Anda di halaman 1dari 19

PERCOBAAN VIII

PENETAPAN KADAR OBAT DALAM SAMPEL BIOLOGIS

A. TUJUAN Agar mahasiswa mampu melakukan uji penetapan kadar obat dalam sampel biologis.

B. LANDASAN TEORI Parameter farmakokinetika obat dapat diperoleh berdasarkan hasil pengukuran kadar obat utuh dan/atau metabolitnya di dalam cairan hayati (darah, urin, saliva, atau cairan tubuh lainnya). Oleh karena itu agar nilai-nilai parameter kinetic obat dapat dipercaya, metode penetapan kadar harus memenuhi berbagai kriteria yaitu meliputi perolehan kembali (recovery), presisi, dan akurasi. Persyaratan yang dituntut bagi suatu metode analisis adalah jika metode tersebut dapat memberikan nilai perolehan kembali yang tinggi (75-90 % atau lebih), kesalahan acak dan sistematik kurang dari 10 %. Kepekaan dan selektivitas merupakan kriteria lain yang penting dan nilainya tergantung pula dari alat pengukur yang dipakai. Dalam percobaan ini akan dilakukan langkah-langkah yang perlu dikerjakan untuk optimalisasi analisis meliputi:
1. Penentuan jangka waktu larutan obat yang memberikan resapan tetap

(khusus untuk reaksi warna)


2. Penetapan panjang gelombang larutan obat yang memberikan resapan

maksimum (parasetamol).

3. Pembuatan kurva baku (parasetamol). 4. Perhitungan nilai perolehan kembali, kesalahan acak dan kesalahan sistemik.

Fasa farmakokinetik meliputi proses fasa II dan fasa III. Fasa II adalah proses absorpsi molekul obat yang menghasilkan ketersediaan biologis obat, yaitu senyawa aktif dalam cairan darah yang akan didistribusikan ke jaringan atau organ tubuh. Fasa III adalah fasa yang melibatkan proses distribusi, metabolisme dan ekskresi obat, yang menentukan kadar senyawa aktif pada kompartemen tempat reseptor berada (Shergel, 1999). Faktor-faktor penentu dalam proses farmakokinetika obat adalah:
a.

sistem kompartemen dalam cairan tubuh, seperti cairan intrasel, ekstrasel, plasma darah, cairan intestinal, cairan serebrospinal, dan berbagai fasa lipofil dalam tubuh.

b. protein plasma, protein jaringan dan berbagai senyawa boilogis yang

mungkin dapat mengikat obat.


c. distribusi obat dalam berbagai sistem kompartemen biologis,terutama

hubungan waktu dan kadar obat dalam berbagai sistem tersebut, yang sangat menentukan kinetika obat.
d. dosis sediaan obat, transport antar kompartemen seperti proses absorspi ,

bioaktivasi dan ekskresi yang menentukan lama obat dalam tubuh. Karena konsentrasi obat adalah elemen penting untuk menentukan farmakokinetik suatu individu maupun populasi konsentrasi diukur dalam sampel biologis seperti air, susu, saliva, plasma, dan urin. Sensitivitas, akurasi, presisi dari

