PENENTUAN INHIBITOR SELEKTIF DALAM MENGHAMBAT KERJA ENZIM SIKLOOKSIGENASE-2 SECARA IN SILICO

ARTIKEL ILMIAH

Oleh Aga Adi Masyhuri NIM 041810301059

JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS JEMBER 2009

PENENTUAN INHIBITOR SELEKTIF DALAM MENGHAMBAT KERJA ENZIM SIKLOOKSIGENASE-2 SECARA IN SILICO

ARTIKEL ILMIAH Disusun dari Sebagian Skripsi Guna Memenuhi Persyaratan Menyelesaikan Program Sarjana Sains Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Jember

Oleh Aga Adi Masyhuri NIM 041810301059

JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS JEMBER 2009 i

HALAMAN PENGESAHAN

Artikel ilmiah ini telah diterima oleh Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Universitas Jember pada: hari tanggal tempat : : : FMIPA Universitas Jember

Mengetahui dan Menyetujui,

Dosen Pembimbing Utama,

Dosen Pembimbing Anggota,

Drs. Sudarko, PhD NIP. 132 005 050

Drs. Siswoyo, Msc, PhD NIP. 132 056 180

ii

Penentuan Inhibitor Selektif Dalam Menghambat Kerja Enzim Siklooksigenase-2 Secara In Silico

Aga Adi Masyhuri Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Jember

ABSTRAK Radang merupakan penyakit yang disebabkan oleh aktifitas dari enzim Siklooksigenase-2. Radang dapat diobati dengan menggunakan (NSAID). Kandungan dari NSAID adalah inhibitor yang bekerja untuk menghambat enzim siklooksigenase 2. Semakin selektif inhibitor yang digunakan dalam NSAID maka, obat ini akan semakin bagus dalam menghambat radang. Untuk menentukan ihibitor yang selektif dilakukan secara in silico. Inhibitor yang dibandingkan adalah Celecoxib, Rofecoxib, Valdecoxib dan Etoricoxib. Hasil yang diperoleh adalah didapatkannya etoricoxib sebagai inhibitor selektif terhadap Siklooksigenase-2. Pada penentuan residu yang paling berpengaruh terhadap Siklooksigenase-1 dan Siklooksigenase-2 didapatkan Fenilalanin 518 sebagai residu yang paling berpengaruh pada Siklooksigenase-1, sedangkan Tirosin 385 merupakan residu yang paling berpengaruh untuk Siklooksigenase-2.

Kata Kunci: Radang, NSAID, Siklooksigenase.

iii

Identification of Selective Inhibitor For Hamper Cyclooxygenase-2 Enzyme by In Silico

Aga Adi Masyhuri University Student in Departement of Chemistry, Faculty of Mathematic and Natural Science, the University of Jember

ABSTRACT Inflammation is disease caused by activity of Cyclooxygenase-2 enzyme. It can be cured by NSAID. NSAID contains inhibitor for protecting this enzyme. The more good in using inhibitor cause NSAID also works good increasingly to hamper the inflammation. To identify selective inhibitor, it is done by in silico. Kind of inhibitors are compared such as Celecoxib, Rofecoxib, Valdecoxib and Etoricoxib. The result for those is Etoricoxib as the selective inhibitor to Cyclooxygenase-2. In identifying of the most influence to Cyclooxygenase-1 and Cyclooxygenase-2 will result Fenilalanin 518 as the most influence residue to Cyclooxygenase-1. While Tirosin 385 as the most influence residue to Cyclooxygenase-2.

Keywords: Inflammation, NSAID, Cyclooxygenase.

