Anda di halaman 1dari 29

USULAN PENELITIAN INDUKSI KALUS DARI DAUN TANAMAN Melaleuca alternifolia MENGGUNAKAN 2,4D DAN BAP

oleh HERNITA YULI NASTITI B1J007092

KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONAL UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2012

INDUKSI KALUS DARI DAUN TANAMANMelaleuca alternifolia MENGGUNAKAN 2,4D DAN BAP

oleh HERNITA YULI NASTITI B1J007092

Diajukan sebagai Pedoman Pelaksanaan Penelitian Studi Akhir pada Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto

Disetujui dan disahkan Pada tanggal .....................................

Pembimbing I,

Pembimbing II,

Sugiyono, S.Si., Ph.D NIP. 19690326 199403 1 001

Ir. Alice Yuniaty, M. Sc., Ph. D NIP. 19680615 199302 2 001

Mengetahui: Pembantu Dekan I Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman,

Drs. Agus Hery Susanto, M.S NIP. 19590814 198603 1 004

ii

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan proposal penelitian ini. Usulan penelitian ini disusun sebagai pedoman dalam pelaksanaan penelitian sehingga penelitian yang akan dilakukan dapat berlangsung terarah dan tepat waktu. Penelitian yang diberi judul Induksi Kalus Dari Daun Tanaman Melaleuca alternifolia Menggunakan 2,4D dan BAP ini termasuk dalam ruang lingkup ilmu Kultur In Vitro Tumbuhan. Tujuan penelitian ini adalah untuk mempelajari pengaruh 2,4D dan BAP terhadap pembentukan kalus dari daun tanaman Melaleuca alternifolia dan menentukan konsentrasi 2,4D dan BAP yang paling baik untuk memacu pembentukan kalus dari daun tanaman Melaleuca alternifolia. Penelitian ini akan dilaksanakan dibawah bimbingan Sugiyono, S.Si, Ph.D sebagai pembimbing I dan Ir. Alice Yuniaty, M. Sc., Ph.D sebagai pembimbing II. Penulis sangat menyadari bahwa usulan penelitian ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik yang bersifat membangun untuk perbaikan pelaksanaan penelitian ini. Akhirnya, semoga tulisan ini bermanfaat bagi yang membutuhkannya. Purwokerto, Maret 2012

Penulis

iii

DAFTAR ISI Halaman

PRAKATA ............................................................................................... DAFTAR TABEL .................................................................................... DAFTAR GAMBAR ................................................................................ DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................. INTISARI ................................................................................................. I. PENDAHULUAN .................................................................................. II. MATERI DAN METODE PENELITIAN ............................................

iii v vi vii viii 1 9

2.1. Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian ............................................ .. . .. 9 2.2. Metode Penelitian ........................................................................ .. . .. 9 2.3. Metode Analisis .......................................................................... .. . 17 III. JADWAL PENELITIAN .................................................................... DAFTAR REFERENSI ............................................................................ 18 18 19

iv

DAFTAR TABEL

Halaman 2.2.1. Kombinasi 2,4D dan BAP ................................................................ 3.1. Jadwal Pelaksanaan Penelitian ............................................................ 10 18

DAFTAR GAMBAR Halaman 1.1. Struktur kimia Dichlorophenoxy Acetic Acid (2,4D)........................... 1.2 Struktur kimia Benzyl Amino Purine ................................................... 5 5

vi

DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Komposisi Garam-Garam Anorganik pada Media MS (1962) ................ 24

vii

INTISARI

Perbanyakan tanaman melalui kultur in vitro dapat dilakukan melalui beberapa cara yaitu : 1) pembentukan tunas ganda, 2) pembentukan tunas adventif, 3) pembentukan embrio somatik, dan 4) pembentukan kalus. Induksi atau pembentukan kalus merupakan tahap awal dalam kultur kalus. Induksi dapat dipacu dengan pemberian zat pengatur tumbuh baik auksin mandiri maupun auksin yang dikombinasikan dengan sitokinin pada media pertumbuhan. Zat pengatur tumbuh mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur sel, jaringan atau organ secara in vitro. Penelitian ini akan dilakukan dengan tujuan untuk: 1) mempelajari pengaruh 2,4D dan BAP pada pembentukan kalus dari daun tanaman Melaleuca alternifolia; 2) menentukan konsentrasi 2,4D dan BAP yang paling baik untuk memacu pembentukan kalus dari daun tanaman Melaleuca alternifolia. Metode penelitian yang akan digunakan adalah metode eksperimental dengan rancangan dasar Acak Lengkap (RAL) pola perlakuan faktorial. Faktor I adalah konsentrasi 2,4D (D), yang terdiri atas 4 taraf yaitu 5; 10; 15, dan 20 M. Faktor II adalah konsentrasi BAP (B) yang terdiri atas 4 taraf yaitu: 1; 2; 3; dan 4 M. Masingmasing kombinasi perlakuan diulang 3 kali sehingga diperoleh 48 unit percobaan. Variabel yang diamati dalam penelitian ini adalah Pembentukan kalus dari daun Melaleuca alternifolia dengan parameter yang diukur berupa waktu kemunculan kalus, persentase eksplan yang membentuk kalus, dan tipe kalus yang terbentuk. Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan analisis ragam (ANOVA), dilanjutkan dengan uji BNT atau BNJ dengan tingkat kepercayaan 95% dan 99%. Untuk memperjelas hasil pengamatan visual, dibuat dokumentasi dalam bentuk foto. Keywords : Melaleuca alternifolia, kalus, 2,4D dan BAP

