En PCR, el cido desoxirribonucleico (ADN) es el analito.

Por tanto, una buena muestra implica siempre un correcto proceso de obtencin de esta molcula a partir de material biolgico. La extraccin de ADN consta de una etapa de lisis, que consiste en romper las estructuras que confinan el citoplasma y liberar al medio su contenido y otra de purificacin, que implica la retirada de la solucin final de la mayora de elementos que pueden interferir en la PCR. De los tres pasos crticos que componen el anlisis de patgenos por PCR (Fig. 1), la extraccin de ADN es quizs el ms desconocido y sobre el que ms control podemos ejercer

Las sales caotrpicas ayudan a romper la estructura tridimensional de macromolculas como las protenas o los cidos nucleicos consiguiendo su desnaturalizacin. La adicin de un detergente como el SDS es necesaria a menudo para eliminar las membranas.

Aislamiento de plsmidos Protocolo

gran escala mini-prep a partir de una colonia

lisis: NaOH 100C lisocima detergente bacterias DNA

restos celulares gradientes de cloruro de cesio+ Bromuro de Etidio El BrEt se intercala entre las bases de la molcula de DNA

Gradiente de ClCs + BrEt

DNA lineal (cromosoma, plsmido L y OC) DNA superenrollado (plsmido CCC) DNA CCC+ BrEt aumenta su densidad

Extraccin- purificacin-concentracin de DNA Protocolo general

DNA en solucin (de lisis tampn)

1 4 2

+ etanol DNA precipita

3

eliminamos sobrenadante resuspendemos DNA precipitado en el tampn adecuado

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