos.

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Cromatografia em papel Materiais (POR BANCADA) Papel de filtro Whatman 1 (retngulos de 15 cm x 25 cm) Secador de cabelos 3 pipetas Pasteur 1 bquer de 1 L de capacidade 3 tubos de ensaio 1 estante para tubos

Reagentes e Materiais (USO GERAL) Soluo de fase mvel butanol, cido actico e gua na relao 4:1:1 (2000 mL) Soluo de Leucina a 2 % em gua (50 mL) Soluo de Tirosina a 2 % em gua (50 mL) Soluo de Glicina a 2 % em gua (50 mL) Soluo de cido glutmico a 2% em gua (50 mL) Soluo de ninhidrina 0,2 % em acetona (400 mL) 3 pipetas graduadas de 5 mL de capacidade 1 grampeador

Soluo de ninhidrina 0,2 % em acetona Ninhidrida ....................................... 400 mg Acetona .......................................... 200 mL

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BIOQ21 + 22 - FERMENTAO ALCOLICA + DESTILAO

OBJETIVO

Transformao de glicose em etanol a partir da fermentao alcolica por processo anaerbio.

INTRODUO Uma mudana qumica em matria animal e vegetal provocada por . 1) leveduras microscpicas, bactrias, ou mofos chamada de fermentao (Fig. Exemplos de fermentao so o azedamento de leite, o crescimento da massa de po, e a converso de acares e amidos em lcool. Muitas substncias qumicas industriais e vrios antibiticos usados em medicamentos modernos so produzidos atravs de fermentao sob condies controladas. O resultado da fermentao que uma substncia seja quebrada em compostos mais simples. Em alguns casos a fermentao usada para modificar um material cuja modificao seria difcil ou muito cara se mtodos qumicos convencionais fossem escolhidos. A fermentao sempre iniciada por enzimas formadas nas celas dos organismos vivos. Uma enzima um catalisador natural que provoca uma mudana qumica sem ser afetado por isto.

Figura 1: Bioqumica da fermentao.

A levedura comum um fungo composto de minsculas celulas tipo vegetais similares s bactrias. Suas enzimas invertase e zimase quebram acar em lcool e gs carbnico. Elas crescem o po e transformam suco de uva em vinho. Bactrias azedam o leite produzindo cidos lctico e buturico. Celulas do corpo humano produzem enzimas digestivas, como pepsina e renina que transformam comida em uma forma solvel.

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Os produtos de fermentao foram usados desde a antiguidade Habitantes das cavernas descobriram que a carne emvelhecida tem um sabor mais agradvel que a carne fresca. Vinho, cerveja, e po so to velhos quanto a agricultura. Queijo, que envolve a fermentao de leite ou creme outro alimento muito antigo.

PARTE EXPERIMENTAL

Reagentes: Caldo de cana (2000 mL), fermento biolgico para po (30 g) e accar.

Aparelhagem: Balana, proveta de 100 mL, densmetro, balo de fundo chato de 3000 mL, sistema de destilao fracionada (bales de 1000 mL e 500 mL), Funil de Buchner e Kitassato.

Determinao da densidade do caldo de cana. Colocar 100 mL de caldo de cana numa proveta, e com o auxlio de um densmetro determinar a densidade. Com o auxlio da Tabela de Stammer (em anexo), fazer a correo da densidade de modo a se obter 14 Brix (a faixa tima de graus Brix entre 12 e 14). Se estiver acima deste valor, fazer a diluio, caso esteja abaixo, adicionar sacarose (acar) de modo a atingir a densidade desejada.

Fermentao Aps a correo da densidade, colocar em balo de fundo chato 1000 mL de caldo e adicionar o fermento (numa relao de 2,5 g de fermento para cada 100 mL de caldo). Vedar o balo com algodo de modo a permitir que o gs carbnico produzido possa ser liberado, agitar at diluir o fermento e deixar fermentando por 24 hs. Colocar o erlenmeyer ao abrigo da luz a temperatura ambiente para que a fermentao ocorra mais rapidamente.

Filtrao O caldo fermentado dever ser filtrado utilizando-se um sistema a vcuo para a retirada de partculas slidas e impurezas. Se no conseguir filtrar, centrifugar a amostra a 3500 rpm durante 5 minutos. Aps a filtrao / centrifugao, medir o volume de amostra e transferir para o balo de destilao.