metode analisis harus ada untuk pengukuran secara langsung obat dalam matriks biologis. Untuk itu metode penetapan kadar secara umum divalidasi sehingga informasi akurat didapatkan untuk dimonitoring farmakokinetika dan klinik. Untuk memberikan efek biologis obat dalam bentuk aktifnya harus berinteraksi dengan reseptor atau tempat aksi atau sel target,dengan kadar yang cukup tinggi. Sebelum mencapai reseptor, obat terlebih dahulu harus melalui proses farmakokinetik. Pengukuran konsentrasi obat di darah, serum, atau plasma adalah pendekatan secara langsung yang paling baik untuk menilai farmakokinetik obat di tubuh. Darah mengandung elemen selule rmencakup sel darah merah, sel darah putih, keping darah, dan protein seperti albumin dan globulin. Pada umumnya serum atau plasma digunakan untuk pengukuran obat. Untuk mendapatkan serum, darah dibekukan dan serum diambil dari supernatan setelah disentrifugasi. Plasma diperoleh dari supernatan darah yang disentrifugasi dengan ditambahkan antikoagulan seperti heparin. Oleh karena itu serum dan plasma tidak sama. Plasma mengalir ke seluruh jaringan tubuh termasuk semua elemen seluler dari darah. Dengan berasumsi bahwa obat di plasma dalam kesetimbangan equilibrium dengan jaringan, perubahan konsentrasi obat akan merefleksikan perubahan konsentrasi perubahan konsentrasi obat di jaringan (Shergel, 1999). Cepat, simpel, dan sensitif telah membuat spektrofotometer UV-VIS menjadi suatu metode analisis farmasetika yang sangat popular untuk pengukuran secara kuantitatif obat dan metabolit dalam sampel biologi. Identifikasi kualitatif dari obat atau metabolit menggunakan spektrofotometri UV-VIS berdasarkan pada panjang gelombang maksimum. Pada absorpsi yang maksimum, menggunakan hukum Beer pada sensitivitas optimum akan didapat. Karena perubahan absorbansi minimal untuk sedikit perubahan panjang gelombang, error diminimalkan. Hasilnya akurasi dan presisi yang baik didapatkan (Smith, 1981).

1.

PARASETAMOL

Gambar 1. Struktur Parasetamol

(Anonim, 1979)

Parasetamol adalah metabolit fenasetin dengan khasiat analgetik dan antipiretik yang sama (sedikit lebih lemah dari pada asetosal). Sifat-sifat farmakokinetiknya lebih kurang sama dengan fenasetin, efek-efek sampingnya lebih ringan, khususnya tidak nefrotoksis dan tidak menimbulkan perdarahan lambung seperti asetosal. Namun, penggunaannya tetap harus dengan hati-hati, karena dosis dari 6-12 g sudah dapat merusak hati secara fatal. Hal ini disebabkan karena terbentuknya metabolit toksis di dalam hati, yang pada dosis di bawah ca 10 g dapat diikat oleh glutathione (suatu tripeptida dengan _SH). Tetapi, pada dosis yang lebih tinggi persediaan akan zat ini telah terpakai seluruhnya dan terjadilah pengikatan pada molekul-molekul makro lainnya dari sel-sel hati hingga mengakibatkan kerusakan yang irreversibel. Keuntungan lain dari parasetamol dibandingkan dengan fenasetin adalah kelarutannya dalam air, sehingga dapat digunakan dalam sediaan-sediaan cair. Terhadap intoksikasi dapat digunakan N-asetil-sistein (Fluimucil atau metionin) pada pasien-pasien borok-lambung. Parasetamol hanya sedikit sekali memperpanjang waktu protrombin bila digunakan lebih dari 14 hari, maka dapat dikombinasi dengan antikoagulansia. Kofein memperkuat efeknya dengan ca.40 % (Tjay dan Rahardja, 1990). 2. CMC-Na

Na-CMC merupakan zat dengan warna putih atau sedikit kekuningan, tidak berbau dan tidak berasa, berbentuk granula yang halus atau bubuk yang bersifat higroskopis. Menurut Tranggono dkk. (1991), CMC ini mudah larut dalam air panas maupun air dingin. Pada pemanasan dapat terjadi pengurangan viskositas yang bersifat dapat balik (reversible). Viskositas larutan CMC dipengaruhi oleh pH larutan, kisaran pH Na-CMC adalah 5-11 sedangkan pH optimum adalah 5, dan jika pH terlalu rendah (<3), Na-CMC akan mengendap (Anonim, 2004). Na-CMC akan terdispersi dalam air, kemudian butir-butir Na-CMC yang bersifat hidrofilik akan menyerap air dan terjadi pembengkakan. Air yang sebelumnya ada di luar granula dan bebas bergerak, tidak dapat bergerak lagi dengan bebas sehingga keadaan larutan lebih mantap dan terjadi peningkatan viskositas (Fennema, Karen and Lund, 1996).

3.