iv

PENDAHULUAN Radang merupakan mekanisme pertahanan tubuh yang disebabkan adanya respons jaringan terhadap pengaruh-pengaruh merusak baik bersifat lokal maupun yang masuk ke dalam tubuh (Mutschler, 1991). Reaksi radang dapat diamati dari gejala-gejala klinis di sekitar jaringan yang terkena radang akan terjadi peningkatan panas (kalor), timbul warna kemerah-merahan (rubor) dan pembengkakan (tumor) kemudian disusul perubahan struktur jaringan yang dapat menimbulkan kehilangan fungsi (Korolkovas, 1988). Penyakit radang ini dapat diobati dengan menggunakan nonsteroidal antiinflammatory drugs (NSAID) atau obat antiradang bukan steroid yaitu golongan obat yang terutama bekerja sebagai anti radang, memiliki aktivitas penghambat radang dengan mekanisme kerja menghambat biosintesis prostaglandin melalui penghambatan aktivitas enzim siklooksigenase. Obat ini bekerja dengan cara mengatasi peradangan-peradangan di dalam dan sekitar sendi seperti lumbago, antralgia, osteoartritis, artritis reumatoid, dan gout artritis. Disamping itu, NSAID juga bekerja pada penyakit-penyakit non rematik, seperti kolik empedu dan saluran kemih, trombosis serebri, infrak miokardium, dan dismenorea (Kartasasmita, 2002). Kandungan kimia dari obat NSAID adalah inhibitor yang bekerja untuk enzim siklooksigenase-2, seperti diklofenak, ibuprofen, aspirin. Semakin selektif inhibitor yang ada dalam NSAID, maka kerja obat ini akan semakin baik dalam menyembuhkan penyakit. Berdasarkan penelitian yang dilakukan Patrignani et al (1994) dan Brideau et al (1996) terhadap keempat jenis inhibitor (Celecoxib, Rofecoxib, Etoricoxib, Valdecoxib) dengan menggunakan konsentrasi inhibitor untuk menghambat kerja enzim COX-1 dan COX-2 didapatkan inhibitor yang paling selektif terhadap COX-2, sedangkan dalam penelitian ini, untuk menentukan inhibitor yang selektif terhadap COX-2 dilakukan secara in silico (simulasi komputer). Agar inhibitor yang dihasilkan nantinya dapat secara efektif menghambat kerja enzim Siklooksigenase-2 maka perlu

diketahui manakah diantara residu enzim Siklooksigenase-2 yang paling berpengaruh pada reaksi katalisisnya. Tujuan yang ingin dicapai dari penelitian ini diantaranya, yaitu: mengetahui inhibitor Celecoxib, Rofecoxib, Valdecoxib dan Etoricoxib yang paling selektif terhadap katalisis enzim Siklooksigenase -2 berdasarkan hasil docking, Mengetahui residu yang paling berpengaruh pada katalisis enzim Siklooksigenase -2. Penelitian ini diharapkan dapat memperkuat analisa mengenai inhibitor yang selektif terhadap Siklooksigenase-2 dan dapat memberikan informasi tentang karakteristik Siklooksigenase -2 hasil modifikasi.

METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret 2009 sampai April 2009 di Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Jember. Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain; komputer Intel(R) Pentium(R) Dual Core 1.86 GHz dengan memori 1 GB dan sistem operasi Dewalinux Chemistry yang dilengkapi dengan program aplikasi AutoDock4.0, Ghemical dan Pymol; serta komputer Intel(R) Pentium(R) 4 3,00 GHz dengan memori 1GB dan sistem operasi Linux Ubuntu 8.04 yang dilengkapi dengan program aplikasi MGL Tools 1.5.2, AutoDock 4.0, TRITON dan Pymol.

Prosedur Penelitian Senyawa substrat dan Inhibitor Senyawa substrat dalam penelitian ini yaitu Asam Arasidonoat dan inhibitor yang digunakan dalam penelitian ini ada empat jenis, yaitu senyawa Celecoxib, Rofecoxib, Valdecoxib dan Etoricoxib

Penyiapan Ligand Strtuktur dari Celecoxib, Rofecoxib, Valdecoxib dan Etoricoxib digambar dalam bentuk 3 dimensi menggunakan software ghemical. Bentuk dari Celecoxib, Rofecoxib, Valdecoxib dan Etoricoxib yang telah digambar menggunakan software ghemical ini dilakukan optimasi sampai memiliki bentuk yang paling stabil. Setelah penggambaran dan optimasi dari Celecoxib, Rofecoxib, Valdecoxib dan Etoricoxib menggunakan software ghemical, maka file Celecoxib, Rofecoxib, Valdecoxib dan Etoricoxib disimpan dalam bentuk PDB.

