Pengujian Kesehatan Benih Tanaman Perkebunan

Pengujian Kesehatan Benih Tanaman Perkebunan Oleh: Yeti Ernaningtyas, S.Si,MP (Calon PBT Pengujian Mutu Benih) Ana Satria (PBT Pengujian Mutu Benih) vPengujian kesehatan benih adalah melihat kesehatan benih secara seksama, apakah benih tersebut mengandung patogen yang menyebabkan benih terjadi penyimpangan atau perubahan dari keadaan normal yang menyebabkan benih tersebut tidak bisa melakukan fungsinya secara normal sebagai bahan perbanyakan tanaman. Benih bermutu dengan kualitas yang tinggi selalu diharapkan oleh petani. Oleh karena itu, benih harus selalu dijaga kualitasnya sejak diproduksi oleh produsen benih, dipasarkan hingga sampai di tangan petani untuk proses penanaman. Untuk menjaga kualitas benih tersebut, maka peranan pengujian benih menjadi sangat penting dan harus dilakukan terhadap benih baik ditingkat produsen benih, pedagang benih maupun pada tingkat petani. Menurut Sutopo (2002) pentingnya uji kesehatan benih dilakukan adalah karena penyakit pada benih dapat mengganggu perkecambahan dan pertumbuhan benih dengan demikian merugikan kualitas dan kuantitas hasil, benih dapat menjadi pengantar baik hama maupun penyakit ke daerah lain dimana hama dan penyakit itu tidak ada sebelumnya. Sehingga baik cendawan, bakteri, virus dan serangga (hama lapang dan gudang) yang semula dari infeksi yang terbawa oleh benih dapat merusak tanaman, dengan dilakukan uji kesehatan benih patogen akan terdeteksi dan dapat mengurangi penyakit pada benih tersebut. Patogen yang menginfeksi benih dapat menyebabkan benih menjadi : a. b. c. d. e. Berubah secara fisik dan kimiawi Berkecambah secara abnormal Tidak dapat berkecambah Kecambahnya tidak mampu muncul kepermukaan lahan Hasil pengujian viabilitas kecambahnya jadi terpengaruh.

Benih dikatakan sehat jika benih tersebut bebas dari patogen, baik berupa bakteri, cendawan, virus maupun nematoda. Patogen adalah suatu kesatuan hidup yang dapat menyebabkan penyakit. Sedangkan patogenisitas adalah kemampuan relatif dari suatu patogen untuk menyebabkan penyakit. Penyakit yang ditimbulkannya kemungkinan dapat terjadi pada kecambah, tanaman muda ataupun tanaman yang telah dewasa. Semua golongan patogen seperti cendawan, bakteri, virus, dan nematoda dapat terbawa oleh benih. Hal ini dapat terjadi karena benihnya telah terinfeksi atau kerena kontaminasi pada permukaan benih. Kebanyakan patogen yang terbawa benih menjadi aktif segera setelah benih disebar atau disemaikan. Sebagai akibatnya benih menjadi busuk atau terjadi damping off sebelum atau sesudah benih berkecambah.

Terdapat beberapa pengaruh penyakit terbawa benih antara lain (Fadhilah, tanpa tahun): 1. Penyakit terbawa benih berpengaruh baik langsung maupun tidak langsung terhadap kualitas benih komersial. 2. Patogen terbawa benih tanaman telah mengintroduksi penyakit ke pertanaman baru sehingga menyebabkan kehilangan hasil dan menurunkan kualitas produksi. Menurunkan daya tumbuh benih di lapang. Penyakit terbawa benih juga berdampak pada pengujian mutu benih dilaboratorium seperti rendahnya daya berkecambah benih akibat infeksi benih maupun kecambah selama masa pengujian. Patogen terbawa benih juga dapat menurunkan kualitas benih selama masa penyimpanan.

3. 4.

5.

