MULTIPLICACIN DE HONGOS MICORRIZICOS ARBUSCULARES MA NATIVOS DE CULTIVO DE CACAO (Theobroma cacao) EN MAIZ (Zea mays) BAJO DISTINTOS TRATAMIENTOS

AGRONMICOS

LILIANA DAVILA ROCHA CARLOS JULIO RAMOS FRAGOZO CINDY MANUELA ROSALES MAESTRE

UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS Y EDUCACION

LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES Y EDUCACION AMBIENTAL VALLEDUPAR 2009

MULTIPLICACIN DE HONGOS MICORRIZICOS ARBUSCULARES MA NATIVOS DE CULTIVO DE CACAO (Theobroma cacao) EN MAIZ (Zea mays) BAJO DISTINTOS TRATAMIENTOS AGRONMICOS

LILIANA DAVILA ROCHA CARLOS JULIO RAMOS FRAGOZO CINDY MANUELA ROSALES MAESTRE

Trabajo presentado como requisito para obtener el titulo de Licenciados en Ciencias Naturales y Educacin Ambiental

Tutor Laura Esther Rojas Martinez Biloga

UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS Y EDUCACION

LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES Y EDUCACION AMBIENTAL VALLEDUPAR 2009

Nota de Aceptacin ______________________________ ______________________________ ______________________________ ______________________________ ______________________________ ______________________________

Firma del Presidente del Jurado

Firma del Jurado

Firma del Jurado

Valledupar, Mayo 15 de 2009

A Dios Por darme vida, salud, fortaleza y perseverancia en el transcurso de mi carrera.

A mis padres Atanasio Dvila y Celia Rocha por haberme brindado su apoyo incondicional durante todo este tiempo.

A mi Ta Sebastiana Dvila Mil gracias porque sin su apoyo, su tolerancia y su bondad no hubiera llegado a ser lo que soy.

A la profesora Laura Rojas Martnez Que dedic parte de su tiempo a la realizacin de este trabajo. Gracias a todos los que confiaron en m y que de una u otra forma siempre estuvieron a mi lado ayudndome.

Liliana Dvila Rocha

A Dios Por siempre iluminar el camino que he recorrido toda mi vida, gracias por ser mi gua.

A mis padres Saudy Maestre Morales Y Orlando Rosales Castro, a quienes les debo todo lo que soy, son mi admiracin porque me han demostrado que nunca se debe uno de rendir y buscar siempre nuevas oportunidades para salir adelante y las adversidades tomarlas como un proceso de aprendizaje de la vida cotidiana. Los amo y gracias por estar siempre conmigo en las buenas y en las malas, son la bendicin ms grande que me ha dado Dios

A mis hermanos y familiares Adriana, Andrs Felipe Y Joaqun quienes juntos crecimos y compartimos muchas vivencias, alegras y tristezas. Espero seguir compartiendo la dicha y la felicidad que nos mantiene unidos.

A la Biloga Laura Rojas Martnez A quien admiro y respeto, gracias por tu gua en este difcil campo de la investigacin micorrizica, adems de brindarme su amistad. Que Dios la bendiga siempre.

A Carlos Julio Ramos Fragozo Por su amor, compaa y ayuda en este proceso.

Cindy Rosales Maestre

A Dios, a mis padres y a los sueos que se hicieron realidad

Carlos Julio Ramos Fragozo

AGRADECIMIENTOS

Los autores de este proyecto expresan su agradecimiento a:

Al propietario de la Finca Monte grande de Pueblo bello Cesar por habernos permitido obtener las muestras del suelo de los cultivos de cacao.

los trabajadores del almacn del laboratorio de Ciencias Naturales Freddy

Prez Domnguez y Luis Gonzales Fernndez por habernos facilitado las herramientas necesarias durante la realizacin de este proyecto.

A la Universidad Popular del Cesar, por brindarnos la oportunidad de superarnos, capacitarnos y crecer intelectualmente, para poder convertirnos en los prximos profesionales del futuro.

Las diferentes personas que intervinieron para la recoleccin de las muestras, la cual fue de gran ayuda para llevar a cabo los diferentes estudios y procesos necesarios para la realizacin de este trabajo.

RESUMEN

En Colombia, los estudios del efecto de los sustratos y el tipo de cultivo trampa adecuado para la multiplicacin de micorrizas arbusculares MA son escasos, debido a ello, el objetivo del presente trabajo consisti en multiplicar hongos micorrizgenos nativos y as obtener un inculo con una diversidad de microorganismos fngico endfitos nativos adaptados a nuestro sistema agroecolgico que pueda evaluarse posteriormente en cultivos de cacao bajo las condiciones edficas y climticas de la regin y aumente la productividad de una manera sostenible.