viii

I.

PENDAHULUAN

Melaleuca alternifolia adalah sejenis tanaman obat yang terkenal di dunia. Tanaman ini disebut juga tea tree, berukuran kecil berasal dari wilayah timur laut pesisir New South Wales, Australia (Thal, 2005 dalam Kiong et al., 2007). Tanaman ini menghasilkan metabolit sekunder berupa minyak esensial (dikenal sebagai tea tree oil). Sejak puluhan tahun yang lalu, secara tradisional tea tree oil digunakan untuk menyembuhkan batuk, radang tenggrokan dan penyembuhan kulit yang luka. Senyawa yang terkandung dalam tea tree oil adalah golongan fenol yang terbukti sebagai anti bakteri, anti jamur dan antiseptik. Manfaat tea tree oil telah dibuktikan dengan penelitian-penelitian terbaru dalam penggunaan skin care, karena efektifitasnya dalam melawan bakteri, jamur dan scabies. Bahkan telah terbukti bahwa tea tree oil dengan konsentrasi 5% menunjukkan efektivitas yang setara dengan benzoyl peroxide 5% dalam mengatasi masalah kulit dan rambut yang disebabkan oleh jamur (Cantiqalami.com, 2012). Tanaman tea tree memiliki habitus semak belukar dengan tinggi 4m sampai 6m. Tanaman ini mempunyai daun linier dengan panjang 10-35mm dan lebar 1mm. Bunganya berwarna putih, muncul di antara duri. Buahnya berbentuk cangkir dengan diameter 2-3mm (Harden, 1991). Klasifikasi Melaleuca alternifolia adalah sebagai berikut (www.ars-grin.gov) Kingdom : Plantae Divisi Class Ordo : Magnoliophyta : Magnoliopsida : Myrtales

2 Family Genus Species : Myrtaceae : Melaleuca : M. alternifolia

Perbanyakan tanaman melalui kultur in vitro dapat dilakukan melalui beberapa cara yaitu : 1) pembentukan tunas ganda, 2) pembentukan tunas adventif, 3) pembentukan embrio somatik, dan 4) pembentukan kalus (Mariska, et. al., 1992). Kalus adalah sekumpulan sel yang belum terorganisasi atau terdiferensiasi. Pada umumnya kalus dihasilkan oleh jaringan yang terluka atau kultur eksplan pada media yang mengandung zat pengatur tubuh. Luri (2010) mengatakan kalus adalah suatu kumpulan sel amorphous yang terjadi dari sel-sel jaringan yang membelah diri secara terus menerus. Menurut Kesse et, al., (1991) dalam Sugiyono (1993) kalus dapat dibedakan dalam beberapa tipe morfologi berdasarkan penampilan luar, tekstur dan susunan selnya. Kalus secara umum diklasifikasikan menjadi 3 jenis yaitu : a. Kalus perkembangan atau kalus embriogenik, yaitu kalus yang mampu berkembang menuju kearah organogenesis somatis atau embriogenesis somatis. Kalus ini dicirikan oleh adanya klorofil, berwarna hijau, keras, dan tumbuh cepat. b. Kalus proliferatif yaitu kalus yang tumbuh dan membesar baik dalam jumlah maupun ukuran sel tetapi tidak mampu berkembang ke arah embriogenesis atau organogenesis. Sel-sel kalus tipe ini berukuran sangat kecil dan berwarna putih atau transparan. c. Kalus senesen yaitu kalus yang memiliki pertumbuhan yang sangat lambat dan tidak menunjukkan perkembangan. Ciri-ciri kalus ini yaitu tidak adanya klorofil, berwarna krem atau coklat, pertumbuhannya lambat dan sel bentuk polyhedral.

