a. JUDUL Identifikasi Bakteri Selulolitik Dari Saluran Pencernaan Rayap Lokal Indonesia. b.

PENDAHULUAN Rayap dalam kategori taksonomi termasuk dalam Kelas Insekta (serangga). Rayap (Glyptotermes montanus) memiliki kemampuan merusak kayu yang diketahui mengandung banyak serat ,dikarenakan adanya kemampuan enzim yang dihasilkan oleh mikroba termasuk flagellata (protista),yeast,dan bakteri yang berada dalam saluran pencernaan rayap (Trisnawati P,dkk: 2003).Fakta yang dapat dijumpai dalam kehidupan sehari-hari rayap merupakan serangga hama yang merugikan secara ekonomi karena menimbulkan kerusakan pada bangunan, berbagai jenis kayu serta tanaman pertanian. Menurut Haltric and Steiner (dalam Trisnawati P,dkk: 2003),sel tanaman mengandung serat atau lignoselulosa yang mengandung selulosa ,hemiselulosa dan lignin. Pada umumnya rayap yang menimbulkan kerugian tersebut merupakan rayap dari kasta pekerja. Rayap kasta pekerja inilah yang dapat mencerna selulosa menjadi karbohidrat rantai pendek sehingga dapat digunakan oleh rayap dari kasta yang lain. Kemampuan rayap pekerja mendegradasi selulosa dimungkinkan oleh keberadaan bakteri selulolitik,dan enzim-enzim lain dalam saluran pencernaannya dan bakteri ini bersifat species spesifik artinya untuk setiap jenis rayap dapat dihuni oleh strain bakteri selulolitik yang berbeda (Eutick et al., 1978; Mannesmann, 1972; Thayer, 1976) Hubungan antara rayap dan bakteri selulotik ini bersifat simbiotik mutualistik. Dengan demikian masing-masing organisme dalam asosiasi ini saling mendapatkan keuntungan dari organisme lain dalam asosiasi tersebut (Atlas and Bartha,1998). Isolasi enzim mikroba dari saluran pencernaan rayap telah dilakukan, antara lain isolasi enzim lignoselulase, yang selanjutnya diproduksi secara komersial.Enzim Komersial dapat dihasilkan oleh berbagai macam mikroorganisme tetapi memiliki aktifitas protein spesifik yang rendah,misalnya yang dihasilkan oleh kapang Trichoderma.sp. (Trisnawati.P,dkk.2003) Adanya kemampuan sifat enzimatik tertentu misalnya kemampuan lignoselulolitik,mikroorganisme tersebut dapat dimanfaatkan misalnya untuk membantu menyederhanakan pakan berserat sehingga mudah diserap oleh ternak, membantu pengomposan, membantu menyederhanakan bahan lignoselulolitik untuk upaya pengolahan limbah, dan industry makanan.

