1 REFERENSI List PH and Schmidt PC, 1989, Phytopharmaceutical Technology, CRC Press, Boston Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Departemen Kesehatan Republik Indonesia Harbone,J.B., 1984, Metode Fitokimia: Penuntun cara modern menganalisis tumbuhan, Penerbit ITB, Bandung 2 ALUR PENCARIAN B. AKTIF DARI TUMBUHAN
Selektifitas Mudah penanganannya Ekonomis Ramah Lingkungan
7 JENIS-JENIS PELARUT Ais Hidrokarbon alifatis (PE,heksan) Kloro hidrokarbon (Diklormetan, Triklormetan) Alkohol (Etanol, metanol, isopropanol) Asam karboksilat Ester Ether Minyak 8 METODE EKSTRAKSI 3 Metode Ekstraksi Proses yang menghasilkan keseimbangan konsentrasi antara larutan dan residu padat Contoh : Maserasi, digesti, ultrasonic extraction, dll Proses Ekstraksi seksama/menyeluruh Contoh : Perkolasi, Countercurrent extraction. Ekstraksi dengan Gas superkritis
PHYTOPHARMACEUTICAL TECHNOLOGY 9 METODE EKSTRAKSI
• Ekstraksi dengan menggunakan Pelarut
• Dingin maserasi, perkolasi • Panas Infus, dekokta, Refluks, Soxhlet • Destilasi • Lainnya • Ekstraksi berkesinambungan • Ekstraksi dengan gas superkritis • Ekstraksi dengan ultrasonik • Ekstraksi dengan tenaga listrik
PARAMETER STANDAR UMUM EKSTRAK TUMBUHAN OBAT
10 Proses yang menghasilkan keseimbangan konsentrasi antara larutan dan residu padat
Maseration, Kinetic maceration,
Digestion Vortical (Turbo) Extraction Ultrasound extraction Extraction by Electrical Energy
11 MACERATION Penyarian dengan menggunakan pelarut beberapa hari (5 hari) dengan pengadukan (tidak kontinu) Sesuai untuk bahan aktif yang mudah larut dalam cairan penyari Simplisia yang mengandung musilago dan bahan lain yan mudah mengambang. (+) Cara pengerjaan dan peralatan sangat sederhana dan mudah (-) Pengerjaan lama dan penyarian kurang sempurna Kinetic Maceration: Maserasi dengan pengadukan konstan dan kontinu Digesti : Maserasi dengan pemanasan (40-50 C)
12 VORTICAL (TURBO) EXTRACTION
Bahan dan pelarut diaduk dengan kecepatan
tinggi (high speed mixer/homogenizer) Bahan semakin halus karena ada pengecilan ukuran partikel selama proses, sehingga meningkatkan luas permukaan bahan dengan cairan penyari Penyarian lebih baik dan waktu lebih singkat dari maserasi Cukup beresiko untuk bahan yang termolabil Pemisahan antara cairan penyari dengan residu jauh lebih sulit Tidak efektif untuk large scale.
13 ULTRASOUND EXTRACTION Penyarian dengan menggunakan gelombang suara (ultrasonik, Frek > 20 hz) Prinsip Meningkatkan permeabilitas dinding sel Membentuk cavity ( lubang-lubang) Meningkatkan tekanan mekanik Dapat menyebabkan rusaknya bahan aktif akibat oksidasi Ekstrak dapat tercemar oleh trace metal High Energy Cost untuk penggunaan large scale
14 Extraction by Electrical Energy
Penyarian dengan mengunakan tenaga listrik
Prinsip Membuat cavity Menyebarkan tekanan gelombang yang dihasilkan oleh listrik dengn kecepatan Ultrasonic
15 Proses Ekstraksi Seksama/Menyeluruh
Exhaustive extraction: The complete removal of the desired
extractive substance from material. Percolation : - Plant material is exhaustively extracted by fresh solvent - Only fresh solvent is used, Consumed a large quantity of solvent - Takes a long time - Inflkuenced by : Selectivity of solvent, Quantity Flow (Dropping rate) of the solvent, Temperatur Repercolation - First extracted with fresh solvent and then some of percolate is used for exhaustive extraction by stagewise concentration in another percolator. Continuous Countercurrent Extraction - Fresh plant material is brought into contact with loaded/charged solvent at the same time as fresh solvent is being brought into contact with already pre-extracted
20 Solvent Extraction Extraction: transfer of a solute from one phase to another. Can use most any combination of phases (solid, liquid, gas, supercritical fluid) Solvent extractions use two immiscible liquids. – Typically aqueous/organic solvent 21 Solvent Extraction
Organic solvents less dense than water
– diethyl ether, toluene, hexane Organic solvents more dense than water – chloroform, CCl4, dichloromethane Like dissolves like so ideally, the extracting solvent should be similar to the solute (analyte) 22 Solvent Extraction Separatory funnel