3 Menurut Parnata (2005) untuk mendukung pertumbuhan eksplan dalam kultur in vitro, diperlukan media tanam yang memiliki unsur-unsur yang diperlukan oleh eksplan. Jumlah dan komposisi unsur tersebut harus seimbang. Wetherel (1982) menambahkan bahwa komposisi media kultur sangat berpengaruh terhadap proses pertumbuhan dan diferensiasi eksplan secara in vitro. Media kultur yang memenuhi syarat adalah media yang mengandung nutrien makro dan mikro dalam kadar dan perbandingan tertentu, sumber energi, air, asam amino, vitamin, dan zat pengatur tumbuh (ZPT). ZPT teutama dibutuhkan bagi pertumbuhan dan diferensiasi tanaman dalam kultur in vitro (Hendaryono dan Wijayani, 1994). Induksi atau pembentukan kalus merupakan tahap awal dalam kultur kalus. Induksi dapat dipacu dengan pemberian zat pengatur tumbuh baik auksin mandiri maupun auksin yang dikombinasikan dengan sitokinin (Rahardja, 1994). George dan Sherington (1984) dalam Sugiri (2005) mengatakan bahwa untuk proses caulogenesis, rhizogenesis, dan pembentukan tunas dibutuhkan suatu imbangan taraf auksin dan sitokinin dalam media. Kultur kalus merupakan salah satu tipe kultur yang banyak digunakan. Keuntungan kultur kalus adalah mudah dilakukan pengontrolan faktor lingkungan baik faktor fisik maupun kimianya (Allan, 1991). Narayanaswamy (1994) menyatakan bahwa tanpa penambahan zat pengatur tumbuh dalam media tanam, pertumbuhan sangat terhambat, bahkan mungkin tidak tumbuh sama sekali. Setiap eksplan yang berasal dari organ dan spesies yang berbeda akan membutuhkan zat pengatur tumbuh yang berbeda pula. Menurut Gunawan (1995) zat pengatur tumbuh mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur sel, jaringan atau organ secara in vitro. Arah perkembangan kultur ditentukan oleh interaksi dan perimbangan antara zat pengatur tumbuh yang diproduki oleh sel tanaman secara

4 endogen dan zat pengatur tumbuh eksogen yang ditambahkan ke media. Zat pengatur tumbuh yang sering ditambahkan ke media kultur adalah auksin dan sitokinin. Auksin merupakan kelompok hormon yang berfungsi pada proses pemanjangan sel, pembengkakan jaringan, pembelahan sel, dan pembentukan akar pada jaringan tunas muda. Auksin sebagai hormon yang juga berperan menginduksi terjadinya kalus, mendorong proses morfogenesis kalus membentuk akar dan tunas, mendororong embryogenesis dan dapat mempengaruhi kestabilan genetik tanaman (Santoso dan Nursandi, 2003). Auksin eksogen biasanya digunakan pada konsentrasi 0,001-10 mg/l. Zat pengatur tumbuh yang tergolong auksin atara lain Indole Asam asetat (IAA), Indol asam butirat (IBA), naftalen asam asetat (NAA), dan 2,4-dichlorophenoxy acetic acid (2,4D) (Hendaryono dan Wijayani, 1994). 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid/2,4-D (C8 H6 C12O3) merupakan salah satu jenis auksin yang paling sering digunakan untuk induksi dan pertumbuhan kalus karena zat ini 1) efektif untuk tahap inisiasi khususnya pada jaringan yang belum dewasa, 2) dimetabolismekan secara lebih lambat, 3) memiliki mobilitas rendah, 4) lebih stabil pada suhu tinggi dan pH rendah, serta 5) mudah terkonjugasi (bentuk konjugat ini mudah dihidrolisis sehingga merupakan pensuplai auksin bebas dan auksin aktif untuk waktu yang lama) (Kusumo,1984; Lee dan Starrat,1992). Struktur kimia auksin dapat dilihat pada Gambar 1.1.

Gambar 1.1. Struktur kimia Dichlorophenoxy Acetic Acid (2,4D) (Salisbury dan Ross, 1995)

5 Zat pengatur tumbuh 2,4D banyak digunakan dalam kultur karena zat ini paling efektif untuk tahap inisiasi dalam kultur jaringan khususnya jaringan yangbelum dewasa, efektit untuk pertumbuhan kalus, dimetabolismekan secara lebih lambat, memiliki mobilitas yang rendah, stabil pada suhu tinggi, stabil pada pH rendah (Wernicke et al., 1987 dalam Sugiyono, 1993). Konsentrasi 2,4D yang umum digunakan berkisar antara 0,1 5,0 M (Pierik, 1987). Sitokinin adalah kelompok zat pengatur tumbuh yang sangat penting dalam pengaturan pertumbuhan dan morfogenesis pada kultur in vitro (George dan Sherrington, 1984). Wattimena (1988) mengatakan bahwa sitokinin menyebabkan pembelahan sel yaitu dalam proses sitokinesis terutama saat sintesis RNA dan sintesis protein. Menurut Hendaryono dan Wijayani (1994) zat pengatur tumbuh yang tergolong sitokinin antara lain kinetin, zeatin, ribosil, dan Benzil Amino Purin (BAP). Struktur kimia sitokinin dapat dilihat pada Gambar 1.2.

