EVALUACION DEL LABORATORIO EN DESORDENES DE CELULAS FAGOCITICAS

Universidad Autnoma de Chiriqu Vicerectora de Investigacin y Postgrado Maestra en Laboratorio Clnico Inmunologa Clnica

Presentado por: Lic. Lisseth Samudio CIP: 4-736-115

Facilitador: Dr. Moiss Alvarez Mdico especialista

David-Chiriqu Fecha: 15 de Agosto del 2012

Evaluacin del laboratorio en los trastornos de clulas fagocticas

Pgina 2

INTRODUCCIN
Las inmunodeficiencias primarias son un grupo heterogneo de desordenes generalmente hereditarios que afectan la inmunidad celular (Linfocitos T) y humoral (Linfocitos B) especifica o los mecanismos de defensa no especficos del husped (Clulas fagocticas, citocinas, protenas del complemento, entre otros).

La importancia de la evaluacin del laboratorio en estos trastornos radica en que en su mayora aparecen durante los primeros estados de vida, no obstante algunas de estas condiciones se desarrollan durante la etapa adulta. Durante los ltimos aos ha aumentado su incidencia y afecta a personas de ambos sexos.

Este trabajo tiene como objetivo, presentar cuales son las pruebas de uso diagnstico en estos trastornos, dividindolas en pruebas cuantitativas y cualitativas.

Iniciamos con la descripcin general de las inmunodeficiencias primarias las cuales engloban a los trastornos inespecficos como los de las clulas fagocitarias. Luego describimos los tipos de clulas que participan en la funcin fagocitaria.

Por ltimo, evaluamos y describimos las pruebas del laboratorio para evaluar los trastornos de clulas fagocitarias.

Evaluacin del laboratorio en los trastornos de clulas fagocticas

Pgina 3

Generalidades
Cuando existe una deficiencia de alguno de los componentes del sistema inmune, aparecen las enfermedades que llamamos inmunodeficiencias primarias. En ellas, el defecto se circunscribe en general a un slo aspecto de la respuesta, por lo que se pueden catalogar en inmunodeficiencias especficas (si se afecta la parte especfica de la respuesta inmunitaria, es decir, los linfocitos B o T) o inespecficas, si afectan a la porcin inespecfica de la respuesta (clulas fagocticas y complemento). La alteracin en las inmunodeficiencias primarias existe desde el nacimiento aunque su expresin puede ser posterior. La mayora se transmiten de padres a hijos a travs de los genes, por lo tanto son hereditarias. Segn el componente del sistema inmune afectado, se pueden considerar cuatro grandes grupos de inmunodeficiencias primarias: 1. Deficiencias de clulas T. ej. Sindrome de Digeorge 2. Deficiencias de clulas B. ej. Agamaglobulinemia, Sndrome de hiper IgM, Deficiencia selectiva de IgA. 3. Deficiencias de los fagocitos. ej. Enfermedad Granulomatosa crnica, Chediak Higashi 4. Deficiencias del complemento El 18% de las deficiencias primarias corresponden a las clulas fagocticas. (S. Manrique). Los fagocitos son clulas especializadas del sistema inmune cuya principal funcin es la de ingerir y destruir microorganismos. Estas clulas, como algunas otras en el sistema inmune, se desarrollan a partir de clulas madre en la mdula sea. Habiendo madurado, emigran a todos los tejidos del cuerpo, pero son especialmente prominentes en el torrente sanguneo, bazo, hgado, ganglios linfticos y pulmones.

www.primaryimmune.org/pubs/book_pats/esp_resources.pdf Hay diversos tipos de fagocitos. Leucocitos polimorfonucleares (neutrfilos o granulocitos) que son encontrados en el torrente sanguneo y pueden emigrar a sitios de infeccin en cuestin de minutos. Son estas clulas fagocticas las que aumentan en nmero

Evaluacin del laboratorio en los trastornos de clulas fagocticas

Pgina 4

en el torrente sanguneo durante una infeccin y son en gran parte responsables por un recuento elevado de glbulos blancos en la sangre cuando existe una infeccin. Son tambin los fagocitos los que dejan el torrente sanguneo y se acumulan en los tejidos durante las primeras horas de la infeccin, y son responsables por la formacin de pus. Figura No1.

