Deteksi Mikrofilaria/Larva Cacing Brugia malayi pada Nyamuk dengan Polimerase Chain Reaction

DYAH HARYUNMGTYASDrnncTuLus SIJBEKTI dan
Bolo; Beror Penelitian Veter;aer,PO Box 151, Bogor 16114

(Diterima dewan redaksi 13 April 2008)
ABSTRACT

HARYUMNGTYAS. and D.T. SUBEKTI D. Detection of Brugia malayi microfilariaLarvae in mosquito using Polimerase Chain Reaction. JITV 13(3): 240-248. Lymphathic filariasis that is also known as elepanthiasis is caused by infestation of 3 species nematode Wuchereria bancrojti, Brugia malayi and Brugia timori. In Indonesia 70% filariasis case caused by Brugia malayi. Mosquito species from genus Anopheles, Aedes, Culex, Mansonia and Armigeres are known as vector of this disease. Microfilaria detection on mosquito is one methode to know infection rate in vector population in endemic area.The objectives of the research were to study the ability of Hhal repeat applicable to detect microfilaridlarvae in a pool of mosquitoes and to get description of adult mosquito night biting population lived in endemic area of filariasis brugian. Mosquito as positive control used in this research come from laboratory of parasitology of FKUI. Mosquito sample from the field was from Binawara and Kolam Kiri villages, South Kalimantan province. Mosquito were trappedthen identified by its species. DNA of mosquitoes was exbacted and then run by the PCR using Hha I repeat primer. Result of the research indicated that adult mosquitoes night biting from Binawara village consist of Culex, Mansonia, Anopheles genus and from Kolam Kiri village only'from Mansonia genus. Hha 1 repeat primer is applicable to detect 1 mosquito infected with microfilaridlarvae in a pool of negative mosquitoes. Mosquito samples from the two villages showing negative PCR.

Key Words: Filariasis, Brugia malayi, Vector, Microfilaria, Filaria Larve, PCR
ABSTRAK

HARYUMNGTYAS, dan D.T. SUBEKTI. D. 2008. Deteksi MikrofilariaLarva Cacing Brugia malayi pada Nyamuk dengan Polimerase Chain Reaction. JITV 13(3): 240-248. Filariasis limfatik atau dikenal dengan penyakit kaki gajah (Elephantiasis) disebabkan oleh 3 spesies utama cacing filaria vaitu Wuchereria bancroffi. B w i a malavi dan Brueia timori. Di Indonesia sebanvak 70% kasus filariasis disebabkan oleh . . Brugia malayi. Nyamuk dari genus Anopheles, Aedes, Culex, Mansonia dan Arrnigeres diketahui merupakan vector dari penyakit ini. Deteksi microfilaria pada nyamuk mempakan salah satu cara untuk mengetahui terjadinya infeksi pada populasi vector di daerah endemis. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah amplifikasi Hhal repeat dapat digunakan untuk mendeteksi mikrofilaridlarva filaria pada pool nyamuk dan untuk mendapatkan gambaran popelasi nyamuk dewasa pada malam hari yang terdapat di daerah endemis filariasis brugian. Nyamuk kontrol positif yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari laboratorium parasitologi FKUI. Sementara itu, nyamuk sample berasal dari desa Binawara dan desa Kolam Kiri. Prooinsi Kalimantan ~ k ~ a t a~ .G m u yang telah diperoleh-diidentifikasispesiesnya dan diisolasi DNAnya selanjutnya dilakukan PCR. n k Hasil oenelitian menuuiukkan bahwa oooulasi nvamuk dewasa oada malam hari vang berasal dari desa Binawara terdiri dari .. . genus Culex. Mansonia dan Anopheles, sedang dari desa Kolam Kiri adalah genus Mansonia dan Anopheles. Primer Hha I repeal dapat digunakan untuk mendeteksi pool nyamuk yang mengandung 1 ekor nyamuk positif mikrofilaridlarva tilaria. Nyamuk yang berasal dari kedua desa tersebut menunjukkan hasil negatif PCR.