Destilao fracionada Montar um sistema de destilao fracionada e colocar o material a ser destilado em balo de 1000 mL de capacidade. Na extremidade do sistema de destilao deve ser

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acoplado um balo de 500 mL. Ligar a manta de aquecimento, a gua do condensador e evitar que a temperatura ultrapasse 85C. Medir o volume coletado e anotar o resultado. Calcular o rendimento.

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TEORIA DA ESPECTROFOTOMETRIA
Os mtodos espectroscpicos baseiam-se na absoro e/ou emisso de radiao electromagntica por muitas molculas, quando os seus eltrons se movimentam entre nveis energticos. A espectrofotometria baseia-se na absoro da radiao nos comprimentos de onda entre o ultravioleta e o infravermelho.

Fig. 1: Espectro electromagntico. A espectrofotometria utiliza a radiao compreendida entre o ultravioleta (ultraviolet) e o infravermelho (infrared).

A chamada radiao luminosa corresponde a uma gama de comprimentos de onda que vai desde o ultravioleta ao infravermelho no espectro da radiao electromagntica. O espectro do visvel est contido essencialmente na zona entre 400 e 800 nm. Um espectrofotmetro um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromtica atravs de uma soluo, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa soluo (Fig. 2). Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de onda (tal como acontece no arco-ris com a separao das cores da luz branca). Pode-se assim fazer passar atravs da amostra um feixe de luz monocromtica (de um nico comprimento de onda, ou quase). O espectrofotmetro permite-nos saber que quantidade de luz absorvida a cada comprimento de onda.

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Fig. 2: Espectrofotmetro. A luz dividida em feixes de diferentes comprimentos de onda por meio de um prisma ptico e passa atravs da amostra, contida numa cuvette ou clula de espectrofotmetro.

Faixas do Espectro Visvel Comprimento de Onda (nm) 340-400 400-430 430-500 500-570 570-620 620-670 670-750 750 Cor Ultravioleta prximo (Invisvel) Violeta Azul Verde Amarelo - Laranja Vermelho claro Vermelho escuro Infravermelho prximo (Invisvel)

Espectros de absoro O conjunto das absorbncias aos vrios comprimentos de onda para um composto chama-se espectro de absoro e varia de substncia para substncia. Se uma substncia verde, por exemplo, ento deixa passar ou reflete a cor nesse comprimento de onda, absorvendo mais a luz na regio do vermelho. A seguir podem ver-se espectros de vrias substncias diferentes.

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Fig. 3: Espectros de absoro de tipos diferentes de clorofilas.

Uma vez que diferentes substncias tm diferentes padres de absoro, a espectrofotometria permite-nos, por exemplo, identificar substncias com base no seu espectro. Permite tambm quantific-las, uma vez que a quantidade de luz absorvida est relacionada com a concentrao da substncia. s vezes uma substncia, quando alterada quimicamente, pode passar a apresentar um espectro de absoro diferente. Quando isto acontece, temos uma maneira de detectar essas mesmas alteraes.

Lei de Lambert-Beer: Lambert (1870) observou a relao entre a transmisso de luz e a espessura da camada do meio absorvente. Quando um feixe de luz monocromtica, atravessava um meio transparente homogneo, cada camada deste meio absorvia igual a frao de luz que atravessava, independentemente da intensidade da luz que incidia. A partir desta concluso foi enunciada a seguinte lei: " A intensidade da luz emitida decresce exponencialmente medida que a espessura do meio absorvente aumenta aritmeticamente ". Esta lei pode ser expressa pela seguinte equao: =================== I = Io . 10-x1

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=================== Onde: I = Intensidade da luz transmitida Io = Intensidade da luz incidente x = constante denominada coeficiente de absoro e que depende do meio absorvente empregado 1 = Espessura do meio absorvente

Beer em 1852 observou a relao existente entre a transmisso e a concentrao do meio onde passa o feixe de luz. Uma certa soluo absorve a luz proporcionalmente concentrao molecular do soluto que nela encontra, isto , " A intensidade de um feixe de luz monocromtico decresce exponencialmente medida que a concentrao da substncia absorvente aumenta aritmeticamente ". Expressa pela equao: ================= I = Io . 10-kc ================= Onde: I = Intensidade da luz transmitida Io = Intensidade da luz incidente k = Constante denominada coeficiente de absoro c = Concentrao do meio absorvente As leis de Lambert-Beer so o fundamento da espectrofotometria. Elas so tratadas simultaneamente, processo no qual a quantidade de luz absorvida ou transmitida por uma determinada soluo depende da concentrao do soluto e da espessura da soluo.