Figura No1. Fagocitosis. http://stephanie-da-silva-gomes.blogspot.com

Los monocitos, otro tipo de clulas fagocticas, se encuentran tambin circulando en el torrente sanguneo. Estos tambin forran las paredes de los vasos sanguneos en rganos como el hgado y bazo. Aqu capturan microorganismos mientras pasan por la sangre. Cuando los monocitos dejan el torrente sanguneo y entran a los tejidos, estos cambian en forma y tamao y se convierten en macrfagos.

www.primaryimmune.org/pubs/book_pats/esp_resources.pdf

Las clulas fagocticas cumplen un nmero de funciones crticas en la defensa del cuerpo contra infecciones. Tienen la habilidad de dejar el torrente sanguneo y moverse dentro de los tejidos hacia el lugar de la infeccin. Una vez que se encuentran en el lugar de la infeccin, ingieren al microorganismo invasor. La ingestin del microorganismo por las clulas facocticas se vuelve ms fcil cuando los microorganismos se encuentran cubiertos ya sea por el anticuerpo, por el complemento o por ambos. Habiendo ingerido al microorganismo, el fagocito inicia una serie de reacciones qumicas dentro de la clula, lo cual resulta en la muerte del microorganismo.

www.primaryimmune.org/pubs/book_pats/esp_resources.pdf
Evaluacin del laboratorio en los trastornos de clulas fagocticas Pgina 5

Las anomalas en la funcin de las clulas fagocitarias afectan a la inmunidad innata, haciendo que los pacientes sean susceptibles a enfermedades bacterianas de repeticin.

Clasificacin
Las alteraciones de clulas fagocticas pueden ser cuantitativas (siendo las ms frecuentes las neutropenias) o cualitativas. Estas ltimas pueden presentarse a varios niveles de la actividad funcional de los fagocitos: en la adhesin, la fagocitosis, la produccin de perxido de hidrgeno, etc. La mayora de estas alteraciones son secundarias a frmacos o a enfermedades concomitantes. Las congnitas son raras pero, en general, son mucho ms graves, salvo excepciones como el dficit de mieloperoxidasa, que es la ms frecuente y es asintomtica. Sin embargo, otras como el dficit de adherencia leucocitaria, el sndrome de Job, el sndrome de Chediak-Higashi o la enfermedad Granulomatosa Crnica, cursan con infecciones graves, que pueden producir la muerte a edades tempranas.

Diagnstico
La valoracin de la inmunocompetencia en un individuo con sospecha de inmunodeficiencia primaria requiere de un anlisis cuantitativo, cualitativo o estructural y de estudios funcionales que permitan detectar alteraciones en sus mecanismos de defensa. El diagnstico comenzar descartando formas secundarias, y a continuacin se estudiarn las congnitas, empezando por las ms frecuentes, basndose en datos clnicos claves o de laboratorio sencillos de obtener (ej. anemia hemoltica, dficit de mieloperoxidasa, anomalas en la granulacin, dosificacin de inmunoglobulinas e IgE) hasta llegar a estudios ms complejos, por citometra de flujo o secuenciacin gnica.

Los signos clnicos que deben despertar una alerta inmediata dirigida a descartar una

deficiencia en las clulas fagocticas son: linfadenopata crnica y/o supurativa; retardo o mala cicatrizacin de las heridas; lceras necrticas no supurativas; cada tarda del cordn umbilical (mayor de 20 das); discromas (albinismo oculocutneo parcial) y fotofobia; gingivoestomatitis severa y perio-dontitis; paroniquia recurrente; eczema crnico; abscesos
Evaluacin del laboratorio en los trastornos de clulas fagocticas Pgina 6

"fros"; enfermedad inflamatoria intestinal; obstruccin granulomatosa del intestino o aparato urinario; infecciones severas como absceso pigeno heptico o pulmonar, osteomielitis multifocal y/o de huesos cortos; sepsis; neumonas supurativas y neumatoceles perennes. Edad de inicio: En la mayora de los casos severos, las infecciones se inician durante el primer ao de vida. En las formas autosmicas recesivas de la enfermedad granulomatosa crnica, se pueden presentar casos de inicio tardo y menor severidad clnica. De acuerdo con el mecanismo de defensa que se quiere evaluar existen diferentes estudios que se pueden organizar por niveles de complejidad.