Gambar 1.2. Struktur kimia Benzyl Amino Purine (BAP) (Salisbury dan Ross, 1995). Konsentasi sitoknin yang tinggi (1-10 mg/l) dapat menginduksi pembentukan tunas batang, namun pembentukan tunas akar secara umum terhambat (Pierik, 1987). Secara alami, sitokinin disintesis melalui modifikasi biokimia adenine yang terjadi pada ujung akar dan biji yang tumbuh. 6-benzylaminopurine (BAP) (C12H11N5) termasuk golongan sitokinin yang memiliki aktifitas yang tinggi dan lebih tahan terhadap

6 perubahan temperatur dan pH media tanam dibanding kinetin,dan mudah diserap oleh tumbuhan (Heylen et al., 1991). Menurut Hataman dan Katser (1986), BAP lebih mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman in vitro . Pemberian auksin dengan konsentrasi lebih tinggi dibandingkan sitokinin mendorong pembelahan sel yang berlebihan sehingga memacu pertumbuhan kalus (Evans et.al., 1981). Pemberian auksin dan sitokinin secara bersamaan akan menimbulkan terjadinya interaksi auksin dan sitokinin yang berdampak baik terhadap pertumbuhan dan perkembangan jaringan dibandingkan pemberian secara mandiri (Wareing dan Phillips, 1981). Berdasarkan uraian diatas, maka dapat dikaji beberapa permasalahan sebagai berikut. 1. apakah 2,4D dan BAP berpengaruh terhadap pembentukan kalus dari daun tanaman Melaleuca alternifolia, 2. berapakah konsentrasi 2,4D dan BAP yang paling baik untuk memacu pembentukan kalus dari daun tanaman Melaleuca alternifolia. Penelitian ini akan dilakukan dengan tujuan sebagai berikut. 1. Mempelajari pengaruh 2,4D dan BAP pada pembentukan kalus dari daun tanaman Melaleuca alternifolia. 2. Menentukan konsentrasi 2,4D dan BAP yang paling baik untuk memacu pembentukan kalus dari daun tanaman Melaleuca alternifolia. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai pengaruh zat pengatur tumbuh 2,4D dan BAP terhadap pembentukan kalus dan konsentrasi zat pengatur tumbuh 2,4D dan BAP yang paling efektif untuk merangsang pembentukan kalus dari daun tanaman tea tree oil.

7 Penelitian tentang induksi kalus dari daun tanaman tea tree oil masih jarang ditemukan. Namun pada pisang kultivar Musa AA cv Penelitian sejenis pernah dilakukan. Penggunaan kombinasi antara auksin dan sitokinin pernah dilakukan untuk menginduksi kalus dari bunga pisang. Frekuensi pembentukan kalus embriogenik pisang kultivar Musa AA cv. Masa paling cepat terjadi pada bunga jantan pisang yang belum dewasa pada sisi ke enam dan ke dua belas. Pada penelitian ini diketahui bahwa konsentrasi yang paling efektif utuk induksi kalus adalah 9 M 2,4D. Persentase bunga jantan pisang yang membentuk kalus pada konsentrasi 9M 2,4D sebesar 41% dan 7,5% dari kalus yang berhasil diinduksi merupakan kalus embriogenik (Huang, et.al., 2005). Khalil dan Elbanna (2003) menambahkan bahwa penggunaan 2,4-D sebanyak 4 mg/l yang dikombinasikan dengan 1 mg/l IBA dan 1 mg/l 1- naphthalene acetic acid mampu menghasilkan embrio somatik primer pada bunga jantan pisang yang belum dewasa (immature). Kemudian dengan penambahan 5 mg/l 6-Benzylaminopurine, kultur mampu meningkatkan proliferasi kalus embriogenik secara cepat sehingga membentuk embrio somatik sekunder atau embrio somatik dewasa. Dengan demikian penggunaan 2,4D yang dikombinasikan dengan BAP dapat memacu pertumbuhan kalus, dan selanjutnya mempercepat transisi dari embrio somatik primer hingga menjadi embrio somatik sekunder (mature). Upaya untuk mendapatkan kalus embriogenik dari bunga jantan pisang telah beberapa kali dicoba. Dari beberapa penelitian diketahui bahwa media yang paling banyak digunakan dalam induksi kalus dari bunga pisang adalah media dasar Murashige dan Skoog. Penggunaan media MS pada induksi kalus embriogenik pisang menghasilkan kalus yang lebih baik dari pada media White (Ganapathi et al., 1999).

8 Hipotesis yang dapat diajukan pada penelitian ini adalah: 1. Pembentukan kalus pada tanaman M.alternifolia dipengaruhi oleh 2,4D dan BAP yang ditambahkan pada media pertumbuhan. 2. Diduga terdapat kombinasi perlakuan 2,4D dan BAP terbaik untuk induksi kalus dari daun tanaman M.alternifolia

9 MATERI DAN METODE PENELITIAN

1.

Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian 1.1. Materi Bahan-bahan yang akan digunakan yaitu bunga daun tanaman Mellaleuca alternifolia, media MS (Murashige dan Skoog-1962), 3% maltose, casein hydrolyzate, sukrosa, agar 0,8 gram, Fe-EDTA, sterile destilled water (sdw), akuades, NaOH, EtOH 70% dan 96%, HgCl2 0,2%, zat pengatur tumbuh 2,4Dichlorophenoxyacetic acid (2,4D) dan Benzyl Amyno Purine (BAP). Alat yang akan digunakan dalam penelitian ini antara lain cawan petri, timbangan analitik, botol kultur, beaker glass, gelas ukur, botol duran, Erlenmeyer, hot plate magnetic stirrer, pH meter, pipet, alumunium foil, kertas saring, autoklaf, laminar air flowcabinet (LAF), bunsen, refrigerator, rak kultur, pinset, skalpel, cling film, kertas label, dan sprayer. 1.2. Waktu dan Lokasi Penelitian Penelitian ini akan dilakukan di Laboratorium Fisiologi Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto selama 6 bulan mulai dari bulan Februari 2012 sampai Juli 2012.

2.

Metode Penelitian 2.1. Rancangan Percobaan Percobaan akan dilakukan menggunakan metode eksperimental dengan Rancangan dasar Acak Lengkap (RAL) pola perlakuan faktorial. Faktor I adalah konsentrasi 2,4D (D), yang terdiri atas 4 taraf sebagai berikut. D0 : 5M D

10 D1 : 10M D D2 : 15M D D3 : 20 M D Faktor II adalah konsentrasi BAP (B) yang terdiri atas 4 taraf yaitu: B0 : 1MB B1 : 2M B B2 : 3M B B3 : 4M B Kombinasi kedua faktor tersebut menghasilkan 16 perlakuan yaitu: B0 D0 D1 D2 D3 D0B0 D1B0 D2B0 D3B0 B1 D0B1 D1B1 D2B1 D3B1 B2 D0B2 D1B2 D2B2 D3B2 B3 D0B3 D1B3 D2B3 D3B3

Tiap kombinasi perlakuan diulang 3 kali sehingga diperoleh 48 unit percobaan. 2.2.Variabel dan Parameter Penelitian Variabel yang diamati dalam penelitian ini adalahpembentukan kalus dari daun Melaleuca alternifolia. Parameter yang diukur adalah waktu kemunculan, persentase eksplan yang membentuk kalus, dan tipe kalus yang terbentuk.

11 2.3. Cara Kerja

2.3.1. Sterilisasi 2.3.1.1. Sterilisasi Alat Peralatan seperti botol kultur, cawan petri, Erlenmeyer, pinset, skalpel dicuci dengan sabun hingga bersih, kemudian dikeringkan. Cawan petri berisi kertas saring dibungkus dengan kertas, sedangkan erlenmeyer dan botol kultur masing-masing ditutup dengan

aluminium foil, begitu pula dengan pinset dan skalpel yang sudah dikeringkan dibungkus dengan aluminium foil. Setelah itu dilakukan sterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121o C dengan tekanan 0,15 MPa selama 30 menit. Cawan petri berisi kertas saring, pinset dan skalpel steril kemudian dimasukkan ke dalam oven pada suhu 70oC sampai saat digunakan. 2.3.1.2. Sterilisasi LAF Sebelum digunakan LAF disterilisasi terlebih dahulu dengan lampu ultra violet (UV) selama 30 menit, kemudian disemprot dan dilap dengan alkohol 96%. Semua alat dan bahan yang akan digunakan (kecuali eksplan) sebelum dimasukan ke dalam LAF disemprot terlebih dahulu dengan alkohol 96%, kemudian diletakkan dengan rapi di dalam LAF agar tidak mengganggu kerja. 2.3.2. Pembuatan Larutan Stok media Murashige and Skoog (1962) (1) Larutan stok hara makro (10x) sebanyak 1000 ml disebut larutan stok A Ditimbang bahan-bahan kimia sebagai berikut : a. NH4NO3 : 16,5 g/l

12 b. c. d. e. KNO3 MgSO4.7H2O KH2PO4 CaCl2.2H2O : 19,0 g/l : 3,7 g/l : 1,7 g/l : 4,4 g/l