Fig. 4: Demonstrao da luz incidente e transmitida atravs de uma soluo em uma cubeta.

Desvios da lei de Lambert-Beer:

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Nem todas as reaes colorimtricas seguem a lei de Lambert-Beer, sendo esta vlida para condies restritas, em que: A luz utilizada aproximadamente monocromtica; As solues a serem analisadas estejam diludas (baixas concentraes); No devem estar presentes na mesma soluo mais de uma substncia absorvente de luz; O aumento da concentrao da substncia analisada no altera as caracteristicas qumicas do meio. A principal causa de desvios da lei a utilizao de solues concentradas. Essa observao pode ser ilustrada pelo grfico da Figura 5, no qual o aumento na concentrao acompanhado pelo aumento crescente e proporcional de A, at um ponto limite. A partir deste ponto (solues concentradas), deixa de existir a proporcionalidade linear entre os valores.

Fig. 5: Grfico de A em funo da concentrao de uma substncia.

Limite de linearidade representa o limite de concentrao para a qual a lei de LambertBeer vlida. Para concentraes superiores ao limite de linearidade observado no desvio da lei de Lambert-Beer, deixa de existir a proporcionalidade linear entre concentrao e absorbncia.

Anotaes:

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BIOQ23 FUNCIONAMENTO DO ESPECTROFOTMETRO

Procedimento: No primeiro tubo pipetar 4 mL de Soluo de permanganato de potssio a 0,05 g/L. No segundo tubo pipetar 2 mL de gua e 2 mL da soluo do primeiro tubo (Diluio 1:2). Misturar. No terceiro tubo pipetar 2 mL de gua + 2 mL da soluo do segundo tubo (Diluio 1:4). Misturar. Desprezar 2 mL dessa soluo no descarte ou na pia. Fazer a leitura das absorbncias em 530 m. Plotar as leituras no grfico e traar a reta da concentrao X absorbncia.

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BIOQ24 DETERMINAO DO ESPECTRO DE ABSORO DO VERMELHO DE METILA

Introduo A cor e a intensidade da cor de uma soluo dependem de: 1. qual a substncia colorida, porque isto determina, para cada comprimento de onda, , o valor da absortividade molar da substncia colorida, = (); 2. qual a concentrao da substncia colorida na soluo, c; 3. qual a espessura da soluo, L, entre a fonte luminosa que a ilumina de um lado e o detector de intensidade luminosa (um instrumento, ou mesmo o olho humano), do outro lado. Tal espessura denominada caminho tico. Sendo I0=I0() o valor da intensidade luminosa com comprimento de onda que incide sobre a soluo e I = I() o valor da intensidade luminosa com o mesmo comprimento de onda que dela emerge, chama-se transmitncia da soluo razo I/I0, que evidentemente um valor adimensional. Define-se, ento, outro valor adimensional denominado absorbncia, A() = - log I() I0() A lei de Lambert Beer afirma que, para solues diludas da substncia colorida, A() = () L.c. Os instrumentos que medem a absorbncia, para cada comprimento de onda, so os espectrofotmetros de absoro. Portanto, mantendo-se fixos os valores L e c, mas alterando-se o comprimento de onda incidente sobre a amostra, A() varia na mesma proporo que (). Ao grfico da variao de A() com denomina-se espectro de absoro. Mas, conforme j afirmado, para cada comprimento de onda o correspondente valor de () depende de qual a substncia colorida. Logo, cada substncia apresenta o seu espectro de absoro caracterstico. Na natureza existe um conjunto de substncias, denominadas indicadores cidobase, as quais mudam suas respectivas estruturas moleculares em funo do pH. Ao mudar a estrutura molecular, muda a substncia, ou seja, para cada comprimento de onda, muda o valor de () . Uma destas substncias o vermelho de metila. No equilbrio qumico, o meio cido favorece a estrutura HInd , enquanto que o meio bsico favorece a estrutura Ind-, porque Hind (aq) + H2O (l) Ind- (aq) + H30+ (aq). Para cada comprimento de onda, HIND() IND-(). Neste experimento, pretende-se determinar o espectro de absoro de cada uma das duas formas do vermelho de metila. Em seguida, em cada espectro deseja-se determinar o comprimento de onda correspondente ao valor mximo de (). Procedimento Determinao do espectro de absoro. 1.a) Escolha a soluo estoque de vermelho de metila (concentrao precisa de 0,01 g/L) com o pH determinado pelo professor (metade dos grupos usar pH=2, enquanto que a outra metade trabalhar com pH=8). 1.b) Mea a absorbncia da soluo entre 370 e 640 nm, de 30 em 30 nm. ATENO: cada vez que o comprimento de onda for alterado, o espectrofotmetro dever ser novamente calibrado, usando como branco uma soluo tampo com o pH correto.

