Laporan Pengantar Genetika Molekuler Nama NRP Kelompok : Routh Meylinda : G34090106 : 11

Hari/Tanggal: Selasa/22 Mei 2012 Asisten: 1. Esa Ayu P. (G34080011)

2. Nurul Rahayu (G34080068) 3. Gina Kusuma (G34080105)

IDENTIFIKASI PATOGEN PADA DAGING DENGAN PCR Pendahuluan Perbedaan antara ribosom sel prokariot dan eukariot adalah subunit yang dimilikinya. Sel prokariot memiliki subunit 50S dan 30S, sedangkan sel eukariot memiliki subunit 60 S dan 40S. S e l a i n i t u , r i b o s o m s e l e u k a r i o t l e b i h b e s a r daripada ribosom sel prokariot dan ribosom pada eukariot mengandung jumlah protein ribosom yang lebih banyak daripada prokariot. Berdasarkan ukurannya, ukuran ribosom pada eukariot sekitar 20 nm-30 nm, sedangkan pada prokariot u k u r a n n y a l e b i h k e c i l . R i b o s o m s e l p r o k a r i o t k e b a n y a k a n b e r g e r a k b e b a s d i sitoplasma, sedangkan ribosom sel eukariot biasanya menempel di RE kasar. Didalam sel eukariot ribosom terbentuk dari 4 untai RNA, sedangkan ribosom sel prokariot terbentuk dari 3 untai RNA eukariot mempunyai nukleus karena materi inti dilingkupi oleh membran inti, sedangkan prokariot tidak mempunyai inti yang sebenarnya, materi inti tersebar dlm sitoplasma karena tidak mempunyai membran inti. Eukariot juga memiliki DNA yang lebih kompleks, lebih banyak mengandung pasangan basa nukleotida, sehingga harus digulung pada protein histon (ada histonnya), sedangkan prokariot memiliki DNA yang lebih sederhana, lebih sedikit mengandung pasangan basa nukleotida, berbentuk sirkuler. Eukariot memiliki kromosom lebih dari satu, sedangkan prokariot hanya memiliki kromosom tunggal. Eukariot memiliki intron dan ekson, sedang prokariot tidak memiliki intron, hanya ekson. Eukariot tidak memiliki operon, prokariot terdapat operon. Pada eukariot transkripsi terjadi di inti dan translasi terjadi di sitoplasma. Keduanya tidak dapat dilakukan secara bersamaan, sedang pada prokariot transkripsi dan translasi dapat terjadi secara simultan. Tujuan Percobaan ini bertujuan mengidentifikasi DNA pathogen pada daging melalui metode PCR. Metode Isolasi daging diperoleh dengan mencincang daging kambing, kemudian ditambahkan nitrogen cair agar daging menjadi serbukan dan menjadi benar-benar halus. Setelah itu ditambahkan sebanyak 350 l buffer lisis (dengan proteinase K), diinkubasi pada suhu 55C selama 15 menit dan setiap 5 menit dibolak-balik. Setelah diinkubasi di es selama 10 menit dan kemudian ditambahkan 150 l NaCl, dibolak-balik 6-8 kali, diinkubasi lagi die s selama 5 menit, dan disentrifuse 10.000 rpm selama 10 menit. Setelah disentrifuse diambil supernatannya sebanyak 500 l, ditambahkan RNAse sebanyak 4 l dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 15 menit. Setelah itu ditambahkan juga isopropanol dingin, dibolak-balik, dan disentrifuse pada 10.000 rpm selam 30 menit. Kemudian pellet yang dihasilkan dari sentrifuse diambil, ditambahkan ETOH 70% sebanyak 500 l, disentrifuse pada 10.000 rpm selama 5 menit, dikeringkan, dan ditambahkan 20 l ddH2O. tahap terakhir yaitu PCR dan kemudian hasil dari PCR dielektroforesis.

Metode PCR dilakukan dengan mencampur semua komponen PCR yaitu DNA template, dNTP, DMSO, tag polymerase, buffer, dan primer. Primer yang digunakan adalah 63 F, dan 1387 F. setalah semua tercampur kemudian dimasukkan ke dalam mesin PCR. Hasil dari PCR kemudian di elektroforesis. Hasil
11 DNA genom 20

Gambar 1 Pita DNA running pada proses elektroforesis (pendaran pita tidak terlihat pada semua kelompok)

marker

11

20

Gambar 2 Hasil elektroforesis PCR gen 16S rRNA yang diperoleh dari bakteri daging (pendaran pita tidak terlihat pada semua kelompok)