-

-

Kata Kunci: Filariasis, Brugia malayi, Vektor. Mikrofilaria, Larva Filaria, PCR

PENDAHULUAN
D i dunia 90% kasus filariasis disebabkan oleh W. bancrofri diikuti B. mnlayi dan B. timori (DAS ei al, 2002). Berbeda dengan W. bancrofti dan B. timori, B. malnyi diketahui bersifat zoonosis karena dapat ditularkau dari hewan (mamalia, primata) ke manusia atau dari manusia ke manusia melalui vektor nyamuk (BUCK, 1991). Diperkiuakan 23 spesies nyamuk dari genus Anopheles, Aedes, Culex, dan Mansonia dapat

menduknng perkembangan filariasis bancrofiian dan brugian (SCHMIDT dan ROBERT, 2000). Pada filariasis bancrofiian vektor potensial adalah Culex sp, Anopheles s p dan Aedes s p sedang pada filariasis brugian, adalah Anopheles dan Mansonia (DITJENPPM dan PL, 2005). Perkembangan Filaria dalam tubuh nyamuk memerlukan wakhl k w a n g lebih selama 2 minggu. Siklus hidup dimulai jika nyamuk sebagai vektor menggigit dan menghisap darah orang yang terinfeksi aktif filariasis. Pada filariasis bancroftian waktu sejak

2008 terjadinya infeksi s a m ~ a itampak mikrofilaria dalam darah adalah sekitar 6-12 bulan sedang pada filariasis Bmgian sekitar 3.553 desa. 2000 dan KLUBER ef al.3 Th. Dengan mf rate 1% atau lebih pada 84 kabupaten teridentifkasi (DlnEN PPM dan PL. 1994).. Pada daerah endemik deteksi yang sangat bermanfaat adalah Jinger prick test dan The DEC provocative test (MCMAHON dan SIMONSEN.5 bulan (MAC DONALD. et 2001 menyatakan bahwa PCR berdasar Hha I repeat dapat digunakan untuk mendeteksi Brugia malayi pada darah manusia dan telah dinji pada sampel darah yang berasal dari Indonesia. LIZOTTE et el a). tersusun tandem dan unik pada genom dari genus bmgia (XIE et al. Tingkat endemisitas filariasis di Indonesia berdasarkan hasil survey darah jari tahnn 1999 adalah mash tinggi dengan rata-rata mikrofilaria (mf rate) 3. FISCHER al. 26 propinsi.l pg DNA genom FK Bancroffi dimana 4 % dari DNA parasit pada nyamuk CX pipiens mengandnng 1 larva (CHANTEU al.223 orang tersebar di 1. Pemutusan transmisi vektor mempakan unsur utama program eliminasi filariasis limfatik sehingga metode deteksi untuk mengetahui ada tidaknya infeksi pada nyamuk adalah sangat diperlukan (RAMZY. Hha I repeat Brugia malayi sekuens adalah nnkleotida sepanjang 322 yang mempnnyai banyak ulangan. Uji mendeteksi 0. 1996).. di 231 dabupaten. et Menurut FISCHER al. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan Hha I repeat dalam mendeteksi Brugia malayi dapat digunakan untuk mendeteksi DNA mikrofilaridla~a filaria pada pool nyamuk dan mengetahui populasi nyamuk dominan pada malam hari yang ada di area endemis filariasis di 2 lokasi di Kalimantan Selatan. Jumlah copy perhaploid genom Hha I repeat B malayi ini adalah jauh lebii banyak dari dari Ssp I repeat W.221 pnskesmas. 1994.5-19.000 copy per haploid genome sehingga amplifkasi PCR salah satu pendekatan molekuler yang menjanjikan untuk mendeteksi infeksi pada vektor. jumlah penderita kronis filariasis yang dilaporkan sebanyak 6. 2005). (1996) Hhd repeat tersusun secara tandem dan mempnnyai >30.64%). Berdasarkan survei pada tahun 2002-2005 diietahui bahwa jumlah penderita terbanyak terjadi pada rentang waktu tersebut temtama di Sumatera dan Kalimantan. Oleh karena parasit mempunyai periode noktnmal (penampakan pada darah hanya pada malam hari) yang membatasinya sehingga test ini hanya efektif dilakukan pada malam hari.l % (0. (2000) menyatakan bahwa HhaI repeat dapat digunakan nntnk mendeteksi Brugia malayi dalam darah siang dan malam pada penderita positif mikrofilaria. (2000) and ZHONG et al. Berdasarkan hasil survei tahun 2000. FISCHER et al. Cacing dewasa dapat hidup 5-10 tahun dan menyebabkan berbagai masalah karena kemsakan pembuluh limfe dan respon sistem imun yang dihasilkan (MAVEN SMITH. MATERI DAN METODE Penangkapan nyamnk . 2002).JITV Vol 13 No . 2002). bancrofti. 1994). Data ini adalah belum menggambarkan data sebenarnya karena hanya dilaporkan oleh 42% dari 7.... 1996) yang menjadi standar emas pengnjian..

