UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE CINCIAS AGRONMICAS CMPUS DE BOTUCATU

CONTROLE DA MANCHA PRETA DOS FRUTOS CTRICOS EM CULTIVO ORGNICO E CONVENCIONAL E DO BOLOR VERDE EM PS-COLHEITA

EDUARDO ROBERTO DE ALMEIDA BERNARDO

Tese apresentada Faculdade de Cincias Agronmicas da Unesp - Cmpus de Botucatu, para obteno do ttulo de Doutor em Agronomia (Proteo de Plantas).

BOTUCATU - SP Novembro - 2007

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE CINCIAS AGRONMICAS CMPUS DE BOTUCATU

CONTROLE DA MANCHA PRETA DOS FRUTOS CTRICOS EM CULTIVO ORGNICO E CONVENCIONAL E DO BOLOR VERDE EM PS-COLHEITA.

EDUARDO ROBERTO DE ALMEIDA BERNARDO

Orientador: Prof. Dr. Wagner Bettiol

Tese apresentada Faculdade de Cincias Agronmicas da Unesp - Cmpus de Botucatu, para obteno do ttulo de Doutor em Agronomia (Proteo de Plantas).

BOTUCATU - SP Novembro 2007

FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELA SEO TCNICA DE AQUISIO E TRATAMENTO DA INFORMAO SERVIO TCNICO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAO UNESP - FCA LAGEADO - BOTUCATU (SP)

B519m

Bernardo, Eduardo Roberto de Almeida, 1972Controle da mancha preta dos frutos ctricos em cultivo orgnico e convencional e do bolor verde em ps-colheita / Eduardo Roberto de Almeida Bernardo. Botucatu : [s.n.], 2007 xi, 72 f. : grfs., tabs. Tese (Doutorado)-Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Cincias Agronmicas, Botucatu, 2007 Orientador: Wagner Bettiol Inclui bibliografia 1. Citros. 2. Fungos na agricultura. 3. Pragas agrcolas Controle biolgicos. 4. Guignardia. 5. Penicillium. I. Bettiol, Wagner. II. Universidade Estadual Paulista Julio de Mesquita Filho (Campus de Botucatu). Faculdade de Cincias Agronmicas. III. Ttulo.

OFEREO Camila, amor de minha vida e para toda uma vida, pelo companheirismo, amizade, confiana, dedicao, otimismo e felicidade a mim dados.

DEDICO Aos meus pais Luiz Adilson e Carmen, pelo incentivo, confiana e apoio depositados.

ii

HOMENAGEM

Ao meu orientador e amigo Prof. Dr Wagner Bettiol, pelo empenho, dedicao na conduo e realizao deste trabalho, convivncia, amizade e ensinamentos.

Ao meu grande amigo Dr. Daniel Cassetari Neto, da Universidade Federal do Mato Grosso, pelo estmulo, honestidade, exemplo profissional e os conhecimentos dispensados durante toda minha vida acadmica.

iii

AGRADECIMENTOS A Deus, por ter me dado coragem para superar todas as barreiras. CAPES, pela concesso da Bolsa de Estudo para a realizao deste trabalho. Embrapa Meio Ambiente, por toda a logstica oferecida para a realizao e conduo dos trabalhos. Aos funcionrios do Campo Experimental da Embrapa Meio Ambiente: Brasilino, Waldemore, Antonio, Larcio, Vicente, Abraho e Henrique, pelo indispensvel auxlio na realizao dos trabalhos. Aos Professores do Departamento de Proteo de Plantas, pela contribuio de cada um em minha formao profissional. Ao meu irmo, amigo e parceiro para todas as horas e nas horas mais difceis Tiago Zucchi, pela amizade, companheirismo e pacincia. Ao meu irmo Fbio Rogrio de Almeida Bernardo, Andra e meus sobrinhos queridos Annelise e Pedro. segunda famlia em Pouso Alegre-MG, composta por Miriam, Valdir, Joo Vitor, Diego, Rafael, Renata e D. Radda, pela amizade e acolhida recebida. Ainda em Pouso Alegre, Macrio, Cndida, Karina e Elias, pela amizade e considerao. Dirce, Ademar (Dem), Ricardo e Michele, pela amizade e carinho a mim dedicados. Aos amigos da Embrapa Meio Ambiente, em especial a Alexandre Sereda, lida, Luciana(s), Sarah, Zayame, Liliana e Manuel. Aos funcionrios do Laboratrio de Microbiologia da Embrapa Meio Ambiente Joo Luiz, Mrcia, Elke e Rosely, pelo carinho, dedicao, presteza e profissionalismo com que atuam. Aos pesquisadores da Embrapa Meio Ambiente, em especial aos Drs. Wagner Bettiol, Itamar Soares de Melo, Raquel Ghini e Clia M. M. Souza. Ao Sr. Paulo DAndrea, pela concesso do Microgeo e das reas de sua propriedade para a conduo dos estudos.

iv

seo de Ps-Graduao do Cmpus da FCA, pela presteza quando solicitada. Ao Conselho do Curso de Ps-Graduao em Agronomia, rea de Concentrao em Proteo de Plantas da Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias da UNESP/FCA, pela oportunidade de realizao dos trabalhos. A todos que, direta ou indiretamente, colaboraram para a realizao deste trabalho.

AGRADEO.

SUMRIO pgina LISTA DE TABELAS RESUMO..................................................................................................................... SUMMARY................................................................................................................. INTRODUO GERAL............................................................................................. REVISO DE LITERATURA.................................................................................... 1 Guignardia citricarpa............................................................................................... 1.1 Sintomatologia da pinta-preta................................................................................ 1.2 Medidas de controle da pinta-preta........................................................................ 1.2.1 Controle qumico................................................................................................. 1.2.2 Controle biolgico............................................................................................... 1.2.3 Biofertilizantes.................................................................................................... ____________________________Captulo I.............................................................. CONTROLE DA PINTA-PRETA DOS FRUTOS CTRICOS EM CULTIVO ORGNICO COM AGENTES DE BIOCONTROLE E PRODUTOS 11 11 13 14 15 18 22 48 vii viii x 1 3 3 5 6 6 7 8 48

ALTERNATIVOS....................................................................................................... Resumo......................................................................................................................... Abstract........................................................................................................................ Introduo.................................................................................................................... Materiais e Mtodos..................................................................................................... Resultado e Discusso.................................................................................................. Referncias Bibliogrficas.......................................................................................... ____________________________Captulo II............................................................ CONTROLE DA PINTA-PRETA DOS FRUTOS CTRICOS EM CULTIVO CONVENCIONAL COM BIOFERTILIZANTES...................................................... Resumo......................................................................................................................... Abstract........................................................................................................................ Introduo.................................................................................................................... Materiais e Mtodos.....................................................................................................

30 30 32 33 35

vi

Resultado e Discusso.................................................................................................. Referncias Bibliogrficas.......................................................................................... ____________________________CaptuloIII............................................................ CONTROLE BIOLGICO DE Guignardia citricarpa e Penicillium digitatum EM PS-COLHEITA DE LARANJA `PERA ORGNICA........................................... Resumo......................................................................................................................... Abstract........................................................................................................................ Introduo.................................................................................................................... Materiais e Mtodos..................................................................................................... Resultado e Discusso.................................................................................................. Referncias Bibliogrficas.......................................................................................... CONCLUSES........................................................................................................... REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.........................................................................

37 40 48

48 48 50 51 52 54 56 62 63

vii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Efeito de Paenibacillus lentimorbus, Bacillus subtilis e Streptomyces sp. na evoluo do nmero leses de Guignardia citricarpa em laranja `Pera orgnica em condio de ps-colheita.................................................................

Pgina

70

Efeito de Paenibacillus lentimorbus, Bacillus subtilis e Streptomyces sp. na severidade do bolor verde causado por Penicillium digitatum em frutos de laranja `Pra orgnicos....................................................................................... 71

Efeito de Paenibacillus lentimorbus, Bacillus subtilis e Streptomyces sp na incidncia do bolor verde em frutos de laranja Pra orgnicos........................ 72

viii

CONTROLE DA MANCHA PRETA DOS FRUTOS CTRICOS EM CULTIVO ORGNICO E CONVENCIONAL E DO BOLOR VERDE EM PS-COLHEITA. Botucatu, 2007. 83p. Tese (Doutorado em Agronomia/Proteo de
Plantas) Faculdade de Cincias Agronmicas, Universidade Estadual Paulista. Autor: EDUARDO ROBERTO DE ALMEIDA BERNARDO Orientador: WAGNER BETTIOL

RESUMO

O Brasil o maior produtor de laranja e o maior exportador mundial de suco concentrado. A pinta preta dos citros, causada por Guignardia citricarpa, uma doena de grande importncia econmica, principalmente para o Estado de So Paulo. O interesse no controle biolgico de fitopatgenos, como alternativa de controle e como forma de reduzir os problemas ocasionados pelo uso intensivo de fungicidas, tem levado ao desenvolvimento de tcnicas alternativas para uma agricultura mais sustentvel. O trabalho teve por objetivo avaliar o efeito de agentes de controle biolgico (Bacillus subtilis e Trichoderma harzianum) e produtos alternativos (biofertilizantes e leite) no controle da pinta preta dos frutos ctricos em cultivos convencional e orgnico. Alm disso, foi avaliado o efeito de Bacillus subtilis, Paenibacillus lentimorbus e Streptomyces sp. no controle de G. citricarpa e Penicillium digitatum em ps-colheita. Os experimentos em campo foram realizados em pomar de laranja`Valncia e `Pra, localizadas nos municpios de Conchal e Santa Eudxia, SP, respectivamente. Em cultivo convencional de `Valncia foram avaliados dois biofertilizantes (Microgeo e Bio2), nas safras 2003/2004 e 2004/2005, com 15 repeties por tratamento, sendo uma planta por repetio. As rvores foram pulverizadas em intervalos de 28 dias, sendo o incio em 08/12/03, para a safra 2003/2004 e 08/11/2004, para a safra 2004/2005. Na safra 2003/2004 as concentraes utilizadas do biofertilizante Microgeo foram 0; 10; 20; 30 e 40%. Na safra 2004/2005 foram repetidos os mesmos tratamentos da

ix

safra anterior e includo tratamento com o biofertilizante Bio2 nas concentraes de 0; 2,5; 5,0; 7,5 e 10%. Para as avaliaes foram utilizadas uma escala de notas de 1=0,5% a 6=49% da rea do fruto atacada. Os biofertilizantes apresentaram comportamento irregular, no reduzindo a severidade da doena em nenhuma das safras em estudo. Em cultivo orgnico num pomar de laranja `Pera os ensaios foram conduzidos nas safras 2004/2005 e 2005/2006, com os seguintes tratamentos: B. subtilis (107 e 108 ufc/mL); Milhocina (0,5%) + Melao (0,5%); T. harzianum (106 condios/mL); leite cru (5%) e Microgeo. O delineamento experimental adotado e as avaliaes foram as mesmas utilizadas na rea convencional. Nas duas safras o leite e o B. subtilis reduziram a severidade e apresentaram um nmero maior de frutos pertencentes s notas 1 e um nmero menor pertencentes s notas de 3 a 6. T. harzianum no foi eficiente no controle da doena. Os testes em ps-colheita foram realizados com frutos de laranja Pera orgnica, com inoculao artificial de P. digitatum e natural de G. citricarpa. Todos os tratamentos reduziram a severidade e a incidncia da podrido dos frutos causada por P. digitatum, sendo que B. subtilis e P. lentimorburs no diferiram do fungicida thiabendazole (1500g/mL), quando inoculados de forma conjunta e curativa, exibindo potencial para o seu controle em ps-colheita. Para G. citricarpa os agentes de biocontrole no foram eficientes na reduo da doena. ____________________________________________________________________________ Palavras chave: Mancha preta dos frutos ctricos, controle biolgico, Bacillus subtilis, Trichoderma harzianum, Paenibacillus lentimorbus, Streptomyces, pscolheita.

BIOCOMPATIBLE PRODUCTS FOR MANAGING CITRUS BACK SPOT (Guignardia citricarpa) AND BLUE MOLD (Penicillium digitatum) IN CONVENTIONAL AND ORGANIC SYSTEMS.
Tese (Doutorado em Agronomia/Proteo de Plantas) - Faculdade de Cincias Agronmicas, Universidade Estadual Paulista. Author: EDUARDO ROBERTO DE ALMEIDA BERNARDO Adviser: WAGNER BETTIOL

SUMMARY

Brazil is the worldwide biggest producer and exporter of orange and orange juice. The citrus black spot (CBS), caused by Guignardia citricarpa, is a disease of great economic importance, mainly for the So Paulo State. The interest in biological control of plant pathogens, as mitigation of the problems caused by intensive use of fungicides, has led to development of alternative techniques for a more sustainable agriculture. The objective of this work was to evaluate the effects of biocontrol agents (Bacillus subtilis and Trichoderma sp.) and other biocompatible products (cow milk and biofertilizers) for managing CBS in organic and conventional systems. Besides, the effect of B. subtilis, Paenibacillus lentimorbus and Streptomyces sp. for control of G. citricarpa and Penicillium digitatum, in post-harvest was also evaluated. The filed experiments were carried through in trees of `Valencia' and `Pera, located in Conchal and Santa Eudxia, SP, respectively. In `Valencia conventional system were evaluated two biofertilizers (Microgeo and Bio2). The experiments were conducted at harvests 2003/2004 and 2004/2005. The trees were sprayed in 28 days intervals, and the first was in 08 December 2003 in 2003/2004 harvest, and 08 November 2004 in 2004/2005 harvest.

xi

In the harvest of 2003/2004 the biofertilizer Microgeo concentrations used were 0, 10, 20, 30 and 40%. In the harvest 2004/2005, the same treatments of the last harvest were repeated and treatments with biofertilizer Bio2 (0; 2.5; 5.0; 7.5 and 10% concentrations) were included. Each treatment was composed by 15 repetitions, being each plant considered a repetition. The severity of the disease on 50 fruits at harvest stage collected randomly from each replication plant were evaluated by means of a six-category scale, which 1=0.5%, and 6=49% of fruit area with lesions. Biofertilizers presented irregular behavior and a reducing of severity was not observed for any of the harvests in study. In `Pera organic cropping systems the assays were carried through 2004/2005 and 2005/2006 harvests. In these experiments, the following treatments were done: B. subtilis (107 and 108 CFU ml-1); autoclaved Milhocina (0.5%) + Molasses (0.5%); Trichoderma sp. (106 conidia ml-1); cow milk (5%) and Microgeo. The experimental design adopted and the evaluations were the same ones used in the conventional area. In 2004/2005 and 2005/2006 harvests, milk and B. subtilis reduced the severity and increased the number of fruits at notes 1 and reduced the number to notes 3 to 6. T. harzianum was not efficient in the control of the disease. All treatments reduced the severity and incidence of P. digitatum in post-harvest, and B. subtilis and P. lentimorbus showed a similar result to the thiabendazole when inoculated at same time and 24h after, demonstrating the potential of these microorganisms for control of P. digitatum in post harvest. B. subtilis (1x108 cfu/mL), P. lentimorbus (1x108 cfu/mL) and Streptomyces sp. (1x108 cfu/mL) were not efficient to reduce the incidence of G. citricarpa in post-harvest. ____________________________________________________________________________ Keywords: Citrus black spot, biological control, Bacillus subtilis, Trichoderma harzianum,

Paenibacillus lentimorbus, Streptomyces sp., post-harvest.