Pembahasan Daging merupakan makanan yang mengandung zat gizi yang tinggi, kandungan gizi yang tinggi terutama protein dengan komposisi asam amino yang seimbang sangat bermanfaat bagi tubuh manusia. Daging yang disimpan dengan cara pendinginan di dalam wadah biasa (tanpa vakum), maka mikroba yang akan tumbuh dominan selama penyimpanan adalah bakteri gram negatif yang bersifat psikotrofik dan aerobik. Berdasarkan hubungan antara suhu dan pertumbuhan, mikrobia dapat dikelompokkan sebagai psikrofilik, psikrotrofik, mesofilik thermofilik atau thermofilik. Bahan pangan yang disimpan dalam suhu almari es akan dirusak oleh spesies dari kelompok psikotrofilik dan psikotropik. Sebagai contoh, pada daging yang disimpan pada suhu lemari es, organisme psikofilik dan psikrotropik seperti Pseudomonas dan Proteus, menurunkan keasaman produk melalui aktivitas proteolitiknya.

Percobaan ini bertujuan mengidentifikasi DNA pathogen pada daging. Daging yang digunakan adalah daging kambing dan daging ayam. Untuk mendapatkan DNA patogen pada daging harus dilakukan isolasi DNA daging terlebih dahulu. Tahap awal yaitu dengan menghaluskan daging dengan tambahan nitrogen cair. Nitrogen cair (liquid N2) adalah cairan yang nampak selalu menguap yang bisa digunakan untuk membantu mempermudah penggerusan suatu bahan. Nitrogen cair memiliki suhu -196 derajat celcius, sehingga sample bisa dibekukan dengan disiram nitrogen cair sebelum digerus. Daging yang telah disiram nitrogen cair akan lebih mudah digerus dan akan menjadi serbuk. Isolasi DNA daging dilakukan dengan berbagai tahapan dana juga membutuhkan senyawasenyawa tertentu. Pemberian larutan NaOH ini dilakukan untuk memecah dinding sel bakteri sehingga nukleoprotein keluar dari dalam sel dan DNA dapat diisolasi. Penambahan isopropanol ke larutan plasmid adalah untuk meningkatkan berat jenis plasmid sehingga jika disentrifuse plasmid akan mengendap ke bawah. Penggunaan NaCl pada assolasi DNA kromosom adalah untuk membersihkan DNA kromosom dari bahan-bahan lain, misalnya sisa SDS yang ada, maupun kotorankotoran lainnya. Dengan kata lain adalah menghilangkan bagian-bagian yang tidak diinginkan selain DNA yang dimaksud agar tidak tercampur dengan bahan-bahan lain. Prinsip dalam melakukan isolasi DNA pada praktikum ini yaitu menggunakan sentrifugasi Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Isolasi DNA daging, tahap selanjutnya yaitu melakukan PCR. Adapun tahapan dari PCR adalah tahap denaturasi, tahap penempelan primer pada DNA template (annealing) serta tahap pemanjangan primer melalui reaksi polimerisasi nukleotida (extention). Berdasarkan hasil percobaan, PCR yang dilakukan tidak berhasil. Kegagalan reaksi PCR mungkin disebabkan karena tidak sempurnanya denaturasi atau suhu annealing yang terlalu tinggi. Selain itu juga karena pada saat pembuatan master mix yang kurang tepat yaitu penggunaaan taq polymerase yang terlalu sedikit sehingga pada saat dipipet tidak ikut tercampur dengan komponen yang lain. Primer yang digunakan pada percobaan ini adalah 16s RNA. 16S rRNA merupakan gen yang bersifat spesies spesifik teradap prokariotik (Amann et al. 1994), untuk membantu proses penempelan primer pada bufer PCR. Simpulan Identifikasi patogen pada daging menggunakan teknik PCR 16S rRNA. Hasil visualisasi PCR gagal menunjukkan adanya patogen. Hal tersebut karena terjadi kesalahan pada teknik pembuatan master mix PCR. Mikroorganisme yang terdapat pada daging antara lain Salmonella, Campylobacter, Clostridium perfringens, Escherichia coli, Yersinia entercolitica dan Listeria monocytogenes. Daftar Pustaka Marchesi JR et al. 1998. Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA. App Env Microbiol 64: 795-799 Siagian A. 2002. Mikroba Patogen pada Makanan dan Sumber Pencemarannya. [Makalah]. Fakultas Kesehatan Masyarakat, Universitas Sumatera Utara. Sambrook W, Russel DW. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Vol 1. Ed e-3. New York: Cold Spring Harbor Laboratory.