CLONACIN

UNIVERSIDAD NACIONAL DE CORDOBA FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS MATERIA: BIOTECNOLOGA DEPARTAMENTO: QUMICA BIOLGICA AO: 2006 Autores: Maria Fernanda Maurino Leila del Valle Joaquin Esteban Mercol Echeverra

INTRODUCCIN

El trmino clon, es utilizado desde su introduccin, hace ya ms de un siglo, para referirse a cualquier proceso que genera organismo genticamente idnticos. La palabra clon proviene del griego Klon que significa retoo, y se aplicaba originalmente a una de las formas de propagacin de las plantas. En este sentido es una forma de reproduccin asexual, en la cual no intervienen los gametos. La clonacin bajo esta acepcin es comn en la naturaleza, las bacterias, plantas, amebas y levaduras pueden o de hecho se reproducen de esta manera. Sin embargo la acepcin de la palabra clon ha variado con el correr de los aos y esto ha generado bastante confusin; hoy podemos clonar molculas, genes, clulas, organismos multicelulares y hasta computadoras y telfonos celulares. Podemos decir que en su sentido mas amplio clonar significa hacer copias idnticas de algo sea este algo lo que sea. La presente monografa pretende hacer referencia a la clonacin en un sentido restringido, refirindose a la clonacin de organismos multicelulares y haciendo nfasis en la clonacin de mamferos dadas las consecuencias mdicas, cientficas, econmicas y ticas de esta tcnica. Para ello trabajaremos los antecedentes histricos que llevaron a la clonacin de los primeros organismos multicelulares culminando con la investigacin que Willmut y su equipo de colaboradores desarrollaron en el instituto Roslin de Escocia en el ao 1997, para finalmente analizar las posibles consecuencias ticas, sociales y econmicas de esta tcnica.

ANTECEDENTES La biologa clsica ensea que tanto en los mamferos, como en otras especies (sean vertebrados, invertebrados, plantas u hongos) la expansin del numero de individuos de una especie se realiza por medio de la reproduccin sexual, en la que un nuevo individuo se forma por la unin de dos clulas llamadas gametos, cada una de las cuales aporta aproximadamente la mitad de la informacin necesaria para construir un nuevo individuo. Es conveniente sin embargo tener presente que en la reproduccin sexual no solo se combinan dos genomas haploides, sino tambin grandes segmentos de informacin gentica que no se encuentra codificada en el ncleo, tales como los genes mitocondriales, o cloroplsticos en el caso de las plantas, as como formas activas de ARN capaces de regular informacin heredable que reside en los cromosomas pero al margen de las secuencias de ADN que reconocemos como genoma . Por el contrario la clonacin en su sentido ms estricto, es la replicacin de individuos a partir de un nico genoma. Es decir, la anttesis de la reproduccin sexual.

Clonacin natural La clonacin en su sentido mas estricto ocurre de manera natural en procariotas, quienes se reproducen simplemente duplicando su material gentico y luego separando este material gentico duplicado en dos clulas hijas; muchos eucariotas son capaces tambin de esta forma de reproduccin, de hecho muchas levaduras tienen como principal forma de replicacin a la mitosis (asexual) y solo ocasionalmente recurren a la combinacin de sus genomas haploides por medio de clulas especificas (gametos). Muchas plantas son capaces tambin de esta forma de replicacin, como casos mas conocidos los famosos piecitos de rosas que nuestras queridas madres de seguro han compartido con sus vecinas, o los cultivos de papas, o como caso extremo los lamos de la peatonal que deben su extica belleza a ser todos clones de un nico mutante estril.

Mattick, J. S. Challengin the Dogma: The Hidden Layer of Non-Protein-Coding RNAs in Complex Organisms. BioEssays, Octubre 2003, Vol. 25, pp 930-39

DIFERENCIACION CELULAR

Clonacin natural Vs. Clonacin artificial Durante el desarrollo de un organismo multicelular ocurren eventos muy importantes que le permiten a una nica clula surgida de la unin de dos gametos ( el cigoto fecundado), y luego de numerosas divisiones, asumir todas las funciones necesarias para sustentar a un organismo complejo. A lo largo de estas divisiones pequeos grupos de clulas van asumiendo algunas propiedades que les permiten diferenciarse de sus compaeras, adquiriendo caractersticas fisiolgicas y morfolgicas que difieren progresivamente de las clulas originales. Esta progresiva diferenciacin es la que permite que una nica clula, el cigoto fecundado, engendre una variedad de clulas tan dismiles como un glbulo rojo, una neurona o una clula muscular. Sin embargo esta diferenciacin implica que la lnea celular que va evolucionando a un tejido especfico tiene que ser capaz de recordar en todo momento, e incluso mientras se est dividiendo, a que tipo celular pertenece, y ah esta el quid de la cuestin. El cigoto fecundado comnmente recibe el nombre de clula totipotencial, porque potencialmente puede diferenciarse a todos los tipos celulares que forman el individuo, sin embargo a medida que va progresando por el camino de la diferenciacin, va perdiendo esta totipotencialidad, convirtindose primero en clulas pluripotenciales comprometidas a un linaje particular (por Ej. Capaces de generar diferentes tipos de tejido conectivo, pero no epitelial), para finalmente acabar en clulas totalmente diferenciadas incapaces de generar otro tipo celular que no sea el propio. En los organismos pluricelulares capaces de reproducirse por va asexual existen mecanismos que le permiten a una clula diferenciada, abandonar este estado y reprogramarse a un estado indiferenciado totipotencial. Las clulas vegetales e incluso las de algunos invertebrados como las estrellas de mar son capaces de esta proeza, sin embargo las clulas de los vertebrados carecen de este mecanismo; la serie de eventos que llevan a la diferenciacin van activando en cada lnea celular una serie de interruptores moleculares (todava no esclarecidos en su totalidad), que aparentemente son imposibles de desactivar. Es decir, una clula diferenciada normal no solo recuerda su estado diferenciado, sino que le resulta imposible olvidarlo. Esto significa que si extraemos una nica clula de un tejido particular de un vertebrado, y la inducimos a reproducirse cultivndola en un medio adecuado, nunca obtendramos a partir de ella un organismo completo; sino a lo sumo una gran cantidad de clulas de ese tejido en particular, y a veces ni siquiera eso como ocurrira con clulas de tejidos que no se dividen, tales como msculo o tejido neuronal. El gran reto de la clonacin de vertebrados se encuentra entonces en descubrir los mecanismos que permitan desactivar estos interruptores moleculares y reprogramar a una clula candidato para asumir un estado totipotencial.