Uji kesehatan benih untuk tanaman perkebunan masih terbatas. Pada SNI benih perkebunan menyebutkan bahwa benih yang digunakan harus bebas patogen tular benih 100%. Berdasarkan masa hidup, benih dapat dibedakan atas benih orthodoks dan rekalsitran. Pada umumnya benih tanaman perkebunan untuk komoditas unggulan tergolong rekalsitran antara lain kakao, karet, kelapa dalam, pala dan cengkeh. Benih orthodoks mempunyai masa hidup yang panjang, dapat dikeringkan hingga kadar air 5% tanpa mengalami kerusakan dan juga toleran pada suhu rendah. Sedangkan benih rekalsitran tidak dapat dikeringkan hingga di bawah kadar air 30% tanpa mengalami kerusakan dan tidak toleran pada suhu rendah. Benih rekalsitran mempunyai masa hidup yang singkat dan sukar untuk disimpan sebab kadar airnya tinggi sehingga mudah terkontaminasi mikrobia dan lebih cepat mengalami kemunduran. Apabila disimpan pada suhu di bawah nol akan menyebabkan terbentuknya kristal es yang dapat merusak membran sel dan terjadinya pembekuan (Roberts dalam Copeland dan McDonald, 1995 ) dalam Hasid, tanpa tahun. Dalam Sukarman dan Hasanah, 2003 menyebutkan bahwa pada kadar air 18-40% benih telah mencapai masak fisiologis, laju respirasi tinggi serta benih peka terhadap deteriorasi, cendawan, hama dan kerusakan mekanis. Sehingga dengan demikian pada tanaman perkebunan perlu adanya pengujian kesehatan untuk mendapatkan bibit bermutu tinggi. Beberapa contoh benih tanaman perkebunan yang terserang cendawan:

Biji Kopi

Biji Kakao

Biji Karet

Kajian pustaka dan hasil penelitian tentang kesehatan benih pada tanaman perkebunan masih terbatas. Perlu pengkajian dan penelitian lebih lanjut pengaruh kesehatan benih tanaman perkebunan. Serta mengidentifikasi jenis penyakit terbawa benih dan pengaruhnya terhadap viabilitas benih. Pemilihan metode dan cara evaluasi pengujian kesehatan benih memerlukan pengetahuan dan pengalaman. Penggunaan metode tergantung pada patogen yang ingin diketahui (patogen target) dan jenis benih maupun tujuan pengujian. Pada prinsipnya pengamatan terhadap contoh kerja ada dua cara yaitu dengan pengamatan langsung dan pengamatan tidak langsung (setelah inkubasi).

Pengujian kesehatan benih meliputi: 1. Pengujian Cendawan

Infeksi cendawan pada benih dapat menyebabkan kehilangan viabilitas, peningkatan asam lemak bebas, penurunan kadar gula, menimbulkan bau apek dan perubahan warna (Justice at al, 2002). Cendawan terbawa benih dapat menimbulkan penyakit pada tanaman sebelum benih berkecambah, pada waktu tanaman masih muda atau menjelang berbunga atau berbuah. Selain dapat menyebabkan penyakit pada tanaman itu sendiri, cendawan dapat pula menjadi sumber infeksi untuk tanaman lain. Cendawan dapat mempertahankan diri di lapang misalnya pada sisa tanaman dan gulma. Pada keadaan ini cendawan tersebut akan menjadi sumber inokulum. Meskipun pada saat penanaman menggunakan benih yang sehat, tanaman akan tetap terserang penyakit. Cendawan terbawa benih dapat bertahan lama di lapang (Sugiharso at al. 1980). Informasi tentang asosiasi cendawan pada benih serta peran dari masing-masing cendawan sangat dibutuhkan untuk mendapatkan bibit dan tanaman sehat di lapang. Terdapat beberapa teknik dalam pengujian Cendawan : a. Teknik Inkubasi Cendawan dengan metode blotter test (Metode kertas saring) Benih disterilkan dengan natrium hipoklorit 1% selama 1 menit kemudian dibilas dengan aquadest steril sebanyak 3 kali dan dikeringkan dengan tissue steril. Kemudian benih disusun pada petridish yang telah dilapisi kertas saring steril. Petridish diletakkan di ruang inkubasi dibawah lampu NUV (Near Ultra Violet) dengan 12 jam gelap dan 12 jam terang selama 7 hari. Setelah 7 hari pertumbuhan cendawan diamati dengan menggunakan compound mikroskop.