En los sistemas de cacao de la regin, la baja productividad ha generado el planteamiento de estrategias como es el uso de microorganismos para estimular su crecimiento, donde se destacan los hongos micorrizgenos. Estos organismos pueden ser obtenidos, seleccionados, multiplicados e incorporados al suelo en forma de inculos. El proceso de inoculacin es complejo, por una parte, implica disear mtodos de aislamiento, seleccin, multiplicacin e incorporacin adecuados para cada especie o propsito. En este trabajo se evalu la multiplicacin de esporas de hongos micorrzicos arbusculares MA nativos obtenidos de cultivo de cacao (Theobroma cacao) en plantas trampas de maz (Zea mays) fertilizadas y no fertilizada. El ensayo se mantuvo en vivero durante cuatro meses con condiciones de riego controladas. En cada una de las unidades

experimentales se evalu nmero de esporas/g de suelo seco, porcentaje de colonizacin y las variables agronmicas como peso seco y altura de las plantas. Dentro de los resultados se obtuvo que las plantas trampas de maz (Sea mays) inoculadas respondieron significativamente a la infeccin y esporulacin por los hongos MA nativos, mostrando mayores niveles de infeccin de micorriza.

El mayor rendimiento en la tasa de crecimiento y porcentaje de materia seca fue alcanzado por el tratamiento de las plantas inoculadas no fertilizadas. El gnero micorrzico predominante con mayor abundancia relativa dentro de la poblacin de esporas aisladas en los tratamientos fue Glomus

Palabras claves: micorriza, inculo, cacao, fertilizacin, infectividad, esporas.

CONTENIDO DEDICATORIA RESUMEN INTRODUCCION 1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 2. JUSTIFICACION 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo General 3.2 Objetivos Especficos 4. MARCO TEORICO 4.1 Antecedentes de la Investigacin 4.2 Bases Tericas 4.2.1 la micorriza 4.2.2 Tipos de micorrizas 4.2.2.1 Ectomicorriza 4.2.2.2 Endomicorriza 5. MATERIALES Y METODOS 5.1Obtencion de esporas nativas MA de cultivo de cacao. 5.1.1 Toma de muestras de suelo. 5.1.2 Preparacin de l pre-Inoculo 5.1.2.1 Tamizaje-Flotacin-Filtracin 5.2.2.2 Secado de las muestras 17 19 21 24 24 24 25 25 30 30 31 31 32 46 46 46 47 47 48

5.2 Multiplicacin de esporas nativas en plantas trampas 5.2.1 Material vegetal 5.2.2 Preparacin de sustratos 5.2.3 Siembra 5.2.4 Aplicacin del pre- inculos 5.2.5 Manejo de los tratamientos 5.3.5 Evaluacin de la infectividad y efectividad de la multiplicacin de los hongos MA nativos 5.3.1 Numero de esporas por gramo de suelo 5.3.2 Determinacin de porcentaje de infeccin 5.3.2.1 Tincin de las Races 5.3.2.2 Evaluacin de la colonizacin micorrizica por el mtodo de intercepto de McGonigle 5.4. Identificacin de esporas de hongos MA multiplicados en el cultivo trampa 6. RESULTADOS Y DISCUSIONES 6.1 Porcentaje de infeccin micorrizal 6.2 Altura de las plantas 6.3 Determinacin de biomasa 6.4 Anlisis de diversidad de hongos micorrzicos

50 50 51 52 53 53

55 56 58 58

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64 65 65 72 76 78

7. CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFA ANEXOS

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Proceso de formacin de micorriza arbuscular (MA) Figura 2: Diversidad en forma de esporas de todos los gneros de Hongos micorrzicos arbusculares MA Figura 3: Toma de las muestras de suelo en el municipio de Pueblo Bello- Cesar Figura 4: Tamizado de las diferentes muestras Figura 5: Semillas de maz (Zea mays) Figura 6: Preparacin de los sustratos y tratamiento Figura 7: Siembra y aplicacin del inculo en los diferentes tratamientos Figura 8: Aplicacin del fertilizante a los diferentes tratamientos Figura 9: Flotacin- filtracin de las muestras de suelo Figura 10: Papel filtro con los sedimentos despus del filtrado y corte de la misma para observar al microscopio Figura 11: Mtodo para la tincin de las races Figura 12: Races de las diferentes plantas en laminas portaobjetos Figura 13: Corte de la raz y parte area de la planta Figura 14: Peso de las races y parte area de las plantas Figura 15: Vescula Figura 16: Arbsculos

35

43

46 44

49 52 55 56

57 59 60 57 62 65 66

Figura 17: Hifas Figura 18: Comparacin de la altura de plantas del tratamiento 2 y tratamiento 3 Figura 19: Crecimiento de parte foliar y raz de las plantas con micorriza y sin micorrizas Figura 20: Entrophospora Figura 21: Acaulospora Figura 22: Glomus Figura 23: Archaeospora Figura 24: Scutellospora Figura 25: Gigaspora

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74 79 79 79 79 80 80

LISTA DE GRAFICAS

Grafica 1: Porcentaje de infeccion por hifas Grafica 2: Porcentaje de infeccin por arbsculos Grafica 3: Porcentaje de infeccin por vesculas Grafica 4: Altura de las plantas en los tratamientos 1, 2 y 3. Grafica 5: Porcentaje peso seco parte area Grafica 6: Porcentaje peso seco de la raz Grafica 7: Porcentaje de esporas por gnero en cada uno de los tratamientos

67 64 69 73 76 76

78

LISTA DE CUADROS

Cuadro 1: Ubicacin taxonmica y gneros de hongos formadores de micorriza arbuscular Cuadro 2: Proporciones del fertilizante Nutrifoliar por g/L
42