ANTECEDENTES EXPERIMENTALES La escisin gemelar Algunos investigadores consideran que los primeros experimentos de clonacin en animales iniciaron en la dcada de 1930, con la produccin de gemelos inducidos experimentalmente al separar las clulas de un cigoto temprano, antes de el estadio de 8 clulas; los anfibios fueron los primeros vertebrados seleccionados por los investigadores, ya que por su fecundacin externa y desarrollo temprano en el agua, son especialmente adecuados para el estudio embrionario temprano. Los primeros experimentos con huevos fecundados de salamandra fueron realizados por el zologo alemn Hans Spemann en 1938, en el experimento el zologo at un pelo muy fino alrededor de un huevo recin fecundado de salamandra, creando un lbulo de citoplasma a un lado. Cuando el huevo alcanzo en estadio de 8 clulas afloj el lazo y permiti que un ncleo pasara hacia el lbulo de citoplasma. Desde all el ncleo escindido fue capaz de dirigir la formacin de un individuo completo.

El experimento de Spemann fue diseado para demostrar que los ncleos de las clulas de una mrula (embrin de unas pocas clulas), mantienen la capacidad de dirigir la formacin de un individuo completo, concluyendo que hasta el estadio de 8 clulas los ncleos son totipotenciales. En etapas posteriores del desarrollo embrionario las clulas comienzan a diferenciarse y pierden la totipotencialidad. Al proceso de obtencin experimental de gemelos se lo conoce tambin como escisin gemelar. La escisin gemelar se utiliza actualmente en ganadera para incrementar el nmero de individuos obtenidos a partir de un cruce parental seleccionado.

Finalmente e n 1993 Jerry Hall y su grupo de colaboradores presentaron evidencias de escisin gemelar en humanos. Para ello utilizaron embriones humanos triploides (que normalmente no son viables) obtenidos de clnicas de fertilizacin asistida. Los embriones fueron tomados en etapas de desarrollo de entre 2 y 8 clulas. De los resultados de estos experimentos concluyeron que cuanto mas temprano se tome al embrin en su desarrollo, ms factible es que las clulas que lo componen manifiesten su totipotencialidad.
Mrula humana de aprox. 10 clulas

En la presente monografa no vamos a considerar a la escisin gemelar como clonacin en el sentido estricto de la palabra, ya que, si bien permite obtener organismos genticamente idnticos; no permite hacer copias de individuos adultos.

Clonacin Vegetal A mediados de la dcada de 1980, una serie de trabajos demostraron que podan reproducirse en laboratorio cultivos de clulas vegetales individuales, para crear luego un grupo de plantas genticamente iguales, es decir, un clon. Por este mtodo la clula vegetal puede extraerse de cualquier parte de la planta adulta, aunque se utilizan preferentemente las clulas de meristemas, es decir la parte en crecimiento de un brote. Principalmente para evitar la contaminacin por virus. La clula o los grupos de clulas se cultivan en medios slidos o semislidos ricos en nutrientes, donde forman una masa celular Investigador cultivando clulas vegetales de crecimiento desordenado, casi tumoral, llamada callo. Tratando a este callo con citoquinas vegetales especficas, puede ordenarse su crecimiento e inducir la formacin de races y brotes. Las plntulas obtenidas son luego transplantadas al suelo donde crecern hasta formar un individuo adulto. La clonacin vegetal es actualmente una prctica de rutina en numerosas aplicaciones biotecnolgicas, aunque la mayor utilidad de la tcnica no es para obtener plantas genticamente idnticas, sino para obtener plantas a partir de clulas nicas que han sido genticamente mejoradas Clonacin de Anfibios En 1952 Robert W. Briggs y Thomas J. King describieron un mtodo para obtener individuos genticamente iguales en Rana pipiens; este mtodo consiste en eliminar el ncleo de un vulo sin fecundar y sustituirlo con otro ncleo diploide procedente de una blstula. De esta manera se inicia el proceso de divisin del cigoto fecundado, pasando por los diferentes estadios del desarrollo embrionario, es decir, mrula, blstula, gstrula, nrula, etc. estos investigadores experimentaron tambin con la transferencia de ncleos de blstulas tardas, observando que muy pocos de los embriones obtenidos alcanzaban la etapa de renacuajo. En 1954, Briggs y King transfirieron ncleos de gstrula tarda en vulos a los que se les haba eliminado el ncleo, observando que solo un 9 % de los vulos se dividi hasta alcanzar la etapa de nrula, pero no formaron renacuajos. Estos investigadores tambin transfirieron ncleos de nrulas y de yemas caudadas. Por sus experimentos se considera a Briggs y King como los iniciadores de la tcnica de clonacin de organismos en la acepcin moderna de la palabra.

Los Experimentos de Gurdon En 1958 Gurdon y su grupo experimentaron con la rana sudafricana Xenopus laevis, logrando obtener, con el transplante nuclear a partir de embriones, ranas adultas. En 1960 el mismo equipo logro obtener, con el transplante nuclear a partir de clulas de embriones en el estadio de yema caudada; renacuajos pero no ranas adultas En 1966 Gurdon logr obtener ranas adultas clonadas de clulas de intestino de renacuajo, demostrando que una clula puede especializarse y an permanecer totipotente. En 1975 este investigador, utilizando la tcnica de clonacin por transferencia de ncleos, a partir de clulas obtenidas de las membranas interdigitales de patas de ranas adultas, logro obtener renacuajos que no lograron sobrevivir hasta la etapa adulta.