b. Teknik Inkubasi Cendawan dengan Metode Agar Test Benih disterilkan dengan natrium hipoklorit 1% selama 1 menit kemudian dibilas dengan aquadest steril sebanyak 3 kali dan dikeringkan dengan tissue steril. Untuk benih besar, benih dipotong terlebih dahulu sedangkan untuk benih kecil langsung ditanam pada media agar (PDA) yang telah disiapkan di petridish. Petridish diletakkan di ruang inkubasi dibawah lampu NUV (Near Ultra Violet) dengan 12 jam gelap dan 12 jam terang selama 7 hari. Setelah 7 hari pertumbuhan cendawan diamati dengan menggunakan compound mikroskop.

1.

Pengujian Bakteri Metode pengujian kesehatan benih yang digunakan pada dasarnya tergantung pada macam benih dan organisme pengganggu tanaman yang mungkin terdapat pada benih tersebut. Keberadaan suatu patogen seringkali baru dapat diketahui dengan pasti setelah melalui teknik pemeriksaan atau pengujian tertentu. Pada pengujian bakteri patogen terbawa benih hal yang perlu diperhatikan adalah kesterilan media tumbuh dan ruang kerja. Penggunaan media yang tidak steril atau ruang kerja tidak steril kemungkinan besar akan terjadi kontaminasi sehingga akan menyulitkan dalam mengidentifikasi bakteri yang terdapat pada benih tersebut. Langkah-langkah pelaksanaan pengujian kesehatan benih untuk bakteri terbawa benih meliputi: 1. Persiapan Media Agar (NA, YDC, MS dan KingB) a. b. 2. Persiapan Media Agar dalam cawan Petri (untuk pengamatan isolat) Persiapan Media Agar dalam Tabung Reaksi (untuk koleksi bakteri)

Sterilisasi alat dan bahan a. Sterilisasi panas basah Sterilisasi basah digunakan untuk mensterilkan bahan atau peralatan yang dapat ditembus uap air dan tidak akan mengalami kerusakan pada suhu tersebut. umumnya media yang digunakan untuk perbanyakan bakteri dapat disterilkan dengan cara ini. Alat yang digunakan adalah autoklaf dengan tekanan uap jenuh pada suhu 121C selama 15-20 menit (tekanan 1 atm). b. Sterilisasi panas kering Alat yang digunakan adalah oven. Bahan-bahan yang biasa disterilkan dengan cara ini adalah alat yang terbuat dari bahan gelas (glass ware) seperti pipet, tabung reaksi, cawan Petri, erlenmeyer, gelas ukur dan botol sampel. Cara tersebut dapat juga digunakan untuk gliserin, minyak, vaselin dan bahan yang berupa bubuk tahan panas. Bahan-bahan tersebut harus dibungkus dengan

pembungkus tahan panas agar tidak terkontaminasi pada saat dikeluarkan dari oven. Suhu (oC) 170 -180 160 150 140 3. Ekstraksi Bakteri dari benih Tujuan ekstraksi bakteri adalah untuk mengeluarkan bakteri dari dalam atau yang berada pada benih, sehingga dapat diisolasi pada media yang sesuai. Adapun caracara ekstraksi: 1. Ekstraksi langsung dari benih yang terdiri dari 2 yaitu: a. b. 2. Metode penghancuran benih Metode perendaman benih yang masih utuh dalam air Waktu (jam) 1,0 2,0 2,5 3,0

Ekstraksi bakteri dengan menabur benih langsung pada media agar (Direct planting)

4. a.

Pengujian Karakter Fisoilogi Bakteri Terbawa Benih (Balai Besar PPMBTPH) Reaksi Gram (Uji KOH) Uji ini dilakukan untuk membedakan antara bakteri yang bersifat gram positif dengan gram negative. Campurkan satu lup bakteri dengan 2 tetes larutan KOH 3%

Amati Catatan: Apabila terbentuk lendir setelah diaduk dengan jarum ose berarti bakteri tersebut bersifat gram negative Sebaliknya apabila tidak terbentuk lendir berarti bakteri bersifat gram positif

b.

