UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PER FACULTAD DE AGRONOMA

INFORME DE PRCTICAS PRE PROFESIONALES

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGA E INGENIERA GENTICA - UNCP

Presentado por: BULLN CASTILLO, Erika Wendy

HUANCAYO PER 2012

NDICE PRIMERA PARTE INTRODUCCIN OBJETIVOS I. REVISIN BIBLIOGRFICA 1.1 TCNICAS Y EQUIPOS DE LABORATORIO 1.2 EXTRACCIN DE DNA 1.3 CULTIVO DE BACTERIAS Y MICROORGANISMOS 1.4 CORTES HISTOLGICOS DE TEJIDO VEGETAL 1.5 RECONOCIMIENTO DE PROTENAS II. LUGAR DE EJECUCIN Y UBICACIN GEOPOLTICA III. PLAN Y CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES DESARROLLADAS IV. DESCRIPCIN DE LAS PRCTICAS 4.1 RECONOCIMIENTO DE EQUIPOS DE LABORATORIO 4.2 EXTRACCIN DE DNA 4.3 CULTIVO DE BACTERIAS Y MICROORGANISMOS 4.4 CORTES HISTOLGICOS DE TEJIDO VEGETAL 4.5 RECONOCIMIENTO DE PROTENAS V. CONCLUSIONES VI. RECOMENDACIONES VII. BIBLIOGRAFA VIII. ANEXOS 3 4 5 5 8 10 12 15 18 19 20 20 24 27 32 35 43 44 45 46

INTRODUCCIN

El presente informe de Prcticas Pre-profesionales describe las actividades realizadas en el Instituto de Biotecnologa e Ingeniera Gentica de la Universidad Nacional del Centro del Per, realizado desde el 31 de enero al 31 de marzo de 2011 para cumplir un requisito acadmico y optar el grado de bachiller en Agronoma Adems se tiene en cuenta que en Biotecnologa e Ingeniera Gentica, la investigacin est tomando mayor importancia en su contexto cognoscitivo y prctico a travs de la creatividad e innovacin cientfica. En este marco acadmico juega un rol importante este Instituto, donde se logra mejorar las capacidades y habilidades de uso y manejo de herramientas adecuadas para la investigacin gentica de la Agronoma. Asimismo se trabaj diversas tcnicas

cientficas en distintas investigaciones que sirvieron de motivacin para ampliar los conocimientos en biotecnologa y biologa. Tambin se describen las actividades realizadas que fueron, extraccin de DNA de tejidos vegetales, cultivo de bacterias y microorganismos, anlisis de bacterias

colifecales en agua potable de la UNCP, reconocimiento de protenas y cortes histolgicos vegetales; entre otros. Las que se consideraron relevantes por su utilidad necesaria y esencial para el desarrollo integral de la agricultura en nuestro pas fueron la extraccin de DNA y el cultivo de bacterias y microorganismos.

OBJETIVOS:

Objetivo General: Ensayar algunas actividades prcticas relevantes en el laboratorio de gentica y

biotecnologa aplicadas a la solucin de problemas agronmicos.

Objetivos Especficos: Reforzar habilidades y destrezas en el manejo de laboratorio en biotecnologa

que permita la incorporacin de esta rea en la investigacin cientfica de acuerdo con las necesidades de la Regin Central. Adquirir herramientas adecuadas de la biotecnologa para utilizarlas en el

campo de accin del ingeniero agrnomo en la investigacin gentico-cientfica.

I.

REVISIN BIBLIOGRFICA

1.1 TCNICAS Y EQUIPOS DE LABORATORIO

1.1.1 TCNICA DE MICROSCOPA Conjunto de tcnicas y mtodos destinados a hacer visible los objetos de estudio que por su pequeez estn fuera del rango de resolucin del ojo normal. Si bien el microscopio es el elemento central de la microscopa, el uso del mismo requiere para producir las imgenes adecuadas, de todo un conjunto de mtodos y tcnicas afines pero extrnsecas al aparato.

Tipos de Microscopa: Microscopa ptica normal (de campo brillante coloreado): El material a observar se colorea con colorantes especficos que aumentan el contraste y revelan detalles que no aprecian de otra manera. Microscopa de campo brillante: el material se observa sin coloracin. La luz pasa directamente y se aprecian detalles que estn naturalmente

coloreados. El microscopio en campo oscuro utiliza una luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espcimen. El campo de visin del objetivo se encuentra en la zona hueca del cono de luz y slo recoge la luz que se refleja en el objeto. Por ello las porciones claras del espcimen aparecen como un fondo oscuro y los objetos minsculos que se estn analizando aparecen como una luz brillante sobre el fondo. Esta forma de iluminacin se utiliza para analizar elementos biolgicos transparentes y sin manchas, invisibles con iluminacin normal. - Microscopa en contraste de fase: se usa principalmente para aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras de las clulas sin colorear. Es ideal para especmenes delgados, o clulas aisladas. El microscopio de fase ilumina el espcimen con un cono hueco de luz, como en el microscopio en campo oscuro. Sin embargo en el microscopio de fase el cono de luz es ms estrecho y

entra en el campo de visin del objetivo, que contiene un dispositivo en forma de anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase de un cuarto de la longitud de onda. Este tipo de iluminacin provoca variaciones minsculas en el ndice de refraccin de un espcimen transparente, hacindolo visible. Este tipo de microscopio es muy til a la hora de examinar tejidos vivos, por lo que se utiliza con frecuencia en biologa y medicina. 1.1.2 MATERIALES VOLUMTRICOS

Pipetas y pipeteadores

Se usan para medir volmenes de lquidos de forma ms precisa que con una probeta. Y son ms verstiles, sobre todo al manejar volmenes pequeos. Las pipetas de bulbo son tiles para medir volmenes que no requieren de mucha precisin. Las pipetas volumtricas vienen en distintos tamaos, desde 1 ml hasta 200 ml, y con distintas formas, de acuerdo al uso que se les d. Micropipetas

Son extremadamente tiles en los laboratorios de biotecnologa. Estas permiten medir con precisin volmenes tan pequeos como 0.1 l hasta 1 ml. Estas requieren de unos pipeteadores especiales que deben ser tratados con mucho cuidado para evitar que se descalibren. Los pipeteadores son de distintos tipos. La mayora pueden servir muestras individuales. Tambin pueden usarse para muestras mltiples, por medio de multicanales: pipetas que sirven 8 o 12 muestras a la vez. Fiolas: Existen de diferentes denominaciones, 10, 25, 50, 100, 250, 500 y 1000 ml, este material no debe calentarse a temperaturas altas ya que se daara su aforo afectando en su precisin. Buretas: Existen las microburetas de 10 ml y las normales de 25, 50, 100 ml. Obviamente tiene mayor precisin las de menor volumen. Siempre llenarse ms arriba del cero y luego abrir la llave para que la solucin pase al pico,

tener cuidado de que no queden burbujas. Es importante que antes de utilizar una bureta se compruebe su buen funcionamiento. 1.1.4 TCNICAS Y EQUIPOS PARA MARCADORES MOLECULARES

ELECTROFORESIS La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas (protenas o cidos nucleicos) sobre la base de su tamao molecular y carga elctrica. Para la separacin se usa un gel de agarosa o poliacrilamida(fibras cruzadas, como una malla). Al poner la mezcla de molculas y aplicar un campo elctrico, stas se movern y debern ir pasando por la malla, por la que las pequeas se movern mejor y ms rpidamente. As, las ms pequeas avanzarn ms y las ms grandes quedarn cerca del lugar de partida.