Penyiapan Siklooksigenase-1 dan Siklooksigenase-2 Struktur Siklooksigenase-2 diambil dari Protein Data Bank, kemudian diedit

menggunakan menggunakan AutoDockTools. Data struktur dari (PDB) perlu diedit karena biasanya terdapat masalah, meliputi atom yang hilang, penambahan molekul air, kelebihan molekul, pemutusan rantai dan lain-lain. Tahap pertama yang dilakukan untuk mengedit molekul enzim dengan AutoDockTools adalah membuka file struktur COX-1 dan COX-2 yang diperoleh dari PDB dengan AutoDockTools menggunakan fitur Grid setelah itu File *.pdb yang telah dibuka menggunakan fitur Grid, kemudian disimpan dalam format *.pdbqt.

Docking AutoDock merupakan program yang dikembangkan untuk memprediksi interaksi ligand dengan target biomakromolekul. Dalam AutoDock, ligan pada awalnya diacak diluar protein, kemudian melakukan translasi, orientasi, dan konformasi sampai sisi ideal ditemukan (Morris et al., 1998). Titik grid yang digunakan dalam penelitian ini sebesar 60x60x60. Energi potensial setiap titik grid dihitung menggunakan program AUTOGRID. Setelah memperoleh data dari semua titik grid, dilakukan simulasi docking. Program AutoDock menghitung energi

interaksi antara konformasi ligand fleksibel dan setiap titik grid melalui kombinasi algoritma pencarian.

Visualisasi Visualisasi dilakukan menggunakan program Pymol. Hasil yang

divisualisasikan berupa konformasi ligand dan makromolekul.

HASIL DAN PEMBAHASAN Inhibitor selektif terhadap Siklooksigenase-2 Pada penelitian ini untuk mengetahui inhibitor yang selektif terhadap Enzim Siklooksigenase-2 ini dilakukan dengan metode in silico yaitu dengan simulasi komputer. Software yang digunakan dalam penelitian ini adalah Autodock 4.0 yang dilengkapi dengan AutoDockTools. Dalam penelitian ini Enzim Siklooksigenase-2 diambil dari Protein Data Bank (www.pdb.org) dengan kode 1CVU sedangkan untuk enzim Siklooksigenase-1 memiliki kode 2OYU. Untuk mengetahui keselektifan inhibitor terhadap enzim maka dilakukan docking antara substrat dan keempat inhibitor, yaitu Celecoxib, Rofecoxib, Etoricoxib, Valdecoxib terhadap COX-1 dan COX-2. Dari docking antara substrat dan inhibitor terhadap COX-1 dan COX-2 maka nantinya akan didapatkan konstanta inhibisi untuk masing-masing docking yang dilakukan sehingga dapat diketahui inhibitor yang selektif terhadap COX-2. Tabel 1. Hasil docking antara inhibitor dengan COX-1 dan COX-2 COX-1 Inhibitor Celecoxib Rofecoxib Etoricoxib Valdecoxib
G Probabilitas G Ki (10-6) kkal/mol (%) kkal/mol -6.62 27.54 63 -8.02

COX-2 Ki (10-6) 1.30 0.41 0.05 0.10 Probabilitas (%) 100 99 100 100

-6.10 -7.06 -7.13

33.55 6.67 5.90

64 57 45

-8.71 -9.54 -9.94

Dari tabel 1 diatas untuk menentukan keselektifan inhibitor terhadap COX-2 ditentukan berdasarkan rasio perbandingan antara COX-1 dengan COX-2 sehingga didapatkan rasio keselektifan Celecoxib, Rofecoxib, Etoricoxib, Valdecoxib terhadap COX-2 berturut turut sebesar 21, 81, 133, 59, sehingga dari rasio keselektifan itu kita bisa menentukan dari keempat inhibitor tersebut yang merupakan inhibitor yang selektif terhadap COX-2. Hasil yang sama juga diperoleh dari penelitian Mardini et al (2001) yang menggunakan metode pengujian darah yaitu untuk menentukan inhibitor yang selektif terhadap COX-2 menggunakan konsentrasi dari inhibitor untuk menghambat laju dari enzim COX sebesar 50 persen pada COX-1 dan 50 persen pada COX-2. Pada penelitianya itu Mardini et al (2001) juga mendapatkan Etoricoxib sebagai inhibitor yang paling selektif terhadap COX-2. Dari data hasil docking, Etoricoxib merupakan inhibitor yang paling selektif dibandingkan dengan ketiga inhibitor yang lain. Etoricoxib memiliki keselektifan enam kali lebih selektif daripada Celecoxib, satu setengah kali lebih selektif daripada Rofecoxib dan dua kali lebih selektif daripada Valdecoxib.