INTRODUO GERAL

A citricultura de extrema importncia para o Brasil e grande fonte de divisas. Desde a dcada de 90, responsvel por 80% do comrcio internacional de suco concentrado de laranja (AGRIANUAL, 2002). Os Estados Unidos aparecem como segundo maior produtor, seguido pelo Mxico, China e Espanha. Desses, Estados Unidos e Espanha respondem por 18 e 38%, respectivamente, das exportaes de frutas frescas (BOTEON, 2006). A produo brasileira estimada em aproximadamente 450 milhes de caixas, sendo o Estado de So Paulo o maior produtor (80%). A maior parte dessa produo (80%) destinada produo de suco industrializado, gerando uma receita anual de mais de 2 bilhes de dlares (ABECITROS, 2007). O setor citrcola enfrenta srios problemas fitossanitrios que deprecia a qualidade do produto e diminu a produtividade. Dentre esses problemas, as doenas exercem fundamental papel, destacando-se a pinta preta dos frutos ctricos (PPC), causada pelo fungo Guignardia citricarpa Kiely (fase anamrfica: Plyllosticta citricarpa). A pinta preta dos citros, tambm denominada mancha preta dos citros, uma doena de grande importncia econmica. Ocorre na cultura em diferentes continentes, como frica, sia e Amrica do Sul (SUTTON; WATERSTON, 1966; KIELY,1948). No Brasil, encontra-se comprovadamente presente de forma epidmica, em mais de quarenta municpios produtores do Estado de So Paulo, Santa Catarina, Paran, Esprito Santo e

Amazonas e ainda nos estados de Minas Gerais, Rio Grande do Sul e Rio de Janeiro (FUNDECITROS, 2000). A doena de grande importncia para o Estado de So Paulo (FEICHTENBERGUER et al., 1997) e foi verificada, de forma mais severa, em pomares de limoeiro Siciliano e laranjeiras doces de maturao tardia, nos municpios de Conchal e Engenheiro Coelho/SP (GOES; FEICHTENBERGER, 1993). A doena, at o momento, apresenta seis tipos de sintomas em frutos (AGUILLAR-VILDOSO et al., 2002), sendo os mais comuns os do tipo mancha dura e os da falsa melanose (KOTZ, 1989). Alm da depreciao comercial no mercado de frutas frescas, o patgeno ocasiona queda precoce dos frutos, reduzindo a produo em at 80% (KLOTZ, 1978). Devido ao longo perodo de susceptibilidade dos frutos, vrias pulverizaes com fungicidas protetores ou sistmicos, isolados ou combinados, so necessrias, elevando o custo de produo. O controle realizado no Brasil baseado em informaes geradas por outros pases, principalmente frica do Sul, onde a doena relevante (GOES, 2002). Alm da elevao dos custos, problemas eminentes como a seleo de fungos resistentes aos produtos qumicos comumente utilizados, impactos negativos ao meio ambiente e problemas de sade pblica tm incentivado a comunidade cientfica e produtores na busca de novas tcnicas de manejo, visando uma maior sustentabilidade agrcola. Alm disso, para o cultivo orgnico, cuja procura por produtos pela sociedade crescente, os problemas com essa doena so altos, havendo necessidade de desenvolvimento de produtos alternativos. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito dos agentes de controle biolgico e de produtos biocompatveis no controle da pinta preta, estabelecer sua relao com os nveis de severidade da doena e avaliar seus efeitos em condies de pscolheita.

REVISO DE LITERATURA

O Brasil o maior produtor mundial de laranja e o maior exportador de suco (CITRUSFEAT, 2001; POLLACK, 2001). A rea cultivada brasileira de 820 mil hectares, dos quais 77% localizam-se na regio Sudeste, representando 49% de toda a produo nacional de frutas (ABECITRUS, 2007). Cerca de 80% dessa produo destinada produo industrial de suco para a exportao. So Paulo o maior produtor do Brasil, possuindo cerca de 760 mil hectares. Grande parte dessa produo destinada exportao de suco industrializado, gerando uma receita anual de mais de 2 bilhes de dlares (ABECITROS, 2007).

1 Guignardia citricarpa A pinta preta, causada por Guignardia citricarpa Kiely (fase anamrfica de Phyllosticta citricarpa McAlp. Van Der Aa), responsvel por elevados prejuzos na cultura dos citros, da ordem de vrios milhes de dlares em diferentes pases da frica, sia, Oceania e Amrica do Sul (GOES, 2002; REIS et al., 2006). Segundo GOES et. al. (2000), sua importncia, do ponto de vista econmico, se d ao fato de atingir variedades mais importantes, depreciar os frutos comercialmente, reduzir a produtividade, devido a queda precoce de frutas, e provocar alteraes nos padres tecnolgicos. A primeira descrio da doena e sua relao com o patgeno se deram na Austrlia em 1895 (KIELY, 1948). Em 1937 foi observada no Brasil em frutos coletados em uma feira livre na cidade de Piracicaba, no Estado de So Paulo (AVERNA-

SACC, 1940). Novos relatos foram feitos no Rio de Janeiro em 1980 (ROBBS et al., 1980), no Rio Grande do Sul, na dcada de 80 (GOES; FEICHTENBERGUER, 1993). No Brasil, encontra-se comprovadamente presente de forma epidmica, em mais de quarenta municpios produtores do Estado de So Paulo, Santa Catarina, Paran, Esprito Santo e Amazonas e ainda nos estados de Minas Gerais, Rio Grande do Sul e Rio de Janeiro (FUNDECITROS, 2000). Porm, a doena foi verificada de forma mais severa em pomares de limoeiro `Siciliano e laranjeiras doces de maturao tardia, nos municpios de Conchal e Engenheiro Coelho/SP (GOES; FEICHTENBERGER, 1993). A pinta preta possui duas fontes de inculo, sendo os condios e ascsporos. Os picnidisporos so formados em leses nos frutos, folhas e folhas cadas ao solo. Segundo Kotz (1981), os picnidisporos podem ser formados tambm em ramos mortos. Os ascsporos so formados exclusivamente em folhas cadas ao solo, no sendo encontrados em frutos ou leses de folhas aderidas s plantas (McONIE, 1965). O incio da sua produo se d por volta de 50 a 180 dias aps a queda das folhas (KOTZ, 1981), onde a liberao dos ascsporos acompanha a chuva, de tal forma que 3mm j podem ser suficientes para a liberao dos mesmos, desde que haja umidade prvia. A queda de folhas de plantas ctricas pode ocorrer durante todo o ano. Entretanto, fatores como estresse hdrico, desequilbrio nutricional, pragas e doenas podem aumentar essa absciso (FUNDECITROS, 1998). Diante disso, teoricamente, existe o potencial de que os pseudotcios e ascsporos possam ser formados durante o ano todo. As condies climticas que exercem maior ou menor impacto na produo, viabilidade e disperso. McOnie (1964) demonstrou na frica do Sul que o tempo necessrio para a formao e maturao dos pseudotcios de folhas cadas no ms de abril, era de 24 semanas, enquanto que as cadas nos meses de dezembro, de apenas seis semanas. Esse fato devia-se, exclusivamente, s diferenas das condies ambientes. A doena afeta folhas, ramos e frutos. Nos frutos, as leses restringem-se casca, impedindo sua comercializao no mercado de frutas frescas (MAUCHMANI; METRAUX, 1998). As perdas so mais severas nos limes e laranjas doces de maturao tardia, ocorrendo quedas prematuras. Segundo Kotz (1981), um aspecto importante a ser destacado referese ao longo perodo de incubao do fungo. Na presena de umidade, emitido um peg de

infeco, que penetra na cutcula do hospedeiro e se expande para dentro do tecido na forma de massa de miclio, permanecendo entre a cutcula e a epiderme, denominada de infeco quiescente, originando leses tpicas da doena. Os mecanismos envolvidos nesse processo no so conhecidos. Entretanto, sabe-se que os sintomas em nveis mais severos esto associados a uma elevao de temperatura por ocasio da maturao dos frutos e a uma maior incidncia de raios solares nos frutos mais expostos. Feichtenberger et al. (1997) relatam que os sintomas em folhas, ramos e frutos so mais freqentes nas faces da planta mais expostas aos raios solares, estresse hdrico e debilidade das plantas resultante de vrios fatores como doenas e desequilbrios nutricionais.

1.1 Sintomatologia da pinta preta Segundo Herbert (1989), quatro tipos de leses podem ser observados: x mancha dura sintoma mais comum e tpico da doena. Aparece quando os frutos

iniciam a maturao. Em frutos ainda verdes podem ser observados halos amarelados ao redor das leses e em frutos maduros observa-se um halo verde ao redor das leses, que apresentam o centro deprimido de cor marrom-claro ou cinza-escuro e os bordos salientes de colorao marrom-escura. No interior dessas leses aparecem pontuaes negras, que so os picndios do fungo. x mancha sardenta aparecem depois da maturao, com a casca apresentando colorao

bem amarelada ou laranja. As leses so avermelhadas e levemente deprimidas, podendo coalescer, formando uma grande leso, ou permanecer pequenas e individualizadas. x mancha virulenta desenvolvem-se normalmente no final da safra, com frutos

maduros e temperaturas elevadas. Pode ocorrer depois da colheita, durante o transporte e o armazenamento dos frutos. As leses aparecem como resultado do desenvolvimento e coalescncia de leses dos dois tipos anteriores, dando origem a grandes leses deprimidas de centro acinzentado e bordos salientes de colorao marrom-escuro ou vermelho-escuro. No centro dessas leses aparecem muitas pontuaes escuras, que so os picndios. A casca do fruto fica necrosada na rea da leso, mas a parte interna do fruto no afetada.

mancha do tipo falsa melanose normalmente encontra-se com cerca de 4-5 meses

aps a queda das ptalas. Caracteriza-se pela presena de manchas irregulares, sem textura spera ao tato, de tamanho variado, mas predominantemente pequenas. Nas fases subseqentes, as leses individualizadas so normalmente circundadas por numerosos pontos escuros, constituindo as leses satlites. Em tais leses, no so formados picndios. Segundo Goes et al. (2000), o sintoma mancha trincada aparece em frutos ainda verdes e caracterizam-se por manchas superficiais, irregulares, lisas e de tamanho variado, inicialmente com aspecto oleoso, escuro ou levemente castanhas. Nas manchas no so produzidos picndios e, de forma semelhante aos sintomas do tipo falsa melanose, normalmente no causa queda dos frutos, mesmo quando esses encontram-se severamente atacados. Quando os frutos atingem a maturidade, a casca dos frutos, correspondentes s reas lesionadas, apresenta trincas ou fissuras. H suspeita de que a mancha trincada esteja associada presena e conseqentes danos causados pelo caro da falsa ferrugem (Phyllocoptruta oleivora). Um sexto sintoma encontra-se associado, sendo denominado de mancha rendilhada, cujos sintomas caracterizam-se pela presena de leses superficiais, sem borda definida e de textura lisa quando os frutos esto verdes.

1.2 Medidas de controle da pinta preta 1.2.1 Controle qumico O controle baseia-se na aplicao de fungicidas, sejam eles protetores, sistmicos ou misturas deles, associada aos leos minerais ou vegetais (GOES et al., 1990, PRATES; NOGUEIRA, 1997). Segundo Goes (1998), melhores resultados so obtidos com pulverizaes a cada 50 a 55 dias com misturas de fungicidas sistmicos e protetores e de 28 dias para somente protetores (SCHUTTE et al., 1997). De acordo com Feichtenberger et al (1997), as medidas de controle para a pinta preta incluem o plantio de mudas sadias produzidas em regies livres da doena; remoo de frutos tempores infectados, antes do incio da florada, visando reduzir a fonte de inculo representada pelos picndios em leses de frutos; reduo da fonte de inculo (ascsporos); eliminao de plantas em estado de depauperamento avanado do pomar; manuteno das plantas em boas condies de nutrio e sanidade; pulverizaes visando proteo dos frutos durante o principal perodo de

suscetibilidade com fungicidas sistmicos (benzimidazis ou estrobirulinas) ou de contato (cobre ou mancozeb), preferencialmente de forma associados e acrescidos de leos mineral ou vegetal. Ainda, o controle varia de acordo com o destino da produo. Quando destina-se a produo industrial o controle em campo realizado com cobre adicionado a leo emulsionvel mineral ou vegetal, usando-se quatro ou cinco aplicaes aps a queda das ptalas. Para fruta in natura, recomenda-se a mistura de cobre misturado a leos nas primeiras pulverizaes, pois esses produtos podem provocar fitotoxidez aos frutos, alm de tornar mais evidente as manchas de origem abitica. Nas demais pulverizaes deve-se utilizar benzimidazis ou estrubirulinas misturadas a leo, aplicados de forma alternada. Os benzimidazis podem ser aplicados at trs semanas antes da colheita e em ps-colheita. No Brasil, o uso de fungicidas em ps colheita, restringem-se ao thiabendazol e imazalil (FISCHER et al., 2004; AGROFIT, 2006).

1.2.2 Controle biolgico Os problemas advindos do uso intensivo de fungicidas, como a seleo de fungos resistentes, impactos negativos ao ambiente, restries de ordem pblica e econmica, tem estimulado a busca de formas alternativas de controle de doenas, principalmente atravs da introduo massiva de antagonistas. Comercialmente o controle biolgico conceituado como o controle de um microrganismo por meio de outro microrganismo. Dentre os microrganismos mais estudados, encontram-se espcies do gnero Trichoderma (BASTOS, 1988; DUBOS et al., 1982; BETTIOL et al., 2003) e Bacillus subtilis (SONODA; GUO, 1996; KALITA et al., 1996; BETTIOL et al., 1994; FERREIRA et al., 1991). Kupper et al. (2006) relatam que na frica do Sul, a Universidade de Pretria comercializa um isolado de B. subtilis para o controle da mancha preta dos frutos ctricos, sendo esse o nico relato de produto biolgico para o controle dessa doena. A literatura apresenta diversos exemplos do potencial do controle biolgico de doenas da parte area (McKEEN et al., 1986; PUSEY et al., 1986; BAKER et al., 1985; BETTIOL et al., 1994; BETTIOL; VRZEA, 1992; MEDEIROS; MENESES, 1994; LORITO et al., 1994; INBAR; CHET, 1995; BENHAMOU et al., 1994; CARISSE et

al.,2000; CULLEN et al., 1984; GULLINO; GARIBALDI, 1983; BASTOS, 1988; DUBOS et al., 1982; PICCININ, 1996; FALK et al., 1996). Entretanto, so poucos os casos de sucesso comercial. Esse fato devido, principalmente, paralisao dos trabalhos em condies controladas de cultivo. Kupper et al. (2003) relataram que, em condies naturais, B. subtilis equiparou-se estatisticamente ao fungicida benomyl, proporcionando menor porcentagem de flores com sintomas de Colletotrichum acutatum e maior nmero de frutos de citros efetivos.

1.2.3. Biofertilizantes Outra opo econmica e de baixo impacto o uso de extratos aquosos de matria orgnica e biofertilizantes. Esses produtos possuem uma complexa e elevada comunidade microbiana, com presena de bactrias, fungos leveduriformes e filamentosos (WELTZIEN, 1989; CASTRO et al., 1992; McQUILKEN et al., 1994; ELAD; SHTIENBERG, 1994; YOHALEM et al., 1996; TRATCH; BETTIOL, 1997; BETTIOL, 1997). Alm da comunidade microbiana original, esses extratos podem ser bioativados com reconhecidos agentes de biocontrole (HAYASHIDA et al., 1989). A principal vantagem desta tcnica o custo, onde o agricultor no depende da compra deste material, mas sim apenas do aproveitamento de material disponvel na propriedade. Com isso, passaram a ser utilizados para o controle de doenas de parte area, que antes seriam controladas basicamente por fungicidas (BETTIOL, 2003). Weltzien e Ketterer (1986) verificaram o aumento da resistncia de folhas de videira contra mldio (Plasmopara viticola), quando essas foram mergulhadas ou pulverizadas com extratos aquosos de uma mistura de composto de esterco de cavalo, palha e solo. Weltzien (1989) obteve controle de P. viticola, Uncinula necator e Pseudopeziza tracheiphila em videira; Phytophthora infestans em batata e tomate; Erysiphe graminis em cevada; Erysiphe betae em beterraba aucareira; Sphaerotheca fuliginea em pepino e B. cinerea em morango e feijo, com aplicaes de extratos aquosos da mistura contendo esterco de cavalo, palha e solo compostados por 8-12 meses. A induo de resistncia foi um dos mecanismos envolvidos, porm o autor observou inibio direta dos fungos pelo extrato. McQuilken et al. (1994), utilizando extratos aquosos obtidos da mistura de esterco e palha compostada, obtiveram supresso do desenvolvimento de leses de B. cinerea em folhas de feijo. Tambm trabalhando com B. cinerea, Elad e Shtienberg (1994)

obtiveram controle em tomate, pimento e uva, pulverizando-os com extratos aquosos de compostos produzidos a partir da mistura de esterco de vaca e de galinha, e a partir de bagao de uva. Esses extratos controlaram parcialmente o odio (Leveillula taurica) de folhas de tomate. Yohalem et al. (1996), pulverizando semanalmente extratos aquosos de substrato exaurido da produo de cogumelo (Agaricus bisporus), observaram reduo na incidncia de sarna da macieira (Venturia inaequalis), embora os extratos no tenham sido to eficientes quanto o captan. O biofertilizante, produzido pela digesto anaerbia de esterco bovino, vem sendo recomendado para o controle de diversas doenas (SANTOS, 1992). Castro et al. (1991) verificaram inibio de Colletotrichum gloeosporioides, Thielaviopsis paradoxa, Penicillium digitatum, Fusarium e Cladosporium pelo biofertilizante. Tratch & Bettiol (1997) tambm observaram inibio do crescimento micelial de Alternaria solani, Stemphylium solani, Septoria lycopersici e B. cinerea e inibio da germinao de esporos de B. cinerea, A. solani, Hemileia vastatrix e Coleosporium plumierae. Zhang et al. (1996) induziram o controle de antracnose (Colletotrichum orbiculare) em folhas de pepino com substrato supressivo a Pythium. Entretanto, o mecanismo de aquisio de resistncia sistmica desconhecido. O uso de substrato capaz de induzir a resistncia sistmica tem como vantagens a facilidade de aplicao e a no necessidade de preparo do extrato. Alm do controle de patgenos, existe referncia dos biofertilizantes no efeito nutricional nas plantas (SANTOS, 1992; McQUILKEN et al., 1994). Contudo, como se trata de uma tcnica que vem sendo expandida, h necessidade de realizao de estudos para a determinao dos impactos no ambiente e na sade pblica. Para minimizar os possveis problemas sugere-se o uso de matria orgnica livre de metais pesados e de agentes nocivos sade pblica. Os biofertilizantes apresentam, tambm, em sua composio macro e micronutrientes, microrganismos e seus metablitos e compostos orgnicos e inorgnicos com efeitos sobre a planta e sobre a comunidade microbiana da folha e do solo (BETTIOL, 2003). O controle de doenas com biofertilizante pode ser devido presena de metablitos produzidos pelos microrganismos presentes no biofertilizante, como pela ao direta dos organismos sobre o patgeno ou sobre o hospedeiro. Ainda, pode ser considerada a ao direta dos nutrientes presentes no biofertilizante sobre os patgenos, alm do efeito nutricional na