- Aparatos de electroforesis Son cmaras que contienen un circuito elctrico expuesto a un lquido electroltico, llamado amortiguador. El aparato se usa para separar mezclas de molculas grandes de acuerdo a su carga y/o su tamao. La tcnica consiste en inocular la muestra en un medio semislido, la fase estacionaria, que se somete a un campo elctrico, en una cmara donde en un extremo se encuentra un filamento que acta como polo positivo, y en el extremo opuesto hay otro filamento formando el polo negativo. Las molculas con cargas netas positivas se movern hacia el polo negativo y las de carga negativa se irn hacia el polo positivo. Dependiendo del tipo de electroforesis, las molculas que viajen hacia uno de los polos se separarn por tamao, viajando ms en la fase estacionaria las molculas ms pequeas. El tipo y concentracin de la fase estacionaria depender del tipo de molculas que nos interesa correr. - Centrfugas Son muy tiles para precipitar clulas y molculas. Vienen en distintos tamaos y con distintas capacidades en el manejo de muestras. Este aparato somete la muestra a fuerzas de aceleracin que obligan a las molculas a concentrarse en

el fondo del envase utilizado, separndolas del medio en que se encuentran. Incluso, bajo ciertos mtodos se puede generar un gradiente de concentraciones dentro del mismo tubo, separando distintas molculas a distintos niveles o fases dentro del tubo. Con ayuda de jeringas, se puede perforar la pared del tubo y extraer del mismo slo aquella fase donde se encuentren las molculas de inters. 1.2 EXTRACCIN DE DNA 1.2.1 ADN Es una molcula compleja formada por cientos y miles de nucletidos distintos en secuencias diversas formando una cadena larga. En el hombre la dotacin haploide de cromosomas presenta una molcula de ADN con una longitud total de

aproximadamente dos a tres cuartos de billn de nucletidos. En el cido nucleico, los nucletidos se unen unos a otros mediante el enlace azcar-fosfrico-azcar-fosfrico, etc. (S-P) con las purinas y las pirimidinas unidas como grupos laterales a las molculas de azcar. Secuencia del ADN

El ADN es un polmero de desoxirribonucletidos formados por miles o incluso millones de residuos monomricos. Los desoxirribonucletidos estn formados de una base de purina (adenina, guanina) o de pirimidina (citosina, timina) unida covalentemente al tomo de carbono 1 de la 2- desoxirribosa. Una unin fosfodister une el grupo 5- hidroxilo de la desoxirribosa al grupo 3- hidroxilo de un desoxirribonucletido adyacente para formar un esqueleto repetido. La secuencia especfica distingue al ADN de un gen al de otro. La secuencia de base representa el contenido de informacin del ADN. La cadena de

polidesoxirribonucletido tiene polaridad. Un grupo 5- hidroxilo se encuentra hacia el extremo 5, y el grupo 3- hidroxilo hacia el extremo 3; la direccin 5 3 de una molcula de cido nucleico es muy importante. Tal polaridad se puede encontrar aun en el ADN circular que no tiene un extremo 5- hidroxilo 3hidroxilo libre.

Desnaturalizacin del ADN

Es el cambio fsico del ADN cuando se somete a: pHs extremos, cambios de temperatura, disminucin de la constante dielctrica del medio acuoso por incorporacin de alcoholes, cetonas, etc., exposicin a la urea, amidas y otras soluciones similares. Cuando la temperatura alcanza el punto de fusin del ADN, la agitacin trmica es capaz de separar las dos hebras y producir una desnaturalizacin. Dos conjuntos de fuerzas son las responsables de mantener la estructura de la doble hlice del ADN: Los puentes de hidrgeno estn entre los pares de base y las interacciones del apilado son las bases sucesivas. Cuando cualquiera de los dos conjuntos de fuerza se interrumpen, la estructura duplo helicoidal nativa experimenta su transicin a una forma con lazos al azar, denominada ADN desnaturalizado o monofilar. En la desnaturalizacin de la estructura del ADN dplex se distinguen dos etapas: a. Las dos hebras se desarrollan parcialmente pero permanecen unidas por lo menos mediante un corto segmento de la estructura duplo helicoidal con algunas bases complementarias todava en registro. Los segmentos desenrollados de las hebras adoptan una conformacin cambiante y al azar. b. En la segunda etapa ambas hebras se separan por completo una de otra, si en este estado se enfran rpidamente cada una de las hebras se doblan sobre s misma para formar unos segmentos duplo helicoidales intracatenarios. Renaturalizacin del ADN

Este es un proceso reversible, ya que al bajar la temperatura se puede producir una renaturalizacin. Las cadenas del ADN separada se renaturalizarn o reasociarn cuando se alcance la temperatura fisiolgica y las condiciones de salinidad adecuada. La desnaturalizacin de un ADN homogneo es fcilmente reversible si el proceso de desenrollamiento no ha pasado de la primera etapa. Mientras un segmento duplo helicoidal est uniendo a las dos hebras con los pares de base en su sitio, los segmentos desplegados de las dos hebras volvern a enrollarse espontneamente reformando un dplex completo instantneamente se

produce un retorno a la conformacin nativa, que es la de mnima energa libre. Sin embargo, si las dos hebras se han separado por completo la renaturalizacin es ms lenta.

1.3 CULTIVO DE BACTERIAS Y MICROORGANISMOS

1.3.1 Medios de Cultivo: Un mtodo fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio lquido o en la superficie de un medio slido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van, desde azcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo slido donde las clulas que se multiplican no cambian de localizacin; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisin binaria una colonia macroscpica compuesta por decenas de millones de clulas similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecer como cultivo puro de un solo tipo de bacteria. - Disponibilidad de nutrientes adecuados Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Todas estas sustancias se suministraban

originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparacin de estas sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo provocaba la prdida de los factores nutritivos lbiles. Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los

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aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona. - Consistencia adecuada del medio Partiendo de un medio lquido se puede modificar su consistencia aadiendo productos como albmina, gelatina o agar, con lo cual se obtendran medios en estado semislido o slido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusin de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el laboratorio.

- Presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones. - Condiciones adecuadas de humedad Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio.