NaOH

Gambar 2. Struktur NaOH

Natrium hidroksida (NaOH), juga dikenal sebagai soda kaustik atau sodium hidroksida, adalah sejenis basa logam kaustik. Natrium Hidroksida terbentuk dari oksida basa Natrium Oksida dilarutkan dalam air. Natrium hidroksida membentuk

larutan alkalin yang kuat ketika dilarutkan ke dalam air. Natrium hidroksida murni berbentuk putih padat dan tersedia dalam bentuk pelet, serpihan, butiran ataupun larutan jenuh 50%. NaOH bersifat lembab cair dan secara spontan menyerap karbon dioksida dari udara bebas, sangat larut dalam air dan akan melepaskan panas ketika dilarutkan. Serta larut dalam etanol dan metanol, walaupun kelarutan NaOH dalam kedua cairan ini lebih kecil daripada kelarutan KOH. Namun, NaOH tidak larut dalam dietil eter dan pelarut non-polar lainnya. Larutan natrium hidroksida akan meninggalkan noda kuning pada kain dan kertas. (Anonim. 2005)

4. Natrium klorida (NaCl)

Gambar 3. Struktur Natrium klorida

Natrium klorida atau sodium klorida dikenal sebagai garam dapur adalah zat yang memiliki tingkat osmotic yang tinggi. Natrium klorida mengandung tidak kurang dari 99,5 % NaCl, dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan. Pemerian berupa hablur heksahedral tidak berwana atau serbuk hablur putih ; tidak berbau; rasa asin. Kelarutan larut dalam 2,8 bagian air, dalam 2,7 bagian air mendidih dan dalam lebih kurang 10 bagian gliserol P; sukar larut dalam etanol (95 %) P. Penyimpanan dalam wadah tertutup baik. Khasiat dan penggunaan sebagai sumber ion klorida dan ion natrium (Anonim, 1979). Normal saline atau disebut juga NaCl 0.9 %. Cairan ini merupakan cairan yang bersifat fisiologis, non toksik, dan tidak mahal. naCl dalam setiap liternya mempunyai komposisi natrium klorida 9,0 gram dengan osmolalitas 308 mOsm/l setara dengan ion-ion Na+ 154 mEq/l dan Cl- 154 mEq/l (Anonim, 2008). Larutan NaCl 0.9

%.adalah larutan fisiologis yang ada di seluruh tubuh, karena alasan ini, tidak ada reaksi hipersensitivitas dari natrium klorida. Normal saline aman digunakan untuk kondisi apapun (Lilley & Aucker, 1999).

C. ALAT DAN BAHAN Alat : 1. 2. 3.


4.

Jarum per oral Beaker glass Stopwatch Pipet volume 10,0 ml Labu takar 50, 100 ml Tabung reaksi Spektrofotometer dan kuvet Silet Stopwatch Sentrifuge Mortir dan stamfer Gunting / pisau

5. 6. 7. 8. 9. 10.
11.

12.

Bahan :
1.

Suspensi parasetamol 1,2 % dalam CMC-Na 0,5 %, dosis 150 mg/kg BB

2.

NaOH 10 % NaCl (0,9%) steril

3.

4. 5.

Hati , paru-paru, ginjal Hewan Uji : Tikus

D. CARA KERJA a).UJI PENDAHULUAN

Hewan uji diberikan parasetamol dengan dosis 150 mg/kg BB Saat obat diperkirakan mencapai kadar puncak kira-kira (1,5 2 jam setelah pemberian ) , lalu hewan uji dikorbankan. Kemudian, diambil organ-organ pentingnya (paru-paru,ginjal, dan hati). Lakukan penetapan kadar obat dalam organ tersebut b).PENETAPAN KADAR DALAM SAMPEL BIOLOGIS Timbang organ (hati, paru-paru-, dan ginjal ).