Vortex diulang setelah satu jam. Hewan gerbill ini digunakan untuk memperbanyak cacing filaria guna keperluan penelitian di laboratorium.000 rpm selama 2 menit kemudian supematan dibuang.2. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil penangkapan dan identifikasi nyamuk Penelitian ini dilahkan di kabupaten Tanah Bumbu dan Barito Kuala. nyamuk dimasnkkan dalam tabung yang berisi alkohol70% sampai dilakukan PCR. 2002). Nyamuk ini yang selanjutnya akan diambil untuk diisolasi DNA dan PCR seperti prosedur diatas. Kedua lokasi tersebut adalah daerah endemis filariasis brugian di Kalimantan Selatan dengan mf rate berkisar sekitar +2%. Amplifikasi PCR Polimerase chain reaction dilakukan dengan thennocycler GeneAmp 9700 (PE Applied Biosystem) menggunakan primer forward HhaI (S'GCGCATAAATTCATCAGC-3') dan reverse HhaII PCR (Amersham Bioscience) dengan total volume 25 ml. #69502) sesuai protocol perusahaan. Identifikasi nyamuk Identifikasi nyamuk hanya dilakukan pada spesies nyamuk yang umum sebagai vektor filariasis brugian. Deteksi Milao$laria/Lawa Cacing Brugia malayipado Nyamuk dengon Polimerase Chain Reaction (1999)..< 2% (Info dari Dinas Kesehatan Propinsi Kalimantan Selatan).HARYUNINGTYAS dan SUBEKn. FKUI. Hasil penangkapan diperoleh sampel nyamuk betina sejumlah 253 ekor dari Kec. selanjutnya divortex dan d i i i b a s i selama 2 jam pada 6 0 ' ~ . Sampel dididihkan selama 15 menit pada 9 5 ' ~selanjutnya sebanyak 2 pl sampel diambil untuk digunakan sebagai template PCR. Tabel 1 adalah spesies vektor filariasis di pulau Kalimantan. denaturasi 9 5 ' ~ : 1 menit. extension 72'C : 1 : menit masing-masing sebtnyak 35 siklus. selanjutnya ditambah Tris EDTA (TE) 500 pl dan d i i i b a s i pada temperatur ruang selama 5 menit sambil divortex. Di Kecamatan Hulu. Hasil PCR sebanyak 5 p1 dielektroforesis pada gel agarose 1. Di daerah ini juga belum pemah terintervensi obat sebelumnya. Pellet dicuci dengan 500 pl TE selanjutnya dicuci kembali dengan 500 p1 Red Blood Cell Lysis Buffer (RCLB) yang terdiri dari Sucrose. pH8. Qiagen.0002% SDS diasukkan pada tabung mikrosenhifus (eppendorf). Pellet selanjutnya ditambah 200 DSP Buffer yang berisi proteinase K dan Tween 20. Propinsi Kalimantan Selatan seperti tertera pada Tabel 2. cat. maka digunakan 10 ekor nyamuk yang mempunyai kemungkinan besar positif mikrofilaria yaitu nyamnk anopheles yang digunakan sebagai vektor penular pada hewan percobaan (gerbill) di bagian parasitologi. Kab. Nyamuk betina dari spesies lain yang diduga sebagai vektor filariasis bancrofiian juga akan dipool untuk dilakukan PCR terhadap kemungkinannya juga mengandung mikrofilaridlarva filariasis brugian. Hilden. Barito Kuala. Kabupaten Tanah Bumbu.5% dan divisualisasi dengan pengecatan ethidium bromida untuk mengkonfmasi terjadinya amplifikasi. MenurUt SOEYOKO (2002) secara epidemiologi terdapat 6 tipe filariasis yang masing-masing ditularkan oleh nyamuk yang berbeda-beda bionomiknya. Terakhir adalah extension pada 72'C selama 5 menit dan hold pada 4 ' ~ . Masing-masing pool kemudian dihomogenisasi dengan pestle dalam tabung mikrosenhifus yang berisi l8Oml phosphate buffer saline @H 7. Kalsel terdapat 10 orang positif mikrofilaria (info dari Loka Litbang Tanah Bumbu) dengan nilai mf rate 2 2% dan penderita belum pemah diobati. Secara garis besar: 100 pl darah dalam antikoagulan Ethylen Diamine Tetra Acetid Acid (EDTA) ditambah 300 p1 0. Hewan positif mikrofilaria d i j a d i dalam satu kandang dengan hewan negatif dan nyamuk anopheles sebagai vektor penular. Isolasi DNA Ekstraksi DNA mikrofilaria dilakukan pada darah gerbill yang positif mikrofilaria dan nyamuk positif mikrofilaria~lmafilaria (sebagai kontrol positif) serta nyamuk sample yang berasal dari lapang. Nyamuk betina d i p u l k a n (dipool) berdasarkan spesies (10-20 ekor nyamukipool). 1M KCI. (5'GCGCAAAACTTAATTACAAAAGC-3').O. Tanah Bumbu dan Desa Kolam Kiri. 1M MgC1. Nyamuk lain yang tidak berlaku sebagai vektor filariasis tidak akan diproses lebih lanjut. Hulu Kab. Di desa Kolam kiii kabupaten Barito Kuala terdapat 1 orang penderita positif dengan mf rate . PBS). Germany. DNA selanjutnya diekshaksi dari masing-masing tabung menggunakan komersial kit (Dneasyw. Setiap daerah endemis umumnya mempunyai spesies nyamuk yang berbeda sebagai vektor penulamya (DEPKES. I M Tris. Salemba. annealing 5 5 ' ~ 1 menit. Campuran selanjutnya disenhifugasi 13. Nyamuk positif Mikrofilaria Karena mikrofilaridlma filaria tidak ditemukan di daerah penelitian. Camporan reaksi PCR menggunakan kit Ready To Go . Program PCR yang digunakan adalah denaturasi a w a l 9 5 ' ~: 5 menit sebanyak 1 siklus. Ekstraksi darah dilakukan dengan metode SUPALI(komunikasi pribadi). Pencucian dilakukan sampai pellet berwarna putih. Kalimantan Selatan. Setelah identifikasi.