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1.3.2 Conteo de Bacterias Principales mtodos de recuento del nmero de bacterias en una muestra El nmero de bacterias puede determinarse directamente por recuento del nmero total de clulas o indirectamente por la estimacin del nmero ms probable, por filtracin o por el recuento de clulas viables en placa (clulas capaces de dividirse en un medio de cultivo slido, tambin se refieren como unidades formadoras de colonias, UFCs). Recuento directo de bacterias al microscopio

Es una tcnica para determinar el nmero total de organismos de una muestra: Se utilizan cmaras de recuento (cmara de Petroff-Hauser) y visualizacin al microscopio. Es un mtodo rpido del nmero total de clulas de una muestra pero no distingue entre viables o no viables. Recuento directo con contadores electrnicos

Se utiliza el contador Coulter recuenta el nmero de clulas suspendidas en un lquido, a su paso por un orificio por donde fluye la corriente elctrica. Se puede determinar a su vez el tamao de las clulas pero tampoco distingue entre viables, muertas o partculas. Recuento del nmero de bacterias viables mediante el mtodo de

dilucin y siembra en placa por siembra en superficie Es la siembra de un volumen conocido de la dilucin de la muestra sobre la superficie de un medio de cultivo en placa Petri. En este mtodo todas las colonias crecen sobre la superficie del medio. Generalmente se utiliza esta tcnica para el recuento de bacterias aerobias. 1.4 CORTES HISTOLGICOS VEGETALES La Tcnica Histolgica abarca varios procedimientos a los que se somete un tejido para proporcionar los cortes como se conocen, montados bajo un cubre objeto con

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imgenes de estructuras contrastadas, para su estudio bajo microscopa ptica o electrnica. Para la obtencin de cortes para observar a microscopio, hay que seguir un protocolo en el que se incluye la obtencin de la muestra, su corte y montaje. 1.4.1 Fijacin Es el proceso mediante el cual los elementos constitutivos de las clulas, y por tanto de los tejidos, son fijados en cuanto a su estado fsico, y parcialmente en su estado qumico, de manera que puedan resistir el tratamiento sucesivo con varios reactivos sin prdida, distorsin importante, o descomposicin. La mayora de los agentes fijadores actan desnaturalizando o precipitando las protenas, que forman entonces una esponja o malla que tiende a englobar los otros componentes celulares. En condiciones ideales, un fijador debe penetrar rpidamente al tejido, su accin debe ser inmediata, y debe causar una prdida y una alteracin qumica y fsica mnima de las clulas y de sus componentes; debe adems ser barato, estable y de fcil manejo. El tiempo de fijacin oscila entre 30 minutos a 12 horas dependiendo del grosor del tejido, las clulas libres requieren solo de 30 minutos, tejido delgado de 2 horas y ms grueso hasta de 12 horas, entre ms delgado sea el tejido mejor se fijar. 1.4.2 Deshidratacin Los tejidos contienen gran cantidad de agua, tanto intra como extracelular, que debe ser eliminada y reemplazada por parafina. Este proceso debe realizarse mediante el uso de alguna sustancia que se mezcle con el agua y tenga cierta afinidad con ella, de manera que pueda penetrar fcilmente entre las clulas de los tejidos. El alcohol etlico es el mejor agente para la deshidratacin, esto se logra utilizando alcoholes en distinta concentracin, empezando por el 70%. La deshidratacin es tambin indispensable antes de que puedan montarse los cortes teidos. 1.4.3 Aclaramiento o limpieza Permite que el alcohol de los tejidos sea reemplazado por un lquido que disuelva la parafina con la cual el tejido va a ser impregnado. Los aclaradores adems de eliminar el alcohol, tienen la propiedad de volver transparentes los tejidos. Ello se debe a sus

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elevados ndices de refraccin, y a los cambios pticos que se producen cuando el agente aclarante penetra entre los elementos tisulares muy refractantes; es decir, el ndice de refraccin de los agentes aclarantes es aproximadamente igual al de los tejidos. La mayora de las sustancias verdaderamente aclarantes son aceites esenciales. Los buenos agentes aclarantes deben eliminar pronto el alcohol y aclarar rpidamente sin endurecimiento; no deben disolver los colorantes de anilina, ni evaporarse demasiado rpido en los baos de parafina. 1.4.4 Corte Se debe cortar en secciones lo suficientemente delgadas como para permitir el paso de la luz. La mayor parte de los preparados para microscopa ptica tienen un grosor entre 5 a 10 micrmetros. Para un estudio riguroso se utiliza un aparato llamado MICROTOMO, con cuchillas de acero. Microtomo para cortes ultradelgados: Para la microscopa electrnica, los cortes deben tener de 50 a 120 m; para ello existen microtomos especiales. 1.4.5 Coloracin Proceso por el cual un cuerpo toma color bajo la accin de un colorante y no desaparece con lavados de la misma sustancia en que se disolvi el colorante. Las estructuras contenidas en las preparaciones histolgicas, poseen poco contraste o carecen de l completamente, por lo que no van a poder ser distinguidas al microscopio. Este inconveniente queda salvado por la propiedad que tienen los distintos componentes celulares y tisulares de incorporar con variable intensidad sustancias colorantes. En la Tcnica Histolgica corriente se usan principalmente colorantes como Hematoxilina y Eosina. Tipos de colorantes: a) Colorantes naturales, extrados de productos animales o vegetales, como el carmn, la hematoxilina, la orcena y la safranina; b) Colorantes artificiales, conocidos como colorantes de anilina, colorantes de carbn o colorantes sintticos.

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1.4.6 Decoloracin Este paso se hace con objeto de llevar a cabo la diferenciacin, es decir, por lo general los cortes se tien con exceso con hematoxilina y es preciso quitar el colorante de aquellas estructuras celulares que no son especficas de la hematoxilina y que la retienen con poca intensidad. Para ello se utiliza una solucin de alcohol-agua que se prepara uno a uno. Luego se procede a lavar con agua destilada. 1.4.7 Montaje Los cortes una vez teidos pueden ser conservados por muchos aos una vez que son protegidos del medio exterior utilizando resinas sintticas o blsamo de Canad. El medio de montaje clsico es el Blsamo del Canad, el cual prcticamente se ha dejado de utilizar debido a que ha sido superado por los medios sintticos como el DPX y otros. 1.5 RECONOCIMIENTO DE PROTENAS 1.5.1 REACCIONES COLOREADAS ESPECFICAS (BIURET): Esta reaccin la producen los pptidos y las protenas, pero no los aminocidos ya que se debe a la presencia del enlace peptdico CO-NH que se destruye al liberarse los aminocidos. El reactivo del Biuret lleva sulfato de Cobre (II) y sosa, y el Cu, en un medio fuertemente alcalino, se coordina con los enlaces peptdicos formando un complejo de color violeta (Biuret) cuya intensidad de color depende de la concentracin de protenas. El nombre de la reaccin procede del compuesto coloreado formado por la condensacin de dos molculas de urea con eliminacin de amonaco. Esta reaccin est dada por aquellas sustancias cuyas molculas contienen dos grupos carbamino (CO.NH) unidos directamente o a travs de un solo tomo de carbono o nitrgeno. El reactivo de Biuret contiene Cu2SO4 en solucin acuosa alcalina (gracias a la presencia de Na (OH) o KOH). La reaccin se basa en la formacin de un complejo de

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coordinacin entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos. Esta ltima reaccin provoca un cambio de coloracin: violeta prpura o violeta rosado. Debe sealarse que el color depende de la naturaleza de las protenas; protenas y pptidos dan un color rosado; la gelatina da un color azul. 1.5.2 REACCIN XANTOPROTEICA Esta prueba caracteriza a los aminocidos aromticos (tirosina, fenilalanina, triptfano. Esta reaccin se debe a la presencia de un grupo fenilo en la molcula proteica. Los complejos de la molcula proteica que son de importancia en esta reaccin son la tirosina y el triptfano. La fenilalanina no reacciona en las condiciones que se realiza en el laboratorio. Para esta prueba se produce la nitracin del anillo bencnico presente en los aminocidos obtenindose nitrocompuestos de color amarillo, que se vuelven anaranjado en medio fuertemente alcalino (formacin de cido picrmico o trinitrofenol). No puede realizarse esa reaccin para identificar albmina en orina, por el color anaranjado de la reaccin final. Las protenas que tienen en su composicin estos aminocidos tambin darn la reaccin. La positividad se reconoce por la aparicin de un color amarillo o verde debido a la formacin de nitrocompuestos. 1.5.3 DESNATURALIZACIN DE PROTENAS POR CALOR Y pH EXTREMOS Efecto del pH sobre la estructura de las protenas Los iones H+ y OH- del agua provocan efectos parecidos, pero adems de afectar a la envoltura acuosa de las protenas tambin afectan a la carga elctrica de los grupos cidos y bsicos de las cadenas laterales de los aminocidos. Esta alteracin de la carga superficial de las protenas elimina las interacciones electrostticas que estabilizan la estructura terciaria y a menudo provoca su precipitacin. La solubilidad de una protena es mnima en su punto isoelctrico, ya que su carga neta es cero y desaparece cualquier fuerza de repulsin electrosttica que pudiera dificultar la formacin de agregados.