Berdasarkan fakta fakta penemuan tersebut diatas, maka ada beberapa hal penting yang dapat diteliti yaitu pertama, masih diperlukan langkah isolasi bakteri utamanya yang bersifat selulolitik, kedua melakukan screening atai memilih isolate bakteri yang memiliki pertumbuhan yang baik.Hal inilah yang menjadi pokok permasalahan yang harus dijawab dari penelitian ini. c.METODE PENELITIAN Penelitian ini merupakan jenis penelitian deskriptif-eksploratif, yaitu dengan mengambil seluruh isolate bakteri dari saluran pencernaan rayap pekerja yang diisolasi dengan media selektif Carboxymetyl Cellulosa (CMC).Isolat bakteri yang ditemukan selanjutnya diidentifikasi karakter morfologi dan karakter biokimiawinya. 1.Prosedur penelitian : a. Sterilisasi dan Pembuatan media Media yang dibuat meliputi media agar RCM, media CMC padat,media CMC cair. Bahan-bahan yang dibutuhkan dalam pembuatan media ditimbang sesuai kebutuhan selanjutnya dicampur dan disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121C, tekanan 2 atm. b. Pengambilan Spesies rayap Spesies rayap yang digunakan adalah spesies rayap kasta pekerja yang hidup di kayu dan tanah lokal Indonesia., dan dalam penelitian ini rayap diambil dari kayu jati yang selanjutnya dikarakterisasi. c. Sterilisasi permukaan rayap dan pemisahan saluran pencernaan : Sterilisasi Rayap :Rayap dari kasta pekerja disterilisasi dengan alkohol 70%. Untuk membuktikan sterilitas permukaan rayap maka rayap diusapkan dan digulungkan di atas medium agar Reinforced Clostridial Medium (RCM) dan diinkubasi pada 30oC selama 72 jam. Bila ada pertumbuhan berarti permukaan belum steril maka harus dicari lagi cara untuk mensterilkan permukaan rayap. Pemisahan saluran pencernaan rayap: Bila rayap sudah steril maka rayap disayat untuk dikeluarkan saluran pencernaannya secara aseptik di dalam Laminar air-flow. Saluran pencernaan dimasukkan dalam buffer Ringer selanjutnya dihomogenisasi. d. Isolasi Bakteri : Melakukan serial pengenceran terhadap suspensi saluran pencernaan.dengan 10 ml buffer Ringer .Mengambil 0,1 ml kemudian dikulturkan kedalam media selektif CMC padat dengan metode Spread Plate dan diinkubasikan pada temperatur 30oC selama 24-72 2

jam. Mengisolasi setiap koloni yang tumbuh kedalam dalam media CMC miring sebagai biakan murni. Selanjutnya biakan murni ini dapat digunakan untuk pengujian sifat morfologi koloni, morfologi sel, uji biokhemis dan pengukuran diameter koloni dan uji pembentukan zona bening. e. Karakterisasi fenotipik dan pengukuran pertumbuhan: Karakterisasi fenotipik bakteri meliputi karakter morfologi koloni,morfologi sel dan sifat biokhemis. Sifat biokimis meliputi uji katalase dan fermentasi karbohidrat (glukosa, fruktosa, sukrosa), uji kemampuan menggunakan amilum ,tipe pertumbuhan dan kebutuhan oksigen. Pengukuran pertumbuhan isolat terpilih selama inkubasi diukur dengan Spectrofotometer. Pembuatan Starter Culture: Media CMC cair steril sebanyak 100 ml diinokulasikan dengan 1 ose biakan murni isolate terpilih dan diikubasikan dalam inkubator goyang. Selanjutnya dilakukan pengukuran pertumbuhan sel pada setiap interval 6 jam selama waktu inkubasi 0-72 jam . d. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN 1.Hasil Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat-isolat bakteri selulolitik dari saluran pencernaan rayap lokal dan menemukan isolate yang memiliki daya selulolitik tinggi. Daya selulolitik tinggi diindikasikan dengan diameter koloni Rayap lokal yang dimaksud adalah rayap yang berasal/ditemukan di Indonesia. Rayap yang berhasil diperoleh selanjutnya dikarakterisasi. Karakterisasi meliputi karakter perilaku membuat sarang dan karakter morfologinya. a.Karakterisasi rayap. Rayap kasta pekerja ini memiliki ciri anatara lain ,memiliki mobilitas yang lebih aktif disbanding rayap kasta yang lain. Ciri morfologi rayap pekerja ini kepalnya bulat telur,tidak memiliki capit,pada kepala dilengkapi antenna yang bersegmen (15 segmen dan berambut). Dan rayap ini tergolong dalam Familia Rhinotermitidae. b. Hasil isolasi bakteri selulolitik yang tumbuh pada media selektif CMC diperoleh beberapa isolat dengan ciri-ciri morfologi koloni, seperti tertuang dalam Tabel 1 berikut. Tabel 1.Morfologi koloni isolate bakteri selulolitik dari saluran pencernaan rayap pekerja No. Kode Konfigurasi/bentuk Warna koloni Margin/tepi Elevasi 1 isolat C3 I 1 Round, with Kuning Lobate F Flat FFF