Berbeda halnya dengan nyamuk tertangkap di Desa Kolam Kiri dimana nyamuk dominan tertangkap adalah nyamuk vektor penular filaria Brugian. Ma.00 107 Desa Kalam kid. Kalirnantan Selatan Lokasi Pengambilan Sampel "Ifrate Lokasi penangkapan Lama nyamuk penangkapan Rumah penduduk di dalam hutan W&u penangkapan Jumlah nyamuk yg diperoleh (eknr) \-----. Hasil yang positif diketahui dengan adanya pita h a i l amplifikasi pada sekuens Hhal repeat sebesar 322 bp. Uniformis. Dep. Anopheles Un&formis Mansonia Uniformis.dives Sumber: Pedaman Pemberantasan Filariasis. Propinsi Kalsel i2% l malam 19. Pada Gambar 1 terliat bahwa pada kontrol positif yang berasal dari darab gerbill positif mikrofilaria terjadi adanya dimer pada h g m e n hasil amplifkasi (dengan ukuran fragmen 322 bp dan 640 bp). Tanah Bumbu terdapat beberapa spesies nyamuk yaitu yang mempunyai kesesuaian dengan vektor penular Brugia malayi di Kalimantan Selatan (Tabel l). Kec. Kec Huh. malayi B. sedangkan pada ekstrak nyamuk positif filaria dan kontrol inhibitor PCR hanya diiasilkan pita tunggal (322 bp).00-03.--Uji PCR menunjukkan hasil yang positif pada kontrol positif PCR. Kab. kontrol negatif dan kontrol inhibitor PCR Sampel darah gerbill positif mikrofilaria dan nyamuk positif mikrofilaria yang berasal dari bag. Salemba digunakan sebagai kontrol positif. Indiana. malayi Mansonia. (DITJEN PPM dan PL. Uniformis. (2002) bahwa Wild Type H h a l repeat disusun sebagai tandem repeat sehingga pada beberapa sampel hasil amplifkasi akan terbentuk adanya . Ma. Ma. Spesies h a d identifikasi (ekor) Culex quinquifasciaku(94) Monsonia bonddives ( 5 ) Mmonia unifoformis (4) Anopheles barbirosbis (2) Anopheles hyrcanus (1) Anopheles nygerimus (1) Desa Binawara. Kab. Spesies cacing tilaria dancacing penyebab kakidi Kalimantanvektorsudah diidentifikasitahun 2002 Propinsi Spesies Spesies eaiah Kalimantan Basat Kalimantan Tengah Kalimantan Selatan Kalimantan Tirnur B.Kes. dan kontrol inhibitor PCR (Gambar 1). Ma. Ma. Kepadatan nyamuk tertangkap adalah dipengaruhi oleh topografi daerah termasuk kesuburan daerah (ada orang atau ternak sebagai sumber makanan nyamuk.nyamukpenulamya yang -Tabel 1. malayi B. Berikut ini adalah hasil amplifkasi PCR pada gen HhaI repeat dari kontrol positif yang berasal dari darah gerbill positif mikrofilaria dan nyamuk positif dari FKIJI. Anulifera. Sesnai pemyataan et FISCHER al. Kab. Anopheles Uniformis Ma. An. rumah dengan halaman dan kebun untuk tempat istirahat nyamuk). ada sumber air atau genangan-genangan air sebagai tempat perkembangbiakan nyamuk.00 146 Monsonia uniformis (140) Anopheles nrgerimus (6) Hasil penangkapan dan identifikasi nyamuk yang berasal dari Desa Binawara. . Ma. Baranbai Propinsi Kalsel +2% Rumah penduduk dan rawa-rawa di sekitamva 2 malam 19. 2004) Polimerase Chain Reaction pada kontrol positif. walaupun demikian nyamuk penular yang tertangkap (Mansonia sp) jumlahnya sangat sedikit dibandiigkan nyamuk dominan tertangkap yang bukan vektor penular (Culex s p ) . Hasil penangkapan nyamuk dari Kecamatan Huh dan Barito Kuala. Parasitologi FKUI. Bonneae.0063. Ma. sedangkan kontrol negatif adalah nyamuk culex yang berasal dari bekasi. Uniformis.RI tahun 2002 Tabel 2. Nigerimus Ma. Pada penelitian ini juga dilakukan kontrol inhibitor untuk memastikan tidak munculnya inhibitor nyamuk yang mengganggu proses PCR. Anulafa. Barito Kuala. Bonneae. malayi B. Tanah Bumbu. Dives. ekstrak nyamuk positif.