I Primera etapa: Estudios bsicos de laboratorio Hemograma completo con eritrosedimentacin, extendido de sangre perifrica y recuento plaquetario. Se debe prestar atencin ante la presencia de los siguientes hallazgos, que sugieren el diagnstico de una deficiencia en las clulas fagocticas: granulocitopenia, neutropenia, leucocitosis an en ausencia de infeccin, eosinofilia, grnulos anormales en las clulas de las diferentes series (pero en especial en los granulocitos), anemia moderada a severa, especialmente con caractersticas de cronicidad. Estudio de la etiologa de las infecciones y su sensibilidad. El dficit en la funcin de las clulas fagocticas se asocia con infecciones producidas por: Staphylococcus aureus, Pseudomonas spp, Serratia marsescens, Klebsiella spp, E. coli, Burkholderia cepacia, Proteus spp, Aspergillus spp, Candida albicans, Nocardia spp. En las alteraciones combinadas de la inmunidad celular y los fagocitos, se encuentran infecciones por: Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Candida albicans, Aspergillus spp y bacilos gram negativos. Electroforesis de protenas sricas. Con la determinacin de las protenas totales, su distribucin y la relacin albmina/globulinas se establece un importante parmetro del estado nutricional del paciente, para descartar deficiencias de origen carencial. Es comn encontrar una hipergamaglobulinemia reactiva ante los procesos infecciosos. Ofrece una

Evaluacin del laboratorio en los trastornos de clulas fagocticas

Pgina 7

visin general de la composicin y distribucin de las protenas circulantes del paciente. Con la determinacin de las protenas totales se deben considerar los siguientes aspectos: Aproximadamente el 90% de la fraccin -1 antitripsina, cuya deficiencia es una causa de infecciones recurrentes especialmente del aparato respiratorio. Esta fraccin se encuentra elevada en la ataxia telangiectasia por un aumento en la produccin de a fetoprotena. Los factores del complemento ms importantes se encuentran representados en la fraccin . En la fraccin migran las diferentes inmunoglobulinas sricas y el mayor porcentaje corresponde a la IgG, por lo tanto con este examen se puede detectar fcilmente una disminucin de inmunoglobulinas. Se considera hipogamaglobulinemia la presencia de menos de 500 mg/dl en esta fraccin y agamaglobulinemia cuando los niveles son menos de 200 mg/dl. En individuos inmunocompetentes o en deficiencias de clulas fagocticas o del complemento es comn encontrar una hipergamaglobulinemia reactiva ante los procesos infecciosos. Estudios imagenolgicos cuando sean necesarios (Rx de trax, TAC, etc.). Se pueden revelar hallazgos como la presencia de neumonas supurativas con desarrollo de neumatoceles y empiemas, abscesos hepticos. Si se confirma un diagnstico de inmunodeficiencia primaria, se debe realizar el rbol genealgico familiar con el mayor nmero de generaciones posibles. II. Estudios de la segunda etapa 1. En todo paciente con sospecha de inmunodeficiencia celular se debe descartar una infeccin por el VIH. 2. Reduccin en placa del Nitroazul de Tetrazolio (NBT) por los neutrfilos de sangre perifrica (en reposo y activados con PMA). Evala la activacin del complejo enzimtico NADPH-oxidasa de los fagocitos. 3. Si se sospecha una neutropenia cclica, realizar al menos dos leucogramas por semana, durante 6 semanas. Con el fin de observar la tpica cada de las cifras de neutrfilos circulantes durante la crisis de la enfermedad y el ascenso unos pocos das despus con la recuperacin clnica.
Evaluacin del laboratorio en los trastornos de clulas fagocticas Pgina 8