scalloped margin 3

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

C3 I 2 C3 I 4 C3 I 6 C3 I7 C3 I 8 C3 I 9 C3 I 10 C3 I11 C3 I 12 C3 I 13 C3 I 14 C3 I 15 C3 I 16 C3 I 17 C3 I 18

Round, with scalloped margin Irreguler, spreading Round, with scalloped margin Irreguler, spreading Round, with scalloped margin Round with,scalloped margin Round, with scalloped margin Round, with scalloped margin Round, with scalloped margin Round, with scalloped margin Round, with scalloped margin Round, with scalloped margin Round, with scalloped margin Round, with scalloped margin Round with,scalloped margin Filamentous Round with scalloped margin Round with scalloped margin Round with scalloped margin Irreguler spreading Irreguler spreading Round

Kuning kehijauan Putih susu Kuning Orange Muda Kuning Kuning kehijauan Kuning Putih bening Kuning kehijauan Putih susu Kuning kehijauan Kuning kehijauan Kuning kehijauan Kuning Putih susu

Lobate Irreguler Lobate Lobate Lobate Lobate Lobate Lobate Lobate Irreguler Lobate Lobate Lobate Lobate Lobate

Convex Flat Convex Hilly Hilly Flat Flat Convex Flat Umbonate Flat Flat Flat Flat Flat

17 18 19 20 21 22 23

C3 I 20 C3 I 21 C3 I 22 C3 I 24 C3 I 25 C3 I 26 C3 I 27

Kuning keputihan Putih susu Bening Kuning keputihan

Branching Irreguler Lobate Lobate Lobate Lobate Irreguler

Umbonate Hilly Umbonate Hilly Hilly Flat Flat

and Putih susu and Putih susu with Putih susu 4

scalloped margin Tabel 1. Menunjukkan bahwa dari 23 isolat yang berhasil diisolasi memiliki morfologi koloni yang bervariasi.Koloni yang telah dikarakterisasi morfologinya selanjutnya diukur diameternya.Untuk pengukuran diameter koloni dilakukan hingga umur 7 hari inkubasi, karena pertumbuhan koloni sangat lambat,sedangkan untuk pengecatan Gram dilakukan pada saat kultur berumur 24 jam.Diameter koloni, isolate bakteri yang bersifat CMCase (selulolitik), disajikan pada Tabel 2. berikut Tabel.2.Karakter morfologi sel, sifat Gram dan diameter koloni bakteri selulolitik pada hari ke 7 inkubasi. No. Kode isolat Bentuk sel Sifat Gram koloni (mm) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 C3 I 1 C3 I 2 C3 I 4 C3 I 6 C3 I 7 C3 I 8 C3 I 9 C3 I 10 C3 I 11 C3 I 12 C3 I 13 C3 I 14 C3 I 15 C3 I 16 C3 I 17 C3 I 18 C3 I 20 C3 I 21 C3 I 22 C3 I 24 kokus kokus kokus kokus kokus kokus kokus kokus kokus kokus kokus kokus kokus kokus baatng pendek batang pendek kokus batang pendek batang pendek kokus 5 negatif negatif negatif negatif negatif negatif negatif negatif negatif negatif negatif negatif negatif negatif negatif negatif negatif negatif negatif negatif Hari ke 7 5,8 5,7 5,7 6,2 * 5,25 5,5 5,3 5,7 5,3 4 5,8 4,5 6,75* 4,6 4,25 4,4 5,1 5,4 4,7 4,8