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Efecto de la temperatura sobre la estructura de las protenas Cuando la temperatura es elevada aumenta la energa cintica de las molculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de las protenas, y se desnaturalizan. Asimismo, un aumento de la temperatura destruye las interacciones dbiles y desorganiza la estructura de la protena, de forma que el interior hidrfobo interacciona con el medio acuoso y se produce la agregacin y precipitacin de la protena desnaturalizada. 1.5.4 REACCIN DE AMINOCIDOS AZUFRADOS Aminocidos con azufre Los dos aminocidos azufrados son esenciales, la metionina estrictamente, mientras que la cistena puede formarse a partir de la metionina (no al revs). Las dietas basadas en leguminosas pueden ser deficientes en estos aminocidos. Adems, ambos son bastante inestables frente a condiciones de oxidacin. La cistena es muy importante en el mantenimiento de la estructura terciaria y cuaternaria de la mayora de las protenas mediante la formacin de puentes bisulfuro, en dmeros de la cistena formados por oxidacin. Prueba o reaccin de los grupos SH: Es una prueba para identificar aminocidos azufrados y las protenas que los contienen, se reconocen por la formacin de una coloracin negra o gris. Los Aminocidos azufrados como Metionina, Cistena y Cistina se reconocen por la formacin de precipitados de Sulfuro de Plomo de color gris oscuro o negro que se forman cuando reacciona con Acetato de Plomo en medio alcalino.

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II. LUGAR DE EJECUCIN Y UBICACIN GEOPOLTICA

LUGAR DE EJECUCIN DE LAS PRCTICAS: Instituto de Biotecnologa e Ingeniera Gentica U.N.C.P. El Instituto de Biotecnologa e Ingeniera Gentica (I.B.I.G.) est ubicado en el pabelln G de la Universidad Nacional del Centro del Per en la provincia de Huancayo. UBICACIN GEOGRFICA: Latitud Longitud Altitud: UBICACIN GEOPOLTICA Regin : Junn : : : 124300 S 750605 O 3.244 m.s.n.m.

Departamento : Junn Provincia Distrito Direccin : Huancayo : El Tambo : Km. 5 Av. Mariscal Castilla, Ciudad Universitaria

Pabelln G 3er Piso. Telfono (064)481082-anexo Centro de investigacin.

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III. PLAN Y CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES DESARROLLADAS

MESES SEMANAS ACTIVIDADES Reconocimiento de equipos de laboratorio Extraccin de DNA de tejidos vegetales, equipos de marcadores moleculares Cultivos de bacterias y microorganismos

2011

FEBRERO
1 2 3 4 1

MARZO
2 3 4

Cortes histolgicos de tejido vegetal

Reconocimiento de protenas

Repaso de todas las prcticas

Fecha de inicio

: 31-01-11

Fecha de culminacin : 31-03-11

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IV. DESCRIPCIN DE LAS PRCTICAS 4.1 RECONOCIMIENTO DE EQUIPOS DE LABORATORIO Antes de empezar a trabajar en un laboratorio, es necesario conocer las normas de seguridad y el uso adecuado de reactivos, estos alcances fueron dados por el Ing. a cargo de este laboratorio y fueron seguidas en todas las prcticas realizadas. 4.1.1 Normas de Seguridad para la Utilizacin del Espacio en Prcticas de Laboratorio Usar guardapolvo de laboratorio para cada prctica y no utilizar calzado destapado. Usar guantes, mascarilla y gorra, cuando se requieran. No pipetear con la boca, usar un pipeteador. No llevarse los dedos a la boca, ojos o nariz, ni respirar directamente sobre ningn reactivo pues sus vapores pueden ser txicos. No ingerir alimentos o bebidas en el laboratorio. No usar durante las prcticas anillos, cadenas, prendedores, pulseras o collares. No ubicar bolsos, mochilas o paquetes, en los lugares de trabajo. 4.1.2 Utilizacin de Reactivos Todo reactivo preparado debe rotularse con el nombre del reactivo, la persona que lo prepar y la fecha de preparacin. No arrojar por los sumideros, cidos, bases o algn otro reactivo, depositarlos en los recipientes de desecho. Evitar derrames de sustancias en las mesas de trabajo, as se previene que algn compaero se queme la piel o se deteriore la ropa.

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 No arrojar al piso ningn reactivo. No arrojar al piso papeles u otros elementos. Utilizar el recipiente para la basura. 4.1.3 Asepsia en el Laboratorio Mantener el ambiente libre de organismos infecciosos y contaminantes que pueden ser perjudiciales para la salud. Al ingresar al laboratorio se debe usar guardapolvo para prevenir la contaminacin del ambiente de trabajo. La limpieza de mesas y repisas se realiza utilizando algodn empapado con alcohol e hipoclorito de sodio para as dejar el medio libre de contaminantes, y finalmente se pulveriza con alcohol de 70. Toda prueba de manipulacin de microorganismos se debe hacer con un mechero al lado para calcinar los residuos que quedan en los instrumentos de manipulacin, para evitar su diseminacin o contaminacin. 4.1.4 Reconocimiento de Materiales y Equipos de Laboratorio Bistur: Es un instrumento con hoja de filo cortante, su mango puede ser de madera, plstico o metal. Viene a ser por sus dimensiones un instrumento en forma de cuchillo pequeo y que su uso se ha extendido para practicar incisiones en tejidos blandos. Placa Petri: Sirve para observar microorganismos en el laboratorio.

Placa Petri

Gradilla

Porta objetos: Pueden ser laminillas de cristal con ligeras hendiduras, o sin ellas, en donde son depositadas las sustancias que posteriormente se observarn al microscopio. 21

Cubreobjetos:

Sirven

para

cubrir

las

muestras

de

animales,

plantas o

microorganismos que sern observados al microscopio y prevenir su contaminacin. Estufa elctrica: Se utiliza para secado de sustancias y esterilizacin. Alcanza temperaturas ente 250 y 300 C. Gotero: Consiste en un pequeo tubo de vidrio y en uno de sus extremos tiene un capuchn de hule, que permite succionar o arrojar las soluciones. Debe mantenerse siempre limpio; por tanto, hay que lavarlo despus de cada manipulacin. Gradilla: Apoyar tubos de ensayo. Mechero de Alcohol: Puede ser cualquier recipiente que contenga alcohol, mecha, el tapn de rosca agujerado donde sobresalga la mecha y un tapn para cubrir la mecha una vez que se ha utilizado.