4. La confirmacin de una deficiencia de adhesin leucocitaria tipo I se hace mediante la evaluacin de las 2 integrinas leucocitarias (CD11a, b, c/CD18) en la superficie de los glbulos blancos por citometra de flujo. 5. Anticuerpos antineutrfilos (anti NA1, NA2, NB1) por inmunofluorescencia indirecta o aglutinacin; importantes para descartar una neutropenia autoinmune. La deteccin de anticuerpos antineutrfilos ha sido particularmente complicada por las caractersticas propias del granulocito, agregabilidad, modulacin de membrana y escasez de clulas. 6. Estudio de la explosin respiratoria por medio de citometra de flujo midiendo la oxidacin de la rodamina 123. Esta tcnica permite confirmar los defectos en la explosin respiratoria de las clulas fagocticas y al mismo tiempo cuantificar la severidad de la deficiencia, as como detectar las madres portadoras de un defecto molecular en la forma de enfermedad granulomatosa crnica ligada al cromosoma X. 7. Biopsia de mdula sea: til en el diagnstico de la Disgenesia Reticular y la Enfermedad de Kostmann. 8. Cuantificacin de subpoblaciones de linfocitos en sangre perifrica por citometra de flujo: porcentaje y valor absoluto de los linfocitos CD3+, CD4+, CD8+ y CD16+/CD56+. Los resultados se deben analizar teniendo en cuenta los valores establecidos para la edad. 9. Anlisis de otras molculas de superficie de los linfocitos, utilizando la citometra de flujo: expresin de molculas del complejo mayor de histocompatibilidad (para diagnstico del sndrome del linfocito desnudo), CD7, cadena gamma comn del receptor de IL-2, CD154. 10. Dosificacin de inmunoglobulinas sricas (IgG, IgA, IgM, IgE: se realizan cuando se sospeche una IDSC; si las cifras de IgG son anormales se deben avaluar tambin los linfocitos CD19+ en sangre perifrica. Se deben tener en cuenta los niveles establecidos para la edad para definir una deficiencia cuantitativa (media geomtrica +/- 2SD). Cifras elevadas de IgE srica se encuentan caractersticamente en algunas formas de IDSC y en los sndromes de Omenn, Nezelof y Wiskott-Aldrich.
Evaluacin del laboratorio en los trastornos de clulas fagocticas Pgina 9

11. Cuando no se encuentren deficiencias cuantitativas en la imunidad humoral, pero existan infecciones bacterianas recurrentes, se recomienda evaluar funcionalmente la produccin de anticuerpos especficos en respuesta a los antgenos suministrados en la vacunacin: para determinar la respuesta ante antgenos proteicos se determinan anticuerpos contra hepatitis B, rubola o sarampin; para analizar la respuesta a poisacridos se analizan los anticuerpos contra diferentes serotipos de neumococo. 12. Cuando se sospecha un Sndrome de Hiper-IgE: se debe realizar dosificacin de IgE srica; en los mayores de 1 ao estn indicadas las pruebas de hipersensibilidad retardada, por ejemplo 0,1 ml de Candida intradrmicos; se considera positiva una induracin mayor de 5 mm leda a las 48 horas. Debido a que en esta inmunodeficiencia se ha reportado una deficiencia cualitativa en la produccin de anticuerpos, se sugiere evaluar tambin funcionalmente la produccin de anticuerpos especficos en respuesta a los antgenos suministrados en la vacunacin: para determinar la respuesta ante antgenos proteicos se determinan anti-cuerpos contra hepatitis B, rubola o sarampin; para analizar la respuesta a polisacridos se analizan los anti-cuerpos contra diferentes serotipos del neumococo. Debido a las implicaciones que tiene una inmunodeficiencia primaria, todo diagnstico de inmunodeficiencia por alteracin en las clulas fagocticas debe estar respaldado por una segunda prueba de laboratorio confirmatoria. III. Estudios de la tercera etapa En los pacientes con sospecha de Sndrome de Hiper-IgE: evaluacin funcional por cultivos de clulas mononucleares de sangre perifrica estimuladas con mitgenos y antgenos, para determinar la produccin de citoquinas y la proliferacin. Tambin se puede realizar cultivo mixto de linfocitos. Evaluacin de la quimiotaxis in vitro (en gel de agarosa) de los neutrfilos de sangre perifrica.