54

ANEXOS

Anexo 1: Resultados del peso seco de la parte area de las plantas en los diferentes tratamientos Anexo 2: Resultados del peso seco de la raz de las plantas en gramos Anexo 3: Altura de las plantas a los 45 das de edad Anexo 4: Altura de las plantas a los 60 das de edad Anexo 5: Altura de las plantas a los 75 das de edad Anexo 6: Altura de las plantas a los 90 das de edad Anexo 7: Nmero de esporas en 10 gr de suelo Anexo 8: Infeccin por hifas Anexo 9: Infeccin por arbsculos Anexo 10: Infeccin por vesculas Anexo 11: Nmero de vesculas por laminas Anexo 12: Porcentaje de esporas por genero Anexo 13: Anlisis fisicoqumico del suelo 91 91 92 92 93 93 94 94 95 95 96 96 97

INTRODUCCION

En la actualidad en los pases europeos y de Amrica latina, existe una alta demanda por los productos orgnicos (Fraire, 2002). Colombia ha mostrado

inters para producir productos agropecuarios con insumos econmicos e inculos para el bienestar de la poblacin consumidora y de la familia de la poblacin ms vulnerable. El cultivo de cacao es un producto agroindustrial que presenta buena aceptacin y demanda. En los ltimos aos los productores han sufrido prdidas en las plantaciones debido a los elevados costos de insumos, bajo nivel tecnolgico, deficiencia de nutrimento en las plantaciones, altas incidencias de plagas y enfermedades dainas como moniliasis (Barreras, 2007). En la actualidad es necesario buscar tecnologas alternativas que estn al alcance de los productores, que permitan minimizar costos de produccin e incrementar la productividad del cultivo mediante la agricultura alternativa y reactivar las plantaciones mediante la reconversin de cacao tradicional a la produccin orgnica competitiva. Una de estas alternativas, es la aplicacin de microorganismos con alto potencial biofertilizantes que puedan mantener la sostenibilidad de los cultivos. Las micorrizas son una de las principales asociaciones simbiticas de la naturaleza ya que las races de la mayora de las plantas vasculares son colonizadas extensivamente por hongos micorrcicos vesculo arbuscular (MA). Estos son organismos biotrficos obligados que pueden estimular el crecimiento y desarrollo

de las plantas al mejorar la nutricin de stas, determinando un incremento importante en la absorcin de nutrimentos inmviles (Stribley, 1990; Bethlenfalvay et al., 1991). El reconocimiento, establecimiento y eficiencia de una asociacin micorrizica dependen de factores como: a) tipo de hongo (su tasa de crecimiento interior y exterior en la raz), b) planta hospedante (como genotipo, exudados radicales, geometra radical, presencia de pelos radicales y de races laterales) y c) los factores biofisicoqumicos del suelo (pH, humedad, textura, fertilidad, tipo de microorganismos) (Graham et al., 1981; Estaol, 1987; Tester et al., 1987; Smith y Giaginazzi, 1988; Varela y Estrada, 1991). Debido a la gran variedad de especies MA es importante, determinar cual de estas MA sera ms idnea para un cultivo especifico, todo esto con el fin de poder llegar a la obtencin de una planta que presente ciertas caractersticas que le permita adaptarse de mejor manera a las condiciones en el momento de su trasplante a terreno definitivo con una disminucin en la aplicacin de fertilizantes inorgnicos.

Teniendo en cuenta esta problemtica, el objetivo del presente trabajo consisti en multiplicar hongos micorrizgenos nativos, tiles para el posterior

establecimiento de un inculo potencial de uso regional en plantaciones de cacao.

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La produccin de cacao en Colombia se desarrolla en unidades productivas pequeas en donde el cacao constituye una de las fuentes alternativas de ingresos. En el Cesar, especficamente en la zona de Pueblo Bello, no es la excepcin. Las plantaciones cacaoteras estn establecidas en fincas familiares, donde la tecnologa empleada es baja, no se llevan a cabo labores de fertilizacin, riego, drenaje y siembras (renovaciones). La fertilizacin se realiza solo en el momento de la siembra, pero durante el desarrollo del rbol esta es casi nula. La Corporacin Colombiana De Investigacin Agropecuaria (CORPOICA)

recomienda, fertilizar dos o tres veces al ao, actividad poco difundida en estas fincas cacaoteras, lo que se constituye en una ventaja a la hora de aplicar tecnologas limpias, como biofertilizantes que mejoren la productividad sostenimiento de los cultivos sin daar los ecosistemas. y

Adicionalmente, las labores culturales realizadas por los agricultores son precarias dando va libre para la propagacin de enfermedades como la moniliasis, que ya ha sido diagnosticada en Pueblo Bello- Cesar y que se

constituye como la principal limitante para la produccin de cacao (Barreras, 2007). Esta enfermedad es causada por el hongo Moniliophthora roreri, que ataca exclusivamente frutos; se estima que ocasiona prdidas superiores al 40%

en la produccin nacional que, estimada en valor comercial de $120.000 millones al ao.