Mechero de alcohol

Pipetas

Pipeta (para llenado): Tienen una sola marca y miden una sola cantidad determinada de lquido; las hay de varias formas y generalmente consiste en un tubo de cristal con un ensanchamiento cilndrico en el centro; en el extremo inferior est estirado y con un orificio de salida en la punta. Las pipetas de este tipo, conocidas como volumtricas, tienen capacidad para 1, 2, 5, 10, 20, 25, 50, 100 y 200 mililitros. Para transvasar un volumen fijo y un lquido determinado, resulta ms exacto usar las pipetas que los matraces y las buretas. Tubo De Ensayo: Estn elaborados de vidrio; se usan para contener diversas sustancias en pequeos volmenes; para preparar cultivos de bacterias y hongos; para realizar diferentes experimentos y pueden ser de diferentes medidas.

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Tubos de ensayo

Probeta Graduada: Las probetas son instrumentos para medir volmenes y su uso es muy frecuente. Este tipo de recipientes son los ms usados en los laboratorios. Es un tubo de cristal con pie, en ste caso cerrada por un extremo y destinada a contener lquidos o bien gases, se usan para medir los lquidos o sustancias en centmetros cbicos.

Probeta

Vaso de precipitado

Varilla De Cristal: Sirve para lograr una perfecta mezcla de las combinaciones que deseamos obtener, ya sea entre lquidos o bien entre lquido y polvo qumico o sea slido. Desempea tambin la funcin de un poderoso agitador. Vaso De Precipitado: Son de vidrio y los hay de diferentes tamaos, estn graduados y tienen pico, pueden ser tambin de plstico. tiles para hacer mezclas o soluciones, preparar colorantes, realizar evaporaciones o para que contengan lquidos. Centrifuga: Una centrfuga es una mquina que pone en rotacin una muestra para separar por fuerza centrfuga sus componentes o fases (generalmente una slida y una lquida), en funcin de su densidad.

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Centrfuga

Destilador de agua: Este aparato tiene un sistema que logra destilar como su mismo nombre lo dice el agua. Horno: Este instrumento de laboratorio sirve para darle temperatura a ciertas sustancias y como tienen temporizador mantiene el calor en una temperatura constante.

Horno

4.2 EXTRACCIN DE DNA DE TEJIDOS VEGETALES 4.2.1 FUNDAMENTO: La extraccin de DNA se fundamenta en que es una molcula que puede ser extrada de cualquier parte de los organismos, por ejemplo en los vegetales, de la raz, tallo, hojas, etc. La extraccin de muestras celulares (tejidos) se basa en el hecho de que los iones salinos son atrados hacia las cargas negativas de los enlaces fosfodister del DNA lo que permite su disolucin y posterior extraccin de la clula.

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4.2.2 EXPERIMENTO: EXTRACCIN DE DNA DE TEJIDOS VEGETALES MATERIALES 1. Materiales de vidrio Vasos de precipitado de 150 ml y 250 ml (10 u) Tubos de ensayo Gradillas Varillas de vidrio Pipeta 2. Reactivos Agua pura (millipore) Amortiguador salino: (NaCl 0,15 M) Bicarbonato sdico Solucin detergente BX-31 Alcohol isoamlico a 0C Alcohol de 96 3. Equipos Homogenizador Centrfuga y microcentrfuga Freezer Balanza analtica Agitador magntico Vortex 4. Muestras biolgicas vegetales Homogenatos de tomate, papaya. TCNICA 1. Preparacin de la solucin tampn

En 120 ml de agua pura Millipore disolver 1,5 g de cloruro de sodio (pm) y 5 g de bicarbonato de sodio, luego se aade 5 ml de solucin detergente BX-31 (Biomol). Mantener el preparado en el freezer a baja T, evitar el contacto con el medio ambiente.

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2.

Preparacin de la muestra biolgica

Elegir la muestra de la que se va extraer el DNA, (tomate, papaya) y homogenizarla a 800 rpm verificando que el homogenato tenga una consistencia coloidal. 3. Extraccin y precipitacin de DNA

En un recipiente limpio mezclar cuidadosamente 5 ml del homogenato con 10 ml del tampn fro y llevar al vrtex agitando durante 2 minutos. Centrifugar a 19C y 3000 rpm durante 5 min. 4. Precipitacin final

Retirar 2,5 ml del caldo molecular a un tubo de ensayo limpio y esterilizado, luego aadir con micropipeta 2,5 ml de alcohol isoamlico enfriado previamente a 0 escurriendo lentamente el alcohol por la cara interna del tubo tenindolo inclinado hasta que el alcohol quede flotando sobre el tampn. Se deja reposar unos 10 min, luego se agregan unas 3-4 gotas de alcohol etlico de 70 y se deja reposar 10-15 min. 5. Extraccin de la medusa de DNA

Introducir la punta de una varilla de vidrio fina en la interfase entre el alcohol y el tampn. Remover la varilla hacia adelante y hacia atrs hasta que poco a poco se enrollen las fibras de DNA. Luego de un minuto retirar la varilla atravesando la capa de alcohol con lo cual el DNA quedar adherido a su extremo con el aspecto de un copo de algodn mojado. Transferir

cuidadosamente la muestra a un portaobjeto limpio y estril, dejar secar y observar al microscopio. RESULTADO Y DISCUSIN Se realiz la extraccin de DNA de los homogenatos de tomate y papaya, lo cual se evidenci por la presencia de algunas fibras blanquecinas inmersas en un lquido transparente, stas correspondan al DNA extrado. Sin embargo para estudios ms estrictos se requiere utilizacin de enzimas especiales que degraden el ARN y as se obtenga DNA puro.

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Esta prctica evidenci la utilidad de realizar una correcta extraccin de DNA en una investigacin biotecnolgica ya que a partir de ella, es posible conocer con exactitud la cantidad de genes presentes en cualquier cultivo. Adems es muy til en investigaciones sobre caracterizaciones moleculares de cualquier especie vegetal que hoy en da se hacen cada vez ms frecuentemente.

4.3 CULTIVO DE BACTERIAS Y MICROORGANISMOS 4.3.1 FUNDAMENTO: El cultivo de microorganismos consiste en brindarles las condiciones fsicas, qumicas, nutritivas y ambientales adecuadas para que stos se multipliquen en forma controlada, lo que requiere conocer los medios de cultivo adecuados para cada microorganismo, las tcnicas de su preparacin y los cuidados que se requieren. 4.3.2 EXPERIMENTO: CONTEO DE BACTERIAS COLIFORMES AEROBIAS TOMADAS DE LA LAGUNA DE OXIDACIN DE LA UNCP MATERIALES Medio de cultivo lquido: AGP: Agar, Glucosa, Peptona. Proporciones para 1 L de agua destilada millipore: Agar: 14 g Glucosa: 5 g Peptona: 5 g

Microorganismo: 5 Cepas K-13 de Escherichia coli TCNICA 1. Seleccin de materiales, equipos e insumos.

Autoclave

Agar

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Glucosa

Peptona

2. Limpieza y asepsia personal: Lavado de manos, uso de mascarilla y gorra. 3. Esterilizacin de materiales. Va hmeda: en autoclave a 120C por 20 minutos. Va seca: Horno Pasteur a 200C por 20 minutos.