Lalu, homogenkan dalam mortir menggunakan stamfer

Ambil 500 mg bagian organ, kemudian tambahkan larutan NaOH 10 % sebanyak 10 ml. Masukkan ke dalam sentrifuge selama 10 menit

Pisahkan filtrate dari endapan yang ada

Pipet filtrate 1 ml dalam 50 ml NaOH 10 %

Tentukan kadar parasetamol pada spektrofotometer 245 nm c).PENENTUAN KURVA BAKU Ambil organ hati, paru-paru, dan ginjal

Buat seri kadar paracetamol Tambahkan seri kadar kedalam masing-masing organ Lakukan penetapan kadar paracetamol sesuai dengan langkah poin b diatas Buat persamaan kurva baku untuk : 1.paracetamol dalam hati 2. paracetmol dalam ginjal 3. paracetamol dalam paru-paru

E. DATA DAN ANALISIS DATA tikus bobot (gram) 1 140 2 200 3 200 Parasetamol 1,2 %, dosis 150 mg/kgBB Pehitungan : Tikus I Dosis individu Vol.pemberian Tikus II Dosis individu Vol.pemberian Tikus III Dosis individu Vol.pemberian = = = 2,37 mg = 0,47 ml = = = 2,37 mg = 0,47 ml = = = 2,37 mg = 0,47 ml

F. PEMBAHASAN

Praktikum ini bertujuan agar mahasiswa mampu melakukan uji penetapan kadar obat dalam sampel biologis. Bioanalisis merupakan analisis secara kualitatif maupun kuantitatif suatu bahan obat maupun sediaan obat dalam sampel biologis. Pada praktikum ini digunakan metode bioanalisis kuantitatif, yaitu analisis suatu bahan obat maupun sediaan obat dalam sampel biologis yang didasarkan pada keberadaan senyawa, dengan cara melakukan penetapan kadarnya. Hewan uji yang digunakan dalam praktikum ini adalah tikus. Sampel yang digunakan untuk penetapan kadar meliputi organ hati, paru-paru, dan ginjal. Hati merupakan organ yang berperan dalam metabolisme tubuh. Sedangkan, paru-paru dan ginjal merupakan organ yang berperan dalam sistem sekresi. Sekresi adalah pengeluaran getah oleh kelenjar pencernaan ke dalam saluran pencernaan. Getah yang dikeluarkan masih berguna bagi tubuh dan umumnya mengandung enzim. Obat yang digunakan dalam praktikum ini adalah parasetamol yang dilarutkan dalam CMC-Na. Parasetamol merupakan obat yang berkhasiat meredakan sakit atau nyeri dan menurunkan suhu tubuh. Parasetamol dimetabolisir oleh hati dan dikeluarkan melalui ginjal. Parasetamol tidak merangsang selaput lendir lambung atau menimbulkan perdarahan pada saluran cerna. Mekanisme kerjanya adalah menghambat pembentukan prostaglandin. Prostaglandin merupakan suatu senyawa kimia yang dapat menimbulkan rasa nyeri dan mempengaruhi hipotalamus. Asetaminofen diabsorpsi cepat dan sempurna oleh saluran cerna. Kadar puncak plasma dicapai dalam waktu 30-60 menit, waktu paruh antara 1-3 jam, dan relatif tidak dipengaruhi oleh fungsi ginjal. Asetaminofen relatif didistribusikan secara merata ke seluruh jaringan tubuh. Sekitar 25 % asetaminofen terikat oleh protein plasma. Metabolisme oleh hati dan diubah menjadi asetaminofen sulfat (60 %) dan glukoronida (35 %) yang secara farmakologi tidak aktif. Suatu metabolit minor sebagai produk dari hidroksilasi tetapi sagat aktif (N-asetil-p-benzokuinoneimine/NAPQI).

Penting pada dosis besar karena bersifat toksik terhadap hepar dan ginjal. Sebagian besar (90-100 %) asetaminofen diekskresikan lewat ginjal dalam bentuk metabolitnya. Hanya sebagian kecil (3-5 %) diekskresikan dalam bentuk utuh. Mekanisme parasetamol dalam menyebabkan kerusakan hati dapat dilihat seperti pada gambar di bawah. Parasetamol biasanya akan diubah oleh sitokrom P450 menjadi metabolit yang sangat reaktif, N-asetil-p-benzoquinoneimine (NAPQI). Biasanya NAPQI secara cepat didetoksifikasi oleh cadangan glutation sel. Glutation dalam bentuk pereduksi aktifnya mengandung gugus sulfinil yang akan berikatan dengan NAPQI. Reaksi tersebut menghasilkan pembentukan konjugat sistein dan asam merkapturat yang akan diekskresikan dalam urin. Pada saat keracunan parasetamol, jumlah dan kecepatan pembentukan NAPQI dapat melebihi kemampuan hepar untuk mengisi kembali persediaan cadangan glutation.