10

planta (BETTIOL, 2003; McQUILKEN et al., 1994; SANTOS, 1992). O Bokashi, desenvolvido no Japo muito utilizado na agricultura natural e orgnica (PENTEADO, 2000), por exemplo, um adubo orgnico concentrado, rico em nitrognio, fsforo e potssio, utilizado em substituio aos fertilizantes qumicos tradicionais e rico em microrganismos. No existe frmula nica para o preparo do biofertilizante. De acordo com Bettiol et al. (1998), um grupo de produtores, alm de realizar a digesto do esterco pelo processo de fermentao, enriquece a suspenso com leite, acar ou melao, micronutrientes na forma de sais, resduos de peixe, farinha de ossos, sangue e fgado, aumentando, assim, o poder nutricional do produto final. Este biofertilizante conhecido como Supermagro. O biofertilizante lquido, quando aplicado em pulverizaes foliares, diludo em gua em propores que variam de 10% a 30% apresenta efeitos nutricionais considerveis, favorecendo a fixao de flores e de frutos e aumentando a rea foliar em diversas culturas, alm do efeito hormonal (SANTOS, 1992). Tambm existe a produo de biofertilizante por meio de digesto aerbica a partir de farelos de arroz e de trigo, farinha de trigo e de ossos, fub, rapadura e vsceras de peixe, sendo que, durante o processo, existe a necessidade de bomba de aerao para oxigenar o produto em fermentao. Os produtos finais, denominados biofertilizantes, so usados para fins nutricionais, alm de transformarem-se numa complexa mistura de vitaminas, hormnios e antibiticos, sem conhecimento do efeito ou do modo de ao no controle de doenas e de pragas (FERNANDES et al., 2000). Quando aplicado no solo, o biofertilizante propicia a melhoria de caractersticas fsicas como densidade aparente, porosidade, aerao e fertilidade e estimulando suas atividades biolgicas (SANTOS, 1992). Apesar dos benefcios creditados ao produto, h poucos relatos quantificando ou explicando seus efeitos.

11

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Controle da pinta preta dos frutos ctricos em cultivo orgnico com agentes de biocontrole e produtos biocompatveis
Eduardo R. A. Bernardo1 & Wagner Bettiol, W. 2
1

Faculdade de Cincias Agronmicas, UNESP, Departamento de Proteo de Plantas, Rua

Jos Barbosa de Barros, n 1780, CEP 18610-307, Botucatu, SP, Brasil, email: erabernardo@hotmail.com; 2Embrapa Meio Ambiente, CP. 69, CEP 13820-000, Jaguarina, SP, Brasil, email: bettiol@cnpma.embrapa.br

Autor para correspondncia: Eduardo Roberto de Almeida Bernardo ____________________________________________________________________________ BERNARDO, E. R. A. & BETTIOL,W. Controle da pinta preta dos frutos ctricos em cultivo orgnico com agentes de biocontrole e produtos biocompatveis. Tropical Plant Pathology,

RESUMO O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito de pulverizaes de agentes de controle biolgico (Bacillus subtilis e Trichoderma harzianum) e produtos biocompatveis (biofertilizante Microgeo e leite) no controle da pinta preta dos frutos ctricos. Os experimentos foram realizados em pomar de laranja `Pra conduzido no sistema orgnico, nas safras 2004/2005 e 2005/2006. Os tratamentos estudados foram: B. subtilis (107 e 108 ufc/mL); Milhocina (0,5%) + Melao (0,5%); T. harzianum (106 condios/mL); leite cru (5%) e biofertilizante Microgeo. Os produtos, com exceo de Microgeo, foram pulverizados a partir de 08/12/2004 e 09/12/05, respectivamente, nos intervalos de 28, 56, 84, 112, 140 e 168 dias aps a primeira pulverizao. O tratamento Microgeo foi pulverizado durante todo o

12

24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36

ano, em intervalos mensais. O delineamento experimental adotado foi o de blocos casualizados com 15 repeties. Para a determinao da severidade da doena empregou-se escala de notas que variou de 1 a 6 em 50 frutos coletados ao acaso, de cada repetio, por ocasio da colheita. A porcentagem de frutos classificados nas classes 1, 2 e de 3 a 6 foram calculados. Na safra 2004/2005, os tratamentos leite cru e B. subtilis (108 ufc/ml) apresentaram maior nmero de frutos pertencentes nota 1 (26,29 e 19,39%, respectivamente) e menor nmero pertencentes s notas de 3 a 6 (29,85 e 35,58%, respectivamente). Na safra 2005/2006, o tratamento com leite a 5% e B. subtilis (107 ufc/ml) exibiram maior nmero de frutos pertencentes s notas 1 (7,41 e 3,74%, respectivamente) e menor nmero de frutos pertencentes faixa de 3 a 6 (64,44 e 71,03%, respectivamente). O tratamento T. harzianum no reduziu a severidade da doena. Palavras-chave adicionais: Guignardia citricarpa, mancha preta dos frutos ctricos, controle alternativo, controle biolgico.

13

37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59

ABSTRACT Biocontrol and biocompatible products for managing citrus back spot (Guignardia citricarpa) in organic cropping systems. The objective of this study was to evaluate the effects of biocontrol agents (Bacillus subtilis and Trichoderma harzianum) and biocompatible products (milk and biofertilizer) to control of citrus black spot in organic cropping systems. To that effect, the following treatments were: B. subtilis (107 and 108 cfu/ml); autoclaved Milhocina (0.5%) + Molasses (0.5%); T. harzianum (106 conidia/mL); milk (5%) and Microgeo (commercial biofertilizer currently used by citrus organic farmers) were studying in 2004/2005 and 2005/2006. The products, except Microgeo, were sprayed at scheduled intervals (0, 28, 56, 84, 112, 140, and 168 days) from December 8th, 2004 and 09/12/05, respectively. The Microgeo treatment was sprayed along all year at a monthly interval. The experiment was conducted in a completely randomized blocks design with 15 replication trees of `Pera, located in Santa Eudxia, SP. The severity of the disease on 50 fruits at harvest stage collected randomly from each plant were evaluated by means of a six-category scale, where 1=0.5%, and 6=49% of fruit area with lesions. The percentage of fruits classified at class 1, 2 and 3 to 6 were calculated. In 2004/2005, milk and B. subtilis (108 cfu/ml) treatments did not differed significantly from each other and presented the higher percentage of fruits classified at class 1 (26.3% and 19.4%, respectively) and the lower percentage of fruits at class 3 to 6 (29.9% and 35.6%, respectively). In 2005/2006 harvest, the milk and B. subtilis (107 cfu/ml) treatments presented the higher percentage of fruits classified at class 1 (7.41 and 3.74%, respectively) and the lower percentage of fruits at class 3 to 6 (64.44 and 71.03%, respectively). T. harzianum treatment did not reduce the severity of disease.

14

60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83

Additional keywords: Guignardia citricarpa, citrus black spot, alternative control, biological control. ____________________________________________________________________________ INTRODUO A pinta preta dos citros, causada por Guignardia citricarpa (fase anamorfa: Phyllosticta citricarpa), responsvel por considerveis perdas em citros cultivados no estado de So Paulo. Causa a queda prematura dos frutos com severas redues de produtividade (Timmer, 1999). Os sintomas restringem-se ao flavedo dos frutos (Cardoso Filho, 2003), no alterando a qualidade, sendo possvel sua utilizao na produo de suco concentrado (Aguilar-Vildoso et al., 2002). O controle da doena baseia-se na aplicao de fungicidas protetores ou sistmicos ou misturas deles, associados a leos minerais ou vegetais (Goes, 2002). Segundo Goes (1998), os melhores resultados so obtidos com intervalos de pulverizaes de 50 ou 55 dias atravs da mistura de fungicidas sistmicos e protetores, e de 28 dias para somente os fungicidas protetores. Entretanto, problemas relacionados ao uso de fungicidas, como o surgimento de fungos resistentes, impactos negativos ao ambiente e restries de ordem pblica e econmica, estimulam a busca de novas alternativas de controle de doenas, principalmente pela introduo de agentes de biocontrole e de produtos alternativos. Alm disso, para o cultivo orgnico, cuja procura por produtos crescente, os problemas com essa doena so altos, havendo necessidade de desenvolvimento de produtos alternativos. Dentre os microrganismos mais estudados encontram-se espcies do gnero Trichoderma (Stefanova et al., 1999; Prasad et al., 2002) e Bacillus subtilis (Bettiol et al., 1994; Kalita et al., 1996; Kupper et al., 2002/2003). Outra opo econmica e de baixo

15

84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105

impacto o uso de extratos aquosos de matria orgnica e biofertilizantes. Esses produtos possuem uma complexa e elevada comunidade microbiana, com presena de bactrias e fungos leveduriformes e filamentosos (McQuilken et al., 1994; Elad & Shtienberg, 1994; Yohalem et al., 1996; Tratch & Bettiol, 1997; Bettiol, 2003; Kupper et al., 2006). A principal vantagem desta tcnica o custo, onde o agricultor no depende da compra deste material, mas sim apenas do aproveitamento de material disponvel na propriedade. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito dos agentes de controle biolgico e produtos biocompatveis no controle da pinta preta dos citrus e estabelecer sua relao com os nveis de severidade da doena.

MATERIAL E MTODOS Multiplicao dos agentes de biocontrole Os agentes de biocontrole foram obtidos da coleo de culturas da Embrapa Meio Ambiente. Para multiplicao de Bacillus subtilis (AP3), a partir de cultura pura mantidas em placas contendo Nutriente-gar (NA), colnias foram raspadas com ala e a suspenso obtida foi transferida para erlenmeyer contendo 500 mL de BD (batata-dextrose). O Erlenmeyer foi mantido em agitao a 180 rpm/min e temperatura ambiente por 72 horas. Decorrido esse perodo, 100 mL do caldo fermentado foi transferido para outros Erlenmeyers contendo 400 mL de BD, que foram submetidos s mesmas condies descritas. Para a fermentao em maior escala, foi utilizado um fermentador com capacidade de 50 L com injeo de ar, contendo meio constitudo de gua, melao de cana-de-acar (0,5% v/v), milhocina (0,5% v/v) e fosfato monobsico (0,3% p/v), autoclavados por 40 minutos a 1,5 atm. Ao meio foi

16

106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128

transferida a suspenso da bactria, anteriormente preparada, na proporo de 10% do volume e mantido sob aerao por 72 horas para a fermentao. Trichoderma harzianum foi multiplicado em meio slido composto de gros de arroz, contidos em sacos de polipropileno (25cm x 35cm), acrescidos de uma alquota de gua, lacrados e autoclavados por 20 minutos a 1,5 atm. Aps o resfriamento, ao meio foi transferida uma suspenso do isolado T01BA de Trichoderma (1 x 104 condios/mL) com auxlio de uma seringa bovina. Aps 7 a 10 dias, perodo necessrio para a colonizao e esporulao, os sacos de polipropileno contendo o fungo foram acondicionados em cmara fria (3 C).

Biofertilizante O biofertilizante Microgeo foi fornecido pela empresa Microbiol Indstria e Comrcio Ltda, Limeira, SP. Amostras de Microgeo foram analisadas quanto populao microbiana por ocasio das pulverizaes. Para tanto, amostras foram coletadas em garrafas PET esterilizadas, acondicionadas em refrigerador e mantidas a temperatura de 8o C 2 por 24 horas. Dessas amostras foram retiradas alquotas de 10 mL e realizada diluio em srie em gua destilada esterilizada. As suspenses foram transferidas para placas contendo os meios NA, meio King (KB) (King, 1954), Meio de Martin (Liu & Baker, 1980), e meio amidocasena-gar (ACA) (Williams & Davies, 1965), para a quantificao de bactrias totais e B. subtilis, Pseudomonas spp., actinobactrias e fungos. No caso especfico de Bacillus, as amostras foram submetidas a um choque trmico de 80o C por 20 minutos em banho-maria, antes do plaqueamento. Dezoito horas, em mdia, aps o plaqueamento, foi realizada a contagem do nmero de colnias, com exceo das actinobactrias, onde o perodo de avaliao estendeu-se at 15 dias.

17

129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150

Controle da doena em cultivo orgnico O experimento foi conduzido durante as safras 2004/2005 e 2005/2006 em pomar de laranja `Pra enxertada em limo cravo com 20 anos, localizado em Santa Eudxia, SP, com histrico da doena e cultivado desde o seu incio no sistema orgnico. Para as avaliaes, foram utilizadas as mesmas plantas em ambas as safras. Os produtos foram aplicados com

pulverizador tratorizado, sendo o volume de calda calibrado para atingir o incio do ponto de escorrimento (aproximadamente 12 L/planta). As rvores foram pulverizadas em intervalos de 28 dias, sendo o incio em 08/12/04, para a safra 2004/2005 e 09/12/05, para a safra 2005/2006, exceto para o tratamento com Microgeo, que foi mensal, pois prtica rotineira na propriedade. As concentraes de B. subtilis foram 107 e 108 ufc/mL, obtidas com o caldo fermentado pela bactria; a de T. harzianum foi de 106 condios/mL, e a de leite cru foi de 5%. Alm desses, foi includo um tratamento contendo o meio de cultivo utilizado para a fermentao de Bacillus (0,5% de milhocina, 0,5% de melao e 0,3% de fosfato monobsico). Cada tratamento foi composto por 15 repeties, sendo cada planta considerada uma repetio. As avaliaes foram realizadas em 50 frutos coletados ao acaso em cada planta. Esses frutos foram pesados e submetidos avaliao da severidade, utilizando-se a escala diagramtica de Spsito et al. (2004) para mancha dura: 1 - 0,5%; 2- 1,7%; 3 - 5,0%; 4 11,5%; 5 - 22,5%; 6 - 49,0% de rea lesionada. Com esses dados foram calculados os ndices de doena (ID) utilizando a frmula (ID=Fv/nX, onde F = nmero de frutos; v = nota; n = nmero total de frutos avaliados; X = nmero de classes de notas). Alm disso, foi calculada a porcentagem de frutos classificados nas classes 1, 2 e de 3 a 6.

18

151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173

Para o ano agrcola 2005/2006 tambm foi avaliada a decomposio de folhas ctricas, que so a principal fonte de inculo de G. citricarpa (McOnie, 1965/1964). A avaliao da taxa de decomposio foi feita pela anlise de perda de massa utilizando-se litter bags. Os litter bags e a metodologia adotada foi a de Fernandes et al. (2006), modificando-se o dimetro de malha para 0,5x0,5 cm e dimenses de 60 x 40 cm. Em cada litter bag foram adicionadas 100 gramas de folhas ctricas verdes e maduras. Os litter bags foram distribudos sob a projeo das copas de plantas adultas, simulando a queda natural do material formador da serapilheira. Os litter bags foram fixados ao solo, com auxlio de grampos metlicos, instalados no inicio do vero (08/12/05) e coletados aos 60, 120 e 180 dias. Aps a coleta, o contedo dos litter bags foi seco em estufa de circulao de ar forada (65C 5) at atingir peso constante. Em seguida, levados ao laboratrio onde o seu contedo foi examinado para retirada de partculas de solo e, posteriormente, sua massa foi determinada. A taxa de decomposio da serapilheira foi quantificada mediante avaliao de medida da perda de massa (Fernandes et al., 2006), com a seguinte frmula: Massa remanescente (%) = (massa final/massa inicial) x 100. Os dados foram submetidos anlise de varincia e as mdias comparadas foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, utilizando-se o programa SAS (2002).

RESULTADOS E DISCUSSO Os valores de ID calculados indicam que B. subtilis 107 (0,40 e 0,53); B. subtilis 108 (0,36 e 0,57); T. harzianum (0,47 e 0,62); meio de cultura (0,43 e 0,57); biofertilizante (0,43 e 0,57) e o leite (0,36 e 0,51), respectivamente para as safras 2004/2005 e 2005/2006 (Figura 1AB), no foram eficientes no controle da doena, quando considerado que Kupper et al.