Todos estos factores contribuyen a la disminucin de la produccin en las plantaciones de cacao. Departamentos como Nario, Tolima, Cundinamarca, Meta y Cesar registran tasas decrecientes en la produccin de cacao. El

departamento del Cesar produjo; 633 toneladas en el ao 2000 y 513 toneladas en el 2004 con un crecimiento de produccin de -3.7% (Barreras, 2007).

Debido a los precarios manejos agronmicos y la proliferacin de enfermedades podemos identificar que la disminucin de la productividad de las plantaciones de cacao es un problema de importancia econmica a nivel departamental y nacional, teniendo en cuenta que el consumo de este producto es mucho mayor que la tasa de produccin, las micorrizas se constituyen como una herramienta til para la sostenibilidad y aumento de produccin de los cultivos de cacao.

2. JUSTIFICACIN

Los fertilizantes qumicos son sustancias que enriquecen el suelo y promueven el desarrollo vegetal, son de gran ayuda si, se quiere lograr un mejor rendimiento y produccin en los cultivos. Muchos agricultores no realizan la aplicacin de estos productos debido a los altos precios que en muchas ocasiones registran.

En los suelos naturales todas las especies forestales incluyendo el cacao forman asociaciones simbiticas y mutuamente benficas entre sus races y hongos endfitos especializados (Guerrero et al, 1996). Esta formacin raz-hongo es llamada micorriza y cuenta con un alto potencial biofertilizante. El 95% de las plantas dependen de las micorrizas para crecer y sobrevivir, lo que es evidenciado por la baja supervivencia de plantas no micorrizadas cuando son plantadas en suelos con carencia de hongos micorrzicos (Alarcn, 2007).

En la actualidad hay una gama de productos biofertilizantes internacionales y algunos nacionales a base de MA, la efectividad de la inoculacin depender del balance de factores ecofisiolgicos en el sistema planta-suelo, lo cual significa que un mismo inculo puede desencadenar efectos muy variados sobre un cultivo, dependiendo del tipo de manejo agronmico que se realice. Por lo tanto, no se puede generalizar el efecto de un tipo de micorrizas sobre todos los rboles ni sobre todos los ecosistemas. (Molina L. y Col.2005).

Sieverding (1990) afirman que existe un desconocimiento acerca de la efectividad de las especies nativas frente a las introducidas. Aunque la efectividad de la inoculacin para la mejora y mantenimiento de la salud y fertilidad del suelo, as como su efecto benfico en la produccin y el crecimiento de plantas de inters han sido extensivamente demostrados para diferentes sistemas a nivel de investigacin (Jeffries et al., 2003; Koide & Mosse, 2004), los reportes de efectividad derivados de aplicacin masiva en campo de inculo producidos para tal fin son ms escasos.

Read (1991) hace un planteamiento biogeogrfico segn el cual cada tipo de micorriza, tendra un juego particular de atributos y funciones adaptados a un ecosistema y ambiente edfico particular la cual hace un uso eficiente del fsforo del suelo y de los fertilizantes fosfricos, optimizar la productividad de los suelos y cultivos con niveles bajos de insumos, hace posible y rentable la produccin vegetal en condiciones adversas (de fertilizacin, presencia de metales pesados, desertificacin), ayudar a establecer cultivos en suelos erosionados o degradados.

Departamentos como Bolvar y Cesar son zonas que se han caracterizado en los ltimos aos (1990-2006) por presentar especialidades de cacao en grano nico reconocidas por empresa internacionales como producto con caracterstica nicas y que por lo tanto puede ser transado a precios ms altos en los mercados internacionales. Sin embargo uno de los principales problemas que afecta la

produccin de estos departamentos es la enfermedad fungosa conocida tradicionalmente como la moniliasis, que es el factor ms limitante para la produccin de cacao en todo el pas, causando graves prdidas representadas en ms del 40% de la cosecha anual (Barreras, 2007)

Ante todas estas dificultades presentadas en la regin del Cesar especficamente en Pueblo Bello, reconocida como zona potencial de alta produccin de cacao. El proyecto en cuestin se propone obtener un inoculo como biofertilizante,

compuesto de hongos nativos (MA), con el objeto de mejorar las condiciones edficas de las plantaciones y proporcionar muchos beneficios a las plntulas y a los rboles adultos, especialmente en la obtencin del agua y los nutrientes que mejoren la productividad del cultivo y mayor tolerancia a patgenos que actualmente afectan a estos cultivos en el Cesar.

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo General

Evaluar la produccin de esporas de hongos Micorrizicos Arbusculares (MA) nativos obtenidos de cultivo de cacao (Theobroma cacao) en plantas trampas de maz (Zea mays) fertilizadas y no fertilizadas.

3.2 Objetivos Especficos

Obtener esporas de hongos MA nativos del cultivo de Cacao del municipio de Pueblo Bello- Cesar. Multiplicar las esporas nativas utilizando plantas trampa de maz (Zea mays). Evaluar la infectividad y la efectividad de los hongos MA nativos obtenidos

del cultivo trampa de maz (Zea mays). Fertilizadas y no fertilizadas. Identificar las esporas de los hongos MA nativos obtenidos y multiplicados en el cultivo trampa de maz (Zea mays).