4. Preparacin del medio de cultivo Pesar 14 g de agar, 5 g de glucosa y 5 g de peptona bacteriana. Medir 1 L de agua en una probeta y verter en un vaso de precipitacin. Disolver la glucosa y la peptona en vasos de precipitacin separados

utilizando 100 ml en cada uno de ellos. Disolver el agar en agua fra en un vaso de precipitacin removiendo con

una varilla. Verter las disoluciones en un vaso de precipitacin y enrasar a 1 L. Autoclavar a 120C durante 20 minutos. Verter en dos vasos de precipitacin de 500 ml.

5. Dispensado Verter en cada placa Petri el medio de cultivo hasta 1/3 de su capacidad aproximadamente. Esta operacin se realiza en cmara de flujo laminar. Tapar el frasco del medio con papel metlico. Dejar enfriar durante 5 minutos hasta solidificarse e identificar la placa: clave, fecha, iniciales. 6. Siembra Abrir la placa Petri dentro de la cmara de flujo. Flamear el asa de Kolle hasta rojo vivo en un mechero de alcohol o bunsen.

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 Sumergir el asa en el inculo, dejar unos segundos. Sembrar sobre el tapiz de agar sin rasgarlo segn la tcnica indicada: puntos, estras, doble estra, etc. Cerrar la placa dentro de la cmara de flujo. 7. Incubacin Programar la incubadora a 37,5 C Trasladar la placa a la incubadora y deslizarla suavemente en forma invertida. Incubar durante 24 a 48 horas. RESULTADO Y DISCUSIN Luego de 24 horas se procedi a sacar las placas Petri (2 por alumno) y no se observ crecimiento de coliformes en ninguna de ellas, por lo que se esper 24 horas ms y luego de revisar las placas en esta ocasin, algunas presentaron crecimiento de colonias de bacterias de E. coli, y algunas otras se contaminaron seguramente debido a algn error humano en la siembra del inculo en la cmara de flujo laminar. La prctica capacit al alumno en la preparacin de un medio de cultivo para microorganismos lo cual es muy til para la realizacin de innumerables trabajos de investigacin que requieren el cultivo de microorganismos. Asimismo, fue interesante observar colonias de bacterias E. coli presentes en la laguna de oxidacin de la UNCP.

4.3.3

EXPERIMENTO:

DETERMINACIN

DEL

NMERO

DE

BACTERIAS

COLIFORMES FECALES TOTALES EN EL AGUA POTABLE DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PER MTODOS: Mtodo de Recuento por Dilucin en Tubo: Necesita T del agar de 40C. Protocolo IBIG

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Petri. -

Preparar el medio de cultivo: esterilizar en autoclave Preparar diluciones hasta 10-3 Preparar dos, tres o cinco tubos por dilucin segn sea el caso. En la cmara de flujo dispensar en placas Petri el medio sin solidificar. Aadir con una pipeta 1 ml de dilucin segn sea el caso a cada placa

Incubar a 37C durante 24-36 horas. Para evaluar contar el nmero de colonias/placa y multiplicar por el

factor de dilucin. TCNICA Se tom muestras de agua en frascos de vidrio previamente esterilizados de 12 pabellones de la UNCP, y se sigui el siguiente protocolo: Esterilizar las placas Petri por 20 min en el horno a 200C. Lavar botellas, cada una por espacio de 2 minutos. Traer muestras de agua codificadas (fecha, pabelln) Preparacin del medio de cultivo siguiendo el protocolo antes Preparar diluciones hasta 10-2.

mencionado. -

Diluciones: Echar 9 ml de agua millipore en un tubo de ensayo. Agregar al tubo 1ml del agua de la zona muestreada (d1:10-1), y diluir a

partir de ste en un segundo tubo (d2:10-2) echando 1 ml del primer tubo. Cada dilucin cuenta con dos repeticiones (h1, h2). Este procedimiento se hace para todas las muestras. Preparar el medio de cultivo siguiendo el protocolo ya mencionado. Previo a la siembra esterilizar los instrumentos antes de su utilizacin. En la cmara de flujo dispensar el medio de cultivo (no esperar a que se

solidifique) Agregar con pipeta 1 ml de dilucin a cada placa Petri Incubar por 24-36 h a 37C.

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Evaluar: contar el N de colonias.

En la prctica realizada, se utiliz el mtodo Recuento del nmero de bacterias viables mediante el mtodo de dilucin y siembra en placa Conteo de Bacterias por el Mtodo de Conteo Directo

El nmero de *UFC contadas dentro de la cuadrcula se multiplican por el inverso del factor de dilucin, por ejemplo si el factor de dilucin es 1 x 10-1, una colonia representara: 1x1x10 = 10 UFC /ml. La cantidad de coliformes fecales totales recomendada por las Guas de la OMS es de 0 UFC (unidades formadoras de colonias) /100ml 0 UFC / ml. RESULTADO Y DISCUSIN: PABELLN H1 A B C E F G I IBIG COMEDOR CAFETERA BIBLIOTECA ED.INTELIGENTE
Datos por ml de agua muestreada.

d1 H2 19 6 0 0 0 0 2 2 0 1 0 0 H1 100 0 2 1 0 0 0 100 2 1 0 0

d2 H2 100 0 2 1 0 0 0 100 2 1 0 0

19 6 0 0 0 0 2 2 0 1 0 0

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* UFC: Unidad formadora de colonias. Se observ una mayor cantidad de bacterias colifecales por ml en el pabelln A, en promedio en la dilucin 1: 190 UFC por ml, debido a que las tuberas del servicio de agua potable probablemente estn ms desgastadas en esa zona a comparacin de otras reas de la UNCP o tal vez haya una rotura; en la dilucin 2 se contaron 100 UFC en promedio en las placas, este resultado es muy posiblemente debido a un error humano, ya que normalmente en la dilucin 1 debiera haber mayor nmero de UFC que en las diluciones posteriores. Para una conclusin certera se recomienda hacer un nuevo anlisis para descartar el error humano. As mismo, se observa presencia

considerable de bacterias en el IBIG en la dilucin 2, lo cual se podra explicar de la misma manera que el caso anterior. En el pabelln B se encontr 60 UFC/ml en la dilucin 1, mientras que en la dilucin 2 no se hallaron UFC. En la cafetera se encontr 10 UFC/ml en la dilucin 1 y en la dilucin 2: 100 UFC/ml, lo cual tambin supondra un error humano. En el comedor en la dilucin 2 se obtuvo 200 UFC/ml Por tanto, en ambos casos se estara superando el lmite establecido por la OMS de 0 bacteria/ml, lo cual tambin tendra que corroborarse con un nuevo anlisis de agua para descartar el error humano. La determinacin de bacterias coliformes totales presentes en el agua potable de la UNCP fue un ejemplo prctico del agua que muchos consumen a veces sin precaucin directamente del cao y gener un inters particular en realizar estudios ms detallados en todo tipo de agua, por ejemplo en el agua de riego de cultivos.

4.4 CORTES HISTOLGICOS DE TEJIDO VEGETAL

4.4.1 FUNDAMENTO: La tcnica histolgica fundamental comprende la preparacin de los tejidos para su estudio microscpico, lo cual se logra sometiendo a la totalidad o a una parte seleccionada del tejido por examinar, a una serie de procesos: fijacin, deshidratacin, aclaracin, corte y tincin.

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4.4.2 EXPERIMENTO: CORTES HISTOLGICOS DE TEJIDOS VEGETALES MATERIALES: Equipos y herramientas: Microscopio compuesto. Portaobjetos. Cubreobjetos. Pipeta pasteur o gotero. Frasco gotero con agua. Hoja de Gillette. Aguja de diseccin.