Masing-masing komponen dilarutkan dengan sedikit akuades hingga homogen, kemudian dimasukan ke dalam beaker glass yang berisi 250 ml akuades sambil di-stirrer.Setelah homogen, larutan dimasukan ke dalam gelas ukur dan ditambahkan akuades hingga volume larutan mencapai 1000 ml. Selanjutnya larutan dipindahkan ke botol Duran, dihomogenkan dengan menggunakan magnetic stirrer, diberi label, dan disimpan di dalam fridge. (2) Larutan stok hara mikro (1000x) disebut larutan stok B sebanyak 100 ml Ditimbang bahan-bahan kimia sebagai berikut : a. b. c. d. e. f. H3BO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O NaMO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O : 0,63 g/100 ml : 2,23 g/100 ml : 0,86 g/100 ml : 0,025 g/100 ml : 0,0025 g/100 ml : 0,0025 g/100 ml

Masing-masing komponen dilarutkan dengan sedikit akuades hingga homogen, kemudian dimasukan kedalam beaker glass yang berisi 50 ml akuades sambil dihomogenkan dengan menggunakan magnetic stirrer dan ditambah akuades hingga volume larutan mencapai 100 ml. Selanjutnya larutan dipindahkan ke dalam Erlenmeyer, dihomogenkan dengan

13 menggunakan magnetic stirrer lagi, diberi label, dan disimpan di dalam fridge. (3) Larutan stok Iodin (1000x) disebut larutan stok C sebanyak 100 ml KI sebanyak 0,083 g dilarutkan dengan akuades, kemudian larutan dimasukan kedalam gelas ukur dan ditambahkan akuades hingga volumenya mencapai 100 ml, kemudian larutan dipindahkan ke dalam beaker glass dan dihomogenkan dengan menggunakan magnetic stirrer. Selanjutnya larutan dipindahkan ke dalam botol gelap, diberi label, dan disimpan di dalam fridge. (4) Larutan stok vitamin (2000x) disebut larutan stok D sebanyak 100 ml Ditimbang bahan-bahan kimia sebagai berikut : a. Nicotinic acid : 0,10 g/100 ml b. Thiamin HCl : 0,02 g/100 ml c. Pyridoxin HCl : 0,10 g/100 ml Masing-masing komponen dilarutkan dengan sedikit akuades hingga homogen, kemudian dimasukan ke dalam beaker glass yang berisi 50 ml akuades sambil dihomogenkan dengan menggunakan magnetic stirrer. Setelah homogen, larutan dimasukan ke dalam gelas ukur dan ditambahkan akuades hingga volume larutan mencapai 100 ml. Selanjutnya, larutan dipindahkan ke dalam Erlenmeyer, dihomogenkan dengan menggunakan magnetic stirrer, diberi label, dan disimpan di dalam fridge. (5) Larutan stok Fe-EDTA (1000x) disebut larutan stok E sebanyak 100 ml Fe-EDTA sebanyak 0,375 g dilarutkan dengan akuades, kemudian larutan dimasukan ke dalam gelas ukur dan ditambahkan akuades hingga volumenya

14 mencapai 100 ml, kemudian larutan dipindahkan ke dalam Erlenmeyer, dihomogenkan dengan menggunakan magnetic stirrer, diberi label dan disimpan di dalam fridge. 2.3.3. Pembuatan larutan stok ZPT Zat pengatur tumbuh (ZPT) yang dibutuhkan ditimbang dengan menggunakan rumus : M= Gram Mr x 1000 V

Dimana: M = molaritas ZPT yang diinginkan G = berat ZPT yang harus ditimbang Mr = berat molekul ZPT V = volume larutan ZPT yang diinginkan Zat pengatur tumbuh ditimbang sesuai kebutuhan kemudian dilarutkan dengan 1 N NaOH/EtOH di dalam beaker glass dan dihomogenkan di hot plate stirrer. Kemudian ditambahkan SDW sampai volume yang dikehendaki. Larutan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer, diberi label, dan disimpan di dalam kulkas. 2.3.4. Pembuatan 1 liter media dasar Murashige and Skoog (1962) Pembuatan 1 liter media dasar Murashige and Skoog (1962) dilakukan sebagai berikut. (1) Diambil larutan stok A sebanyak 100 ml, larutan stok B sebanyak 1 ml, larutan stok C sebanyak 1 ml, larutan stok D sebanyak 0,5 ml, dan larutan stok E sebanyak 1 ml dan dimasukan ke dalam beaker glass yang berisi 500 ml akuades sambil dihomogenkan dengan menggunakan magnetic stirrer. (2) Ditambahkan 20 g sukrosa, sambil dihomogenkan dengan menggunakan magnetic stirrer.