4. MARCO TERICO 4.1 Antecedentes de la Investigacin

La produccin a gran escala de inculos de hongos MA se inici en los aos 80 90s, habiendo en la actualidad un amplio nmero de compaas registradas para este fin en todo el mundo (Dalpe & Monreal, 2003). Los sistemas de produccin han evolucionado considerablemente en los ltimos aos, de tecnologas relativamente simples a otras ms complejas, como los mtodos in vitro. Actualmente, el inculo es producido para propsitos comerciales de diversas maneras.

En general, la investigacin en el rea de microbiologa en Colombia ha tenido un buen desarrollo en campos biotecnolgicos orientados a la solucin de necesidades particulares relacionadas con las condiciones tropicales del pas, la caracterizacin de microflora de plantas nativas de nuestros ecosistemas con aplicacin en la produccin de biofertilizantes. Se puede decir que se han obtenido desarrollos con impacto a nivel econmico en diferentes campos.

En el estudio de los hongos que forman endomicorrizas, principalmente de tipo arbuscular MA, la Universidad Nacional Palmira ha estado comprometida desde el ao1983 y en 1984, los estudios se enfocan hacia el conocimiento de MA en agroecosistemas de importancia estratgica como es el caso del caf, yuca,

gramneas, hortalizas y frutales, indagando en primera instancia sobre especies nativas y tambin sobre respuestas a inoculaciones con estos hongos. En esta sede existe como programa de investigacin el estudio de endomicorrizas en agroecosistemas y ecosistemas, con varias lneas de trabajo; sin embargo, el trabajo en el campo ha mostrado que los MA son un componente del sistema y que slo en la medida que se integra su manejo a los otros componentes, es posible hacer un uso de sus potencialidades.

Existen instituciones en donde se estn adelantando procesos de obtencin de patentes a nivel nacional como es el caso del Instituto de Biotecnologa de la Universidad Nacional de Colombia - IBUN.

El segundo caso de estudio est representado por CENICAF quien ha establecido un modelo para la produccin de diferentes microorganismos biocontroladores de plagas y enfermedades en el cultivo de caf, adems de adelantar investigaciones relacionadas con el empleo de microorganismos como biofertilizantes con miras a establecer una caficultura biolgica. El modelo de convenio internacional con la Comunidad Europea (proyecto INCO) firmado entre varios pases tiene como fin la caracterizacin y produccin de inculo micorrzico all se observa que a partir de la obtencin y caracterizacin de micorrizas vesculo arbusculares (MA) se establece una coleccin cuyo manejo tecnolgico (cultivo

monoaxnico), inoculacin y formulacin favorece el establecimiento de musceas (pltano y banano) micropropagadas.

En Colombia, el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) inici trabajos de investigacin con micorrizas MA desde la dcada de los 80, donde se evalu su importancia agronmica en cultivos tropicales como yuca y algunas pasturas. Se iniciaron trabajos de recoleccin de hongos nativos, aislamiento e identificacin de micorrizas originarias del Valle de Cauca, Llanos Orientales, entre otras. Como resultado de estas investigaciones se form un Banco de Germoplasma, y algunas recomendaciones relacionadas con su biodiversidad potencial de uso en la agricultura. Existen tambin experiencias positivas con la aplicacin de inculos de micorrizas (Glomus, Scutellospora y Entrophospora) en frutales tropicales.

La Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria (CORPOICA) es una entidad con gran trayectoria y reconocimiento en el pas. Mediante convenio con el Ministerio de Agricultura y el Instituto Colombiano Agropecuario (ICA), administra el banco de germoplasma de microorganismos (4.500 cepas) que son de inters en biofertilizacin y fotoproteccin, han obtenido biofertilizantes (Rhizobium, Bradyrhizobium, micorrizas).

Ejemplo de este trabajo es el realizado por los tcnicos de la Regional Siete de CORPOICA, quienes realizaron aislamientos de micorrizas en muestras de suelo

de la rizsfera de plantas de cacao, tomadas a diferentes altitudes de las zonas de Ro negro, Landazur, El Carmen y San Vicente de Chucur. Las micorrizas fueron analizadas en el laboratorio de microbiologa del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), concluyendo que para la multiplicacin e inoculacin de estos microorganismos benficos en el cultivo de cacao, es aconsejable la utilizacin de micorrizas nativas, ya que tienen mejor capacidad de adaptacin al medio; si se aplican micorrizas forneas se corre el riesgo de que ocurra competencia entre ellas.

En Colombia, la diversidad de climas y ecosistemas hace que la multiplicacin de los cultivos vare por las diversas condiciones agroecolgicas, y estos factores son las mayores limitantes para la produccin sostenible y eficiente. Los microorganismos tienen un gran potencial para contribuir a la solucin de mltiples problemas de la agricultura, dentro de los cuales, los biofertilizantes con base en Micorrizas Arbusculares MA son una alternativa para reducir prdidas en los procesos de multiplicacin de especies. Estas tecnologas tienen aplicacin de fcil transferencia para los pequeos productores ya que son de bajo costos.