Gambar 2. Mekanisme Asetaminofen

Deplesi glutation mengakibatkan NAPQI bebas berikatan secara kovalen dengan gugus sistein pada protein. Target utamanya adalah protein mitokondria, yang

mengakibatkan kerusakan produksi ATP (energi). Disfungsi mitokondria juga akan menghasilkan reaktif oksigen spesies (ROS) yaitu superoksida/O dan reaktif nitrogen spesies (RNS) yaitu peroksinitrit, yang mengakibatkan terjadinya stres oksidatif. Stres oksidatif inilah yang menyebabkan terjadinya hepatotoksisitas (kerusakan hati). Pada praktikum ini satu kelompok besar dibagi menjadi 3 kelompok kecil yang masing-masing kelompok kecil mendapatkan 1 ekor tikus yang sudah diinjeksikan dengan parasetamol 1 jam sebelum praktikum dimulai. Dosis parasetamol yang diberikan sebesar 150 mg/kg BB secara per oral. Tikus yang sudah diinjeksi kemudian dimatikan dengan cara dislokasi leher setelah 1,5 jam pemberian obat. Setelah tikus mati, dilakukan operasi kecil untuk mendapatkan sampel organ hati, ginjal, dan paruparu dari tikus. Ketiga organ tersebut dibersihkan dan ditimbang untuk kemudian dilumatkan dengan bantuan mortir dan stamfer. Hasil lumatan kemudian ditimbang seberat 500 mg dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang selanjutnya ditambahkan NaOH sebanyak 10 ml. Fungsi penambahan NaOH adalah untuk melarutkan parasetamol dalam sampel yang telah dilumatkan tersebut. Setelah ditambah dengan NaOH, sampel kemudian di sentrifuge. Centrifuge adalah alat untuk memutar sampel pada kecepatan tinggi dan memaksa partikel yang lebih berat terkumpul ke dasar tabung centrifuge. Larutan yang telah disentrifuge akan memisah dengan sendirinya karena partikel yang lebih berat akan mengendap di dasar tabung. Bagian yang bening kemudian diambil dan diencerkan dengan NaOH dalam labu ukur 50 ml hingga tanda batas. Larutan ini berfungsi sebagai larutan sampel induk. Larutan induk yang telah dibuat diukur serapannya dengan menggunakan spektrofotometer UV pada 245 nm. Dari praktikum, diperoleh absorbansi untuk masing-masing organ pada larutan sampel 50 ml melebihi rentang absorbansi yang diperbolehkan kecuali pada replikasi III sampel paru-paru sehingga perlu dilakukan pengenceran. Pengenceran dilakukan dengan cara membuat larutan sampel kerja. Larutan sampel kerja dibuat dengan