Reactivos e Insumos: Colorante: eosina, fucsina, azul de metileno. Alcohol. Clorox. Fijador de Carnoy. Blsamo de Canad. Esmalte de uas. Etiquetas.

Material Biolgico: - Tejidos vegetales: raz, hojas, tallo de algn cultivo. TCNICA: 1. Obtencin de la muestra Escoger un rgano de la planta para trabajar: hoja, tallo o raz. 2. Fijacin: En un frasco de vidrio o plstico se utiliza el fijador de Carnoy, el cual contiene cido actico y alcohol 3:1 respectivamente. Colocar aqu los cortes realizados y mantener 12 horas mnimo en maceracin.

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3. Deshidratacin: En un frasco colocar agua destilada para enjuagar las muestras. En 4 placas de Petri hacer 4 soluciones con alcohol y agua destilada en diferentes concentraciones como se indica en el siguiente cuadro:

Concentraciones Alcohol 1 1 1 1 Agua 1 2 3 4

Tiempo (15 min) (15 min) (15 min) (15 min)

La muestra vegetal se lava en el frasco lavador antes de pasarla a la siguiente concentracin. 4. Aclaracin o limpieza: Generalmente se utiliza el disolvente orgnico Xilol, pero es muy fuerte. Por ello usamos Clorox, ya que en este caso es ms apropiado. La proporcin utilizada para el lavado es: 1:9 (clorox, agua) por 1 min. 5. Corte: Seccionar manualmente en fragmentos que midan de 2 a 4 cm de longitud utilizando hoja de Gillette y aguja de diseccin. En el caso de la hoja, incluir la nervadura central. Cortar transversal o longitudinalmente el rgano elegido,

procurando que los cortes sean finos, sin desgarramientos y de un solo golpe. En el caso de la raz hacer un corte de 25 aproximadamente. Observar al microscopio los cortes, eligiendo los mejores para montarlos. 6. Coloracin: Se puede usar variados colorantes tales como, azul de metileno, verde, fucsina, etc. Colocar 1 a dos cortes sobre un portaobjetos y proceder a teirlos con el colorante elegido utilizando un gotero para aadir dos a tres gotas sobre cada

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corte y dejar en coloracin por 3 min. Observar al microscopio y descartar los cortes que no satisfagan. 7. Decoloracin: Para poder aclarar los tejidos se procede a colocar los cortes en una solucin de alcohol y agua al 50% dispuesta en una placa Petri por alrededor de un minuto. 8. Montaje: Poner una gota de blsamo de Canad en un portaobjetos. El blsamo se puede reemplazar con glicerina. Encima del blsamo colocar el pequeo corte de tejido vegetal. Luego sellar las orillas con esmalte de uas. Etiquetar. 9. Etiquetado: Anotar en la etiqueta los datos correspondientes: nombre del cultivo, rgano, tipo de corte: transversal, longitudinal, sagital, etc., iniciales de quin realiz la preparacin y la fecha. 4.5 RECONOCIMIENTO DE PROTENAS

4.5.1 FUNDAMENTO: Las protenas debido al gran tamao de sus molculas forman con el agua soluciones coloidales que pueden precipitar formndose cogulos al ser calentadas a temperaturas superiores a 70C o al ser tratadas con soluciones salinas, cidos, alcohol, etc. La coagulacin se debe a la desnaturalizacin de las protenas (prdida de estructura) y en muchos casos es irreversible. 4.5.2 EXPERIMENTO: RECONOCIMIENTO DE PROTENAS MATERIALES: Materiales de Vidrio Tubos de ensayo Gradillas Mechero Vasos de precipitado de 250 ml

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Pipetas Gotero

Reactivos cido ntrico concentrado Acetato de plomo al 5% Alcohol de 96 Solucin de sulfato cprico (SO4Cu) al 1% Hidrxido de sodio al 20% Hidrxido de sodio al 40%

Muestras Biolgicas Clara de huevo Leche Gelatina de postre.

METODOLOGA Determinacin cualitativa experimental y anlisis de las muestras al aplicar reactivos especficos. TCNICA: I. PREPARACIN DE SOLUCIONES 1. SULFATO CPRICO AL 1%: En un vaso precipitador disolver 2,5 g de

Sulfato cprico y aforar con agua destilada hasta 250 ml. 2. ACETATO DE PLOMO AL 5%: En un vaso precipitador disolver 2,5 g de

Acetato de plomo y aforar con agua destilada hasta 50 ml. 3. NA (OH) al 20%: En un vaso precipitador disolver 10 g de Na (OH) y

aforar con agua destilada hasta 50 ml. Esta solucin provocar una reaccin exotrmica de xido. II. EXPERIMENTOS A) REACCIN XANTOPROTEICA (Reaccin coloreada)

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Fundamento Esta reaccin se debe a la formacin de un compuesto aromtico nitrado de color amarillo, cuando las protenas son tratadas con cido ntrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas protenas con aminocidos portadores de grupos bencnicos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un alcali vira a un color anaranjado oscuro.

Tcnica Se separa la clara de la yema de huevo en un vaso de precipitado. Tomar una muestra y agregar en un tubo de ensayo 2-3 ml de albmina

(clara de huevo). Aadir lentamente por las paredes del tubo 1 ml de cido ntrico(HNO3). Calentar a bao mara a 100C y luego enfriar en agua fra. Agregar por las paredes del tubo cuidadosamente, inclinando el tubo y

despacio unas gotas de una disolucin de Na (OH) al 40%. Resultados En la muestra de clara de huevo se observ una interfase con forma de anillo naranja al aadir HNO3 y calentarlo, luego la solucin tom un color amarillo suave, y al aadir Na (OH) tom un tono anaranjado. As mismo se observ una solidificacin de la clara de huevo color blanco en la base del tubo de ensayo. Dado que los resultados de esta prueba Xantoproteica dan positivos, queda demostrada la presencia de protenas en ambas muestras. El hecho de que la clara solidifique en contacto con el HNO3 es debido a que al cambiar el pH de la disolucin, las protenas que en ella hay se desnaturalizan y se vuelven insolubles.

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Albmina con HNO3

Albmina, luego de la adicin de Na (OH).

B) DESNATURALIZACIN DE PROTENAS POR CALOR y pH EXTREMOS Fundamento Muchas protenas se desnaturalizan por calor, que afecta las interacciones dbiles como enlaces de hidrgeno. El cambio es abrupto, la prdida de la estructura en una parte de la protena desestabiliza el resto. La accin de los extremos de pH afecta a las protenas mediante la accin de los iones de H- y OH+. Tcnica En dos tubos de ensayo agregar 5 ml de cada protena (albmina y leche). Aadir a ambos tubos 0,5 ml de cido ntrico respectivamente, y colocarlos en bao mara de agua hirviendo por 10 min. Enfriar a temperatura ambiente y observar los resultados. En un tercer tubo agregar 10 ml de albmina y luego gota a gota aadir 5 ml de alcohol de 96.Observar los resultados.

Resultados En el primer experimento con HNO3 al poner ambos tubos en bao mara, se observa como la albmina se precipita solidificndose casi completamente y se torna color blanco amarillento, mientras que en el caso de la leche se observa un precipitado leve amarillento.