CLONACION DE MAMFEROS

Antecedentes pre-Dolly En 1983 J. McGrath y D. Solter obtienen embriones viables de ratn (Mus musculus) por transferencia nuclear utilizando clulas embrionarias como dadoras de ncleo y aplicando una tcnica de fusin por virus Sendai para inducir la unin del vulo enucleado con la clula donora. En 1986 S. M. Willadsen reporta haber obtenido embriones viables de oveja, utilizando como donoras de ncleo a clulas provenientes de blstulas de entre 8 y 16 clulas y como aceptores vulos enucleados, utilizando la tcnica de microciruga para retirar el ncleo del vulo y posterior fusin con la clula donora por virus Sendai. Hasta el momento todos los intentos por clonar mamferos ms grandes que un ratn haban fracasado En 1994 M. Sims y N. L. First presentan evidencias de haber obtenido clones de vacas utilizando como donoras de ncleo a clulas de la masa interna de clulas de una blstula tarda de 9-10 das, mantenidas en cultivo en un medio especial, y fusionando estas clulas con vulos enucleados utilizando polietilenglicol como inductor de la fusin, cultivando luego los huevos fecundados e implantndolos en una madre sustituta. De un total de 659 vulos enucleados tratados por medio de esta tcnica obtuvieron 460 fusiones, y de ellos solo 109 evolucionaron hasta el estadio de blastocitos. 34 de los blastocitos obtenidos fueron implantados en madres sustitutas obteniendo 13 vacas preadas y solo 4 nacimientos de animales normales.
Representacin de una blstula mostrando las clulas de la capa externa que formaran la placenta en naranja y las clulas de la masa interna que formaran el feto en azul

En 1996 O. Y. Kwon y T. Kono presentan un trabajo de investigacin sobre la clonacin de ratones en el que afirman haber obtenido un sexteto de cras genticamente idnticas a partir de un mtodo novedoso que utiliza clulas embrionarias. Los investigadores fusionaron un vulo enucleado con 4 clulas embrionarias, obteniendo un vulo fertilizado con dos ncleos tetrapliodes en un primer paso, luego transfiriendo estos ncleos anormales a sendos vulos enucleados y obligando a estos embriones a recuperar una ploida normal por tratamiento con citocalasina B (un inhibidor del huso mittico). Obteniendo por lo tanto el doble de embriones que en una transferencia nuclear comn. El mtodo depende de una correcta sincronizacin ya que las clulas donantes deben encontrarse en metafase del ciclo celular.

Tambin en 1996 se escucha hablar por primera vez de Wilmut, ya que un equipo formado por K. H. Campbell, J. McWhir, W. A. Ritchie e I. Wilmut trabajando en el instituto Roslin de Escocia, presentan evidencia de haber obtenido por primera vez en la historia clones de ovejas, por transferencia nuclear a partir de clulas diferenciadas, y no ya de clulas de embriones tempranos toti o pluripotentes, las clulas donoras se obtuvieron a partir de fetos de oveja y fueron mantenidas en cultivo llevndolas a un estado quiescente por una paulatina reduccin en la concentracin de nutrientes en el medio de cultivo, la evidencia presentada hace sospechar que la induccin del estado de quiescencia en la clula donora causa modificaciones en la estructura de la cromatina nuclear, que facilita la reprogramacin y permite el desarrollo normal del embrin. El grupo concluye que el desarrollo de embriones depende de las interacciones entre el ncleo donor y el citoplasma aceptor, especficamente de una baja actividad MPF (Factor Promotor de Mitosis/Meiosis/Maduracin) en el citoplasma aceptor, lo que corresponde a una metafase II de oocito, y a la correcta sincronizacin con el ncleo G0 donor .

El Doctor Ian Wilmut posando a contraluz con un tubo de centrfuga

DOLLY

Dolly Wilmut su equipo de colaboradores fueron los primeros en reportar la clonacin de un mamfero a partir del ncleo de una clula adulta. Este grupo de investigadores logro obtener el nacimiento de una oveja de raza Finn Dorset, derivada del ncleo de una clula de glndula mamaria de una oveja de 6 aos. 6LL3 (etiqueta de identificacin que llevo durante el experimento) o simplemente Dolly, como se la bautiz cariosamente, naci con un peso de 6kg 600g de una oveja Scottish Blackface que fue su madre sustituta durante los 148 das que duro su gestacin. Y una pregunta se hace obligada: por qu pasaron 31 aos desde que Gurdon clon Xenopus, hasta el nacimiento de Dolly, si por ese entonces la clonacin de mamferos pareca evidente? La clave para responder a esta pregunta es que era necesario encontrar un mtodo que permitiera inducir, o retornarle, a una clula diferenciada su condicin totipotencial. Wilmut y su equipo dieron con la clave. La clonacin de Dolly El mtodo utiliz como donador del material gentico a las clulas de la ubre de una oveja adulta, las cuales se colocaron en un medio de cultivo especial al cual, paulatinamente se le fue disminuyendo la concentracin de protenas nutritivas. Esto provoc que las clulas explantadas Salieran del ciclo de replicacin y entraran en un estado de quiescencia, es decir se detuvieran en la fase G0, fuera del ciclo celular. Por otro lado se extrajo el ncleo de un ovulo obtenido a partir de otra oveja donadora. A continuacin se extrajo una de las clulas donadoras de ncleo del cultivo y con una micro pipeta fue puesta en contacto estrecho con el oocito enucleado. A continuacin se aplic una pequea descarga elctrica, lo que indujo la fusin de las membranas del oocito aceptor y de la clula donadora, la descarga simula adems la entrada de un espermatozoide. La descarga provoca la

10

despolarizacin de la membrana del oocito, lo que causa apertura de canales de calcio dependientes de voltaje. La entrada de Ca++ activa el mecanismo de replicacin celular, con lo cual se inicia el proceso de desarrollo embrionario normal. En forma natural esta despolarizacin inicial es causada por la ruptura de membrana que provoca el espermatozoide con su entrada. Finalmente, el huevo fecundado fue implantado en el tero de una tercer oveja que hizo las veces de madre sustituta. Tcnica de transferencia nuclear Por estimulacin hormonal puede inducirse la maduracin y liberacin de vulos en hembras de numerosas especies (se utiliza la hormona gonadotrfico estimulante GnRH), estos vulos pueden ser recogidos por laparoscopia (haciendo una puncin en el abdomen), o por va transvaginal; lavando el oviducto con una solucin especifica y recogiendo el liquido con el vulo en suspensin. Ambas tcnicas se apoyan en la ultrasonografa para detectar la liberacin y ubicar el, o los vulos producidos. El vulo obtenido tiene un ncleo haploide y citoplasma, pero el ncleo debe ser retirado, para reemplazarlo con el ncleo de la clula donadora. Bajo visin microscpica el vulo es perforado con una micro pipeta, especialmente diseada, que hace la succin del material nuclear; queda as un oocito vaco, sin material cromosmico. Por otro lado, de otro animal que llamaremos sujeto donante, se obtienen clulas de un tejido para ser cultivadas in Vitro. Dentro de ese cultivo se selecciona una clula en fase de reposo (G0), la cual con ayuda de una micro pipeta es puesta en contacto con el oocito vaciado, induciendo la fusin de ambas membranas. Se tiene as un huevo fertilizado con el material nuclear de la clula donante. L La experiencia acumulada demostr que este ovulo fecundado requera adems una estimulacin elctrica: el sperm effect para iniciar su desarrollo normal. A diferencia de un cigoto que posee el 50 % de material gentico de origen materno y 50 % de origen paterno, este proceso crea un producto que posee 100 % del material gentico del organismo donante; a esta nueva entidad biolgica Advanced Cell Technology, un laboratorio lder en este campo, la ha denominado OVUMSUM. Este es el famoso clon que ha despertado tanto inters y discusin en los ltimos tiempos.