19

174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196

(2006) verificaram ID=0,217 para o controle da pinta preta nas rvores pulverizadas com oxicloreto de cobre + carbendazim + mancozeb. Entretanto, h a necessidade de ser considerado que no existe tratamento padro para o controle da doena em cultivo orgnico. Para a safra 2004/2005, os tratamentos com Bacillus (108 ufc/mL) e leite (5%), apesar de no diferirem estatisticamente do tratamento controle, que foi o biofertilizante Microgeo, diferiu do tratamento com T. harzianum (Figura 1). Por outro lado, na safra 2005/2006 apenas o leite diferiu do Trichoderma. Leite e Bacillus (108 ufc/mL) apresentaram, na safra 2004/2005, as maiores porcentagens de frutos pertencentes nota 1 (26,3 e 19,4%, respectivamente) e a menor porcentagem pertencentes s notas de 3 a 6 (29, 85 e 35,58%, respectivamente) (Figura 2A), sendo mais eficientes que o biofertilizante, que apresentou 10,9 e 50,8%, respectivamente (Figura 2A). Trichoderma no foi eficiente no controle da doena apresentando 6,6% de frutos com nota 1 e 64,3% com notas entre 3 a 6 (Figura 2A). Na safra 2005/2006, os tratamentos leite e Bacillus (107 ufc/mL) apresentaram as maiores porcentagens de frutos pertencente nota 1 (7,41 e 3,74%, respectivamente) e as menores porcentagem pertencentes s notas de 3 a 6 (64,44 e 71,03%, respectivamente) (Figura 2B). Esses tratamentos foram mais eficientes que o biofertilizante, que apresentou 2,33 e 76,74% de frutos com notas 1 e de 3 a 6, respectivamente. Assim como na safra 2004/2005, Trichoderma apresentou a maior porcentagem de frutos com notas nas classes de 3 a 6 (87,68%) (Figura 2B). O efeito protetor do leite obtido no trabalho a primeira observao, pois esse produto apenas recomendado para o controle de odio (Bettiol et al., 1999). Assim, haveria a necessidade da realizao de mais estudos com esse produto biocompatvel, inclusive para entender o seu modo de ao. Se for confirmada a eficincia do leite, esse produto apresenta

20

197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219

amplas possibilidades de uso, pois a regio citrcola do estado, tambm produtora de grandes quantidades de leite. Aliado a isso, poderiam ser testados os subprodutos da indstria lctea. O fato de T. harzianum no ter sido eficiente no controle da doena indica que o organismo, originado do solo (Bernardo et al., 2003), no se adaptou ao ambiente da parte area das frutas ou que o mesmo no eficiente para esse patossistema. B. subtilis tem se mostrado eficiente no controle de vrios patgenos que ocorrem no filoplano, inclusive com diversos produtos comerciais disponveis no mercado mundial (Fravel, 2005). Segundo Knudsen e Spurr Jr. (1986), a habilidade de bactrias formadoras de esporos permanecerem metabolicamente dormentes por longos perodos, aumenta sua sobrevivncia na superfcie foliar, possibilitando sua permanncia em perodos secos, em temperaturas extremas e nas deficincias temporrias de nutrientes. Tal fato, provavelmente, tenha colaborado para a eficincia de B. subtilis no controle da pinta preta na safra 2004/2005. Kupper et al. (2006) relatam que na frica do Sul, a Universidade de Pretria comercializa um isolado de B. subtilis para o controle da mancha preta dos frutos ctricos, sendo esse o nico relato de produto biolgico para o controle dessa doena. Alm disso, Kupper et al. (2003) relataram que, em condies naturais, B. subtilis equiparou-se estatisticamente ao fungicida benomyl, proporcionando menor porcentagem de flores com sintomas de Colletotrichum acutatum, agente causal da queda prematura de frutos ctricos, e maior nmero de frutos de citros efetivos. A comunidade microbiana encontrada nos biofertilizantes varivel e depende da forma de produo (aerbio ou anaerbio) e do substrato utilizado na sua produo e composio (Fernandes, 2000; Kaffure et al., 2004). O biofertilizante Microgeo apresentou a carga microbiana, composta principalmente por bactrias (3 x 106 ufc/mL), sendo na sua

21

220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242

maioria Bacillus spp. (3,2 x 105 ufc/mL), Pseudomonas spp. (1,5 x 104 ufc/mL) e, em menor escala, actinobactrias (1,1 x 102 ufc/mL), que so organismos interessantes no controle biolgico de diversas doenas de plantas (Janisiewicz e Jeffers, 1997; Rui Jnior et al., 2007). Os dados populacionais encontrados no Microgeo diferem dos encontrados por Kupper et al. (2006), que comparando dois biofertilizantes, encontraram populaes de bactrias totais da ordem de 1,29 x 105 ufc/mL e Bacillus spp. de 3,6 x 104 ufc/mL. A comunidade de fungos do biofertilizante Microgeo utilizado foi de 5,5 x 105 ufc/mL. A decomposio das folhas ctricas cadas ao solo, em reas de ocorrncia da pinta preta, de extrema importncia, visto que dependendo da umidade, poca do ano e do estado de decomposio das folhas, so suficientes para a liberao dos ascsporos, sua principal fonte de inculo (Kotz, 1981). Segundo Swift et al. (1979) e Aerts (1997), os trs principais fatores que influenciam a decomposio, em ordem de importncia, so as condies climticas, composio qumica das folhas e os organismos presentes no solo, que so determinados pelo microclima. Neste trabalho, a taxa de decomposio manteve-se estvel durante o perodo de avaliao, no sendo observadas diferenas estatsticas entre os tratamentos. Nos primeiros 60 dias a perda de massa foi rpida, mantendo-se contnua at o final das avaliaes (Figura 3). Leite e B. subtilis, apesar de uma eficincia de controle inferior s apresentadas para os fungicidas (Kupper et al., 2006), podem ser teis para o controle da pinta preta dos citros em sistema de produo orgnico. Para tanto, h necessidade de adequar principalmente a poca de incio, bem como a freqncia pulverizaes, pois so produtos de contato e de baixa persistncia no ambiente. Entretanto, existem evidncias na literatura de potencial de uso de B. subtilis para plantas de ciclo longo e com doena que ocorre ao longo do perodo, como por

22

243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 264 265

exemplo, o controle da sigatoka-negra da bananeira e da antracnose em manga com o produto Serenade base de B. subtilis (Edgecomb & Manker, 2008).

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS AERTS, R. Climate, leaf litter chemistry and leaf litter decomposition in terrestrial ecosystems: a triangular relationship. Oikos 79:439-449. 1997. AGUILAR-VILDOSO, C.I., RIBEIRO, J.G.B., FEICHTENBERGER, E., GOES, A. & SPSITO, M. B. Manual Tcnico de Procedimentos da Mancha Preta dos Citros. Braslia. MAPA/SDA/DDIV. 2002. BERNARDO, E. R. A.; OLIVEIRA, J. C.; COIT, K. M. & NEMOTO, F. M. Aplicao de Trichoderma sp. no controle de Sclerotinia sclerotiorum e Rhizoctonia solani em cultivo de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) sob piv central no Oeste da Bahia. Resumos, 8o Simpsio de controle biolgico, So Pedro, SP. 2003. p.69. BETTIOL, W. Controle de doenas de plantas com agentes de controle biolgico e outras tecnologias. In: Campanhola, C. & Bettiol, W. Mtodos alternativos de controle fitossanitrio. Jaguarina: Embrapa, 2003. pp.191-215. BETTIOL, W.; ASTIARRAGA, B. D. & LUIZ, A. J. B. Effectiveness of cows milk against zucchini squash powdery mildew (Sphaerotheca fuliginea) in greenhouse conditions. Crop Protection 18:489-492. 1999. BETTIOL, W.; SAITO, M. L. & BRANDO, M.S.B. Controle da ferrugem do cafeeiro com produtos base de Bacillus subtilis. Summa Phytopathologica 20:119-122. 1994. CARDOSO FILHO, J.A. Efeito de extratos de albedo de laranja (Citrus sinensis) e dos indutores de resistncia cido saliclico, acilbenzolar-s-metil e Saccharomyces cerevisiae no

23

266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287 288

controle de Phyllosticta citricarpa (teleomorfo: Guignardia citricarpa). Tese de doutorado. Piracicaba SP. Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz". 2003. EDGECOMB, D.W. & MANKER, D.C. Serenade (Bacillus subtilis strain QST713) and Sonata (Bacillus pumilus strain QST2808), new biological tools for integrated and organic disease control programs. Summa Phytopathologica 34S:196-199. 2008. ELAD, Y. & SHTINBERG, D. Effect of compost water extracts on grey mould (Botrytis cinerea). Crop Protection 13:109-114. 1994. FERNANDES, M. C. A. O biofertilizante Agrobio. Informativo do Centro Nacional de Pesquisa de Agrobiologia, n. 13. EMBRAPA-Agrobiologia, Seropdica, Ano 4, setembro de 2000. In: A Lavoura, v.103, n.634, p.42-43, 2000. FERNANDES, M. M; PEREIRA, M. G.; MAGALHES, L. M. S.; CRUZ, A. R. & GICOMO, R. G. Aporte e decomposio de serapilheira em reas de floresta secundria, plantio de sabi (Mimosa caesalpiniaefolia Benth.) e andiroba (Carapa guianensis Aubl.) na Flona Mrio Xavier, RJ. Cincia Florestal 16:163-175. 2006. FRAVEL, D.R. Commercialization and implementation of biocontrol. Annual Review of Phytopathology 43:337-359, 2005. GOES, A. de. Controle da mancha-preta dos frutos ctricos. Laranja 19:305-20. 1998. GOES, A. Efeito da combinao de fungicidas sistmicos e protetores no controle da mancha preta dos frutos ctricos causados por Guignardia citricarpa. Summa Phytopatologica 28:9-13. 2002. JANISIEWICZ, W. J. & JEFFERS, S. N. Efficacy of commercial formulation of two biofungicides for control of blue mold and gray mold of apples in cold storage. Crop Protection 16:629-633. 1997.

24

289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311

KAFFURE, O. U., CRDOBA, C. A., NIEVES, J. S. & CASTELLANOS, D. Efecto de dos tipos de compost y un biofertilizante sobre algunas poblaciones microbianas edficas y su posible relacin con el desarrollo de un cultivo de zanahoria y cebolla en el municipio de Pueblo Rico (Risaralda, Colombia). Acta Biolgica Colombiana 9, n.2, 2004. KALITA, P., BORA, L.C. & BHAGABATI, K.N. Phylloplane microflora of citrus and their role in management of citrus canker. Indian Phytopathology 49:234-237. 1996. KNUDSEN, G. R. & SPURR Jr., H. W. Management of bacterial populations for foliar disease biocontrol. In: Mukerjl, K.G. & Garg, K.L. Biocontrol of Plant Diseases, CRC Press, Inc., Boca Raton, Flrida (Ed.). 1986. pp.83-92. KOTZ, J. M. Epidemiology and control of citrus black spot in South Africa. Plant Disease 65:945-50. 1981. KUPPER, K. C. & FERNANDES, N.G. Isolamento e seleo de Bacillus spp. para o controle de Colletotrichum acutatum em flores destacadas de lima cida Tahiti. Summa Phytopathologica 28: 292-295. 2002. KUPPER, K C ; BETTIOL, W ; GOES, A. ; SOUZA, P. S de & BELLOTTE, J A M . Biofertilizer for control of Guignardia citricarpa, the causal agent of citrus black spot. Crop Protection 25:569-573. 2006. LIU, S. D., BAKER, R.. Mechanism of biological control in soil suppressive to Rhizoctonia solani. Phytopathology 70:404-412. 1980. McONIE, K. C. Source of infection for black spot of citrus. The South African Citrus Journal 5:9. 1965. McONIE, K.C. The latent occurrence in citrus and other hosts of a Guignardia easily confused wit G. citricarpa, the citrus black spot pathogen. Phytopathology 54:40-43. 1964.

25

312 313 314 315 316 317 318 319 320 321 322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333

McQUILKEN, M. P.; WHIPPS, J. M. & LYNCH, J. M. Effects of water extracts of a composted manure-straw mixture on the plant pathogen Botrytis cinerea. World Journal Microbiology Biotechnology 10:20-66. 1994. MORETTO, K. C. K.; FERNANDES, N. G. & GOES, A. Controle biolgico de Colletotrichum acutatum, agente causal da queda prematura dos frutos ctricos. Fitopatologia Brasileira, 28:251-257. 2003. PRASAD, R. D.; RANGESHWARAN, R.; HEGDE, S. V. & ANUROOP, C. P. Effect of soil and seed application of Trichoderma harzianum on pigeonpea wilt caused by Fusarium udum under field conditions. Crop Protection 21:293-297. 2002. RUI JNIOR, S.; BELTRAN, R.; VICENT, A. ARMENGOL, J.; GARCA-JIMNEZ, J. & MEDEIROS, E. V. Biological control of Monosporascus cannonballus by Chaetomium. Fitopatologia Brasileira 3:70-74. 2007. SAS. Statistical Analysis System-Getting Started with the SAS Learning Edition. Carry, NC: SAS Institute Inc. 2002. SPSITO, M.B., AMORIM, L., BELASQUE JUNIOR, J., BASSANEZI, R.B. & AQUINO, R. Elaborao e validao de escala diagramtica para avaliao da severidade da mancha preta em frutos ctricos. Fitopatologia Brasileira 1:81-85. 2004. STEFANOVA, M.; LEIVA, A.; LARRINAGA L. & CORONADO, M. F. Actividad metablica de cepas de Trichoderma spp. para el control de hongos fitopatgenos del suelo. Rev. Fac. Agron. (LUZ) 16:509-516. 1999. SWIFT, M.; HEAL, O. W. & ANDERSON, J. M. Decomposition in terrestrial ecosystems. Studies in ecology. Blackwell Scientific, Oxford, UK. vol. 5. 1979.

26

334 335 336 337 338 339 340 341 342

TIMMER, L. W. Diseases of fruit and foliage. In: Timmer, L.W. & Duncan, L.W. (Eds.) Citrus Health Management. Saint Paul. APS Press. 1999. pp.107-115. TRATCH, R. & BETTIOL, W. Efeito de biofertilizante sobre o crescimento micelial e a germinao de esporos de alguns fungos fitopatognicos. Pesquisa Agropecuria Brasileira 32:1131-1139. 1997. WILLIAMS, S.T. & DAVIES F.L. Use of antibiotics for selective isolation and enumeration of actinomycetes in soil, Jounal of Genetic and Microbioly 38:251-261. 1965. YOHALEM, D.S.; NORDHEIM, E.V. & ANDREWS, J.H. The effect of water extracts of spent mushroom compost on apple scab in the field. Phytopathology 86:914-922. 1996.

27

343

0,60 A AB 0,40 AB AB B B

ndice de Doena (DI=fv/nX)

0,50

0,30 0,20

0,10

0,00 Th. Biof. Meio Tratamentos Bs7 Bs8 Leite

344
0,6 A AB 0,5 ndice de doena (ID=Fv/nX) AB AB AB B

0,4

0,3

0,2

0,1

0 Th. Biof. Meio Tratamentos Bs7 Bs8 Leite

345 346 347 348 349 350 351 352

Figura 1. Efeito do leite, Bacillus subtilis (Bs7 = 107 ufc/mL; Bs8 = 108 ufc/mL), Trichoderma harzianum (Th = 106 condios/mL), meio de cultura (Meio= 0,5% de melao de cana-de-acar + 0,5% de milhocina e 0,3% de fosfato monobsico) e biofertilizante (Biof.) no ndice de doena da pinta preta de frutos ctricos (Guignardia citricarpa), em laranja `Pera' orgnica. Safra 2004-2005. B) Safra 2005/2006. Mdias seguidas pela mesma letra maiscula no diferem entre si (Tukey 5%).

28

353 354
70,00
49,06 49,33 64,30

A B
50,80

60,00
38,80

38,20

38,81

50,00 % de frutos
26,29

43,86

45,03

11,87

12,13

19,39

30,00 20,00 10,00 -

Nota 1

6,56

10,99

Nota 2 Severidade

29,13

29,85

40,00

Nota 3-6

355
100,00
79,80 87,68 64,44

35,58

80,00 % de frutos 70,00 60,00 50,00

25,23 25,00

7,41

3,74

20,00
1,48

0,97

10,00 -

Nota 1

0,72

2,33

Nota 2 Severidade

11,59

30,00

18,72

20,93

40,00

28,15

Nota 3-6

Meio

Leite

Bs7

Bs8

Th.

Biof.

356 357 358 359 360 361 362 363

Figura 2. Efeito do leite, Bacillus subtilis (Bs7 = 107 ufc/mL; Bs8 = 108 ufc/mL), Trichoderma harzianum (Th = 106 condios/mL), meio de cultura (Meio= 0,5% de melao de cana-de-acar + 0,5% de milhocina e 0,3% de fosfato monobsico) e biofertilizante (Biof.) na porcentagem de frutas com notas 1, 2 e de 3 a 6 de severidade da pinta preta de frutos ctricos (Guignardia citricarpa), em laranja `Pera' orgnica. Safra 2004-2005. B) Safra 2005/2006. Mdias seguidas pela mesma letra maiscula no diferem entre si (Tukey 5%).