21 22 23

C3 I 25 C3 I 26 C3 I 27

kokus kokus batang pendek

negatif negatif negatif

4,3 4,75 5,8

Tabel 2. diatas menunjukkan bahwa dari 23 isolat yang diperoleh juga memiliki bentuk sel,serta diameter koloni yang bervariasi,namun seluruh isolat memiliki sifat Gram yang sama yaitu Gram (-). Untuk keperluan praktis perlu dipilih koloni yang memiliki pertumbuhan yang baik,yaitu yang memiliki diameter koloni paling besar.Dari 23 isolat yang diperoleh, dapat dipilih isolat yang memiliki ukuran diameter koloni yang besar yaitu isolate C3I6 dengan diameter koloni 6,2 mm dan isolate C3I15 dengan dameter 6,75mm. Karakterisasi biokimiawi atau karakter fenotipik selanjutnya hanya dilakukan untuk 2 koloni terpilih tersebut. Karakter biokimiawi meliputi uji katalase ,uji fermentasi karbohidrat (glukosa, fruktosa, sukrosa) uji hidrolisa amilum,uji penggunaan asam sitrat, uji motilitas,kemampuan memproduksi H2S.Karakter fenotipik dari 2 isolat bakteri terpilih dapat disajikan didalam Tabel3. berikut. Tabel 3. Hasil pengamatan karakter fenotipik isolat bakteri selulolitik terpilih No. Karakter MORFOLOGI KOLONI Configuration (bentuk koloni) 1 Round 2 Round with Scallope Margin 3 Round with Raised Margin 4 Round with Radiating Margin 5 Irreguler and spreading 6 Filamentous Margins (Tepi koloni) 7 Smooth 8 Wavy 9 Lobate 10 Irreguler 11 Branching Elevation (Permukaan koloni) 12 Flat 13 Raised 14 Convex 15 Umbonate 16 Hilly Warna koloni 17 Putih 6 Isolat bakteri terpilih C3.I.6 + + + C3.I.15 + + + -

18 Kuning 19 Merah Pertumbuhan pada media agar miring 20 Filiform 21 Echinulate 22 Beaded 23 Effuse 24 Arborescent 25 Rhizoid PERTUMBUHAN PADA MEDIA CAIR 26 Uniform Fine Turbidity 27 Flocculant Growth 28 Pellicle 29 Sediment Kebutuhan oksigen 30 Aerob 31 Anaerob 32 Anaerob fakultatif MORFOLOGI SEL Sifat Gram 33 Gram (+) 34 Gram (-) Bentuk sel 35 Kokus 36 Batang pendek 37 Batang panjang Rangkaian sel 38 Tunggal 39 Diplo 40 Rantai 41 Tetrad 42 Seperti anggur UJI FISIOLOGIS (biokimiawi) 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52

+ + + + + + + -

+ -

+ + + + + + -

Fermentasi glukosa Kuning (asam) Kuning (asam) Fermentasi Sukrosa Kuning (asam) Kuning (asam) Fermentasi laktosa Merah muda (basa) Kuning (asam) Fermentasi galaktosa Kuning (asam) Kuning (asam) Fermetasi maltosa Kuning (asam) Kuning (asam) Hidrolisis amilum Uji katalase + + Uji Sitrat Motilitas Produksi H2S Tabel 3.di atas menunjukkan bahwa kedua isolat terpilih memiliki banyak

kesamaan baik sifat morfologi koloni,morfologi sel,sifat dinding selnya dan sifat 7