Uji Katalase Teteskan larutan H2O2 3% pada gelas obyek

Ambil satu lup bakteri yang berumur 48 jam Dari media NA dan campurkan pada larutan H2O2 3%

Amati Catatan: Adanya gelembung-gelembung gas (Oksigen) menunjukkan reaksi yang positif, berarti organism yang bersangkutan menghasilkan enzim katalase yang mengubah air dan oksigen. c. Uji Oksidase Kovacs Kertas filter ditetesi dengan 1% (w/v) larutan Tetramethyl-p-phenylenediamine yang baru dibuat

Bakteri digoreskan pada kertas filter

Amati setelah 10 detik Catatan: Apabila kertas filter berubah warna sebelum 10 detik, berarti bereaksi positif dan apabila tidak berubah warna berarti bakteri tersebut bereaksi negatif d. Hidrolisis starch Inokulasi medium starch dengan bakteri yang diuji

Inkubasi selama 4 hari

Siram dengan larutan Lugols Iodin

Amati e. Produksi senyawa Fluoresen dan Non-Fluoresen Goreskan bakteri yang diuji pada media Kings B

Inkubasi pada suhu 25oC/ suhu ruang

Setelah 48 jam amati ada/tidak ada pigmen fluoresen dan non-fluoresen ditempat gelap dengan sinar UV 366 nm

f.

Aktivitas arginin dihidrolase Inokulasikan bakteri dari kultur murni berumur 24-48 jam yang akan diuji ke dalam tabung reaksi yang berisi media Thornleys

Lapisi tabung reaksi dengan 1 ml parafin atau mineral oil steril

Inkubasikan selama 3 hari pada suhu 27oC Amati perubahan warna media

Catatan : jika media berubah menjadi merah maka bakteri tersebut bereaksi positif (menghasilkan NH3/alkali). Sebaliknya jika tidak ada perubahan warna, mengindikasikan tidak terjadi degradasi arginin berarti bakteri tersebut bereaksi. g. Uji Hipersensitifitas Siapkan suspense bakteri dengan konsentrasi 10 cfu

Ambil suspense dengan jarum suntik 1 ml

Inkubasikan tanaman selama 24-28 jam

Amati h. Uji patogenitas Isolat murni berumur 24-48 jam

Bakteri yang tumbuh disuspensi dengan NB atau air steril

Inokulasi ke tanaman inang

Amati

i.

Uji Virulensi

Pengujian ini dimaksudkan untuk membedakan antara bakteriPseudomonas solanacearum Syn Ralstonia solanacearumyang virulen dan tidak virulen. R. solanacearum yang virulen terlihat sebagai koloni bulat dan berlendir, dengan tepi berwarna putih dan bagian pusat koloni berwarna pink. R. solanacearum yang tidak virulen koloninya tidak berlendir dengan pusat yang berwarna merah tua, bentuknya bulat kecil, tanpa atau sedikit dikelilingi warna putih.

1.

Pengujian Virus Benih memegang peranan penting dalam budidaya tanaman. Kualitas benih yang baik merupakan syarat penting untuk mendapatkan produksi yang tinggi dan menguntungkan. Salah satu karakter mutu adalah tidak terdapatnya patogen terbawa benih, yang salah satunya adalah virus. Masalah penyakit yang disebabkan oleh virus menjadi aspek yang penting karena beberapa hal, yaitu: (1) Benih dari beberapa komoditas dilaporkan mengandung virus sehingga benih dapat menjadi sumber infeksi. (2) Di alam penyakit yang disebabkan oleh virus ditularkan oleh serangga (vektor) yang banyak terdapat pada tanaman yang dibudidayakan. (3) Varietas tanaman budidaya yang memiliki ketahanan tinggi terhadap virus masih sangat jarang. Kerugian secara ekonomis akibat serangan virus sering tidak dapat diketahui secara pasti, karena pada kondisi lapang infeksi virus atau patogen lainnya sering terjadi secara simultan. Berdasarkan hasil penelitian secara umum dapat dikatakan bahwa kerugian karena serangan virus dapat berkisar dari 10 sampai dengan 90%, tergantung dari berbagai aspek yang terkait dengan bagaimana pola budidaya yang dilakukan (Balitsa, 2006). Untuk mengetahui ada tidaknya gejala virus pada suatu tumbuhan dapat dilakukan melalui beberapa pengujian antara lain: a. Pengujian Growing on Test 1. 2. Menyiapkan media tanam pasir dan kompos (1:1). Mengambil benih secara acak dari sampel benih dan menanam benih tersebut pada media yang telah disiapkan. Mengamati dan mencatat gejala-gejala yang timbul pada tanaman.