memipet sejumlah ml sampel induk yang diencerkan dengan akuades hingga tanda dalam labu ukur 10 ml. Pada sampel organ hati, replikasi I diencerkan 4 ml larutan sampel dalam labu ukur 10 ml. replikasi II diencerkan 1 ml dalam 10 ml dan replikasi III diencerkan 5 ml dalam 10 ml. Sampel organ ginjal, replikasi I diencerkan 2 ml dalam 10 ml, replikasi II 1 ml dalam 10 ml, dan replikasi III 5 ml dalam 10 ml. Sedangkan, organ paru-paru pada replikasi I dan II diencerkan 4 ml dalam 10 ml. untuk replikasi III tidak dilakukan pengenceran karena absorbansi yang diperoleh memenuhi rentang absorbansi yang diterima, yaitu 0,2-0,8. Pada praktikum ini dibuat kurva baku yang berfungsi sebagai kontrol dalam penentuan kadar dengan jumlah hewan uji yang digunakan sebanyak 3 ekor tikus. Data absorbansi untuk kurva baku dengan sampel organ hati dan ginjal diperoleh dari konsentrasi 0,5; 0,75; 1; dan 1,25 dengan nilai absorbansi berturut-turut 0,3151; 0,4404; 0,6373; 0,7987 untuk hati dan 0,2368; 0,4594; 0,5485; 0,7323 untuk organ ginjal. Dari data konsentrasi larutan baku dan absorbansi yang dihasilkan oleh tiap seri konsentrasi tersebut maka dapat diperoleh nilai A,B, dan r dengan memasukkan data ke program regresi linier sehingga dapat diperoleh persamaan regresi linier kurva baku Y=Bx + A. Dari perhitungan diperoleh : 1. Hati A= - 0,0288 2. Ginjal A= - 0,0572 3. Paru-paru B= 0,6302 B= 0,6591

A= - 0,0853

B= 0,4430

Nilai A merupakan harga intersep kurva, yaitu titik potong kurva pada sumbu y. Semakin kecil nilai A maka penyimpangan juga senakin kecil sehingga kurva ideal memiliki nilai A = 0, dengan demikian apabila kurva diperpanjang maka akan melalui titik (0,0). B (tangen ) merupakan harga kemiringan/slope kurva baku sehingga menjadi parameter sensitivitas metode pengukuran. Apabila sudut () yang dihasilkan slope kurva baku semakin mendekati 45 o, maka metode pengukuran akan semakin sensitive. Dari data regresi tersebut dapat dihitung kadar parasetamol dalam sampel organ. Dari perhitungan, diketahui kadarnya berturut-turut dari hati, ginjal, dan paruparu adalah 55,0794 mg, 10,5925 mg, dan 3,7839 mg. Data tersebut menunjukkan bahwa hati memiliki kadar yang terbesar dibanding dua sampel organ lainnya. Secara teoritis, urutan yang memberikan kadar paling besar ke paling kecil adalah hati > ginjal > paru-paru. Hal ini karena peran hati sebagai organ metabolisme lebih besar dibanding dua sampel organ lain yang perannya sebagai agen pensekresi.

G. KESIMPULAN

Dari praktikum yang telah dilakukan, dapat ditarik kesimpulan bahwa kadar yang diperoleh masing-masing sampel organ adalah :
1. Hati 2. Ginjal 3. Paru-paru

: 55,0794 mg : 10,5925 mg : 3,7839 mg

Dari data tersebut diketahui hati memiliki nilai kadar yang terbesar. Urutan kadar dari yang tertinggi hingga terkecil adalah : hati > ginjal > paru-paru. Hasil tersebut sesuai dengan teori, dimana hati > ginjal > paru-paru.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 1979. Farmakope Indonesia Edisi III. Depkes RI: Jakarta. Anonim. 2004. Cellulose. http://en.wikipedia.org/wiki/cellulose. diakses tanggal 1 Mei 2012. Anonim. 2005. Natrium hidroksida. http://id.wikipedia.org/wiki/Natrium_hidroksida. diakses tanggal 1 Mei 2012. Fennema, Karen and Lund. 1996. Principle of Food Science. Connecticut : The AVI Publishing. Lilley, Linda Lane & Aucker, Robert S. 1999. Pharmacology; Nursing; Drug Therapy; Pharmaceutical Preparations; nurses' instruction; administration & dosage. Mosby (St. Louis). Shergel, L., Yu, B.C. Andrew., 1999, Applied Biopharmaceutics & Pharmacokinetics, edisi 4, hal 30-32, Appleton & Lange, USA. Smith, R & Steavary, 1981, Text Book of Biopharmaceutics Analysis A Description of Methods for The Determination of Drug in Biological Fluid, hal 80, Les & Febiger, Philadelphi. Tjay, T.H. dan Rahardja, K., 1991, Obat-obat Penting Edisi Empat, Depkes RI: Jakarta.