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Comprimento Absorbncia de onda 370 m 400 m 430 m 460 m 490 m 520 m 550 m 580 m 610 m 640 m
1.c) Desenhe o grfico do espectro de absoro e determine o comprimento de onda correspondente ao valor mximo de A().

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BIOQ25 DETERMINAO DA GLICEMIA

Vrios mtodos foram propostos para a determinao de glicose. No incio, era utilizado o seu poder redutor, vrias tcnicas neste sentido foram desenvolvidas. Os oxidantes mais empregados foram os ons cobre e os ons ferricianeto; ambos, em meio alcalino. Naturalmente, estes mtodos sofrem interferncias de outros agentes redutores, presentes na amostra, o que determina a falta de especificidade para a anlise em questo. Outros mtodos, aonde a glicose reage diretamente com certas substncias orgnicas, foram desenvolvidos. Destas substncias, a ortotoluidina a mais utilizada. Posteriormente, os mtodos enzimticos foram surgindo e colocados em prtica. Como exemplo, podemos citar o mtodo de glicose-oxidase e o mtodo da hexoquinase.

1 MTODO ENZIMTICO

Finalidade Sistema enzimtico para a determinao de Glicose no sangue, lquor e lquidos ascticos, pleural e senovial em mtodo cintico. Somente para uso diagnstico in vitro.

Princpio A glicose oxidase catalisa a oxidao da Glicose de acordo com a seguinte reao:

GOD Glicose + O2 + H2O cido Glucnico + H2O2

H2O2 formado reage com 4-aminoantipirina e fenol, sob ao catalisadora da peroxidase, atravs de uma reao oxidativa formando um antipirilquinonimina vermelha cuja intensidade de cor proporcional concentrao da glicose na amostra.

2H2O2

POD + 4 Aminoantipirina + fenol

Antipirilquinonimina + 4H2O

REAGENTES Enzimas conservar entre 2 8 C Tampo Conservar entre 2 8 C. Tampo fosfato pH 7,4 Padro 100 mg/dl Estvel entre 15 25 C. Aps o manuseio armazenar, bem vedado, entre 2 8 C, para evitar evaporao.

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INFLUNCIAS PR-ANALTICAS: cido ascrbico em concentraes acima de 100 mg/L interferem na reao diminuindo os resultados. Nas 24 horas que sucedem ingesto aguda de lcool, ocorre significativa reduo na glicemia. As redues podem tambm ser significativas nos indivduos submetidos a jejum prolongado ou em obesos tratados com dieta com baixo valor calrico.

AMOSTRA: A amostra de sangue deve ser obtida aps jejum de no mnimo 8 horas ou de acordo com recomendao mdica. Usar plasma ou soro tomando as precaues a seguir. Realizar a colheita do sangue utilizando um anticoagulante contendo um inibidor da gliclise. As amostras de sangue no contendo um antiglicoltico, devem ser centrifugadas imediatamente aps a colheita e o plasma ou soro, separados das clulas ou cogulo. O mesmo procedimento deve ser realizado na colheita de lquor e lquidos asctico, pleural e senovial. Nas amostras com antiglicoltico, a concentrao da glicose permanece estvel por at 24 horas. No plasma, soro e outros lquidos separados das clulas, a glicose permanece estvel por 3 dias entre 2 8 C, quando no ocorre contaminao bacteriana.

INTERFERNCIAS: Bilirrubina at 16 mg/dL, Hemoglobina at 160 mg/dL e Triglicrides at 750 mg/dL no produzem interferncias significativas.

Procedimento: Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir: Branco 2,0 mL Teste 20 L 2,0 mL Padro 20 L 2,0 mL

Amostra Padro Reagente de cor

Misturar vigorosamente e colocar em banho-maria a 37 C durante 15 minutos. Determinar as absorvncias do teste e padro em 505 nm. A cor estvel por 60 minutos.

CLCULOS:

Glicose (mg/dL) = Absorvncia do teste x 100 Absorvncia do padro

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LINEARIDADE: A reao linear at 400 mg/dl. Diluir a amostra com NaCl mol/L (0,85%), dosar novamente e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluio. VALORES DE REFERNCIA: Plasma: 70 a 110 mg/dL Lquor: 2/3 da glicemia em amostras colhidas simultaneamente.