71,03

74,03

90,00

76,74

29

364
100,00 90,00 80,00 Massa remanescente (%) 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 Tempo (dias) Biof. Th. Meio Bs7 Bs8 Leite yBiof. = -0,4592x + 84,815 R2 = 0,8313 yTh. = -0,4664x + 84,717 R2 = 0,8341 yMeio = -0,4501x + 86,547 R2 = 0,8577 yBs7 = -0,4463x + 86,753 R2 = 0,8577 yBs8 = -0,4789x + 83,165 R2 = 0,8135 yLeite = -0,4746x + 85,985 R2 = 0,8609

365 366 367 368 369 370 371

Figura 3. Efeito do leite, Bacillus subtilis (Bs7 = 107 ufc/mL; Bs8 = 108 ufc/mL), Trichoderma harzianum (Th = 106 condios/mL), meio de cultura (Meio= 0,5% de melao de cana-de-acar + 0,5% de milhocina e 0,3% de fosfato monobsico) e biofertilizante (Biof.) na velocidade de decomposio de folhas ctricas.

30

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
1

Controle da pinta preta dos frutos ctricos em cultivo convencional com biofertilizantes
Bernardo E. R. A.1 & Bettiol W.2

Faculdade de Cincias Agronmicas, UNESP, Departamento de Proteo de Plantas, Rua

Jos Barbosa de Barros, n 1780, CEP 18610-307, Botucatu, SP, Brasil, e-mail: erabernardo@hotmail.com; 2Embrapa Meio Ambiente, CP. 69, CEP 13820-000, Jaguarina, SP, e-mail: bettiol@cnpma.embrapa.br

Autor para correspondncia: Eduardo Roberto de Almeida Bernardo ____________________________________________________________________________ Bernardo E. R. A. & Bettiol, W. Controle da pinta preta dos frutos ctricos em cultivo convencional com biofertilizantes. Tropical Plant Pathology

RESUMO O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito de dois biofertilizantes (Microgeo e Bio2) no controle da pinta preta dos frutos ctricos. Os experimentos foram realizados em pomar de `Valncia, nas safras 2003/2004 e 2004/2005. As rvores foram pulverizadas em intervalos de 28 dias, sendo o incio em 08/12/03, para a safra 2003/2004 e 08/11/2004, para a safra 2004/2005. No ensaio da safra 2003/2004 as concentraes utilizadas do biofertilizante Microgeo foram de 0, 10, 20, 30 e 40%, alm do tratamento qumico utilizado na propriedade. Os mesmos tratamentos foram repetidos na safra 2004/2005 nas mesmas plantas. Na safra 2004/2005 foi instalado outro ensaio com o biofertilizante Bio2 nas

31

24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46

concentraes de 0, 2,5, 5,0, 7,5 e 10%, no mesmo pomar. Cada tratamento foi composto por 15 repeties, sendo uma planta por repetio. O delineamento experimental adotado foi o de blocos casualizados com 15 repeties. Para a determinao da severidade da doena empregou-se escala de notas que variou de 1 a 6 em 50 frutos coletados ao acaso, de cada repetio, por ocasio da colheita. A porcentagem de frutos classificados nas classes 1, 2 e de 3 a 6 foram calculados. Tambm foi determinado o peso dos frutos. Na safra 2003/2004, os tratamentos com o biofertilizante Microgeo nas doses 30 e 40% e o qumico diferiram estatisticamente do tratamento controle, sendo os demais semelhantes entre si em relao aos nveis de severidade. Na safra 2004/2005 no foram observadas diferenas entre nenhum dos tratamentos. Ainda na mesma safra, dentre as plantas tratadas com o Bio2, apenas o tratamento qumico diferiu estatisticamente da testemunha, sendo os demais semelhantes entre si. Quando considerada a porcentagem de frutos por classe de severidade de doena, na safra 2003/2004, o tratamento qumico apresentou a maior porcentagem de frutos pertencentes s notas 1 e 2 (6,27 e 44,40%, respectivamente) e a menor porcentagem de frutos pertencentes s notas de 3 a 6 (49,33). Na safra seguinte (2004/2005), para a mesma rea, todos os tratamentos apresentaram porcentagens semelhantes ao tratamento controle que foram de 2,56, 11,88 e 85,56% para as notas 1, 2 e de 3 a 6, respectivamente. No experimento com Bio2 (safra 2004/2005), apenas o controle qumico apresentou uma discreta proporo superior de frutos pertencentes nota 2 (10,82%) e a menor proporo de frutos pertencentes s de 3 a 6 (87,20%), enquanto o tratamento controle apresentou 5,05 e 94,42% nas notas 2 e de 3 a 6, respectivamente. Palavras-chave adicionais: Guignardia citricarpa, biofertilizantes, controle

alternativo.

32

47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69

ABSTRACT Control of citrus black spot in convencional cropping systems by biofertilizer. The present work evaluates the effect of two biofertilizers (Microgeo and Bio2) in the control of the citrus black spot. The experiments were carried through in orange trees `Valencia', located in Conchal, SP, in harvests 2003/2004 and 2004/2005. The trees were sprayed in intervals of 28 days, the first application was in 08/12/03, for 2003/2004 harvest, and 08/11/2004, for 2004/2005 harvest. In the assay of the harvest 2003/2004, the biofertilizer Microgeo concentrations used were: 0, 10, 20, 30 and 40%, beyond the used chemical treatment similar used by grower. The same treatments had been repeated in 2004/2005 harvest in the same plants. In 2004/2005 another assay with the Bio2 was installed (concentrations 0, 2.5, 5.0, 7.5 and 10%). Each treatment was composed of 15 repetitions, being each plant considered a repetition. The severity of the disease on 50 fruits at harvest stage collected randomly from each plant were evaluated by means of a six-category scale, where 1=0.5%, and 6=49% of fruit area with lesions. The percentage of fruits classified at class 1, 2 and 3 to 6 were calculated. These fruits had been weighed. In 2003/2004, Microgeo in concentration of 30 and 40% and fungicides differed to the control, while the others treatments were similar between themselves in severity levels of disease. In 2004/2005, the severities were similar for all treatments. Still in the same harvest, amongst the plants sprayed with the Bio2, only the fungicide differed from the control, while the others were similar. When considered the percentage of fruits for class of disease severity, in harvest 2003/2004, it was observed that in the area sprayed with Microgeo the chemical treatment presented 6.27 and 44.40%, respectively , fruits to notes 1 and 2, and 49.33% notes of 3 to 6.

33

70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93

In the following harvest (2004/2005), for the same area, all the treatments had respectively presented similar percentages to control with 2.56, 11.88 and 85.56% for notes 1, 2 and of 3 to 6, respectively. In the area sprayed with Bio2 (2004/2005 harvest), only the fungicide presented superior ratio of pertaining fruits to note 2 (10.82%) and the lesser ratio of pertaining fruits to the ones of 3 to 6 (87.20%), while the control presented 5.05 and 94.42% in notes 2 and of 3 to 6, respectively. Key Words: Guignardia citricarpa, citrus black spot, alternative control. ____________________________________________________________________________ INTRODUO

A pinta preta dos citros, causada por Guignardia citricarpa (fase anamorfa: Phyllosticta citricarpa) responsvel por considerveis perdas em citros cultivados no estado de So Paulo. Causa a queda prematura dos frutos, com severas redues de produtividade (Timmer, 1999). A doena apresenta seis tipos de sintomas em frutos (Aguillar-Vildoso et al., 2002), sendo os mais comuns os do tipo mancha dura e os da falsa melanose (Kotz, 1988). Os sintomas restringem-se ao flavedo dos frutos (Cardoso Filho, 2003), no alterando a qualidade, sendo possvel sua utilizao na produo de suco concentrado (Aguilar-Vildoso et al., 2002). O controle da doena baseia-se na aplicao de fungicidas, sejam eles protetores, sistmicos ou misturas deles, associadas aos leos minerais ou no (Goes, 2002). Segundo Goes (1998), os melhores resultados so obtidos com intervalos de pulverizaes de 50 ou 55 dias com misturas de fungicidas sistmicos e protetores e de 28 dias para somente protetores. Entretanto, problemas relacionados ao uso de fungicidas, como o surgimento de fungos resistentes, impactos negativos ao ambiente, restries de ordem pblica e econmica e o

34

94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116

crescente aumento da procura de produtos orgnicos, estimula a busca de novas alternativas de controle de doenas, principalmente quanto introduo de agentes de biocontrole e de produtos alternativos. Uma alternativa econmica e de baixo impacto baseia-se no de uso de extratos aquosos de matria orgnica e biofertilizantes. Esses produtos possuem uma complexa e elevada comunidade microbiana, com presena de bactrias e fungos (Mcquilken et al., 1994; Elad & Shtienberg, 1994; Yohalem et al., 1996; Tratch & Bettiol, 1997; Bettiol, 2003; Kupper et al., 2006) sendo recomendados para o controle de vrias doenas (Zhang et al.; 1996; Tratch e Bettiol, 1997). Com isso, passaram a ser utilizados para o controle de doenas de parte area, comumente controladas basicamente por fungicidas (Bettiol, 2003). Os biofertilizantes apresentam tambm em sua composio macro e micronutrientes, microrganismos e seus metablitos e compostos orgnicos e inorgnicos com efeito sobre a planta e sobre a comunidade microbiana da folha e do solo (Bettiol, 2003). O controle de doenas com biofertilizantes pode ser devido presena de metablitos produzidos pelos microrganismos, como pela ao direta dos organismos sobre o patgeno ou sobre o hospedeiro. Ainda, pode ser considerada a ao direta dos nutrientes presentes no biofertilizante sobre os patgenos, alm do efeito nutricional na planta (Bettiol, 2003; Mcquilken et al., 1994; Santos, 1992). Apesar dos benefcios creditados aos biofertilizantes, h poucos relatos quantificando ou explicando seus efeitos. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito de dois biofertilizantes no controle da mancha preta.

35

117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139

MATERIAL E MTODOS Biofertilizante O biofertilizante Microgeo, produzido por fermentao aerbia foi fornecido pela empresa Microbiol Indstria e Comrcio Ltda, Limeira, SP. O biofertilizante Bio2 foi produzido a partir de fermentao aerbia utilizando hmus, farinha de osso, micronutrientes, solo, levedo de cerveja e melao. O processo de fermentao foi realizado em fermentador de recirculao aerada (modelo Vortex) por 24 horas. Amostras dos biofertilizantes foram analisadas quanto comunidade microbiana presente por ocasio das pulverizaes. Para tanto, amostras foram coletadas em garrafas PET esterilizadas, acondicionadas em refrigerador e mantidas a temperatura de 8o C 2 por 24 horas. Dessas amostras foram retiradas alquotas de 10 mL e realizada diluio em srie em gua destilada esterilizada. As suspenses foram transferidas para placas contendo os meios NA, meio King (KB) (King, 1954), Meio de Martin (Liu e Baker, 1980), e meio amido-casena-gar (ACA) (Williams e Davis, 1965), para a quantificao de bactrias totais e B. subtilis, Pseudomonas spp. e actinobactrias, respectivamente. No caso especfico de Bacillus, as amostras foram submetidas a um choque trmico de 80o C por 20 minutos em banho-maria, antes do plaqueamento. Dezoito horas, em mdia, aps o plaqueamento foi realizada a contagem do nmero de colnias, com exceo das actinobactrias, onde o perodo de avaliao estendeu-se at 15 dias.

Controle da doena em cultivo convencional O experimento foi conduzido durante as safras 2003/2004 e 2004/2005 em pomar comercial de laranja `Valncia enxertada em limoeiro cravo com 20 anos, localizado em Conchal, SP, com histrico da doena, conduzido no sistema convencional.

36

140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162

Os biofertilizantes foram aplicados com pulverizador tratorizado, sendo o volume de calda calibrado para atingir o incio do ponto de escorrimento (aproximadamente 12 L/planta). As rvores foram pulverizadas em intervalos de 28 dias, sendo o incio em 08/12/03, para a safra 2003/2004 e 08/11/2004, para a safra 2004/2005. Na safra 2003/2004 as concentraes utilizadas do biofertilizante Microgeo foram 0, 10, 20, 30 e 40%. Na safra 2004/2005 foram repetidos os mesmos tratamentos da safra anterior nas mesmas plantas. Alm disso, foi instalado nessa safra um ensaio com o biofertilizante Bio2 aplicado nas concentraes de 0, 2,5, 5,0, 7,5 e 10%. Cada tratamento foi composto por 15 repeties, sendo uma planta por repetio. O tratamento qumico padro da propriedade foi considerada como testemunha relativa (oxicloreto de cobre e carbendazim + mancozeb aos 84 e 140 dias aps a primeira pulverizao). As avaliaes foram realizadas em 50 frutos coletados ao acaso em cada planta. Esses frutos submetidos avaliao da severidade, utilizando-se a escala diagramtica de Spsito et al. (2004) para mancha dura: 1 - 0,5%; 2- 1,7%; 3 - 5,0%; 4 - 11,5%; 5 - 22,5%; 6 -49,0% de rea lesionada. Com esses dados foram calculados os ndices de doena (ID) utilizando a frmula (ID=Fv/nX, onde F = nmero de frutos; v = nota; n = nmero total de frutos avaliados; X = nmero de classes de notas). No ano agrcola 2005/2006 foi instalado um ensaio em pomar de laranja `Bahia, no municpio de Holambra (SP), onde foi avaliado o efeito do biofertilizante Bio2 (0, 2,5, 5, 7,5 e 10%), leite cru (5 e 10%), FishFrtil (1%) e qumico na decomposio de folhas ctricas, a principal fonte de inculo de G. citricarpa (McOnie, 1965). A avaliao da taxa de decomposio foi feita pela anlise de perda de massa utilizando-se litter bags. Os litter bags e a metodologia adotada foi a de Fernandes et al. (2006), modificando-se o dimetro de

37

163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185

malha para 0,5x0,5 cm e dimenses de 60 x 40 cm. Em cada litter bag foram adicionadas 100 gramas de folhas ctricas verdes e maduras. Os litter bags foram distribudos sob a projeo das copas de plantas adultas, simulando a queda natural do material formador da serapilheira. Os litter bags foram fixados ao solo, com auxlio de grampos metlicos, instalados no inicio do vero (09/12/05) e coletados aos 60, 120 e 180 dias. Aps a coleta, os litter bags foram secos em estufa de circulao de ar forada (65C 5) at atingir peso constante, sendo posteriormente retirada as partculas de solo e determinadas as massas. A taxa de decomposio da serapilheira foi quantificada mediante avaliao de medida da perda de massa (Fernandes et al., 2006), com a seguinte frmula: Massa remanescente (%) = (massa final/massa inicial) x 100.

RESULTADOS E DISCUSSO Para a safra 2003/2004, os tratamentos com o biofertilizante Microgeo nas doses 30 e 40% e o qumico diferiram estatisticamente do tratamento controle, sendo os demais semelhantes entre si (Figura 1A). Entretanto, na safra 2004/2005 no foram observadas diferenas entre os tratamentos, sendo ainda observada uma elevao do ID, quando comparado ao ano agrcola 2003/2004 (Figura 1B). Quando considerada a porcentagem de frutos por classe de severidade de doena, na safra 2003/2004, observa-se que o tratamento qumico apresentou a maior porcentagem de frutos pertencentes s notas 1 e 2 (6,27 e 44,40%, respectivamente) e a menor porcentagem de frutos pertencentes s notas de 3 a 6 (49,33) (Figura 2A). Nos demais tratamentos as porcentagens de frutos nas classes avaliadas foram semelhantes ao tratamento controle, que foi de 0,13, 9,73 e 90,13% pertencentes s notas 1, 2 e de 3 a 6, respectivamente (Figura 2A). Na

38

186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208

safra seguinte (2004/2005), para a mesma rea, todos os tratamentos apresentaram porcentagens semelhantes ao tratamento controle, que foram de 2,56, 11,88 e 85,56% para as notas 1, 2 e de 3 a 6, respectivamente (Figura 2B). Na safra 2004/2005, no ensaio com o biofertilizante Bio2, apenas o tratamento qumico (convencional) diferiu estatisticamente da testemunha, sendo os demais semelhantes entre si (Figura 3A). Na mesma safra (2004/2005), apenas o controle qumico apresentou uma discreto incremento de frutos pertencentes nota 2 (10,82%) e a menor proporo de frutos pertencentes s de 3 a 6 (87,20%), enquanto o tratamento testemunha apresentou 5,05 e 94,42% nas notas 2 e de 3 a 6, respectivamente (Figura 2B). O fato da irregularidade de eficincia dos biofertilizantes testados, nas pocas de avaliao, no os desclassificam como uma possibilidade de manejo da doena, fato tambm observado no controle qumico, cuja eficincia variou no mesmo perodo. Os microrganismos presentes nos biofertilizantes, uma vez adicionados superfcie foliar e de frutos podem encontrar um ambiente hostil, principalmente devido s variaes de temperatura, umidade, ao de raios ultravioletas e competio com outros organismos pr-existentes. Provavelmente, pulverizaes mais concentradas ou em intervalos menores de aplicao e adio de substncias protetoras, como leos adesivos, poderiam favorecer o estabelecimento dos agentes e seus compostos, aumentando sua eficincia. Os agentes de controle biolgico necessitam se estabelecer, at um determinado nvel crtico no interior das copas das rvores, antes que o efetivo controle possa ocorrer. Com isso, o estabelecimento do antagonista pode ser monitorado no campo em vrios intervalos, comeando com o incio de aplicao. Essa informao, associada com os dados de variaes climticas, seria importante para o estabelecimento de critrios prticos para a racionalizao da utilizao do controle biolgico.