Gambar 1. Model Pengikatan substrat dengan Sisi Aktif Serin 530 pada Siklooksigenase-2

Gambar 2. Model Pengikatan Etoricoxib dengan Sisi Aktif Serin 530 pada Siklooksigenase-2 Proses mutasi in silico Pada proses ini residu Enzim COX-1 dan COX-2 dimutasi dengan menggunakan program MODELLER. Tujuan yang diharapkan dari mutasi residu ini adalah untuk mengetahui residu yang paling berpengaruh pada enzim COX-1 dan COX-2. Proses pembuatan mutan memerlukan waktu kira-kira 5 menit untuk tiap mutan yang dihasilkan. Residu Enzim COX-1 dan COX-2 disubstitusi dengan residu yang gugus R-nya memiliki sifat yang sama. Pada COX-1, residu Isoleusin disubstitusi dengan Leusin menghasilkan mutan I517 dan I523, Fenilalanin disubstitusi dengan Prolin menghasilkan mutan F518 dan Glisin disubstitusi dengan Threonin menghasilkan mutan Q192. Sedangkan pada COX-2, residu Arginin disubstitusi dengan Lisin menghasilkan mutan R120, Tirosin disubstitusi dengan Threonin menghasilkan mutan Y385 dan Y355, Valin disubstitusi dengan Leusin menghasilkan mutan V523 dan Histidin disubstitusi dengan Arginin menghasilkan mutan H90.

Efek mutasi COX-1 dan COX-2 pada substrat Asam arasidonoat merupakan senyawa substrat yang didocking ke semua mutan dan nantinya dibandingkan dengan COX-1 dan COX-2 yang tidak dimutasi (Wild type). Proses perhitungan docking membutuhkan waktu rata-rata dua jam tiap perhitungan. Data hasil docking sebagai berikut : Tabel 2. Data hasil docking substrat pada COX-2 Asam Arasidonoat Enzim Wild type Mutan H90A Mutan Y385T Mutan V523L Mutan Y355T Mutan R120L
G kkal/mol

Ki(10-6) 11.87 18.54 19.18 17.3 17.31 11.02

Probabilitas (%) 29 19 34 13 26 32

-6.71 -6.45 -6.43 -6.49 -6.49 -6.76

Dari Tabel 2. diatas dapat diketahui bahwa terjadi peningkatan Ki paling tinggi yaitu untuk mutan Y385 sebesar 7.31x10-6 terhadap substrat, hal ini dikarenakan pada mutasi ini residu Tirosin disubstitusi dengan Threonin yang memiliki berat molekul lebih kecil sehingga ruang diantara sisi aktif semakin besar yang menyebabkan substrat akan semakin mudah masuk pada sisi aktif enzim dan Ki substrat meningkat. Sedangkan pada mutan Y355 hal ini tidak berlaku dikarenakan Tirosin 355 letaknya lebih jauh dari sisi aktif daripada Tirosin 385, sehingga peningkatan Ki tidak terlalu besar. Pada mutasi yang lain tidak terjadi peningkatan Ki yang besar, hal ini dimungkinkan karena mutasi residu tersebut sisubstitusi dengan residu yang ukuran molekulnya lebih besar sehingga ruang disekitar sisi aktif menjadi semakin kecil sehingga substrat lebih sulit masuk pada daerah sisi aktif enzim. Dari tabel 2 diatas dapat disimpulkan bahwa residu yang paling berpengaruh adalah Tirosin 385.