15 (3) Ditambahkan 3 gr casein hydrolizate, dan larutan tetap dihomogenkan dengan menggunakan magnetic stirrer. (4) Setelah semua bahan terlarut, kemudian ditambahkan akuades hingga mencapai volume 1 liter, sambil tetap dihomogenkan dengan menggunakan magnetic stirrer. 2.3.5. Pembuatan Media Perlakuan Pembuatan 200 ml media perlakuan dilakukan sebagai berikut. (1) Disiapkan 16 buah Erlenmeyer sesuai kebutuhan dan diberi label sesuai perlakuan, dan masing-masing Erlenmeyer diisi 150 ml media dasar, (2) Masing-masing perlakuan ditambahkan dengan zat pengatur tumbuh sesuai dengan konsentrasi yang dibutuhkan, dengan menggunakan rumus : V1M1 =V2M2 Keterangan : V1 = volume larutan stok ZPT yang harus ditambahkan M1 = konsentrasi larutan stok ZPT V2 = volume media yang akan dibuat M2 = konsentrasi ZPT yang dikehendaki (3) pH masing-masing media diukur dan diatur hingga mencapai 5,83. (4) Dimasukkan agar masing-masing sebanyak 0,8 % (1.6 g). (5) Ditambah larutan media dasar MS hingga mencapai volume 200 ml. (6) Botol Erlenmeyer ditutup dan media siap disterilisasi di dalam autoklaf. 2.3.6. Sterilisasi media Media tanam disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 oC dan tekanan 0,15 MPa selama 20 menit. Setelah sterilisasi, media dituang secara aseptis ke dalam cawan petri steril dengan volume sebanyak 30 ml di dalam LAF.

16 2.3.7. Persiapan eksplan untuk induksi kalus Daun tanaman tea tree diambil dari pohon kemudian dimasukkan ke dalam akuades steril untuk mencegah browning. 2.3.8. Sterilisasi eksplan untuk induksi kalus (1) Daun tanaman tea tree dimasukkan ke dalam botol kultur steril, kemudian dituang 70% alkohol ke dalam botol kultur hingga eksplan terendam dan dilakukan pengocokan selama 2 menit. (2) Alkohol 70% dibuang dan diganti dengan larutan HgCl2 0,2% hingga eksplan terendam. Proses pengocokan HgCl2 tersebut dilakukan selama 2 menit dan diulang 2 kali. (3) HgCl2 dibuang dan eksplan dicuci dengan Sterile Distilled Water (SDW) dan dikocok selama 30 detik. Langkah ini diulang sebanyak 3 kali. (4) SDW dibuang, dan dilakukan blotting dengan memasukkan eksplan steril ke dalam cawan petri steril yang dialasi dengan kertas saring steril dengan tujuan untuk mengurangi agen sterilisasi yang mungkin masih melekat dalam eksplan. 2.3.9. Penanaman induksi kalus Penanaman dilakukan secara aseptis di dalam LAF yang telah disemprot dengan alkohol 96%. Daun tanaman tea tree yang sudah disterilisasi diambil dengan pinset kemudian diletakan pada cawan petri steril yang dilapisi kertas saring steril. Selanjutnya daun tanaman tea tree dipotong-potong dan ditanam dalam cawan petri yang berisi media MS (1962) yang mengandung 5 M 2,4D dan 1 M BAP. Setiap cawan petri berisi 5-7 potong eksplan daun tanaman tea tree.

17 Cawan petri kemudian di-wrapping serta diberi label. Cawan petri diinkubasi tanpa cahaya di dalam ruang inkubasi dengan suhu 24 0C selama 4-6 minggu. 2.4. Pengambilan Data Pengamatan terhadap waktu kemunculan kalus, persentase eksplan yang terbentuk, dan tipe kalus yang terbentuk. 3. Analisis Data Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan analisis ragam (ANOVA), dilanjutkan dengan uji BNT atau BNJ dengan tingkat kepercayaan 95% dan 99%. Untuk memperjelas hasil pengamatan visual, dibuat dokumentasi dalam bentuk foto.

18

III. JADWAL PENELITIAN Penelitian ini akan dilakukan selama 6 (enam) bulan dengan jadwal sebagai berikut : Tabel 3.1 Jadwal pelaksanaan penelitian No 1 2 3 4 5 Kegiatan I Penyusunan proposal Persiapan penelitian Pelaksanaan penelitian Analisis data Penyusunan laporan II Waktu (Bulan) III IV V VI