11

La Tcnica de Wilmut (detalle) Se obtuvieron clulas de la glndula mamaria de una oveja Finn Dorset en el ltimo trimestre de preez; Mientras que por otro lado los oocitos fueron recuperados de ovejas Scottish Blackface luego de 28 a 33 horas de la inyeccin de Ngr., y fueron enucleados tan rpidamente como fue posible. Estos oocitos fueron recogidos en un medio PBS libre de calcio y magnesio y conteniendo 1 % de FCS; y posteriormente fueron transferidos a un medio M2 libre de calcio y conteniendo 10 % FCS a 37 C. Las clulas donoras del ncleo en estado quiescente fueron obtenidas reduciendo paulatinamente la concentracin de suero nutritivo en el medio de cultivo de 10 % a 0,5 % a lo largo de 5 das. Esto caus que las clulas salieran del ciclo de proliferacin y se arrestaran en fase G0. la confirmacin de que estas clulas abandonaron el ciclo de replicacin se realiz por marcacin con un anticuerpo anti PCNA/CICLINA (protenas implicadas en la replicacin celular), revelado con un segundo anticuerpo conjugado con rodamina. La fusin de la clula donora con el oocito enucleado fue inducida con un pulso elctrico entre 34 y 36 hs. Despus de la inyeccin de GnRH. En la oveja donora del oocito. Las mayora de los embriones reconstituidos fueron cultivados en oviductos ligados de oveja (como ocurri con Dolly), pero algunos fueron cultivados en un medio qumico definido. La mayor parte de los embriones se desarrollaron hasta la etapa de mrula o blastocisto dentro de los 6 das, momento en el que fueron transferidos a su oveja recipiente, donde se les permiti desarrollarse a trmino. Uno, dos o tres embriones; dependiendo de su viabilidad fueron transferidos a cada oveja recipiente. En los casos en que se obtuvieron un gran numero de embriones viables, se seleccionaron aquellos de mejor morfologa. Se utiliz ultrasonografa para diagnosticar preez, y para monitorear el desarrollo fetal en intervalos de dos semanas. Finalmente las ovejas nacieron por cesrea veterinaria cuando los animales presentaron los primeros sntomas de trabajo de parto. La identidad gentica de las ovejas obtenidas fue confirmada por medio de anlisis de ADN microsatlite, utilizando para ello marcadores ovinos especficos, y comparando los resultados con los de las ovejas donadoras del vulo y del ncleo.

12

Discusin El xito de Wilmut y su equipo de colaboradores del Instituto Roslin, se basa en la perfecta sincronizacin entre los ciclos celulares de las clulas donadora del ncleo y del vulo receptor. Ya que al ponerlas en un medio de cultivo mnimo, para inducirlas a un estado de quiescencia, se logro que el ncleo de una clula diferenciada, recuperara la capacidad de interactuar con el citoplasma del vulo y fuera capaz de dirigir la formacin de un organismo completo. El mtodo de clonacin de la oveja Dolly, demostr que las diferenciacin celular que ocurre al formarse los diversos tejidos, durante el desarrollo embrionario; no implica cambios irreversibles en el ADN (como algunas corrientes de pensamiento sostenan), ya que al inducir a una clula adulta al estado quiescente, recupera la condicin de totipotencial, reprogramando la maquinaria molecular de la clula, y ponindola en condiciones de iniciar y completar el desarrollo embrionario. Se ha especulado mucho acerca de las posibles aplicaciones y beneficios de la tcnica de clonacin a partir de clulas somticas, as como de sus posibles consecuencias nefastas. En ganadera por ejemplo, a pesar de los enormes beneficios potenciales, tendra importantes repercusiones ecolgicas y evolutivas, ya que paulatinamente los organismos clonados, iran perdiendo diversidad gentica, y esto podra ser muy grave por ejemplo si surgiera alguna enfermedad a la que los clones fueran especialmente susceptibles. Se ha propuesto tambin a la clonacin como un medio de salvataje para animales en serio peligro de extincin, y un tanto fantasiosamente incluso como un medio de recuperar animales ya extintos. O, como se hace con vegetales, para obtener animales genticamente modificados. Las perspectivas de aplicacin son enormes y muy variadas, sin embargo lo que ha causado mayor impacto y polmica en el mbito cientfico y en la poblacin en general, es la posibilidad cierta de clonar seres humanos (desde el momento en que se trata de un mamfero), manipularlo y propagarlo a gusto y placer del investigador de turno.

13

CLONACION HUMANA

Bebs de probeta La historia comienza en 1978, cuando Patric Steptoe, un gineclogo del Hospital General de Oldham, y Robert Edwards, un fisilogo de la Universidad de Cambridge; luego de muchos ensayos iniciados en 1966, sobre los que dieron solo ocasional informacin; anunciaron haber logrado la fertilizacin in vitro, seguida de la implantacin in tero, el desarrollo normal del embrin y por fin el nacimiento a travs de cesrea de Louise Joy Brown, la primer beb de probeta. Esta informacin conmovi al mundo cientfico y al publico en general, si ellos y su grupo de investigadores hubieran iniciado sus investigaciones comunicando sus objetivos, sus fallas iniciales y xitos parciales, es posible que la polmica y debate suscitados hubieran retrasado, imposible saber por cuanto tiempo, la aplicacin de la fertilizacin in vitro. Hoy ya nadie discute la aplicacin de la tecnologa de la fertilizacin in vitro, y son centenas de miles las familias beneficiadas. Para cuando Louise Joy Brown cumpli 18 aos ya haban nacido ms de 300.000 bebs de probeta.