add second immiscible solvent
shake
23 KROMATOGRAFI
Teknikpemisahan fisik campuran
komponen berdasarkan perbedaan migrasi komponen-komponen tersebut dari fase diam oleh pengaruh fase gerak
24 Klasifikasi Metode Kromatografi CH RO M ATO G RAPHY
26 Pemilihan metode kromatografi didasarkan: – Sifat Kelarutan – Sifat keatsirian Kromatografi Kertas: – Mudah larut dlm air (Karbohidrat, asam amino, senyawa fenolat, asam organik, basa asam nukleat KLT: – Mudah larut lm lipid (Lipid, steroid, karotenoid, klorofil) KGC – Mudah teratsirikan (Minyak atsiri, monoterpena, sesquiterpena, asam lemak) KCKT – Sulit teratsirikan 27 Kromatografi Kertas
Eluasi desending satu arah atau
kadang 2 arah Kertas whatman 46 x 57 cm Fase diam selulosa, alumina, silikat Deteksi bercak berwarna atau berflouresensi UV setelah direaksikan Fase gerak : Butanol: Asam asetat:Air
28 Prinsip : Partisi dua fase Semakin banyak air migrasi semakin lambat Semakin panyak pelarut organik migrasi semakin cepat (Rf tinggi)
29 Prosedur : Pemilihan eluen(pelarut pengembang) – Eluasi sampel dengan berbagai eluen – Pilih yang bisa memisahkan senyawa tersebut Fraksinasi dengan kromatografi kertas – Ekstrak yang akan ditotolkan ditotolkan berupa garis – Jangan lupa di keringkan dengan hair dyer – Eluasi dengan eluen terpilih (bisa bidimensional) – Amati noda – Ambil noda yang diinginkan dengan memotong kertas – Ekatraksi dengan pelarut yg sesuai
Fase diam: Selulosa, silika gel, celite, Poliamida, sephadex KLT analitik : tebal 0,1-0,25 mm KLT Preparatif: tebal ad 1 mm
32 KROMATOGRAFI KOLOM Kolom konvensional elusi berdasarkan gaya gravitasi Kromatografi Cepat Vacum Liquid Chromatography – Eluasi dengan bantuan pompa – Eluasi bisa secara gradien Kromatografi Cair Kinerja Tinggi – Volume injeksi >> besar – Kolom juga jauh lebih besar dan panjang – Eluat dapat ditampung 33 Contoh Separasi dengan Kromatografi Kolom
34 Prosedur Pemilihan Eluen untuk Fraksinasi Standar kurkumin dan ekstrak kurkuminoid yang telah dicuci dilarutkan dalam etanol 96% dan ditotolkan 2-5µl pada lempeng KLT. Lempeng KLT selanjutnya dieluasi dengan menggunakan eluen yang sesuai di dalam bak kromatografi sampai batas yang ditentukan. Amatilah lempeng pada lampu UV 254 nm dan 365 nm. Eluen dipilih apabila ekstrak kurkuminoid yang ditotolkan terpisah menjadi 3 noda yaitu kurkumin, bisdemetoksi kurkumin dan desmetoksi kurkumin. Lihat gambar dibawah ini. 35 36 Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom Langkah-langkah untuk fraksinasi dengan kromatografi kolom adalah sebagai berikut: – Silika gel sebanyak 75 kali bobot ekstrak kurkuminoid dimasukkan dalam Erlenmeyer dan ditambahkan dengan eluen ± 2 cm diatas permukaan silika gel, dikocok pelan hingga merata dan masukkan dengan hati-hati ke dalam kolom kromatografi yang pada bagian bawahnya telah diberi glass wool. Kolom tersebut kemudian didiamkan selama 1 hari untuk memampatkan dan melihat ada tidaknya keretakan (lihat gambar dibawah ini).
37 Apabila kolom tidak retak, tambahkan eluen 0,5 cm diatas permukaan silika gel dan bila retak ulangi langkah a. Kemudian ke dalam kolom ditambahkan ekstrak kurkuminoid (1% bobot silika) yang telah dicampur dengan silika gel. Alirkan eluen dan tampung sebanyak ± 50 ml dalam Erlenmeyer (eluen ini belum membawa zat kimia tanaman sehingga dapat dibuang). Selanjutnya kran dibuka dan diatur penetesannya (1 tetes/detik) dan ditampung dalam vial atau tabung yang telah diberi nomor masing-masing vial 5 ml (lihat gambar dibawah ini). Pada setiap vial dengan kelipatan 10 dilakukan uji KLT untuk melihat noda yang dihasilkan. Apabila menghasilkan noda yang sama vial-vial tersebut digabung. Penetesan dihentikan apabila vial sudah tidak memberikan noda saat diuji KLT. 38 PEMURNIAN
Metode pemurnian: Rekristalisasi Sublimasi Kromatografi
Hasil ISOLAT (DIIDENTIFIKASI)
39 IDENTIFIKASI ISOLAT
Spektroskopi UV/Vis Spektroskopi IR Spektroskopi Massa Spektroskopi Resonansi Magnetik Nuklir