19

DAFTAR REFERENSI

Allan, E., 1991. Plant Cell Culture. In Stafford, A and Warren. G. (eds.). 1991. Plant Cell and Tissue Culture. Open University Press, Buckingham. http://cantiqalami.com/2011/12/manfaat-tea-tree-oil/. Diakses tanggal 2 Maret 2012. Evans, D. A., W. R. Sharp and C. E. Flick. 1981. Growth and Behaviour of Cell Cultures: Embriogenesis and Organogenesis. Thorpe Press, Cophenhagen. Ganapathi, T. R., P. Suprasanna, V. A. Bapat, V. M. Kulkarni, and P. S. Rao. 1999. Somatic Embryogenesis and Plant Regeneration from Male Flower Buds In Banana. George, E.F. and P.D. Sherington. 1984. Plant Propagation by Tissue Culture. Exegetics Ltd, England. Gunawan, L.W. 1995. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. Laboratorium Kultur Jaringan. Pusat Antar Universitas (PAU) Bioteknologi. IPB, Bogor. Harden, G.J., (ed), Flora of New South Wales, Vol. 2, 1991, ISBN 0-86840-172-2. http://en. wikipedia.org/wiki/Melaleuca_alternifolia. Diakses tanggal 18 Desember 2012. Hartman, H. T. Dan D. E. Ketser. 1986. Plant Propagation : Prinoplesand Practices. Prentise Hall. Inc. Engelwood Clifts, New Jersey. Hendaryono, D. P. S dan Wijayanti, A. 1994. Teknik kultur Jaringan Pengenalan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif-Modern. Kanius, Yogyakarta. Heylen, C., J. C. Vendrig, and H. V. Onckelen. 1991. The Accumulation and Metabolism of Plant Growth Regulator During Organogenesis. Physiologia Plantarnum, 83 (4) : 578-584. Huang, X., Y. Rong Wei, J. Li, And W. Xiao. 2005. Establishment Of Embryogeni Cell Suspension Culture And Plant Regeneration Of Banana (Musa Spp) For Gen Transformasion. Professor And Chairman Departement of Biology, School Of Life Science, Zhongsang (Sun Yat-San) University Guangzhou, China, 13: 177185. Khalil, S. M. dan A. A. M. Elbanna. 2003. Highly Efficient Somatic Embryogenesis and Plant Regeneration Via Suspention Culture of Banana (Musa sp). Arab J. Biotech, 7 (1) : 99-110. Kiong, A. L. P., H. H. Huan and S. Hussein. 2007. Callus induction leaf explants of Melaleuca alternifolia. International Journal of Agricultural Research. 2(3):227-237. Kusumo. 1984. Zat Pengatur Tumbuh Tanaman. CV. Yasaguna, Bogor. Lee, T.T., A.H. Starrat. 1992. Metabolism of Indole-3-acetic acid by Soybean Callus and Hypocotyl Setions. Physiologia Plantarus. 84 (2) : 209.

20 Luri. 2010. Kultur Kalus. http;//kultur-jaringan.blogspot.com/2009/08/kulturkalus_15.html. Diakses tanggal 24 Desember 2011.

Parnata, A. S. 2005. Panduan Budi Daya dan Perawatan Anggrek. PT Agro Media Pustaka, Jakarta. Pierik, R. L. M. 1987. In Vitro Culture of Higher Plants. Martinus Nijhoff Publisher, Dordrecht. Rahardja, P. C. 1994. Kultur Jaringan : Teknik Perbanyakan Secara Modern. Penebar Swadaya, Jakarta. Salisbury, F. B. and C. W. Ross. 1995. Fisiologi Tumbuhan Jilid III. Penerbit ITB, Bandung. Santoso, U dan F. Nursandi. 2003. Kultur Jaringan Tanaman. Malang, Pusbitan UMM. Sugiyono. 1993. Pengaruh Hormon 2,4 D dan BAP terhadap Multiplikasi Kalus Purwoceng (Pimpinella pruatjan Mollcenb) pada Kultur Aseptis. Skripsi. Tidak Dipublikasikan. Departemen Pendidikan Nasional Fakultas Biologi UNSOED, Purwokerto. Wareing, P. F. and D. J. Phillips. 1981. The Control of Growth and Differention in Plant. Pergamon Press, Oxford. Narayanaswamy. 1994. Plant Cell and Tissue Culture. Tata Mc Graw-Hill Publishing Company Limited, New Delhi. Wattimena, G. A. 1988. Zat Pengatur Tumbuh Tanaman. PAU IPB, Bogor. Wernicke, W., and L. Milkovits, 1987 a. Effect of Auxin on The Mitotic Cell Cycle in Cultured Leaf Segments at Different Stages of Development in Wheat. Physiologia Plantarum. The Scandinavian Society for Plant Physiology. Copenhagen. Vol. 69 (1) January 1987; pp. 16-22. Wetherell, D. F. 1982. Pengantar Propagasi Tanaman secara In Vitro. Diterjemahkan oleh Koensumardiyah. Avery Publishing Group Inc, New Jersey. www.ars-grin.gov. "Melaleuca alternifolia information from NPGS/GRIN". Diakses tanggal 18 Desember 2011.

21 Lampiran 1. Komposisi garam-garam anorganik pada media MS (1962) Makronutrien NH4NO3 KNO3 MgSO4.7H2O KH2PO4 CaCl2.H2O Mikronutrien (mg/L) H3BO3 MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O NaMO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O KI Fe-EDTA Vitamin (mg/L) Nicotinic acid Thiaminic HCl Pyridoxin HCl 0,5 0,1 0,5 6,2 22,3 8,6 0,25 0,025 0,025 0,83 37,3 Media MS (mg/L) 1.650 1.900 370 170 440