Clulas Estaminales, Stem Cells o Clulas Madre Por qu es de tanto inters para nuestra exposicin el tema de los bebs de probeta? El asunto descansa en el hecho de que para lograr un embarazo por medio te la tcnica in vitro, es necesario fertilizar muchos vulos (en general de 4 a 6), ya que slo algunos embrionan, y de estos embriones, solo algunos son viables. Es por ello que en las clnicas de fertilidad, para cada caso en particular, se hacen mltiples fertilizaciones de las cuales solo se llegan a utilizar un pequeo nmero de ellas. De esto resulta que, finalmente, quedan vulos fertilizados que se desechan. La disponibilidad de vulos fertilizados estimul a los investigadores a intentar el cultivo de clulas embrionarias humanas. Para tener una idea del material existente baste sealar que segn un informe del ao 2002, slo en una clnica de fertilidad de la India se desechan ms de 1000 embriones al ao .

DESPERTAD! Watchover Bible

and Tract Society Of New York, inc. Col. Heigts Brooklyn, N. Y., 11201-2483. Nov. 22, 2002

14

El embrin en estado de blastocisto es una bolsa hueca cuyo dimetro no es mayor que el de una pestaa. Este blastocisto tiene una estructura o capa de clulas externa y una zona interna engrosada, denominada masa de clulas interna. La envoltura o capa de clulas externas es la que, producida la implantacin, dar lugar a la placenta, fundamental para nutrir al embrin, y por lo tanto, para que pueda constituirse el nuevo ser; la masa celular interna es la que formara al feto. Experimentos realizados en animales menores han demostrado que al colocar al blastocisto en una placa de petri, la envoltura o capa externa se colapsa y, eventualmente, desaparece, quedando solo la masa de clulas internas. Esta masa de clulas de ser implantada in tero es incapaz de generar un nuevo ser, estas clulas reciben el nombre de Clulas Estaminales, Troncales o Stem Cells. Ingeniera de Tejidos y rganos Se ha comprobado que la masa de clulas internas prolifera en lacas de cultivo por largos periodos de tiempo, manteniendo su condicin de clulas pluripotenciales. Estas clulas son capaces de reaccionar fisiolgicamente y pueden dar lugar a todos los tipos de tejido existentes en el embrin. En 1998 James A. Thompson y su equipo de colaboradores de la Universidad de Wisconsin lograron finalmente producir un cultivo derivado de clulas de un blastocisto humano. Desde entonces se puede cultivar una masa de clulas que tiene todos los atributos de las clulas embrionarias, excepto la capacidad de formar placenta. Tener en laboratorio por tiempos indefinidos cultivos de Clulas Embrionarias Troncales Pluripotentes Humanas constituye un asunto que origina gran expectativa por la trascendencia que puede tener para el futuro de la medicina Algunos procesos patolgicos (como el infarto de miocardio, la enfermedad de Parkinson, el Alzheimer, la diabetes tipo 1,...) son ocasionados por la degeneracin, disfuncin o muerte (aguda o crnica) de determinados tipos de clulas (miocardiocitos en el caso del infarto de corazn; neuronas dopaminrgicas en el caso de la enfermedad de Parkinson, clulas Beta del pncreas productoras de insulina en el caso de la diabetes mellitus tipo 1,...). La medicina reparadora tiene por objetivo regenerar estas clulas, de modo que se recupere la funcin del tejido u rgano pertinente. Para lograrlo, es preciso practicar microtransplantes de clulas que, de un modo similar al transplante de un rgano entero (hgado, corazn, rin,...) podran suplantar la funcin de las clulas alteradas. La mayor dificultad tcnica de la medicina reparadora viene dada por la obtencin de los tipos celulares deseados. ste es tambin el punto que plantea mayores dilemas y discusiones, tanto en la comunidad cientfica como entre la poblacin en general.

15

Esto parecera un contrasentido debido a que las clulas embrionarias indiferenciadas con estmulos especficos apropiados: Factores de crecimiento, citoquinas, etc. (que cada vez se descubren y definen con mayor precisin) pueden ser inducidas a diferenciarse en tejidos especficos. El problema es tico y se plantea a partir del momento de tratar de definir cul ser el donante de tales clulas, la dificultad tecnolgica esta a un pequeo paso de ser superada. En la medida en que se conozcan mejor los factores que determinan la diferenciacin celular especifica, se estar en condiciones de producir clulas y tejidos para utilizarlos en la terapia medica, la idea de reparar rganos o incluso construirlos de novo, ya no parece asunto de ciencia ficcin es mas ya se han comenzado a patentar procedimientos de formacin de clulas o tejidos aptos para corregir diversas condiciones patolgicas y es por eso que ya se habla de ingeniera de tejidos y rganos.

Un listado publicado por la revista Science en enero de 2000 sealaba a las primeras 11 compaas de Estados Unidos, Reino Unido y Australia constituidas para promover la produccin y aplicacin industrial de clulas embrionarias troncales humanas, la rapidez de aparicin de estas compaas puede dar una idea del inters econmico subyacente.

Fusin de la tecnologa de clonacin y Clulas Stem El problema con el cultivo de clulas troncales humanas es que no escapan al problema bsico derivado de la individualidad biolgica codificada en el ADN. Cada lnea de clulas troncales tiene la especificidad gentica del embrin de donde provino, por lo que expresan en su superficie los factores de reconocimiento celular propios de ese individuo, entre ellos los complejos de histocompatibilidad. En otras palabras, los pacientes tratados con estas clulas, son receptores de un transplante de clulas

16

extraas, por lo que deben ser sometidos a tratamientos inmunosupresores para evitar las reacciones de rechazo del organismo aceptor. La nica manera de evitar estas reacciones de rechazo es que las clulas troncales reemplazantes sean derivadas del propio organismo receptor, y esto por el momento slo puede conseguirse por medio de la clonacin. Aqu es donde se unen ambas tecnologas; solo as se garantiza un transplante o reemplazo tisular sin la limitacin de un rechazo inmunolgico Actualmente son centenares de miles los pacientes a la espera de la factibilidad de estos tratamientos

Perspectivas en Clonacin Humana Desde el experimento de Dolly en 1997 se ha hablado mucho de intentos y supuestos logros en clonacin de seres humanos, sin embargo por su carcter clandestino, son ajenos a todo anlisis crtico serio, concretando: En el ao 2001 Advanced Cell Technology inform que despus de mltiples intentos, haban logrado el desarrollo de un embrin humano por clonacin, utilizando para ello la tecnologa de transferencia nuclear. La clula donante del ncleo provino del mismo cmulo que rodea al vulo, y el embrin se desarroll hasta constituir una masa de 6 clulas. En abril del 2003, en la revista Science, se publicaron una serie de experimentos cuyos resultados se interpretaron como un serio revs a las crecientes expectativas de lograr, por medio de la transferencia nuclear, la clonacin de seres humanos con fines teraputicos. El Dr. Gerald Schatten, de la Universidad de Pittsburg, experimentando con el mono Rhesus, y utilizando 716 oocitos en 4 grupos experimentales, por medio de la tcnica de transferencia nuclear a partir de clulas adultas; no consigui ni una sola gestacin de 33 embriones implantados in tero. A pesar de que en muchos de ellos se inici la divisin, pronto se observaron diversas fallas a nivel molecular en las etapas de mitosis, que finalmente dieron lugar a embriones aneupliodes y con otras anomalas cromosomales.