Evaluacin del laboratorio en los trastornos de clulas fagocticas

Pgina 10

Estudio de la explosin respiratoria de los neutrfilos: cuantificacin de la produccin de anin superxido por espectrofotometra o quimioluminiscencia; determinacin de la produccin de perxido de hidrgeno por citometra de flujo (Dihidrorodamina 123). Determinaciones enzimticas: G6PDH, mieloperoxidasa. Estudio por citometra de flujo de la expresin de: molculas de adhesin como las Beta-2 integrinas leucocitarias (CD11/CD18) y la L-selectina, FcR gamma II (CD32), receptores para fragmentos del complemento (CD35, CD11b/CD18). Estos estudios son tiles para descartar entidades como las deficiencias de adhesin leucocitaria. Western blot: para evaluar las protenas del sistema NADPH-oxidasa: gp91-phox, p22-phox, p47-phox, p67-phox. Esta tcnica analtica es usada para detectar protenas especficas en una muestra determinada (una mezcla compleja de protenas, como un extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las protenas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a una membrana adsorbente (tpicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la protena de inters con anticuerpos especficos contra ella. Finalmente, se detecta la unin antgenoanticuerpo por actividad enzimtica, fluorescencia entre otros mtodos. De esta forma se puede estudiar la presencia de la protena en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a otras protenas. Estudios gentico-moleculares para la caracterizacin de mutaciones en las diferentes inmunodeficiencias. Cuando estn indicados: caracterizacin del HLA en los afectados y familiares, y el cariotipo.

Evaluacin del laboratorio en los trastornos de clulas fagocticas

Pgina 11

Pruebas para medir la funcin de las clulas fagocticas:

Los defectos en la funcin de los neutrfilos se pueden clasificar como cuantitativos o cualitativos. En los trastornos cuantitativos el nmero total de neutrfilos de funcin normal se encuentra bastante disminuido. En los trastornos cualitativos el nmero total de neutrfilos se encuentra normal pero no pueden ejercer sus funciones microbicidas normales (Stites, 1999).

Para poder evaluar el tipo de defecto que presentan estas clulas existen varias clases de pruebas de laboratorio como la reduccin de NBT, la medicin de radicales libre de oxigeno y la expresin de beta-2 integrinas, entre otras.

Reduccin de NBT La muerte de un microorganismo despus de su fagocitosis se debe a la produccin de iones superoxido, que ayudan a la muerte del microorganismo. En algunas enfermedades la fagocitosis no tiene ningn problema pero la produccin de sustancias toxicas para el microorganismo no ocurre eficientemente, por lo que la destruccin no se lleva a cabo correctamente. El azul de tetrazolio nitrado (NBT) es un compuesto claro, amarillo y soluble en agua que al reducirse forma el formazan, tincin de color azul oscuro. Los neutrfilos pueden reducir el colorante despus de la ingestin de ltex u otras partculas, subsecuente a la descarga metablica abrupta generada por la va derivada del monofosfato de hexosa.

Figura No 2. Prueba de NBT. http://www-sante.ujf-grenoble.fr/CGD/diagnosis.html

Evaluacin del laboratorio en los trastornos de clulas fagocticas Pgina 12

La reduccin del NBT es una prueba til para analizar la integridad metablica de los neutrfilos ya que la falla en la reduccin del colorante se asocia con enfermedad granulomatosa crnica por lo tanto los neutrfilos de estos pacientes no pueden dar muerte a ciertos microorganismos intracelulares ni generar radicales superoxido.