39

209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231

A comunidade microbiana encontrada nos biofertilizantes varivel e depende da forma de produo (aerbio ou anaerbio) e do substrato utilizado na sua produo e composio (Fernandes, 2000; Kaffure et al., 2004). O biofertilizante Microgeo apresentou a carga microbiana, composta principalmente por bactrias (3 x 106ufc/mL), sendo na sua maioria Bacillus spp. (3,2 x 105 ufc/mL), Pseudomonas spp. (1,5 x 104 ufc/mL) e, em menor escala, actinobactrias (1,1 x 102 ufc/mL). O biofertilizante Bio2 apresentou uma comunidade composta por bactrias (3,2 x 108 ufc /mL), sendo na sua maioria Bacillus spp. (3,7 x 105 ufc /mL), Pseudomonas spp. (3,4 x 104 ufc/mL) e actinobactrias (3,8 x 102 ufc/mL) que so comprovadamente agentes de controle biolgico das mais variadas doenas de plantas (Jnior et al., 2007; Janisiewicz & Jeffers, 1997). Os dados populacionais encontrados nos dois biofertilizantes diferem dos encontrados por Kupper et al. (2006), que comparando dois biofertilizantes produzidos de forma aerbia e anaerbia, encontrou populaes de bactrias totais da ordem de 1,29 x 105 ufc/mL e Bacillus spp. de 3,6 x 104 ufc/mL. A taxa de decomposio manteve-se estvel durante o perodo de avaliao, no sendo observadas diferenas estatsticas entre os tratamentos em nenhuma das pocas (Figura 4). Nos primeiros 60 dias a perda de massa foi rpida, mantendo-se contnua at o final das avaliaes (Figura 4). A decomposio das folhas ctricas cadas ao solo, em reas de ocorrncia da pinta preta, de extrema importncia, visto que dependendo da umidade, poca do ano e do estado de decomposio das folhas, so suficientes para a liberao dos ascsporos, sua principal fonte de inculo (Kotz, 1981). Segundo Swift et al. (1979) e Aerts (1997), os trs principais fatores que influenciam a decomposio, em ordem de importncia, so as condies climticas, a composio qumica das folhas e os organismos presentes no solo, que so determinados pelo microclima.

40

232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS AERTS, R. Climate, leaf litter chemistry and leaf litter decomposition in terrestrial ecosystems: a triangular relationship. Oikos 79:439-449. 1997. AGUILAR-VILDOSO, C.I., RIBEIRO, J.G.B., FEICHTENBERGER, E., GOES, A. & SPSITO, M.B. Manual Tcnico de Procedimentos da Mancha Preta dos Citros. Braslia. MAPA/SDA/DDIV. 2002. BETTIOL, W. Controle de doenas de plantas com agentes de controle biolgico e outras tecnologias. In: Campanhola, C. & Bettiol, W. Mtodos alternativos de controle fitossanitrio. Jaguarina: Embrapa, 2003. pp.191-215, 2003. CARDOSO FILHO, J.A. Efeito de extratos de albedo de laranja (Citrus sinensis) e dos indutores de resistncia cido saliclico, acilbenzolar-s-metil e Saccharomyces cerevisiae no controle de Phyllosticta citricarpa (teleomorfo: Guignardia citricarpa). Tese de Doutorado. Piracicaba SP. Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz". 2003. ELAD, Y. & SHTINBERG, D. Effect of compost water extracts on grey mould (Botrytis cinerea). Crop Protection 13:109-114. 1994. FERNANDES, M. M; PEREIRA, M. G.; MAGALHES, L. M. S.; CRUZ, A. R. & GICOMO, R. G. Aporte e decomposio de serrapilheira em reas de floresta secundria, plantio de sabi (Mimosa caesalpiniaefolia Benth.) e andiroba (Carapa guianensis Aubl.) na Flora Mrio Xavier, RJ. Cincia Florestal 16:163-175. 2006. FERNANDES, M. C. A. O biofertilizante Agrobio. Informativo do Centro Nacional de Pesquisa de Agrobiologia, n. 13. EMBRAPA-Agrobiologia, Seropdica, Ano 4, setembro de 2000. In: A Lavoura 103:42-43. 2000.

41

255 256 257 258 259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277

GOES, A. de. Controle da mancha-preta dos frutos ctricos. Laranja 19:305-20. 1998. GOES, A. Efeito da combinao de fungicidas sistmicos e protetores no controle da mancha preta dos frutos ctricos causados por Guignardia citricarpa. Summa Phythopatologica 28:913. 2002. JANISIEWICZ, W. J. & JEFFERS, S. N. Efficacy of commercial formulation of two biofungicides for control of blue mold and gray mold of apples in cold storage. Crop Protection 16:629-633. 1997. JUNIOR, R. S.; BELTRAN, R. & VICENT, A. Controle biolgico de Monosporascus cannonballus com Chaetomium. Fitopatologia Brasileira 32:70-74. 2007, KAFFURE, O. U.; CRDOBA, C. A.; NIEVES, J. S. & CASTELLANOS, D. Efecto de dos tipos de compost y un biofertilizante sobre algunas poblaciones microbianas edficas y su possible relacin con el desarrollo de un cultivo de zanahoria y cebolla en el municipio de Pueblo Rico (Risaralda, Colombia). Acta Biolgica Colombiana, v.9, n.2. 2004. KING, E. O.; WARD, M. K. & RANEY, D. E. J. Lab. Clin. Med. 44:301-307. 1954. KOTZ, J. M. Black spot. In: WHITESIDE, J.O.,GARNSEY, S.M. & TIMMER, L.W. (Eds). Compendium of citrus disease. St. Paul: APS Press, 1988. pp.10-12. KOTZ, J. M. Epidemiology and control of citrus black spot in South Africa. Plant Disease 65:945-50. 1981. KUPPER, K. C.; BETTIOL, W. ; GOES, A. ; SOUZA, P. S. de & BELLOTTE, J. A. M. . Biofertilizer for control of Guignardia citricarpa, the causal agent of citrus black spot. Crop Protection 25:569-573. 2006. LIU, S. D. & BAKER, R. Mechanism of biological control in soil suppressive to Rhizoctonia solani. Phytopathology 70:404-412. 1980.

42

278 279 280 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298

McONIE, K. C. Source of infection for black spot of citrus. The South African Citrus Journal 5:9. 1965. McQUILKEN, M.P.; WHIPPS, J.M. & LYNCH, J.M. Effects of water extracts of a composted manure-straw mixture on the plant pathogen Botrytis cinerea. World Journal Microbiology Biotechnology 10:20-66. 1994. SANTOS, L. A. C. V. Biofertilizante lquido, o defensivo da natureza. Niteri: EMATER. 1992. (Agropecuria Fluminense, 8). SPSITO, M.B., AMORIM, L., BELASQUE JUNIOR, J., BASSANEZI, R.B. & AQUINO, R. Elaborao e validao de escala diagramtica para avaliao da severidade da mancha preta em frutos ctricos. Fitopatologia Brasileira 1:81-85. 2004. SWIFT, M.; HEAL, O. W. & ANDERSON, J. M. Decomposition in terrestrial exosystems. Studies in ecology. Blackwell Scientific, Oxford, UK, vol. 5. 1979. TIMMER, L. W. Diseases of fruit and foliage. In: Timmer, L.W. & Duncan, L.W. (Eds.) Citrus Health Management. Saint Paul. APS Press. 1999. pp.107-115. TRATCH, R. & BETTIOL, W. Efeito de biofertilizante sobre o crescimento micelial e a germinao de esporos de alguns fungos fitopatognicos. Pesquisa Agropecuria Brasileira 32:1131-1139. 1997. WILLIAMS, S.T. & DAVIES F.L. Use of antibiotics for selective isolation and enumeration of actinomycetes in soil. Journal of Genetic and Microbioly 38:251-261. 1965. YOHALEM, D.S.; NORDHEIM, E.V. & ANDREWS, J.H. The effect of water extracts of spent mushroom compost on apple scab in the field. Phytopathology 86:914-922. 1996.

43

299 300 301

ZHANG, W., DICK, W.A. & HOITINK, H.A.J. Compost-induced systemic acquired resistance in cucumber to Pythium root rot and anthracnose. Phytopathology 86:1066-1070. 1996.

44

0,80

A
0,70 0,64 A 0,60 ABC ndice de Doena (DI=Fv/nX) 0,60 0,62 AB 0,56 C 0,58 BC

0,50 0,43 D 0,40

0,30

0,20

0,10

Quimico Testemunha Microgeo 10% Microgeo 20% Microgeo 30% Microgeo 40% Tratam entos

302
0,80
0,70 A 0,72 A 0,76 A 0,76 A 0,76 A

0,75 A

0,70

0,60 ndice de Doena (ID=Fv/nx)

0,50

0,40

0,30

0,20

0,10

Convencional Testemunha Microgeo 10% Microgeo 20% Microgeo 30% Microgeo 40% Tratamentos

303 304 305 306 307 308

Figura 1. Efeito do biofertilizante Microgeo na severidade (ndice de Doena) da pinta preta dos frutos ctricos, causada por Guignardia citricarpa, em frutos de laranja `Valncia nas safras A) 2003/2004 e B) 2004/2005. Mdias seguidas pela mesma letra no diferem estatisticamente entre si (Tukey 5%).

45

309
90,74

90,53

90,13

90,00 80,00 70,00 % de Frutos

49,33

60,00 50,00 40,00 30,00

9,73 9,20 9,26 9,47 44,40

20,00
0,13 0,27

10,00 -

6,27

Nota 1

Nota 2 Severidade

16,67

Nota 3 a 6

Qumico

Testemunha

Biofertilizante 10%

Biofertilizante 20%

Biofertilizante 30%

Biofertilizante 40%

83,33

90,53

100,00

310
86,62 90,14

100,00
85,56 85,77

90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00

12,54 11,62 11,88 12,60

% de Frutos

20,00 10,00 Nota 1

2,79

1,76

2,56

1,69

2,72

1,08

Nota 2 Severidade

7,14

13,04

Nota 3 a 6

311 312 313 314

Qumico

Testemunha

Biofertilizante 10%

Biofertilizante 20%

Biofertilizante 30%

Biofertilizante 40%

Figura 2. Efeito do biofertilizante Microgeo na severidade da pinta preta (% de frutos com notas 1, 2 e 3 a 6) causada por Guignardia citricarpa em frutos de laranja `Valncia nas safras A) 2003/2004 e B) 2004/2005.

84,62

85,89

46

315
0,72
0,70 A

A
0,68 AB

0,70 ndice de Doena (DI=Fv/nX) 0,68

0,67 AB 0,66 AB 0,66 AB 0,66 AB

0,66 0,64 0,62 0,60 0,58 0,56 Convencional Testemunha Bio2 10% Bio2 7,5% Tratamentos Bio2 5,0% Bio2 2,5% gua
0,61 B

316
94,42 95,09 93,36 94,18

90,00 80,00 70,00 % Frutos 60,00 50,00 40,00 30,00

5,05 6,11 7,63

20,00
1,06 0,53 0,27 0,53 0,39 0,93

10,82

4,64

4,76

10,00 -

1,98

Nota 1

Nota 2 Severidade

3,44

87,20

100,00

Nota 3 a 6

Convencional

Testemunha

Biofertilizante 10%

Biofertilizante 7,5%

Biofertilizante 5,0%

Biofertilizante 2,5%

317 318 319 320 321 322

Figura 3. Efeito do biofertilizante Bio2 na severidade (ndice de Doena) da pinta preta dos frutos ctricos, causada por Guignardia citricarpa, (A) e na % de frutos com notas 1, 2 e 3 a 6 (B) em frutos de laranja `Valncia na safra 2004/2005. Mdias seguidas pela mesma letra no diferem estatisticamente entre si (Tukey 5%)

91,98

gua

95,63

47

65 60 55 50 Massa remanescente (%) 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Tempo (dias)
yTest = -0,3387x + 54,162 R2 = 0,9092 yBio 2,5% = -0,341x + 55,415 R2 = 0,9364 ybio2 5% = -0,343x + 57,168 R2 = 0,9611 yBio 10% = -0,3419x + 55,145 R2 = 0,9296 yLeite 5% = -0,3395x + 54,623 R2 = 0,922 yLeite 10%= -0,3377x + 53,909 R2 = 0,9083 yFF = -0,3419x + 55,753 R2 = 0,9417 yQuim = -0,3395x + 56,315 R2 = 0,9492 Test FF Bio2 10% Bio2 5% Bio2 7,5% Bio2 2,5% Leite 5% Leite 10% Quim

323 324 325 326

Figura 4.

Efeito do biofertilizante Bio2, leite e FishFrtil na velocidade de decomposio de folhas ctricas.

48

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
1

Controle biolgico de Guignardia citricarpa e Penicillium digitatum em ps-colheita de laranja `Pra orgnica Eduardo R. A. Bernardo1; Tiago D. Zucchi2; Wagner Bettiol3

Faculdade de Cincias Agronmicas, UNESP, Departamento de Proteo de Plantas, Rua

Jos Barbosa de Barros, n 1780, CEP 18610-307, Botucatu, SP, Brasil, e-mail: erabernardo@hotmail.com; 2Centro de Pesquisas Biotecnolgicas, Universidade de So Paulo, Av. Prof. Lineu Prestes, 1374, 05508-900, So Paulo, SP, Brasil. e-mail:

tdzucchi@terra.com.br; 3Embrapa Meio Ambiente, CP 69; 13820-000 Jaguarina, SP, Brasil. e-mail: bettiol@cnpma.embrapa.br

Autor para correspondncia: Eduardo Roberto de Almeida Bernardo ____________________________________________________________________________ Bernardo, E. R. A.; Zucchi, T.D. & Bettiol, W. Controle biolgico de Guignardia citricarpa e Penicillium digitatum e em ps-colheita de laranja `Pra orgnica.

RESUMO O presente trabalho avaliou o efeito de Bacillus subtilis, Paenibacillus lentimorbus e Streptomyces sp. na reduo da incidncia de Guignardia citricarpa e no controle de Penicillium digitatum em ps-colheita de frutos de laranja `Pra orgnica. No estudo com Guignardia citricarpa, foram utilizados frutos naturalmente infestados com o patgeno no campo que apresentavam sintomas da doena. Os frutos foram mergulhados, separadamente, por 5 minutos, na suspenso contendo 1x108 ufc/mL, de P. lentimorbus, B. subtilis e

49

24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37

Streptomyces sp. e incubados 25oC2C. Os frutos foram avaliados contando-se as leses antes e aps o tratamento. Para P. digitatum foram realizados trs ferimentos nos frutos (0,5 mm de dimetro x 10 mm de profundidade) e depositados 50L da suspenso de P. digitatum (1x105 condios/mL). Os tratamentos foram feitos aplicando-se os agentes de controle (1x108 cfu/mL) 24h antes, aps e simultaneamente inoculao do patgeno. Foram avaliadas a incidncia e a severidade da doena em cada ponto de inoculao. Os tratamentos foram comparados com as testemunhas, com e sem inoculao do patgeno, e com o fungicida thiabendazole (1500g/mL). Para G. citricarpa no foram verificadas diferenas significativas entre os tratamentos quando comparados com a testemunha. Por outro lado, todos os tratamentos reduziram severidade e a incidncia de P. digitatum, com destaque para B. subtilis e Paenibacillus sp. que no permitiram o estabelecimento do patgeno quando aplicados 24h antes ou simultaneamente ao patgeno. Palavras chave: Citrus sinensis, Phylosticta citricarpa, controle alternativo, bolor verde, pinta preta dos citrus, controle biolgico.