SIGNIFICADO CLNICO: Valores elevados ocorrem nos vrios tipos de diabetes primrias, nos estados de intolerncia glicose e nas diabetes secundrias a vrias doenas (hipertiroidismo, hiperpituitarismo, hipoadrenocorticismo, etc). Valores diminudos ocorrem nas hipoglicemias que podem ser devidas a vrias causas. Quando a ocorrncia de sintomas de hipoglicemia relacionada alimentao, duas formas de hipoglicemia podem ser definidas: hipoglicemia do jejum e ps-prandial. Causas mais comuns de hipoglicemia do jejum: hiperinsulinismo, tumores extrapancreticos, sndrome auto-imune (formao espontnea de anticorpos para receptores da insulina), insuficincia supra-renal e/ou hipofisria, doena heptica grave e alcoolismo. A hipoglicemia ps-prandial classificada em hipoglicemia alimentar, hipoglicemia do diabtico tipo II e do paciente com intolerncia glicose. A reduo da concentrao de glicose nos lquidos corporais encontra-se relacionada a processos inflamatrios ou infecciosos. A concentrao de glicose no lquor representa um dos parmetros para a distino entre meningite bacteriana e virtica.

Observaes: A limpeza e secagem adequadas do material utilizado so fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obteno de resultados corretos A gua utilizada na limpeza do material deve ser de boa qualidade A urina contm numerosas substncias, principalmente o cido rico, que interferem nos mtodos utilizando a reao GOD-POD levando a resultados falsamente diminudos.

Anotaes:

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BIOQ26 - QUANTIFICAO DO COLESTEROL SANGUNEO

OBJETIVO Demonstrar a metodologia de doseamento do colesterol sanguneo total.

INTRODUO O colesterol no soro quantificado atravs das seguintes reaes enzimticas:

1. steres de colesterol 2. Colesterol + O2

colesterol livre + cidos graxos colesterona + H2O2

3. 2H2O2 + 4 Aminoantipirina + p-Hidroxibenzoato 4-Antipirilquinonimina + 4 H2O

O produto formado pela oxidao da 4-Aminoantipirina (4-Antipirilquinonimina) de colorao avermelhada e sua intensidade, diretamente proporcional concentrao de colesterol no soro. A cor vermelha, formada pela reao, medida em espectrofotmetro ou fotocolormetro, com absoro mxima em 510nm.

PARTE EXPERIMENTAL

Identificar 3 tubos de ensaio com B (branco), T (teste) e P (padro). Proceder como segue: B Reagente de cor Soluo Padro Amostra 2,0mL T 2,0mL 20 uL P 2,0mL 20 uL -

Misturar por agitao e incubar por 10 minutos, em banho maria, a 37oC. Retirar do banho maria e ler as absorbncias em espectrofotmetro ou fotocolormetro, a 510nm, zerando o aparelho com o branco. A cor desenvolvida permanece estvel por 60 minutos. CLCULO

Colesterol (mg/dL) =

Absorbncia do teste x 200 Absorbncia padro

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VALORES DE REFERNCIA

recomendado que cada laboratrio estabelea sua prpria faixa de valores de referncia na populao atendida. Em termos estatsticos, na populao brasileira adulta, em ambos os sexos, os nveis de colesterol situam-se na faixa de 150-240mg/dL. O colesterol e suas fraes so componentes lipdicos de maior importncia na evoluo do quadro de aterognese. Estudos mostram

relao entre o aumento da incidncia de doena coronria isqumica (DCI) e o aumento da taxa de colesterol sanguneo, determinando ento os grupos de risco. Como referncia, d-se valor no ao dado estatstico, mas sim aos nveis de colesterol srico que definam prognsticos:

Colesterol mg/dL Desejvel Limtrofe Alto risco (DCI) < 200 200 - 239 > 240

SIGNIFICADO CLNICO

Aterosclerose um fenmeno degenerativo que compromete as artrias de grande e mdio calibre de nosso organismo. Inicia-se precocemente, tendo papel importante na sua evoluo, determinados fatores raciais e principalmente, alimentares. Sua expresso

anatmica a diminuio da luz vascular com srias consequncias quando as leses se localizam nas artrias cerebrais ou coronarianas. Grande quantidade de lipdeos, com predominncia de colesterol, esto presentes nas leses. Estudos de Framinghan mostram uma correlao direta entre os nveis sanguneos de colesterol e as leses aterosclerticas.

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