fisiologisnya.Perbedaan hanya terlihat pada pertumbuhannya pada agar miring dan permukaan koloninya. Pemilihan isolate berdasarkan diameter koloni memerlukan konfirmasi lebih lanjut yaitu dengan melihat profil pertumbuhan dari isolate tersebut selama masa inkubasi 0 jam hingga 72 jam dengan interval waktu 6 jam. Pertumbuhan sel diukur dengan Spectrofotometer yaitu dengan melihat kepadatan sel selama waktu inkubasi.Pada pengukuran ini suspensi yang digunakan adalah pengenceran 10- .Data hasil pengukuran pertumbuhan isolate bakteri selulolitik terpilih dengan spectrophotometer berdasarkan Optical Density pada panjang gelombang () 600 nm disajikan pada Tabel 4. berikut. Tabel 4. Pertumbuhan isolat bakteri selulolitik terpilih pada masa inkubasi 0-72 jam
Kode isolat C3I6 Rt2 C3I15 Rt2 0 0.08 0,07 0,15 0,08 0,05 0,09 0,14 0,07 6 0,19 0,75 0,94 0,47 0,68 0,29 0,97 0,49 12 0,19 0,21 0,40 0,20 0,57 0,54 1,11 0,56 Jumlah sel/ml (1x10)dengan interval inkubasi 6 jam 18 24 30 36 42 48 54 1,13 0,49 0,54 0,51 0,47 0,49 0,53 1,20 0,86 0,45 0,50 0,55 0,45 0,51 2,33 1,35 0,99 1,01 1,02 0,94 1,04 1,17 0,67 0,49 0,51 0,51 0,47 0,52 1,20 0,64 0,46 0,54 0,69 0,54 0,55 1,40 0,60 0,62 0,41 0,60 0,52 0,54 2,60 1,24 1,08 0,95 1,29 1,06 1,09 1,3 0,62 0,54 0,48 0,65 0,53 0,55 60 0,52 0,52 1,04 0,52 0,53 0,65 1,18 0,59 66 0,33 0,41 0,74 0,37 0,38 0,34 0,72 0,59 72 0,39 0,33 0,72 0,36 0,31 0,21 0,52 0,26

Jika dilihat data Tabel.4 di atas menunjukkan bawa pertumbuhan bakteri selulolitik kedua isolate terpilih mengalami pertumbuhan yang menurun setelah inkubasi 18 jam. Sedangkan pertumbuhan terbaik dicapai pada inkubasi 18 jam. B.Pembahasan Dari data-data diatas dapat dinyatakan bahwa hasil isolasi bakteri selulolitik dengan menggunakan media selektif CMC dari pencernaan rayap pekerja diperoleh 23 isolat bakteri yang bersifat selullolitik,karena koloni ini mampu tumbuh pada media selolusa. Data yang tertuang dalam Tabel.2 menunjukkan bahwa diameter koloni yang juga menggambarkan pertumbuhan sel, nampak lambat pertumbuhannya dalam inkubasi sampai 7 hari. Hal ini dapat diartikan bahwa,masa inkubasi yang panjang nampak tidak mendukung pertumbuhan koloni yang baik.Fakta ini kemungkinan dilatar belakangi oleh ketersediaan substrat yang tidak cukup untuk mendukung pertumbuhan, atau juga oleh faktor-faktor lain. Menurut hasil penelitian, bahwa produksi CMCase tidak ditentukan oleh lama inkubasi (dalam Tresnawati P. et al,2003). Biasanya jika diameter koloninya tinggi juga memiliki daya selulolitik tinggi.Lambatnya pertumbuhan ini dimungkinkan oleh sedikitnya sumber karbon tersedia yaitu glukosa di dalam media sebagai hasil hidrolisis selulosa. Glukosa merupaka sejenis sumber karbon yang paling mudah 8