Medicin de radicales libres de oxigeno El desbalance en la produccin de especies reactivas de oxgeno y la defensa antioxidante provoca un dao oxidativo conocido como estrs oxidativo, que lleva a una gran cantidad de cambios fisiolgicos y bioqumicos, los cuales provocan el deterioro y muerte celular. Figura 3.

Figura 3. Produccin de radicales libres a nivel mitocondrial. http://alucinamedicina.com/tag/teorias-del-envejecimiento/

Se puede medir este tipo de dao mediante mtodos directos e indirectos. Entre los mtodos directos est la medicin de la concentracin de agentes oxidantes, que es muy difcil debido a su corta vida media. El uso de la espectrometra de la resonancia de rotacin (espn) de electrones, es la nica tcnica analtica que mide directamente las especies oxgeno reactivas, pero debido a su costo y complejidad su aplicacin en el ser humano es difcil. Los mtodos indirectos se realizan mediante la determinacin de los productos finales de la accin oxidante sobre algunas molculas biolgicas tales como los
Evaluacin del laboratorio en los trastornos de clulas fagocticas Pgina 13

lpidos, cidos nucleicos y protenas. Los mtodos para medir perxidos lipdicos son el patrn de oro, cuando se trata de probar el papel de los oxidantes en algn tipo de dao celular. Es posible medir los dienos conjugados derivados del cido araquidnico mediante espectrofotometra UV, los hidroperxidos lipdicos mediante cromatografa lquida de alta presin.

Quimiotaxis La locomocin direccional de los neutrfilos hacia diversos estmulos

quimiotacticos se cuantifican mediante el uso de la cmara de boyden. Las clulas por analizar se colocan en la parte superior y se separan de la cmara inferior que contiene la sustancia quimiotatica mediante una membrana de filtro de poro pequeo. Los neutrfilos pueden atravesar el filtro, pero se atrapan en el trnsito hacia la membrana y luego de un periodo de incubacin, el filtro se tie y se observa al microscopio. Figura No 4

Fig.3 Quimiotaxis. http://es.wikipedia.org/wiki/Ensayos_de_quimiotaxis

Fagocitosis y actividad bactericida de los neutrfilos La ingestin de microorganismos por neutrfilos es un proceso que requiere la produccin de energa por parte de la clula fagoctica. La internacin de microorganismos recubiertos de anticuerpos y complemento se presenta muy rpido despus del contacto con neutrfilos ya que los procesos intracelulares subsecuentes dependen del xito de la fagocitosis. Las pruebas para fagocitosis proporcionan un mtodo rpido y relativamente simple para evaluar el proceso fagoctico en general.

Evaluacin del laboratorio en los trastornos de clulas fagocticas

Pgina 14

Adherencia En el proceso de fagocitosis es importante el mecanismo de adhesin de las clulas fagocticas al endotelio vascular, ya que se sabe que el neutrfilo se encuentra en un estado de patrullaje permanente y que el mecanismo de adherencia esta mediado por una serie de citocinas y factores qumicos que lo inducen a llevar a cabo el proceso de fagocitosis. Figura 6.

Evaluacin del laboratorio en los trastornos de clulas fagocticas

Pgina 15

BIBLIOGRAFA
1. Morado Arias, M; Hernndez Navarro, F Publicado en Medicine. 2

http://alucinamedicina.com/tag/teorias-del-envejecimiento/004;09:1303-13. - vol.09 nm 21 2. R. Buznego Snchez*, J.E. Viuela Roldn**, M.L. Couce Pico*, M.J. Saavedra Pereira**, J.R. Fernndez, Lorenzo*, J.M. Fraga Bermdez* An Esp Pediatr 1996;44:176-178. Neutropenia neonatal aloinmune por anticuerpos anti-NA1. 3. http://es.wikipedia.org/wiki/Ensayos_de_quimiotaxis 4. http://alucinamedicina.com/tag/teorias-del-envejecimiento 5. http://www-sante.ujf-grenoble.fr/CGD/diagnosis.html 6. www.primaryimmune.org/pubs/book_pats/esp_resources.pdf

Evaluacin del laboratorio en los trastornos de clulas fagocticas

Pgina 16