50

38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61

ABSTRACT Biological control of Guignardia citricarpa and Penicillium digitatum in post-harvest of organic orange fruits `Pra. This work evaluated the effect of Bacillus subtilis, Paenibacillus lentimorbus and Streptomyces sp. in control of Guignardia citricarpa and Penicillium digitatum in post-harvest of organic orange fruits. In the study with Guignardia citricarpa, were used fruits with natural occurrence of disease in field. The fruits were dived, separately, per 5 minutes, in a suspension (1x108 cfu/mL) of P. lentimorbus, B. subtilis and Streptomyces sp. The fruits were evaluated counting the injuries before and after the treatment. The P. digitatum experiments were carried through three wounds on the fruits (0,5 mm of diameter x 10 mm of depth) and deposited 50L of the suspension of P. digitatum (1x105 conidia/mL). The treatments were made applying the agents of control (1x108 cfu/mL) 24h before, after and simultaneously inoculation of the P. digitatum. The incidence and the severity of the disease in each point of inoculation were evaluated. The treatments were compared with the control, with and without inoculation of the P. digitatum, and with the fungicide thiabendazole (1500g/mL). For G. citricarpa were not verified significant differences between the treatments when compared with the control. On the other hand, all the treatments reduced severity and the incidence of P. digitatum, with prominence for B. subtilis and P. lentimorbus, which had not allowed the establishment of the P. digitatum when applied 24h before or simultaneously. Key Words: Citrus sinensis, Phylosticta citricarpa , Citrus black spot, green mold, alternative control, biological control. ____________________________________________________________________________

51

62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

INTRODUO O Brasil o maior produtor de laranja e o maior exportador de suco (Citrusfeat, 2001; Pollack, 2001). Dentre as variedades plantadas, a laranja `Pra representa 41% do total, sendo comercializada principalmente in natura (Amaro & Maia, 1997). Dentre as doenas mais importantes em ps-colheita, destacam-se a pinta preta, causada por Guignardia citricarpa, e os bolores, causados pelo fungo Penicillium spp. (Franco & Bettiol, 2002). A pinta preta dos citros responsvel por considerveis perdas em pomares cultivados no estado de So Paulo, provocando a queda prematura dos frutos, com severas redues na produtividade (Timmer, 1999). Os sintomas restringem-se ao flavedo dos frutos (Cardoso Filho, 2003), no alterando a qualidade, sendo possvel sua utilizao na produo de suco concentrado (Aguilar-Vildoso et al., 2002). Entretanto, mesmo aps tratamento e rigorosa seleo dos frutos, os sintomas ocorrem no transporte, no armazenamento e no destino final. No caso da pinta preta, alm da importncia na reduo da produo, a doena apresenta barreiras quarentenrias o que limita o setor (Noronha, 2002). No caso dos bolores, os mais comuns so o bolor verde e azul, sendo o verde o mais freqente nas regies produtoras do Brasil (Feichtenberguer et al., 1997). Para essa doena, em ps-colheita recomenda-se aplicaes de thiabendazole e imazalil (Fischer et al., 2004). Como mtodos gerais para o controle de doenas em ps-colheita, incluem-se os fsicos (temperatura, modificao de atmosfera, radiao), qumicos (sanificantes e fungicidas de contato/sistmicos), biolgicos (antagonistas) e alternativos (produtos naturais, indutores de resistncia, etc.) (Benato, 1999). Os problemas relacionados ao uso de fungicidas, como contaminao alimentar, impactos negativos ao ambiente e restries de ordem pblica e econmica, tem estimulado a busca de novas formas de controle de doenas de plantas, e

52

85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107

dentre essas encontra-se a utilizao de agentes de biocontrole e de produtos alternativos. Alm disso, no cultivo orgnico, cuja procura por produtos crescente, os problemas com essas doenas so altos, havendo necessidade de desenvolvimento de produtos e tcnicas alternativas para a otimizao da produo. Nos ltimos anos, o uso indiscriminado de agrotxicos tem levado a um aumento da percepo pblica com relao aos danos que essas molculas podem causar aos seres humanos e ao ambiente (Bechor et al., 2002; Zucchi et al., 2005). Neste contexto, o controle biolgico de fitopatgenos mostra-se como uma alternativa vivel para diminuir os riscos relacionados aos fungicidas (Cook, 2000). O presente trabalho teve por objetivo avaliar o potencial de agentes de controle biolgico na reduo G. citricarpa e Penicillium digitatum em ps-colheita em frutos de laranja `Pra orgnica.

MATERIAL E MTODOS Os agentes de controle utilizados so provenientes do banco de organismos da Embrapa Meio Ambiente. Para multiplicao de Bacillus subtilis (AP3), Paenibacillus lentimorbus (Cont-1) e Streptomyces sp. (ASBV-1), a partir de cultura pura mantidas em placas contendo BDA, colnias foram raspadas com ala e a suspenso obtida foi transferida para erlenmeyer contendo 500 mL de meio de cultura LB (Sambrook et al., 1989). Os erlenmeyers foram mantidos em agitao a 180 rpm/min e temperatura ambiente por 72 horas. Decorrido esse perodo, 100 mL do caldo fermentado foi transferido para outros Erlenmeyers contendo 400 mL de LB, que foram submetidos s mesmas condies anteriores. As concentraes de todos os agentes de biocontrole foram ajustadas para 1x108 ufc/mL.

53

108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130

Para o ensaio com G. citricarpa, frutos de laranja `Pra orgnica foram selecionados de acordo com a quantidade de doena presente, sendo escolhidos os que apresentavam poucos sintomas. P. digitatum foi isolado de laranja `Pra com sintomas de bolor verde. O isolamento foi feito direto das leses transferindo-se os condios para meio de cultura BDA. Em seguida, foram incubadas at o aparecimento das colnias. Para os ensaios, a concentrao do patgeno foi ajustada para 1x105 condios/mL. No ensaio com G. citricarpa, no foi realizada inoculao artificial, mas foram utilizados frutos naturalmente infestados no campo e apresentando sintomas da doena. Aps a desinfestao superficial, os frutos foram mergulhados, separadamente, por 5 minutos em suspenso contendo 1x108 cfu/mL de P. lentimorbus, B. subtilis e Streptomyces sp. Em seguida, os frutos foram dispostos sobre papel absorvente ao ar livre para a secagem. Depois de secos, foram acondicionados em bandejas de papelo e incubados 25oC2 e umidade relativa mdia de 78%. Foi realizada uma avaliao inicial e a cada 4 dias fez-se a contagem de novas leses que surgiam nos frutos. Para cada tratamento foram utilizados 10 frutos, considerados uma repetio. Ao final de 16 dias foram realizadas avaliaes da evoluo da doena em relao avaliao inicial. No ensaio com P. digitatum, frutos maduros de laranja `Pra orgnico, foram desinfestados superficialmente pela imerso em soluo de hipoclorito de sdio (0,5%) durante trs minutos, em seguida, lavados duas vezes em gua destilada e dispostos sobre papel absorvente ao ar livre para a secagem. Para a inoculao de P. digitatum foram realizados ferimentos (0,5mm de dimetro x 0,3mm de profundidade), onde foi removido o flavedo, em trs pontos eqidistantes na regio equatorial dos frutos. Aps essa etapa, em cada ferimento, foram depositados 50L da suspenso de condios (1x105 condios/mL) com

54

131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152

auxlio de uma micropipeta. Os tratamentos foram os mesmos utilizados no ensaio de G. citricarpa e adicionalmente foi includo o fungicida thiabendazole (1500g/mL). Os agentes de biocontrole foram aplicados preventivamente (24h antes da inoculao do patgeno), simultaneamente inoculao do patgeno e de forma curativa (24h aps a inoculao do patgeno). Foram avaliadas a incidncia e a severidade (%Severidade = Dimetro mdio das leses/altura mdia dos frutos x 100) em cada ponto de inoculao (Franco & Bettiol, 2002). Todos os produtos foram comparados com as testemunhas, com e sem inoculao do patgeno, e com o fungicida.

RESULTADOS E DISCUSSO Apesar de redues no nmero de leses de G. citricarpa em at 30% em relao testemunha, essas diferenas no foram significativas (Tabela 1). Mesmo com esses resultados, esse fato no descarta esses agentes como potenciais para o controle biolgico em ps-colheitas, visto que Bacillus tem mostrado eficincia no controle de vrias doenas em ps-colheita (Florianowicz, 2001; Janisiewicz & Jeffers, 1997). Penicillium digitatum foi controlado totalmente quando P. lentimorbus e B. subtilis foram aplicados simultaneamente inoculao do patgeno, o mesmo ocorrendo com a aplicao do fungicida. Entretanto, para Streptomyces observou-se uma severidade de 59,34% e uma incidncia de 8,33% (Tabelas 2 e 3). Aplicando-se os agentes de controle 24h aps a inoculao de P. digitatum, os resultados foram semelhantes aos obtidos com a aplicao simultnea. Dessa maneira, thiabendazole, P. lentimorbus e B. subtilis no permitiram o estabelecimento do patgeno, enquanto que para Streptomyces sp. houve aumento de

55

153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172

eficincia quando aplicado de forma curativa. Esse resultado pode ser atribudo a um desenvolvimento mais lento desse organismo em relao s demais. Os agentes de biocontrole, quando foram aplicados antes da inoculao de P. digitatum, reduziram a severidade da doena. Entretanto, thiabendazole no permitiu o estabelecimento do patgeno e no foi observada incidncia do patgeno nos frutos (Tabelas 2 e 3). Dentre os agentes de controle, a menor severidade da doena foi constatada para P. lentimorbus (50%), seguido por B. subtilis (61,09%) e Streptomyces sp. (72,96%), com incidncia do patgeno de 25, 25 e 100%, respectivamente (Tabelas 2 e 3). Assim, em todos os momentos de inoculao, os agentes de controle biolgico reduziram em maior ou menor grau a severidade e a incidncia da doena nos frutos. Franco & Bettiol (2000), utilizando B. subtilis em inoculao conjunta com o patgeno, observaram uma severidade de 52,5% e uma incidncia de 70%. Neste trabalho, somente de forma preventiva B. subtilis permitiu o estabelecimento da doena (severidade de 69,0% e incidncia de 25%) (Tabelas 2 e 3). Provavelmente, para todos os organismos avaliados no esteja ocorrendo um s mecanismo de ao por parte dos antagonistas na reduo da doena. Produo de enzimas lticas e/ou antibiticos, competio por nutrientes e espao e parasitismo podem estar associados, havendo necessidade de maiores estudos em condies de armazenamento e transporte, pois estudos mostram que o controle biolgico de P. digitatum em ps-colheita de citrus vivel (Droby et al., 1998; Huang et al., 1992; Wilson & Chalutz, 1989).

56

173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS AGUILAR-VILDOSO; C. I., RIBEIRO, J. G. B.; FEICHTENBERGER, E.; GOES, A. & SPSITO, M.B. Manual Tcnico de Procedimentos da Mancha Preta dos Citros. Braslia. MAPA/SDA/DDIV. 2002. AMARO, A. A. & MAIA, M. L. Produo e comrcio de laranja e de suco no Brasil. Laranja 18:1-26. 1997. BECHOR, O.; SMULSKI, D. R.; VAN DYK, T. K.; LAROSSA, R. A. & BELKIN, S. Recombinant microorganisms as environmental biosensors: pollutants detection by Escherichia coli bearing fabA::lux. J. Biotechnol. 94:125132. 2002. BENATO, E. A. Controle de doenas ps-colheita em frutas tropicais. Summa Phytopathologica 25:90-93. 1999. CARDOSO FILHO, J.A. Efeito de extratos de albedo de laranja (Citrus sinensis) e dos indutores de resistncia cido saliclico, acilbenzolar-s-metil e Saccharomyces cerevisiae no controle de Phyllosticta citricarpa (teleomorfo: Guignardia citricarpa). Tese de Doutorado. Piracicaba SP. Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz". 2003. CITRUSFEAT. Fresh citrus situation. FASonline. Horticultural & Tropical ProductsDivision. 2001(www.faz.usda.gov/htp/circular/2001/10/08/citrusfeat.htm). (16 set. 2002). COOK, R. J. Advances in plant health management in the Twentieth century. Annu. Rev. Phytopathol. 38:95-116. 2000. DROBY, S.; COHEN, L.; DAUS, A.; WEISS, B.; HOREV, B.; CHALUTZ, E.; KATZ, H.; KEREN-TZUR, M. & SHACHNAI, A. Commercial testing of aspire: a yeast preparation for the biological control of postharvest decay of citrus. Biological Control 12:97-101. 1998.

57

195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218

FEICHTENBERGER, E.; MULLER, G.W. & GUIRADO, N. Doenas dos citros. In: Kimati, H., Amorim, L., Bergamin Filho, A., Camargo, L.E.A. & Rezende, J.A.M. (Ed.). Manual de Fitopatologia v.2. So Paulo. Editora Ceres. 1997. pp.261-296. FISCHER, I.H. & SPSITO, M.B.; LOURENO, S.A.; AMORIM, L. Eficincia dos fungicidas thiabendazole + imazalil, aplicados previamente ou em mistura cera, no controle do bolor verde em citros. Brazilian Journal of Plant Physiology 16:22. 2004. (Resumo) FLORIANOWICZ, T. Antifungal activity of some microorganisms against Penicillium expansum. European Food Research Technology, Berlin, v.212, n.3, p.282-286, 2001. FRANCO, D. A. S. & BETTIOL, W. Controle do bolor verde em ps-colheita de citros com produtos alternativos. Embrapa Meio Ambiente. 2000. (Comunicado Tcnico n.10). FRANCO, D. A. S. & BETTIOL, W. Efeito de produtos alternativos para o controle do bolor verde (Penicillium digitatum) em ps-colheita de citros. Revista Brasileira de Fruticultura 24. 2002. HUANG, Y.; WILD, B. L. & MORRIS, S. C. Postharvest biological control of Penicillium digitatum decay on citrus fruit with Bacillus pumilus. Ann. Appl. Biol. 120:367-372. 1992. JANISIEWICZ, W. J. & JEFFERS, S. N. Efficacy of commercial formulation of two biofungicides for control of blue mold and gray mold of apples in cold storage. Crop Protection 16:629-633. 1997. KAVANAGH, J. A. & WOOD, R. K. S. Green mould of oranges caused by Penicillium digitatum Sacc.; effect of additives on spore germination and infection. Annals of Applied BiOlogy 67:35-44. 1971. MORETTO, K. C. K.; FERNANDES, N. G. & GOES, A. Controle biolgico de Colletotrichum acutatum, agente causal da queda prematura dos frutos ctricos. Fitopatologia Brasileira, 28:251-257. 2003.

58

219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232

NORONHA, M. A. Escala diagramtica para avaliao da mancha preta em folhas de citros e efeito da temperatura e durao do molhamento na pr-penetrao dos condios de Guignardia citricarpa. 2002. No paginado. POLLACK, S. Forecast for citrus: a mixed bag growers. Agricultural Outlook 287:2-4. 2001. SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F. & MANIATIS, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2 Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989. TIMMER, L. W. Diseases of fruit and foliage. In: Timmer, L. W. & Duncan, L. W. (Ed.). Citrus Health Management. Florida: APS Press, 1999. pp. 107-123. WILSON, C. L. & CHALUTZ, E. Postharvest biological control of Penicillium rots of citrus with antagonistic yeasts and bacteria. Sci. hortic. 40:105-112. 1989. ZUCCHI, T. D.; ZUCCHI, F. D.; POLI, P.; MELO, I.T.; ZUCCHI, T. M. A. D. A short-term test adapted to detect the genotoxic effects of environmental volatile pollutants (benzene fumes) using the filamentous fungus Aspergillus nidulans. J. Environ. Monit. 7:598-602. 2005.

59

233 234 235

Tabela 1. Efeito de Paenibacillus lentimorbus, Bacillus subtilis e Streptomyces sp. na evoluo do nmero leses de Guignardia citricarpa em laranja `Pera orgnica em condio de ps-colheita. Tratamento P. lentimorbus (108 ufc/mL) B. subtilis (108 ufc/mL) Streptomyces sp.(108 ufc/mL) Testemunha F DMS (Tukey) C.V. % de aumento no nmero de leses 84,8 a 87,7 a 93,8 a 125,9 a 0,65 NS 28,28 35,00

236 237

Para as anlises os dados foram transformados para arc sen raiz x/100. Mdias seguidas pela mesma letra, maiscula na coluna, no diferem estatisticamente entre (Tukey 5%). NS No significativo.

60

238 239 240

Tabela 2. Efeito de Paenibacillus lentimorbus, Bacillus subtilis e Streptomyces sp. na severidade do bolor verde causado por Penicillium digitatum em frutos de laranja `Pra orgnicos. Severidade Tratamento Paenibacillus lentimorbus (108 ufc/mL) Bacillus subtilis (108 ufc/mL) Streptomyces sp.(108 ufc/mL) Testemunha inoculada Testemunha no inoculada Thiabendazole (1500 g/mL) F DMS (Tukey) C.V. Preventivo 50,0 b 61,1 ab 72,9 ab 100,0 a 0,0 0,0 35,96** 26,0555 41,81 c c Conjunto 0,0 c 0,0 c 59,3 b 100,0 a 0,0 c 0,0 c 160,33 ** 12,6935 34,89 Curativo 0,0 c 0,0 c 18,79 b 100,0 a 0,0 c 0,0 c 105,35 ** 13,7253 48,70

241 242 243

Para as anlises os dados foram transformados para arc sen raiz x/100. Mdias seguidas pela mesma letra, maiscula na coluna, no diferem estatisticamente entre si (Tukey 1%). (%Severidade = Dimetro mdio das leses/altura mdia dos frutos x 100).