17

Todo indica que al remover el ncleo del vulo para obtener el llamado vulo vaco, se extraen tambin protenas esenciales, que rodean a los cromosomas (NuMa y HSET), fundamentales para la formacin del huso mittico en el vulo fecundado. Esto no parece ocurrir en los mamferos menores, pero es una contingencia en los primates; las protenas NuMa y HSET estn desparramadas en el citoplasma del oocito de los mamferos inferiores, pero se encuentran muy prximas al los cromosomas de los primates. De tal manera que al succionar el ncleo, para vaciar el vulo, se extraen tambin estas protenas esenciales para la mitosis normal. Desde que el Homo sapiens es un primate, estos resultados parecen indicar la imposibilidad de la clonacin en seres humanos (al menos utilizando las tcnicas conocidas hasta el momento). Por fin en febrero de 2004 una nueva luz pareca abrirse en las perspectivas de clonacin teraputica de seres humanos. Hwang y Moon de la universidad de Sel, Corea del Sur, publicaron un articulo en la revista Science (W. S. Hwang et al. Science 303, 1669-1674; 2004). En el que afirmaban haber logrado clulas estaminales humanas en cultivo a partir de uno de 30 clones obtenidos utilizando una tcnica de transferencia nuclear ligeramente modificada. Segn el informe, luego de efectuada la clonacin, se estimulo la divisin celular, esperaron 7 das hasta la obtencin del blastocisto, eliminaron la capa externa y cultivaron las clulas de la capa interna, logrando que estos cultivos se mantuvieran indefinidamente y que de ellos se pudieran derivar clulas generadoras de hueso, msculo y clulas inmaduras cerebrales. La ilusin dur poco tiempo, numerosas sospechas se centraron rpidamente en torno al cientfico coreano, en primer lugar de ndole tica ya que al parecer el cientfico habra obtenido una buena parte de los 246 oocitos que dijo haber utilizado, forzando a miembros femeninos de su equipo, y sin informarles de las consecuencias para su salud implicadas en tal donacin. En noviembre de 2005 admite haber pagado para obtener algunos vulos, es prontamente condenado por la comisin de tica de Corea y dimite de su posicin oficial en la Universidad, pero dice que seguir investigando. El 1 de diciembre de 2005, aparecen sospechas de que Hwang habra falseado sus resultados de ADN, haciendo coincidir las lneas celulares establecidas con el supuesto donante del ncleo. El 15 de diciembre uno de los colaboradores de Hwang sale a decir que el investigador habra falseado los datos. El 10 de enero de 2006 el comit de investigaciones de la Universidad Nacional de Sel expide el veredicto de que la investigacin de Woo Suk Hwang esta basada en datos falseados. El 12, Science pide una retraccin formal por parte del cientfico. El 16 de marzo de este ao (2006) Woo Suk Hwang pierde su licencia para continuar con la investigacin en clulas stem y el 20 del mismo mes es despedido por su Universidad. Desde entonces la informacin divulgada es mucho ms escasa y cuidadosa, nadie parece querer continuar con una lnea de investigacin tan complicada, el problema quema.

18

Discusin final La posible aplicacin de la tcnica de clonacin al ser humano ha despertado grandes polmicas a nivel mundial, polmica que est muy bien darla en este momento en que la ciencia y la tcnica van por delante de la tica y de la ley. Hoy por hoy, la clonacin humana no es tcnicamente posible (o no lo es de un modo suficientemente eficaz como para poderla plantear como alternativa teraputica aplicable en la prctica); en cualquier caso, las barreras tcnicas, se superan con tiempo e inversin econmica; lo que nunca se podr eliminar es la barrera tica: la clonacin supone, igual que la utilizacin de embriones humanos producidos por fecundacin in vitro, la destruccin de un ser humano; adems, en este caso, el embrin humano es generado con la finalidad de ser utilizado y para ser destruido; por ltimo, cabe aadir que la clonacin presenta algn agravante tico "extra" en comparacin a la destruccin y manipulacin de embriones producidos in vitro: en el caso de la clonacin se est utilizando un tipo de reproduccin que no es el propio de la especie humana: la clonacin no implica la fusin de dos gametos procedentes de dos organismos distintos (reproduccin sexual) sino la generacin de un nuevo ser humano a partir de clulas adultas de una nica persona. En este sentido, la clonacin no slo es reprobable desde el punto de vista de la defensa de la dignidad de la persona humana, sino tambin desde la perspectiva ecolgica de defender y respetar la naturaleza en lo que a su diversidad biolgica se refiere. Hoy por hoy, la clonacin humana se intenta llevar a cabo en plan experimental; el caso es que para lograr una clonacin, es necesario disponer y utilizar gran cantidad de vulos (por una cuestin de imperfeccin de la tcnica) y no es factible disponer del nmero de vulos humanos necesario (procedentes de donantes voluntarias que deben someterse a serios procedimientos no exentos de riesgos e incomodidades y que, adems, no son recompensados). Para solventar este problema, se intenta clonar ncleos humanos sobre vulos murinos (de ratn), de vaca, de cerdo y otros animales; esos productos de la clonacin... son humanos? Son ratones? Son hbridos humano-ratn? Amparndose en esta ambigedad, los cientficos que realizan o defienden estas prcticas alegan que no se puede considerar el producto de esta manipulacin como algo propiamente humano, de modo que su destruccin no supone un atentado contra la dignidad de la persona. Otra alternativa para intentar solventar el problema de la escasez de vulos propone extraer los vulos de los ovarios de las nias que han sido abortadas. Sin comentarios. Otra ventaja es de ndole econmica: el poder disponer de los embriones congelados o poder generar embriones por fecundacin in vitro para este fin proporciona una inagotable y casi gratuita fuente de clulas madre humanas toti, pluri y multipotenciales con las que investigar sin lmite; adems, estas clulas no pertenecen a nadie en particular, ya que el donante fue destruido precisamente al obtenerlas y los padres biolgicos de ese embrin, muy probablemente ni siquiera estn al corriente del uso que se est haciendo de sus gametos y de unos hijos que ni tan slo saben que han procreado. Es obvio que el poder disponer de estas clulas sin restricciones supone grandes ventajas desde le punto de vista econmico. Se han propuesto distintas vas de obtencin de estas preciadas clulas; para simplificar el asunto desde el punto de vista tico, distinguiremos entre las clulas procedentes de embriones (cuya obtencin supone la destruccin del embrin donante) y las clulas no procedentes de embriones (cuya extraccin no supone, en principio, la destruccin de una vida humana ni la violacin de sus derechos fundamentales).