.

Menurut FARID et al. Baranbai. Kab.l%.s. Menurut data dari subdit FILARIASIS dan SCHISTOSOMIASIS. Baranbai. Hasil amplifikasi PCR (negatif) dari pool sampel nyamuk no S147 (10 ekor nyamuklpool) yang berasal dari Desa Kolam Kiri. 4 2 9 ekorlpool 1 pool nyamuk Mansonia sp.1% dan prevalensi infeksi pada nyamuk adalah 8. Huh. Jumlah pool nyamuk yang telah diidentifikasi dan diuji dengan PCR Lokasi pengambilan sampel Desa Binawara. Barito Kuala. (2001) rata-rata infeksi yang diamati pada pool nyamuk menggambarkan proporsi rumah dengan nyamuk yang terinfeksi pada suatu malam atau pada periode tertentu. Kec. Propinsi Kalsel Mansonia uniformis 140 Anopheles nigerimus 6 6 ekorlpool - I pool nyamuk Anopheles Gambar 2. DITJEN PPM dan PL (2005) di Propinsi Nusa Tenggara Timur mf rate 2. Dari jumlah tersebut diperkirakan nyamuk yang positif adalah sehanyak 6.02%.16. Oleh karena itu peningkatan kekuensi sampling dan jumlah nyamuk yang ditangkap meningkatkan probabilitas nyamuk positif yang tertangkap.6 . Sedangkan angka penyakit filariasis di Propinsi Kalimatan Selatan mempunyai mf rate berkisar antara 1. barbirosbis tertangkap yang diuji PCR dalam 61 pool diketahui 39 pool positif. Propinsi Kalimantan Selatan (M : DNA maker ladder 100 bp. Hasil negatif pada penelitian ini diduga karena jumlah sampel yang diperoleh adalah kurang sehingga belum ditemukan nyamuk yang positif pada pool nyamuk.2 . Kab. - 1 1 1 pool nyamuk Anopheles sp. Kec.6. I3 No . Propinsi Kalsel Spesies h a i l identifikasi Jumlah nyamuk (ekor) 94 5 Jumlah pool nyamuk Jumlah nyamuk per oool 20 ekorlpool Hasil PCR - Culex quinquifaciatus Mansonia bone/dives Mansonia uniformis Anopheles barbiroshis Anopheles hyrcauus Anopheles nygerimus 5 pool nyamuk Culex SP. Barito Kuala. Tabel 3. Kec. 14 pool nyamuk Mansonia 4 ekorlpool 10 ekorlpool - Desa Kolam Kiri. Tanah Bumbu.JlTY Val. Kab.3 7 h 2008 A. S1-S7 : Pool nyamuk no 1-7) .