Prosedur yang sama juga dilakukan pada COX-1 yaitu asam arasidonoat didocking pada COX-1 Wild type dan dibandingkan dengan mutan. Tabel 3. Data hasil docking substrat pada COX-1 Asam Arasidonoat Enzim Wild type Mutan I517L Mutan I523L Mutan G192T Mutan F518P
G kkal/mol

Ki(10-6) 3.02 2.30 3.28 1.66 4.94

Probabilitas (%) 11 37 47 44 42

-3.43 -3.59 -3.38 -3.79 -3.14

Dari tabel 3 diatas dapat dilihat terjadi peningkatan Ki paling besar yaitu pada mutan F518 hal ini juga dikarenakan pada mutasi ini residu disubstitusi dengan residu yang ukurannya lebih kecil sehingga ruang diantara sisi aktif semakin besar yang menyebabkan substrat akan semakin mudah masuk pada sisi aktif enzim dan Ki substrat meningkat. Sedangkan pada mutan yang lain residu COX-1 disubstitusi dengan residu yang ukurannya molekulnya lebih besar sehingga ruang di daerah sisi aktif semakin kecil yang menyebabkan substrat semakin sulit masuk pada daerah sisi aktif enzim dan mengakibatkan Ki substrat kecil. Dari tabel 4.3 maka dapat disimpulkan bahwa residu yang paling berpengaruh pada katalisis COX-1 adalah Fenilalanin 518.

KESIMPULAN dan SARAN Dari keempat inhibitor yaitu Celecoxib, Rofecoxib, Valdecoxib dan Etoricoxib, yang merupakan inhibitor paling selektif terhadap Siklooksigenase-2 adalah Etoricoxib. Hal ini ditunjukkan dengan rasio perbandingan konstanta inhibisi Etoricoxib pada COX-1 dibagi COX-2 yang lebih besar dari pada rasio COX-1 dibagi COX-2 pada inhibitor yang lain. Pengaruh mutasi residu COX-2 dapat menyebabkan K1 enzim

terhadap substrat meningkat. Residu yang berpengaruh pada proses katalisis dapat dilihat dari perubahan K1 yang signifikan pada mutan terhadap Wild type. Pada COX1 residu yang paling berpengaruh pada aktifitas katalitiknya adalah Fenilalanin 518. Pada COX-2 residu yang paling berpengaruh pada aktifitas katalitiknya adalah Tirosin 385. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mempelajari mekanisme reaksi katalisis pada COX-2. Dari hasil penelitian yang telah dilakukan dengan menggunakan software Autodock ternyata didapatkan hasil yang tidak jauh berbeda dengan yang dilakukan secara eksperimen, oleh karena itu metode ini juga dapat digunakan untuk mendisain inhibitor yang baru. DAFTAR PUSTAKA Brideau, C., Kargman, S., Liu, S., Dallob, L., Ehrich, E.W., Rodger, W.I., Chan, C. 1996. A human whole blood assay for clinical evaluation of biochemical efficacy of cyclooxygenase inhibitors Journal Inflammation Research 45:68 74. Basel:Verlag. Kartasasmita,R.E. 2002. Perkembangan Obat Antiradang Bukan Steroid. Bandung: Unit Bidang Ilmu Kimia Medisinal/Farmasi Analisis, Departemen Farmasi, FMIPA ITB. Korolkovas, A. (1988). Essentials of Medicinal Chemistry. Ed 2. New York: A Wiley lnterscience Publ. Mardini, I. A., Fitzgerald, G. A. 2001. Selective Inhibitors of Cyclooxygenase-2. National Institutes of Health. Morris, G. M., Goodsell, D. S., Huey, R., Hart, W. E., Halliday, S., Belew, R., and Olson, A. J. 2001. Users Guide : AutoDock (Automated Docking of Flexible Ligands to Receptors),Version 3.0.5. USA: The Scripps Research Institute. Mutschler, E. 1991. Arzneimittelwirkungen, Terjemahan: Dinamika obat oleh: Mathilda B. dan Anna S.R. Bandung: Penerbit ITB. Patrignani, P., Panara, R., Greco, A., Fusco, O., Natoli, C., Iacobelli, S., Cipollone, F., Ganci., A., Creminon, C., Maclouf, J. 1994. Biochemical and pharmacological characterization of the cyclooxygenase activity of human blood prostaglandin endoperoxide synthases. Journal of Pharmacol.