En la costa atlntica se est incursionando en el estudio microbiolgico y la aplicabilidad que tienen estos sobre el suelo, CORPOICA ha financiados estudios microbiolgicos con nfasis en micorrizas, especialmente con el objeto de aumentar la produccin de especies de importancia econmica en la Costa

Atlntica como pltano, algodn, yuca y ame, mediante el desarrollo e implementacin de metodologas de manejo y produccin, que incluyan las micorrizas arbusculares.

Sin embargo en el departamento del Cesar hay mucho por hacer acerca de la multiplicacin y obtencin de especies nativas de hongos MA que sirva para mejorar la produccin y sostenibilidad de un cultivo especfico. Estudios financiados por la Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria (CORPOICA) ha incursionado en el estudio de las micorrizas sobre suelos

algodoneros deteriorados en Codazzi y san Juan del cesar, obteniendo respuestas positivas en las plantas tratadas.

Las micorrizas tienen gran potencial para contribuir a una produccin sostenible. Sin embargo, se resalta la importancia de profundizar en la investigacin sobre el uso de micorrizas nativas o del sitio, lo que implica conocer ms sobre la relacin hongo-planta, buscando aislar cepas especficas que permitan potencializar el crecimiento y productividad de los rboles en determinados agroecosistemas y evaluar las interacciones de estas con otros microorganismos de dicho suelo.

El estudio de microorganismos en un cultivo con produccin sostenible y sin aplicacin de agroqumicos como ocurren en las plantaciones de cacao de Pueblo Bello - Cesar. Se pueden detectar actividades rizosfrica importantes y reconocer

microorganismos promisorios para mejorar el estatus de nutrientes en el suelo y la productividad en los cultivos, informacin que se divulgara en la zona estimulando ms la incursin en el establecimiento de ms hectrea cultivable con este sistema agroecolgico con produccin. menos costos de insumos para mantener la

En la evaluacin del proceso de multiplicacin de hongos MA, se han usado diferentes tipos de inculos, entre ellos nativos de agroecosistemas bananeros del Urab (Antioquia-Colombia),con diferentes plantas hospedadoras para determinar la infectividad y efectividad sobre plantas de banano (Musa AAA cv. Gran Enano). La colonizacin micorrizal promedio general de los MA a las plantas trampa fue de 37,76. Se ha observado que las plantas micorrizadas se benefician en diferente magnitud. (Usuga Osorio; Castaeda Snchez 1999)

4.2 Bases Tericas 4.2.1 La micorriza Las micorriza debe entenderse como una estructura especializadas con diversas funciones, la cual se origina al asociarse, en forma mutualista, diversos grupos de hongos especficos con el sistema radical de la planta.

4.2.2 Tipos de micorrizas 4.2.2.1Ectomicorrizas

Las ectomicorrizas crecen en el exterior de las races formando una autntica capa que envuelve a aquellas y que se llama el manto creciendo hacia el interior entre las clulas formando retcula que recibe el nombre de red de Harting.

Las ectomicorrizas en general son bastante especficas, lo que quiere decir que una especie de hongo solo puede vivir con una o unas pocas especies de plantas.

Las esporas slo germinan en contacto con una raz y las esporas sin germinar tienen un perodo de viabilidad tambin corto. Adems los hongos de este grupo son adems especficos a la planta, en general especficos al medio (suelo, clima, etc.) y en general mucho ms sensibles a las agresiones externas que las endomicorrizas.

4.2.2.2 Endomicorrizas Son poco especficas, lo que quiere decir que una especie puede infectar a un gran nmero de especies vegetales. Son mucho menos sensibles a las agresiones externas que las ectomicorrizas, sus esporas germinan con facilidad alejadas de races vivas y pueden crecer considerablemente sin contacto con ninguna raz, lo que les permite localizar a stas y pueden sobrevivir durante dilatados perodos de tiempo (meses) sobre trozos de raz si otras condiciones no son adversas. Como su nombre indica viven en el interior de la raz, en los espacios intercelulares y si emiten hifas al interior de las clulas que se subdividen formando estructuras en rbol (arbsculo) dan origen al grupo de hongos micorrzicos ms abundante que se conoce.

Proceso de infeccin de la micorriza La infeccin o colonizacin de una raz por parte de un hongo micorrizgeno es un proceso que involucra una secuencia de etapas reguladas de una precisa interaccin entre endosimbionte y hospedero.

La pre-infeccin est asociada a la actividad de los propgulos infectivos presentes en el suelo que circunda la raz. Dichos propgulos pueden ser esporas o micelios fngicos. Este ltimo, generalmente se encuentra vinculado a raicillas de plantas vivas o segmentos de raz infectada. La penetracin se inicia con la formacin de un punto de entrada que se caracteriza por el desarrollo de un abultamiento o apresorio en el punto de contacto sobre la superficie de la raz. Cada espora genera un solo punto de entrada, mientras que un segmento de raz puede eventualmente generar ms de uno. No es del todo claro si el mecanismo de penetracin esta mediado por un evento enzimtico, por un evento mecnico o por una combinacin de ambos.