61

244 245

Tabela 3. Efeito de Paenibacillus lentimorbus, Bacillus subtilis e Streptomyces sp na incidncia do bolor verde em frutos de laranja Pra orgnicos. Incidncia (%) Tratamento Preventivo Paenibacillus lentimorbus (108 ufc/mL) Bacillus subtilis (108 ufc/mL) Streptomyces sp.(108 ufc/mL) Testemunha inoculada Testemunha no inoculada Thiabendazole 1500 ug/mL 25 25 100 100 0 0 Conjunto 0 0 8,3 100 0 0 Curativo 0 0 50 100 0 0

246

62

CONCLUSES x x x x x

Para as condies de cultivo comercial em Conchal, SP, os biofertilizantes testados no foram eficientes no controle de G. citricarpa. Leite a 5% e B. subtilis apresentam potencial para o controle da pinta preta dos frutos ctricos em condies de cultivo orgnico da laranja `Pra. T. harzianum no foi eficiente no controle da pinta preta em cultivo orgnico. P. lentimorbus, B. subtilis e Streptomyces sp. no foram eficientes na reduo de G. citricarpa em condies de ps-colheita. P. lentimorbus, B. subtilis e Streptomyces sp. foram eficientes no controle de P. digitatum em p-colheita.

63

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

ABECITRUS.

Disponvel

em:

http://www.abecitrus.com.br/informativo/nota_receita_jul07.html. Acesso em 17/02/2008.

ABECITRUS. Disponvel em: http://www.abecitrus.com/exporano.html#expofcooj2. Acesso em 20/05/2007.

AGRIANUAL 2002: Anurio da agricultura brasileira. So Paulo: FNP Consultoria e Comrcio, 2002. p.285-332.

AGRIANUAL 2003: Anurio da agricultura brasileira. So Paulo: FNP Consultoria e Comrcio, 2003. 213p.

AGROFIT. Disponvel em <http//www.agricultura.gov.br> Acesso em: 22 set. 2007.

AGUILAR-VILDOSO, C.I.; RIBEIRO, J.G.B.; FICHTENBERGER, E.; GOES, A.; SPSITO, M.B. Manual tcnico de procedimentos da mancha preta dos citros. Brasilia: MAPA/DAS/DDIV, 2002.

64

AMARO, A.A., MAIA, M.L. Produo e comrcio de laranja e de suco no Brasil. Laranja, v.18, n.1, p. 1-26, 1997.

AVERNA-SACC; R. Pstulas pretas sobre laranjas doces produzidas por Phoma citricarpa. Revista de Agricultura, v.15, p.468-475, 1940.

BAKER, C. J., et al. Inhibitory effect of Bacillus subtilis on Uromyces phaseoli and on development of rust pustules on bean leaves. Phytopathology, v.73, p.1148-1152, 1983.

BASTOS, C. N. Resultados preliminares sobre a eficcia de Trichoderma viride no controle da vassoura-de-bruxa (Crinipellis perniciosa) do cacaueiro. Fitopatologia Brasileira, v.13, p.340-342, 1988.

BENHAMOU, N., LAFONTAINE, P.J., NICOLE, M. Induction of systemic resistance to fusarium crown and root rot in tomato plants by seed treatment with chitosan. Phytopathology, v.84, p.1432-1444, 1994.

BETTIOL, W. Controle de doenas de plantas com agentes de controle biolgico e outras tecnologias. In: Campanhola, C; Bettiol, W. Mtodos alternativos de controle fitossanitrio. Jaguarina: Embrapa, 2003. p.191-215.

BETTIOL, W., SAITO, M. L., BRANDO, M.S.B. Controle da ferrugem do cafeeiro com produtos a base de Bacillus subtilis. Summa Phytopathologica, v.20, p.119-122, 1994.

BETTIOL, W., TRATCH, R.; GALVO J.A.H. Controle de doenas de plantas com biofertilizantes. Jaguarina: EMBRAPA-CNPMA, 1998, 22p. 1998.

BETTIOL, W., VARZEA, V.M.P. Controle biolgico da ferrugem (Hemileia vastatrix) do cafeeiro com Bacillus subtilis em condies controladas. Fitopatologia Brasileira, v.17, p.9195, 1992.

65

BOTEON, M. Cadeia agroindustrial de citros. Centro de estudos avanados em economia aplicada (CEPEA/ESALQ/USP) http://cepea.esalq.usp.br, 14p. Acessado em: 21 jan. 2006.

CARISSE, O., et al. Effect of fall application of fungal antagonists on spring ascospore production of the apple scab pathogen, Ventura inaequalis. Phytopathology, n.90, p.31-37, 2000.

CASTRO, C.M., SANTOS, A.C.V., AKIBA, F. Bacillus subtilis isolado do biofertilizante Vairo com ao fungisttica e bacteriosttica a alguns fitopatgenos. In: SIMPSIO DE CONTROLE BIOLGICO, 3, 1992, Jaguarina, Anais... p.291.

CASTRO, C.M., SANTOS, A.C.V., AKIBA, F. Comprovao in vitro da ao inibidora do biofertilizante Vairo produzido a partir da fermentao anaerbica do esterco bovino, sobre a germinao de condios de diversos gneros de fungos fitopatognicos. In: REUNIO BRASILEIRA SOBRE CONTROLE BIOLGICO DE DOENAS DE PLANTAS, 4. 1991, Jaguarina, Anais... p.18.

CITRUSFEAT. Fresh citrus situation. FASonline. Horticultural & Tropical Products Division. 2001(www.faz.usda.gov/htp/circular/2001/10/08/citrusfeat.htm). (16 set. 2002).

CULLEN, D., BERBEE, F. M., ANDREWS, J.H. Chaetomium globosum antagonizes the apple scab pathogens, Venturia inaequalis, under field conditions. Canadian Journal of Botany, n.62, p.1814-8, 1984.

DUBOS, B., JAILLOUX, F., BULIT, J. Protection du vignoble contre la pourriture grise: les proprites antagonistes du Trichoderma a lgard du Botrytis cinerea. Les Colloques de LINRA, v.11, p.205-219, 1982.

ELAD, Y., SHTINBERG, D. Effect of compost water extracts on grey mould (Botrytis cinerea). Crop Protection, n.13, p.109-114, 1994.

66

FALK, S.P., et al. Fusarium proliferatum as a biocontrol agent against grape downy mildew. Phytopathology, n.86, p.1010-1017, 1996.

FEICHTENBERGER, E., MULLER, G.W., GUIRADO, N. Doenas dos citros. In: KIMATI, H., et al. (Ed.). Manual de fitopatologia - doenas das plantas cultivadas. So Paulo: Agronmica Ceres, 1997, v.2, p.261-96.

FEITCHTENBERGUER, E.; BASSANEZI, R. B.; SPOSITO, M. B.; BELASQUE Jr. J. Doenas dos citros (Citrus spp.) In: KIMATI, H.; AMORIN, L.; REZENDE, J. A. M.; BERGAMIM FILHO, A.; CAMARGO, L. E.A. (Ed.) Manual de Fitopatologia. So Paulo: Agronmica Ceres, 2005. v.2, p. 239-270.

FERNANDES, M.C.A. O biofertilizante Agrobio. Informativo do Centro Nacional de Pesquisa de Agrobiologia, n. 13. EMBRAPA-Agrobiologia, Seropdica, Ano 4, setembro de 2000. In: A Lavoura, v.103, n.634, p.42-43, 2000.

FERREIRA, J.H.S., MATTHEE, F.N., THOMAS, A.C. Biological control of Eutypa lata on grapevine by an antagonistic strain of Bacillus subtilis. Phytopathology, n.81, p.283-287, 1991.

FISCHER, I. H.; SPSITO, M. B.; LOURENO, S. A.; AMORIM, L. Eficincia dos fungicidas thiabndazole+imazalil, aplicados previamente ou em mistura cera no controle do bolor verde em citros. Brazilian Journal of Plant Physiology, v.16, p.22, 2004 (Suplemento).

FRAVEL, D. Comercial biocontrol products for use against soilborne crop diseases. (http://www.barc.usda.gov/psi/bdpl/bdplprod/bioprod.ttml). (13 out 1998).

FUNDECITRUS. Manual de pinta preta. Araraquara: Fundo Paulista de Defesa da Citricultura, 2000. 7p. (Manual).

67

FUNDECITRUS. Manual tcnico sobre pinta preta. Araraquara: Fundo Paulista de Defesa da Citricultura, 1998. 10p. (Boletim Tcnico).

GOES, A. de, FEICHTENBERGER, E. Ocorrncia da mancha preta causada por Phyllosticta citricarpa (McAlp) Van der Aa (Guignardia citricarpa Kiely) em pomares ctricos do Estado de So Paulo. Fitopatologia Brasileira, n.18, p.138, 1993. (Resumo).

GOES, A. de. Controle da mancha-preta dos frutos ctricos. Laranja, v.19, p.305-20. 1998.

GOES, A. de; ANDRADE, A.G.; MORETTO, K.C.K. Efeito de diferentes tipos de leos na mistura de benomyl + mancozeb no controle de Guignardia citricarpa, agente causal da mancha preta dos frutos ctricos. Summa Phytopathologica, v.26, p.233-236, 2000.

GOES, A. de; FEICHTENBERGUER, E. Ocorrncia da mancha preta causada por Phyllosticta citricarpa (Mcalp) Van der Aa (Guignardia citricarpa Kiely) em pomares ctricos do Estado de So Paulo. In: Congresso Brasileiro de Fitopatologia, 10, 1993, Aracaju. Anais... p.318.

GOES, A. Efeito da combinao de fungicidas sistmicos e protetores no controle da mancha preta dos frutos ctricos causados por Guignardia citricarpa. Summa Phytopatologica, v.28, p.9-13, 2002.

GOES, A. Efeito da combinao de fungicidas sistmicos e protetores no controle da mancha preta dos frutos ctricos causados por Guignardia citricarpa. Summa Phytopatologica, v.28, p.9-13, 2002.

GOES, A. Mancha preta dos citros: situao atual e perspectivas futuras. Cincia & Prtica, p.5-7, 2001.

68

GOES. A.; GRAA, J.; BARROS, J. C. S. M.; PINHEIRO, J. E. Controle da pinta preta em frutos de tangerina `Rio (Citrus deliciosa) ocasionada por Phyllosticta citricarpa (Guignardia citricarpa). Fitopatologia Brasileira, v.15, p.73-75, 1990.

GULLINO, M.L., GARIBALDI, A. Situation actuelle et perspectives davenir de la lutte biologique et intgre contre la pourrite grise de la vigne en italie. Colloques de LINRA, v.18, p.91-97, 1983.

HAYASHIDA, S.H., et al. Control of potato common scab with an antibiotic biofertilizer produced from swine feces containing Streptomyces albidoflavus CH-33. Agricultural and Biological Chemistry, v.53, p.349-354, 1989.

HERBERT, J. A. Citrus black spot. Citrus and subtropical fruit research institute, Nelspruit. Citrus, h. 30, 1989.

INBAR, J., CHET, I. The role of recognition in the induction of specific chitinases during mycoparasitism by Trichoderma harzianum. Microbiology, n.141, p.2823-2829, 1995.

KALITA, P., BORA, L.C., BHAGABATI, K.N. Phylloplane microflora of citrus and their role in management of citrus canker. Indian Phytopathology, n.49, p.234-237, 1996.

KIELY, T.B. Control and epiphytology of black spot of citrus on the central coast of New South Wales. New South Wales: Department of Agriculture Science Bulletin, 1948, 88p.

KIELY, T.B. Preliminary studies on Guignardia citricarpa n. sp.: the ascigenous stage of Phoma citricarpa McAlp. and its relation to black spot of citrus. Proceedings of the Linnean Society of New South Wales, n.73, p.249-292, 1948.

69

KLOTZ, L.J. Fungal, bacterial, and nonparasitic diseases and injuries originating in the seebed, nursey, and orchard. In: REUTHER, W., CALAVAN, E.C., CARMAN, G.E. (Ed.) The Citrus Industry. Riverside: University of California, 1978. p.1-66.

KOTZ, J. M. Black spot. In: WHITESIDE, J.O., GARNSEY, S.M., TIMMER, L.W. (Eds). Compendium of citrus disease. St Paul: APS Press, 1989. p.10-12.

KOTZ, J. M. Epidemiology and control of citrus black spot in South Africa. Plant Disease, v.65, p.945-50, 1981.

KUPPER, K. C.; GIMENES-FERNANES, N.; GOES, A. Controle biolgico de Colletotrichum acutatum, agente causal da queda prematura dos frutos ctricos. Fitopatologia Brasileira, v. 28, n. 3, 2003

LORITO, M., et al. Synergistic interaction between fungal cell wall degrading enzymes and different antifungal compounds enhances inhibition of spore germination. Microbiology, v.140, p.623-629, 1994.

MAUCH-MANI, B.; METRAUX, J. P. Salicylic acid and systemic acquired resistence to plant pathogen attack. Annals of Botany, v.82, p. 535-540, 1998.

McKEEN, C.D., REILLY, C.C., PUSEY, P.I. Production and partial characterization of antifungal substances antagonistic to Monilinia fructicola from Bacillus subtilis. Phytopathology, v.76, p.136-139, 1986.

McONIE, K.C. The latent occurrence in citrus and other hosts of a Guignardia easily confused with G. citricarpa, the citrus black spot pathogen. Phytopathology, v.54, p.40-43, 1964a.

70

McQUILKEN, M.P., WHIPPS, J.M., LYNCH, J.M. Effects of water extracts of a composted manure-straw mixture on the plant pathogen Botrytis cinerea. World Journal Microbiology Biotechnology, v.10, p.20-66, 1994.

MEDEIROS, S.A.F., MENEZES, M. Potencial antagnico de alguns fungos a Colletotrichum gloeosporioides, agente causal da antracnose do cajueiro, Anacardium occidentalle. Fitopatologia Brasileira, v.19, p.84-91, 1994.

PENTEADO, S.R. 2000. Controle alternativo de pragas e doenas com as caldas bordalesa, sulfoclcica e Viosa. Campinas: Buena Mendes Grfica e Editora. 95p.

PICCININ, E. Proteo de plantas de sorgo (Sorghum bicolor), maracuj azedo amarelo (Passiflorae edulis ) e eucalipto (Eucalyptus spp.) contra fitopatgenos fngicos e bacterianos por Saccharomyces cerevisiae. (Tese). Piracicaba. Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Universidade de So Paulo. 1996.

POLLACK, S. Forecast for citrus: a mixed bag growers. Agricultural Outlook, n. 287, p.2-4, 2001.

PRATES, H.S.; NOGUEIRA, N.L. Controle qumico da pinta preta (Phyllosticta citricarpa) em laranjeiras Pra. Summa Phytopathologica, v.23, p.53. 1997 (resumo).

PUSEY, P.L. et al. Compatibility of Bacillus subtilis for postharvest control of peach brown rot with comercial fruit waxes, dicloran, and cold-storage conditions. Plant Disease, v.70, p.587-590, 1986.

REIS, R. F.; GOES, A.; TIMMER, L.W. Effect of temperature, leaf wetness, and rainfall on the production of the Guignardia citricarpa ascospores and on black spot severity on sweet orange. Fitopatologia Brasileira, v.31, p. 29-34, 2006.

71

ROBBS, C.F.; PIMENTEL, J.P.; RIBEIRO, R.L.D. A mancha preta dos citros causada por Phoma citricarpa. Fitopatologia Brasileira, v.5, p.455, 1980.

SANTOS, L A.C.V. Biofertilizante lquido, o defensivo da natureza. Niteri: EMATER, 1992, 16p. (Agropecuria Fluminense, 8).

SCHUTTE, G.C., BEETON, K.V., KOTZ, J.M. Rind stippling on Valencia oranges by copper fungicides used for control of citrus black spot in South Africa. Plant Disease, v.81, p.851-854, 1997.

SONODA, R.M., GUO, Z. Effect of spray applications of Bacillus subtilis on postbloom drop of citrus. Phytopathology, v.86, p.S52, 1996. (Abstract).

SUTTON, B.C., WATERSTON, J.M. Guignardia citricarpa, Kew: C.M.I., 1966. 2p. (Descriptions of Pathogenic fungi and bacteria, 85).

TRATCH, R.; BETTIOL, W. Efeito de biofertilizante sobre o crescimento micelial e a germinao de esporos de alguns fungos fitopatognicos. Pesquisa Agropecuria Brasileira, v.32, p.1131-1139, 1997.

TRONSMO, A., DENNIS, C. The use of Trichoderma species to control strawberry fruit rots. Netherlands Journal of Plant Pathology, v.83, p.449-455, 1977.

WELTZIEN, H.C.; KETTERER, N. Control of downy mildew, Plasmopara viticola (de Bary) Berlese et de Toni, on grapevine leaves through water extracts from composted organic wastes. Journal of Phytopathology, Berlin, v.116, p.186-188, 1986.

WELTZIEN, H.C. Some effects of composted organic materials on plant health. Agriculture, Ecosystems and Environment, v.27, p.439-446, 1989.

72

YOHALEM, D.S., NORDHEIM, E.V., ANDREWS, J.H. The effect of water extracts of spent mushroom compost on apple scab in the field. Phytopathology, v.86, p.914-922, 1996.

ZHANG, W., DICK, W.A., HOITINK, H.A.J. Compost-induced systemic acquired resitance in cucumber to Pythium root rot and anthracnose. Phytopathology, v.86, p.1066-1070, 1996.