19

En resumen: si obviamos los posibles beneficios econmicos, el uso de embriones y la prctica de la clonacin, no suponen ventajas (respecto las clulas madre procedentes de adulto) que justifiquen su aplicacin en medicina reparadora, ni si quiera desde una perspectiva meramente prctica o utilitarista. Si el nico modo de obtener clulas madre aplicables al campo de la medicina reparadora fuera a partir de embriones en ese caso sera lcita su utilizacin? Y esto teniendo en mente los muchsimos enfermos que se podran beneficiar de estas estrategias teraputicas. En el fondo de estos dilemas subyacen dos cuestiones importantes: la primera es de carcter antropolgico: qu se entiende por persona humana?, cules son los principios ticos fundamentales que nos permiten establecer los derechos humanos universales?; la segunda, es una cuestin ms bien prctica: qu se debe hacer con los miles (o millones) de embriones congelados almacenados en las clnicas de fecundacin asistida? Para poder justificar la utilizacin de embriones y la produccin de los mismos para fines distintos de la reproduccin, sera necesario o bien negar que el embrin sea realmente un ser humano, o bien admitir la licitud de someter determinadas personas a la voluntad de otros o ponerlas al servicio de las necesidades de terceros, con las consecuencias que ello conlleva. Pero discutir todas estas cuestiones llevara varias monografas y no es el objetivo de la presente; de modo que dejamos estos planteamientos en el aire para que el lector reflexione por s mismo. Antes de concluir, una ltima cuestin: en el caso de que, dentro de unos aos, la medicina reparadora basada en el uso de clulas madre procedentes de embriones (clonados o no) sea una realidad clnicamente aplicable,... cmo oponerse a que el propio hijo, padre, madre, hermano, esposo, esposa o cualquier otro ser querido sea tratado con estos procedimientos de una enfermedad de otro modo incurable e incluso mortal? No estaramos ante una situacin de chantaje emocional? Sera lcito ofrecer a los pacientes semejantes opciones teraputicas? Este interrogante no es nuevo: basta pensar en el caso de las donaciones de rganos: por muy necesitada que est una persona, bajo riesgo de muerte inminente, de un transplante de corazn, no sera aceptable que ese corazn procediera de un pobre padre de familia de la India que, como nica va para salvar a su familia de morir de inanicin, no slo habra renunciado a un puado de clulas suyas, sino que habra sacrificado su propia vida a cambio de una msera suma de dinero. Supongo que habr personas capaces de aceptar un rgano de semejante procedencia an sabindolo; pero ni la Medicina ni la Ley pueden permitir que semejantes situaciones lleguen a ser posibles. En el caso de la utilizacin de embriones con fines teraputicos, nos encontramos ante una situacin equivalente y el modo de enfocar el tema desde la tica mdica y la jurisprudencia, debera ser el mismo. Por ultimo queda por considerar una cuestin que parece trivial, y es la relacin de parentesco de una hipottica persona clonada. En el caso de Dolly se considera que tuvo tres madres: la donadora del ncleo, la donadora del vulo con su contenido mitocondrial, y la madre uterina. Sin embargo podra haber tenido slo una que proveyera el ncleo, vulo y gestara al embrin. Cules serian las relaciones de parentesco de una tal persona?podra la mujer llamar hija a su clon?. Y si, el objetivo fuera obtener dos personas exactamente iguales estaramos realmente frente a una fantasa, aunque el clon posea exactamente el mismo material gentico que el original, difcilmente resulte en una copia idntica, ya que el fenotipo es producto de una muy, muy compleja interaccin del material gentico con el medio ambiente, adems del ruido aleatorio del desarrollo. Como mucho podra aspirarse a obtener gemelos nacidos en tiempos diferentes.

20

Bibliografa

Hernandez Martinez R.; Ruiz Olan A.; La Clonacin de Mamferos; en :( 2006-05-05) http://www.ujat.mx/publicaciones/kuxulkab/k14/raymundo.pdf Montoliu L., (montoli@u cnb.uam), Clulas Madre, Embriones y Clonacin; en: (2006-05-05) http://www.cnb.uam.es/~transimp/stem.html Briggs, R., King, T.J. Transplantation of living nuclei from blastula cells into enucleated frogs eggs. Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1958). 38: 455-63. Gurdon, J.B. The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells of feeding tadpoles. J. Embryol. Exp. Morphol. (1960). 10: 622-40. Illmensee, K. Hoppe, P.C. Nuclear translation in Mus musculus: developmental potential of nuclei from preimplantation embryos. Cell. (1981). 23: 9-18. McGrath J., Solter D., Nuclear Transplantation in the Mouse Embryo by Microsurgery and Cell Fusion; Science (1983) jun. 17; 220 (4603) :1500-2 Willadsen, S. M., Nuclear transplantation in Sheep Embryos; Nature (1986) Mar. 6-12; 320 (6057):63-5 Kwon O. Y., Kono T., Production of Identical Sextuplet Mice by Transferring Metaphase Nuclei From Four Cell Embryos; Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1994) jun. 21; 91 (13):6141-3 Campbell K. H., McWihr J., Ritchie W. A., Wilmut I., Sheep Cloned by Nuclear Transfer from A Cultured Cell Line; Nature (1996) mar. 7, 380 (6569):64-6 Wilmut, I., Schnieke, A.E., Mc Whir, J., Kinf, A.J. and Campbell, K.H.S. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature, 385, February 1997. 27: 810-13. Merchant Larios, H. Clonacin en mamferos: bases biolgicas e implicaciones Tericas, prcticas y ticas. Ciencia (1997). 48(4): 49-57. Aznar, J., Medicina reparadora: Distintas posibilidades; en: (2006-05-05), http://www.bioeticaweb.com/Inicio_de_la_vida/medicina_reparadora.htm Aznar, J., Medicina reparadora: Clonacin y clulas madre; en: (2006-05-06) http://es.catholic.net/sexualidadybioetica/328/754/articulo.php?id=5628 Aznar, J., Alternativas a la utilizacin de clulas madre embrionarias con vista a la medicina regenerativa y reparadora, en: (2006-0506) http://www.bioeticaweb.com/index2.php?option=com_content&do_pdf=1&id=99 Aznar, J., Clulas Madre de tejidos adultos. Diez razones para su utilizacin, en:(2006-05-06) http://www.bioeticaweb.com/content/view/123/45/ De Ojeda, R., Clulas madre de adulto: aplicaciones actuales y potenciales, en: (2006-05-06) http://www.bioeticaweb.com/Inicio_de_la_vida/Ojeda_celulas_madre_de_adulto.htm Di Berardino, M.A., Ban human cloning, Differentiation (2002) 69: 147-149. Lpez Moratalla, N., Aspectos biomdicos de la clonacin humana y clulas madre, en: (2006-05-09) http://www.bioeticaweb.com/Inicio_de_la_vida/Moratalla_clona_celula.htm Lpez Moratalla, N., Tres razones cientficas para optar por obtener clulas madre sin emplear embriones, en: (2006-05-10) http://www.bioeticaweb.com/Inicio_de_la_vida/Moratalla_tres_razones_cient.htm McKinell, R.G., Cloning of homo sapiens? No!, Differentiation (2002) 69; 150-153