Una vez que penetre el hongo se asegura un proceso proliferativo que conduce al establecimiento de una unidad de colonizacin que se puede extender hasta un centmetro de distancia a partir del punto de penetracin. El avance de la infeccin est restringido a la epidermis y el parnquima cortical. La unidad de colonizacin avanza mediante el crecimiento de hifas aseptadas que se extienden por entre las

clulas corticales y que generan estructuras caractersticas como los arbsculos y las vesculas Algunas semanas despus iniciada la infeccin, el hongo est en condiciones de esporular, lo cual supeditado a las condiciones ambientales del suelo en particular la humedad parece ser un factor regulador de importancia, ya que se ha visto que le estrs hdrico en el suelo dispara la esporulacin (Guerrero, et, al 1996).

Las hifas externas estn en capacidad de reinfectar el mismo sistema de raz del cual se origina. Algunas de estas hifas generan puntos de entrada que provocan nuevas unidades de colonizacin, lo cual supone la infeccin avanza a lo largo de la raz a travs de unidades de colonizacin discontinuas. Este proceso de proliferacin se puede trasladar a otros sistemas de raz vecinos de la misma o diferente especie de planta. Se ha establecido que los hongos micorrizgenos se pueden mover en el suelo a razn de 0.6 -3.2 m/ao, lo cual da una idea de las posibilidades de expansin de la infeccin micorrizica (Powell, 1970, citado por guerrero, 1996). Figura 1

Figura 1: Proceso de formacin de micorriza arbuscular (Guerrero, et, al 1996)

Las ventajas de la aplicacin de micorrizas en un sistema agroecolgico son: Mayor crecimiento y desarrollo de las plantas en beneficio de la adaptacin

y eficiencia de stas al facilitar una mayor absorcin de nutrientes minerales del suelo. La capacidad de la raz para absorber nutrientes del suelo unido al movimiento de estos en el suelo, permiten su absorcin por la planta. La tasa de absorcin de iones de alta movilidad en el suelo (como el nitrato) est determinada por la especie vegetal o la variedad, y la de iones poco mviles, como el P, Zn, Mo y en menor grado el K, S y NH4, dependen ms de la densidad de las races por volumen de suelo. En este caso, la absorcin de los nutrientes la determina la morfologa de la raz y el crecimiento del hongo micorrcico en el suelo. Las hifas del hongo no son capaces de absorber del suelo nutrientes diferentes a aquellos que estn disponibles para la raz, bien sea en la solucin del suelo o las rpidamente intercambiables. La micorriza solamente aumenta la eficacia de la absorcin de nutrientes por la planta; as, las plantas cultivadas y asociadas con hongos eficientes pueden usar el abono aplicado entre 2 y 10 veces ms que las plantas micorrizadas y abonadas (Mosse y col., 1986). La solucin del suelo contiene una concentracin relativamente baja de P y alrededor de la raz se forma rpidamente una zona carente de este elemento. Como la hifa de los hongos formadores de la micorriza vesculo-arbuscular (MA)

crecen mas all de la zona agotada de la raz, permiten que el suelo sea mas intensivamente explorado. El P, una vez absorbido por la hifa en forma de

ortofosfato, es transportado por polifosfato hacia el interior de la raz donde es liberado (Herrera y col., 1984).

Mejora el reciclado de nutrientes en el suelo.

La micorriza interacta significativamente en los reciclajes de nutriente por la intensiva exploracin del suelo a travs de las hifas de los hongos MA, incluyndose la perdida de nutrientes por la fijacin qumica o la lixiviacin, despus de la mineralizacin de la materia orgnica.

Aumenta la eficiencia de otros microorganismos que tienden a asociarse

con ellas, tales como Rizhobium, Azospirillum, Azotobacter, que a su vez incrementan la captacin de nutrientes para las plantas. (Fitter, 1998), encontr que las micorrizas interactan con otros organismos del suelo y estas interacciones pueden inhibir (crean competencia entre ellos) o estimular (forman asociaciones mutualistas). Sin embargo, en muchos casos no ha sido posible definir completamente dichas interacciones. Entre los organismos mencionados pueden estar hongos patgenos (a nivel del micelio interno), protozoarios, nemtodos y artrpodos.

Mejora el control de enfermedades y la disminucin en gasto de insecticidas

y funguicidas, con el uso de plantas micorrizadas. En investigaciones realizadas, se encontr que la mezcla de bacterias del genero Rhizobium con micorrizas, dan mayor vigor a la planta, lo cual la hace ms resistente al ataque de patgenos, porque las micorrizas forman una barrera fsica impenetrable en la superficie de las races, variando en grosor y densidad (INGHAM, 2003). Adems se encontr que especies de micorrizas parasitan a otros hongos como es el caso del Trichoderma y lo destruyen. Sin embargo existen interacciones donde las micorrizas pueden sobrecolonizar la planta y convertirse en parsitos ( FITTER AH, GARBAYE J, 1994 ).

Produce plantas ms resistentes al ataque de patgenos.

Varios autores concuerdan en que las micorrizas pueden contribuir a la salud de la planta y a su productividad al aumentar el desarrollo de tolerancia a enfermedades y parsitos (READ D. J. 1991). Las ectomorrizas protegen la raz ya que reciclan los carbohidratos, aminocidos y otros compuestos producidos por las races, capaces de atraer agentes patgenos. Adems proveen una barrera fsica a patgenos debido a la formacin del manto, en el cual las hifas individuales o cordones de hifas crecen hacia afuera, introducindose en el suelo, y hacia adentro, intercalndose entre las clulas del crtex de la raz a travs de la lmina media, formando un entramado denominado red de Harting.