ditransfer kedalam sel dan mudahdimetabolisir.Daya selulolitik suatu mikroba tergantung pada jenis mikrobanya yang selanjutnya akan menentukan perbandingan komplek selulase.Hal ini didukung oleh suatu hasil penelitian bahwa enzim ekstraseluler bakteri Cellulomonas CS1-17 lebih berperan dalam penguraian selulosa amorf (Tresnawati P. et al,1995).Menurut Ramasamy dan Verachert,1980 (dalamTresnawati P. et al,2003) enzim selobiase atau -glukosidase,umumnya bersifat ekstraseluler pada kapang bukan pada bakteri,dan enzim ini pada bakteri Pseudomonas.sp disimpan dalam periplasma dan tidak diekskresikan.Hal ini memperkuat dugaan bahwa lambatnya pertumbuhan koloni bakteri tersebut lebih disebabkanoleh tidak adanya enzim selobise yang berakibat tidak tersedianya substrat glukosa dilingkungannya. Berdasar penelusuran terhadap karakter fenotipik 2 isolat terpilih yaitu isolat C3I6 dan C3 I15 nampak bahwa sejumlah besar karakter, baik morfologi koloni, morfologi sel, sifat dinding sel dan sifat biokhemisnya memiliki banyak kesamaan, kecuali pada pada pertumbuhannya di media agar miring dan permukaan koloninya. Pemanfaatan bakteri selulolitik untuk tujuan praktis dapat dilakukan misalnya untuk tujuan pengomposan ,membantu dalam penyediaan pakan ternak sehingga lebih mudah dicerna .Dalam aplikasinya ,lebih banyak digunakan isolat bakteri atau kapang yang bersifat selulolitik secara langsung. e.KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan : Berdasarkan hasil dan pembahasan diperoleh kesimpulan sebagai berikut : Hasil isolasi bakteri selulolitik dari pencernaan rayap yang hidup di pohon nangka mati atau rayap local yang termasuk dalam Fam. Rhinotermidae, diperoleh 23 isolat bakteri selulolitik.Diantara 23 isolat yang ditemukan diperoleh 2 isolat yang memiliki pertumbuhan yang baik yaitu isolate C3I6 dengan koloni 6,2 mm dan isolate C3 I15 dengan koloni 6,75. Kedua isolate tersebut diketahui memiliki karakter yang banyak kesamaannya, kecuali berbeda pada sifat pertumbuhannya di media agar miring dan permukaan koloninya.Disamping itu juga menunjukkan bahwa pertumbuhan paling baik dari kedua isolat tersebut dicapai pada inkubasi 18 jam. Saran & rekomendasi: Beberapa saran yang dapat disampaikan antara lain,perlunya dilakukan optimasi pertumbuhan pada kisaran suhu dan pH dan faktor-faktor eksternal lain yang berpengaruh terhadap produksi CMCase.Perlunya dilakukan karakterisasi lebih lanjut tentang sifat 9

genetiknya.Aplikasi bakteri selulolitik seyogyanya dilakukan bersama kapang selulolitik agar dapat diperoleh hasil pemecahan substrat yang optimal.Perlu dilakukan penelitian lanjut dari lingkungan hidup rayap yang kemungkinan juga terdapat mikroorganisme selulolitik. f.DAFTAR PUSTAKA Aaronson, S. 1970. Experimental Microbial Ecology. Academic Press, New York. Atlas, R.M. and Bartha, R. 1998. Microbial Ecology, Fundamental and Application. Benjamin/ Cummings Science Publishing 2725 Sand Hill Road, Menlo Park,California Eutick, M.I., OBrien, R.W. and Slaytor,M. 1978. Bacteria from the gut of Australian termites. Appll. and Environ. Microbiol. 35 (5) : 823-828. Fahn, A. 1985. Plant anatomy. 3rd ed. Great Britain. Pergamon Press Kabirun. 1990. Biodegradasi limbah berselulosa: kursus singkat ekologi mikrobia. PAU Bioteknologi UGM. Yogyakarta Lehninger, A. 1983. Dasar-dasar Biokimia. Penerbit Erlangga. Jakarta Lynd L.R., J.W. Paul, H.V.Willem, and S.P. Isak. 2002. Microbial cellulase utilization Fundamental & Biotech. Microbial and Mol. Biology. 66(3): 506-577 Tresnawati,P.,P.A.Marbuna.,A.P.Sinurat.2003.Perbandingan Aktivitas Enzim Selulase dari Bakteri dan Kapang.Indonesian Journal of Agricultural Science.IPB. Tresnawati,P.,P,P.Ketaren,A.P Sinurat.,Irawan Sutikno.2003. Identification and Evaluation of Fiber Hydrolitik Enzymes in The Exctract of Termites (Glyptotermes montanus) For Poulktry Feed Application. Indonesian Journal of Agricultural Science.IPB Bogor.

10