3.

b. Pengujian Tanaman indikator

1. 2. 3. 4.

Menyiapkan tanaman indicator misalnya tembakau. Menyiapkan ekstrak daun yang memiliki gejala terserang virus. Menaburi daun tanaman indicator dengan carborundrum. Mengolesi daun indicator tersebut dengan ekstrak daun dengan menggunakan cotton bud. Kemudian daun tersebut disemprot dengan aquades dan dibiarkan selama 3-4 hari atau setelah menunjukkan adanya gejala.

5.

c. Pengujian Ellisa Metode Ellisa disebut juga metode langsung (Direct Elisa/DAS Elisa) yang merupakan metode pengujian untuk mengetahui suatu sampel mengandung virus atau tidak. Adapun langkah-langkah dalam pengujian Ellisa yaitu: 1. Persiapan Buffer. terdapat beberapa buffer yang digunakan dalam pengujian Ellisa, antara lain: a. 0,05 M Larutan buffer carbonate pH 9,6 (Coating Buffer) b. 0,1 M PBS pH 7,4 (larutan stok 5x) c. 0,02 M PBS Tween (PBS-Tween) d. Sample extraction buffer (sampel buffer) pH 7,4 e. Conjugate buffer f. Substrate buffer ph 9,8 (10% Diethanolamine) g. Larutan 3 M NaOH 2. Prosedur kerja elisa: ( Hartati, tanpa tahun)

Isi plate dengan coating buffer + IgG CMV

Inkubasi plate pada T:37oC selama 2-3 jam

Cuci plate dengan washing buffer

Isi plate dengan SAP + ekstrak buffer

Inkubasi pada T: 4oC 1 malam

Cuci plate dengan washing buffer

Isi plate dengan conjugate buffer + AB Label

Inkubasi plate pada T:37oC selama 4 jam

Cuci plate dengan washing buffer

Isi plate dgn substrate buffer + P-nitrophenylphosphate

Inkubasi pada suhu ruang selama 30- 60

Amati: secara visual / ELISA Reader

Daftar Pustaka Metode Pengujian Mutu Benih Tanaman Pangan dan Holtikultura. 2010. BBP2MB-TPH Dirjen Tanaman Pangan. Kementrian Pertanian. Fadhilah,Siti. Tanpa tahun. Makalah disampaikan pada peserta magang di Balai Besar PPMBTPH. Pada tanggal 17-21 Oktober 2011. Hartati, puspa. Tanpa tahun. Makalah disampaikan pada peserta magang di Balai Besar PPMBTPH. Pada tanggal 17-21 Oktober 2011. Pedoman Laboratorium Pengujian Mutu Benih Tanaman Pangan dan Hortikultura. 2006. Dirjen tanaman Pangan dan Holtikultura. Departemen Pertanian. Sukarman dan Hasanah M, 2003. Perbaikan Mutu Benih Aneka Tanaman Perkebunan Melalui Cara Panen dan Penanganan Benih. Jurnal Litbang Pertanian, 22(1), 2003. Sutopo, Lita. 2002. Teknologi Benih. Universitas Brawijaya. Raja Grafindo Persada Jakarta. Copeland , L.O. and M.B. McDonald. 1995. Principles of Seed Science and Technology. Chapman and Hall Press. New York. 409 p.