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Albmina con HNO3

Leche con HNO3

Albmina con alcohol

Al agregar alcohol a la albmina, se observan estructuras blanquecinas que semejan fibras de algodn en la superficie de la solucin. C) REACCIN BIURET (Reaccin coloreada) Fundamento El Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de protenas, pptidos cortos y otros compuestos con dos o ms enlaces peptdicos en sustancias de composicin desconocida. Cuando una protena se pone en contacto con un alcali concentrado se forma este complejo denominado Biuret cuya frmula es NH2-C-N-C-NH2 que en contacto con una solucin de sulfato cprico diluida produce un color violeta caracterstico.

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Tcnica

Colocar en un tubo de ensayo 3 ml de albmina (clara de huevo) Aadir 2 ml de solucin de Na (OH) al 20%, y a continuacin 4-5 gotas

de solucin de SO4Cu al 1%.

Agitar para que se mezcle bien y observar los resultados. Al agregar la solucin cprica se observar una coloracin lila

(protenas) y celeste en forma de anillo en la superficie. La reaccin es la siguiente: Protena + alkali NH2 C-N-C- NH2 + SO4 Cu Resultados: Al colocar la clara de huevo en un tubo de ensayo y aadirle la solucin de SO4Cu al 1% de color azul turquesa, se observ un color azul fuerte. Luego al aadirle a esta mezcla el Na (OH) al 20%, se vuelve la disolucin de un color azul ms claro. Luego de agitarlo se puede observar que la mezcla se torna color violeta, lo que nos indica que efectivamente hay presencia de protenas gracias a la reaccin del Biuret, por la coordinacin del Cu en medio alcalino, con los enlaces peptdicos de las protenas de la clara del huevo.

Albmina con reactivo de Biuret

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D) REACCIN DE LOS AMINOCIDOS AZUFRADOS Fundamento Se pone de manifiesto por la formacin de un precipitado negruzco de sulfuro de plomo. Esta reaccin se basa en la separacin mediante un alcali, del azufre de los aminocidos, el cual al reaccionar con una solucin de acetato de plomo, forma el sulfuro de plomo. Tcnica Poner en un tubo de ensayo de 2 a 3 cc. de solucin muestra (gelatina diluida). Aadir 2 cc. de solucin de Na (OH) al 20%. Aadir 10 gotas de solucin de acetato de plomo al 5%. Calentar el tubo cuidadosamente hasta ebullicin. Si se forma un precipitado color negruzco nos indica que se ha formado sulfuro de plomo utilizndose el azufre de los aminocidos, lo que nos sirve para identificar protenas que tienen en su composicin aminocidos con azufre. Resultados Apenas se form un anillo pequeo color negruzco en la superficie de la solucin con gelatina lo que nos indica una presencia mnima de aminocidos azufrados en esta sustancia. Por tanto, en este caso el resultado de la reaccin es negativo, y esto muestra que en la gelatina comercial de postre carece de protenas que tienen aminocidos con azufre.

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Gelatina con anillo gris en la superficie

DISCUSIN Esta prctica fue muy interesante ya que permiti observar prcticamente a los componentes proteicos de algunos alimentos y conocer las distintas reacciones que se generan al aadir determinadas sustancias a stos, como el cido ntrico, o el hidrxido de sodio en la reaccin xantoproteica. La aplicacin prctica fue diferenciar a las

protenas de los alimentos de los dems componentes que existen en ellos, es por eso que se utiliz alimentos con alto contenido proteico para una mejor visualizacin de las protenas.

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V. CONCLUSIONES

En las prcticas realizadas en el Instituto de Biotecnologa e Ingeniera Gentica de la UNCP se realizaron actividades relacionadas con

investigaciones genticas y cientficas las cuales permitieron aplicar las teoras aprendidas en estas reas. Las prcticas llevadas a cabo en el IBIG incluyeron extraccin de DNA, preparacin de medios de cultivo para microorganismos, determinacin de bacterias coliformes fecales totales en agua potable, protenas, entre otras. reconocimiento de

En cada una de las prcticas se desarrollaron habilidades en el manejo de instrumentos de laboratorio, as como tambin se aprendieron tcnicas de experimentacin e investigacin. En la prctica de determinacin de bacterias coliformes fecales totales en el agua potable de la UNCP se aprendi un mtodo sencillo de anlisis de agua y ello motiv a realizar mayores investigaciones relacionadas al tema.

En la prctica de reconocimiento de protenas se observaron algunas de las propiedades de las protenas tanto fsicas como fisicoqumicas, as como tambin las reacciones especficas para cada aminocido que las constituye. Las actividades realizadas dentro y fuera del laboratorio ayudaron al practicante a afianzar los conocimientos adquiridos en gentica y biotecnologa en la universidad.

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VI. RECOMENDACIONES

Se recomienda a los alumnos de Agronoma realizar prcticas en el Instituto de Biotecnologa e Ingeniera Gentica de la UNCP ya que es importante tener una visin integral de la carrera para llegar a ser mejores profesionales. La UNCP debiera destinar un mayor presupuesto al IBIG ya que es fundamental ampliar el laboratorio e implementarlo con el material necesario para poder recibir mayor cantidad de alumnos de todas las carreras.

Los estudiantes de la Facultad de Agronoma deberan tener mayor y mejor preparacin en reas de la gentica y biotecnologa, para ser competitivos en la ciencia y en la empresa. Se recomienda a la facultad de Agronoma de la UNCP crear la ctedra de Biotecnologa Agraria para actualizar cientficamente la carrera de Agronoma en la Regin Central.

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VII. BIBLIOGRAFA BEREZOV T.T, Korovkin B.F: Chemistry of Proteins. En Biochemistry, 1 ED. Mir Publishers Moscow Mosc, Rusia, 1992. pp. 19 64 CARLSON, S. (1998). Deshilando el tejido de la vida. Investigacin y Ciencia. 266, 8485 LEHNINGER, A. L. Principios de bioqumica. Barcelona: Ed. Omega, 2 ed., 1993. GONZLEZ DE BUITRAGO JM, Arilla E, Rodrguez-Segade M, Snchez A: Alteraciones de la digestin de protenas y de la absorcin y metabolismo de losaminocidos. Bioqumica Clnica, 1 ED.McGraw-Hill Interamericana, Madrid, Espaa, 1998.181190. MURRAY, Robert K. MAYES, Peter A. GRANNER, Daryl K. Bioqumica de Harper.13 edicin. Ed. el manual moderno. Mxico. DF. 1993. Pg. 19-20 Recuento de bacterias, Proyecto Prcticas online de microbiologa para farmacuticos, Universidad de Granada, 2010 en:

http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/recuento-de-bacteriasviables/recuento-text http://www.oas.org/dsd/publications/classifications/Armoniz.EstandaresAguaPot able.pdf http://www.ipb.csic.es/servicios/Microscopia/uploads/3/6/2/2/3622788/microscop ia_a_grandes_rasgos.pdf

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VIII. ANEXOS

Equipo del IBIG

DETERMINACIN DE BACTERIAS COLIFORMES TOTALES EN AGUA POTABLE DE LA UNCP

Placas esterilizndose en estufa

Muestras de agua potable

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Medio de cultivo dispensndose en placas Petri

Cmara de flujo laminar

Diluciones de agua muestreada

Dilucin de agua aadida al medio de cultivo

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RECONOCIMIENTO DE PROTENAS

Grupo trabajando en laboratorio

Muestra de clara de huevo

Reaccin xantoproteica de albmina

Reacciones de protenas

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