.

An4: (+) Hasil amplifikasi 1 ekor nyamuk positif + 19 ekor nyamuk negatit) : Hasil (+) Hasil amplifikasi 1 ekor nyamuk positif + 9 ekor nyamuk negatif) : Had(+) Hasil amplifikasi nyamuk Mansonia sp dari Desa Binawara. Kec Huh Kab. BEATY and W. An2 : (-): An3: (-). and C. Baranbai.C. Tanah Bumbu. University Press of Colorado. Niwot. Kalimantan Selatan. Hasil :An1 : (+) . Kec.C. dan Desa Kolam Kiri. disease vectors. Propinsi Kalimantan Selatan (4 ekor nyamuk) : Hasil : (-) tingkah laku dan faktor lingkungan mempunyai peran untuk membedakan kapasitas sebagai vektor. Kec Hulu Kab. Kalimantan Selatan dan stafnya serta Bapak Karman dkk dari Dinas Kesehatan Propinsi Kalimantan Selatan atas bantuan dan kerjasamanya. W. Hasil amplifikasi PCR pada nyamuk Anopheles. MARQUARDT The biology of (ed). Tanah Bumbu. Tanah Bumbu serta Mansonia sp dan Anopheles sp di Kab. Colo. 1996. tetapi jika spesies nyamuk ini jarang kontak dengan hospes yang megandung patogen atau sumber darah yang diinginkan tidak termasuk hospes tersebut maka nyamuk ini bukan mempakan vektor yang cocok untuk patogen hasil penangkapau adalah Mansonia sp dan Anopheles sp dan Culex sp di Kab. Kab. MOORE. . Kecamatan H u h . DAFTAR PUSTAKA Hasil penelitian menunjukkan bahwa Hha 1 repeat adalah sensitif dapat mendeteksi mikrofilaridlarva filaria pada pool nyamuk (10-20 ekorlpool) dengan satu ekor nyamuk positif. Tanah Bumbu. Parasitologi I<UI dan pool nyamuk yang berasal dari Desa Binawara. Tanah Bumbu. Nymamuk yang diduga sebagai vektor filaria berdasarkan nyamuk dominan pada malam hari dari BLACK. Propinsi Kalimantan Selatan Keterangan: M Anl. Barito Kuala. Baranbai. semua menunjukkan hasil negatif PCR. Kab.Gambar 4.yang diduga filmia yang berasal dari bag. Propinsi Kalimantan Selatan. Propinsi Kalimantan Selatan. Nyamuk yang berasal dari Desa Binawara. Propinsi Kalimantan Selatan (9 ekor nyamuk) : Hasil : (-) Hasil amplifikasi nyamuk Anopheles sp dari Desa Binawara.An4 Pan1 Pan2 Tn l Tn2 : : : : : : DNA marker ladder 100 bp Hasil amplifikasi nyamuk Anopheles dari FKUI (masing-m&ing 1 ekor nyamuk. Penelitian ini didanai oleh APBN 2006. Kec Hulu Kab. Sebagai contoh spesies nyamuk tertentu mungkin secara genetik dan biokimia cocok untuk perkembangan secara komplit dari patogen tertentu.G. Pp: 393-416. Population Biology as a tool for studying vector borne diseases.J. In B. UCAPAN TERIMAKASM Penulis mengucapkan terimakasih kepada Kepala Loka Litbangkes Kabupaten Tanah Bumbu.