21

Pastor, L. M., Biotica de la manipulacin embrionaria humana, en: (2006-05-10): http://www.bioeticaweb.com/Inicio_de_la_vida/Pastor_mani_emb.htm Rehman-Sutter, C., Why care about the ethics of therapeutic cloning?, Differentiation (2002) 69; 179-181 Rifkin, J., El estudio de clula madre: el plan comercial oculto, en: (2006-05-10) http://www.bioeticaweb.com/Inicio_de_la_vida/comercio_cel_mad.htm Vila Coro, M. D., Desprogramar clulas somticas fue el gran acontecimiento cientfico, Diario Mdico, 22.XI.2000. Recomiendo muy especialmente consultar la pgina web : http://www.bioeticaweb.com !!!!! Arias-Stella, J., Clonacin de Mamferos, Procedimiento y posibles utilidades en (2006-0505)http://www.acadnacmedicina.org.pe/publicaciones/anal_ago03-jul04/02simposios/02Javier_Arias_Stella.pdf Sean, R.E. Non-Coding RNA Genes and the Modern RNA World. Nature Reviews Genetics (2000), December. Vol. 2, pp. 919-29. Storz, G. An Expanding Universe of Noncoding RNAs. Science. (2002) May 17. Vol. 296, pp. 1260-63. Asakura A., et al., Muscle satellite cells are multipotential stem cells that exhibit myogenic, osteogenic and adipogenic differentiation, Differentiation (2001) 68; 245-253 Mattick, J.S. Challenging the Dogma: The Hidden Layer of Non-Protein-Coding RNAs in Complex Organisms. BioEssays, (2003)Oct. Vol. 25, pp. 930-39. NIH report Stem Cells: Scientific Progress and Future Research Directions released July 2001. Silver, Lee. What are clones?: Theyre not what you think they are. Nature (2001). July 5, Vol. 412, p21. The meaning of life. Nature (2001), July, Vol. 412, Issue N. 6844, pp. 255. Lanza, R.P., Cibelli, J.B., and West M.D. Human Therapeutic Cloning. Nature Medicine (1999). Vol. 5, N9, pp. 975-77. Lanza, R.P., Cibelli, J.B., West, M.D. Prospects for the Use of Nuclear Transfer in Human Transplantation. Nature Biotechnology, (1999). Vol. 17, N12, pp. 1171-74. Lanza, R.P. et al. The Ethical Validity of Using Nuclear Transfer in Human Transplantation. J. American Medical Association, (2000). Vol. 284, N24, pp. 27. Ronald, M.G. The Human Embryo Research Debates: Bioethics in Vortex of Controversy. Oxford University Press, 2001. Steptoe, P. and Edwards, R. Englands Test-Tube Baby. U.S. New & World Report 31 July 1978. Despertad!. Watchover Bible and Tract Society of New York, Inc. 25 Columbia Heights Brooklyn, N.Y. 11201-2483. Apartado Postal 85058, Bogot 8 D.C., Nov. 22, 2002. Pedersen, R.A. Embryonic Stem Cells for Medicine. Scientific American, April 1999. Thomson, J.A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S.S., Waknitz, M.A., Swiergiel, J.J., Marshall, V.S., and Jones, J.M. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science, 1998. Vol. 282, pp. 1145-47. Marshall, E. The Business of Stem Cells. Science, 2000. Vol. 287, pp. 1419-21. Perry, D. Patients Voices: The Powerfull Sound in the Stem Cell Debate. Science, 2000. Vol. 287, p. 1423. Cibelli, J., Lanza, R., and West, M. The First Human Cloned Embryo. Scientific American, January 2002.

22

Simerly, C., Dominko, T., Navara, Ch., Payne, Ch., Capuano, S., Gosman, G., Chong, K., Takahashi, D., Chace, C., Compton, D., Hewitson, L., Schatten, G. Molecular Correlates of Primate Nuclear Transfer Failures. Science, April 2003. Vol. 300, p. 297. Woo Suk Hwang, Young June Ryu, Jong Hyuk Park, Eul Soon Park, Eu Gene Lee, Ja Min Koo, Hyun Yong Jeon, Byeong Chun Lee, Sung Keun Kang, Sun Jong Kim, Curie Ahn, Jung Hye Hwang, Ky Young Park, Jose B. Cibelli, and Shin Yong Moon. Evidence of a Pluripotent Human Embryonic Stem Cell Line Derived from a Cloned Blastocyst. Science, Vol. 303, pp 1669-74, 12 March 2004. Published online 16February 2004 [DOI: 10.1126/science.1094515] (Este fue el articulo que levant tanta polvareda...) Vogel, G. Scientists Take Step Toward Therapeutic Cloning. Science, 13 February 2004. Vol. 303, pp. 937-39.

23