En esta red el micelio deja de estar tabicado, es xenofitico, lo que se interpreta como ventaja para acelerar los procesos de intercambio. La red de Harting puede sintetizar compuestos como el diatretinenitrilo, con efecto de tipo antibitico. As mismo, (RADDATTZ E. 2002) reporta tolerancia contra ataques de nemtodos.

Facilitan la adaptacin a suelos salinos.

La salinidad es un factor limitante de la produccin agrcola, los estudios sobre micorrizas y tolerancia de las plantas a este estrs es relativamente reciente. Resultados reportados por Barea, 2003, demuestran el efecto inducido por la micorrizacin en la disminucin de la deficiencia nutritiva provocada por antagonismos inicos, efecto secundario del estrs salino, lo que permite crecimiento mayor de las plantas micorrizadas. Concretamente, las micorrizas mejoran diversos procesos fisiolgicos (incremento del ritmo de intercambio de CO2, transpiracin, cambios en la conductancia estomtica, eficacia en el uso de agua), aparte del derivado de la captacin de nutrientes. Adicionalmente, (Corredor 2003) y( Barea, 2003),

sugieren otros mecanismos para justificar el papel de las micorrizas en relacin con la tolerancia a salinidad, tales como la induccin de cambios hormonales o la mejora en la capacidad de agua.

Contribuyen con la disminucin de la erosin. (Molina L. y Col 2005)

Se sabe que tanto el medio agrcola como los ecosistemas naturales pueden ser afectados por procesos de degradacin de diversa ndole, en cuanto a su origen y naturaleza, que inciden en la productividad y calidad de las cosechas y/o en la estabilidad, diversidad y productividad de los ecosistemas. La utilizacin de micorrizas no slo ha facilitado mejor revegetalizacin en condiciones particulares, como pueden ser la recuperacin de suelos degradados por la minera y la introduccin de especies exticas en distintas partes del mundo, sino tambin ha mejorado la repoblacin de especies vegetales en suelos forestales (3). Lo anterior es confirmado por (LONDOO C, 2002), quien manifiestat que cuando se aplican hongos edficos, la prdida por lixiviacin, fijacin y erosin se disminuye, dado que la red de hifas captura y trasloca elementos nutritivos hacia la planta desde sitios no explorados por la raz; as en los sistemas selvticos de los trpicos hmedos, el reciclaje de nutrientes de la materia orgnica descompuesta hacia la planta, la hacen los hongos, principalmente por los sistemas micorrcico.

La falta de especificidad en la asociacin micorrizal se ha mostrado con estudios moleculares de DNA, al encontrar que una misma raz puede albergar tres o ms especies de hongos micorrcicos (Clapp et al., 1995). As mismo tambin se ha comprobado la colonizacin de diferentes sistemas radicales por parte de un mismo organismo fngico (Chiariello et al., 1982; Francis & Read, 1984). La

proporcin de especies de hongos micorrcico-arbusculares MA y especies de plantas descritos (150/ 225000) puede explicar la baja especificidad existente entre planta y hongo en la asociacin micorrcica (Zobel et al., 1997). Esta falta de especificidad puede condicionar una considerable diversidad en los componentes de la red de micelio extramatricial, como sistema captador de nutrientes.

La ubicuidad y biodiversidad que presenta la micorriza dan la idea de un organismo multifuncional, cuyo beneficio no se limita solamente al aumento de toma de nutrientes -Fsforo especialmente- debido a un volumen mayor de suelo explorado con ayuda de las hifas del hongo (Newsham et al., 1995). Tambin est jugando un papel muy importante en la composicin de una comunidad vegetal, pues el micelio presente en el suelo puede gobernar el establecimiento de una planta. Adems, la colonizacin de material de origen vegetal -y posiblemente animal- en descomposicin, hace de la micorriza un posible puente directo entre plantas cultivadas y enmiendas orgnicas. Recientemente se ha propuesto un rbol filogentico (cuadro 1) donde se incluyen siete familias ancestrales, Glomeraceae Paraglomeraceae, Archaeosporaceae, Acaulosporaceae, Gigasporaceae, diversisporaceae y pacisporaceae. De estas dos ltimas familias estn en estudio para su reaclasificacion. Asi mismo se

incluye el gnero sclerocystis como parte del genero Glomus. (Schubler et al, Walter, 2004)

Cuadro 1. Ubicacin taxonmica y gneros de hongos formadores de micorriza arbuscular (Schubler et al, Walter, 2004)

Taxonoma basada en la morfologa de las esporas MA Prcticamente, para la identificacin taxonmica de las esporas MA se toman en cuenta las caractersticas morfolgicas de la hifa de sostn, el tamao de la espora, el cual es muy variable aun centro de la misma especie, sin embargo se tienen algunos rangos de estas. Para Acaulospora entre 50-150 um siendo las mas comunes entre 50 y 100 um, para Entrophospora entre 50- 150 um, para

Gigaspora 250- 300 um y 300- 450 um, Scutellospora 150- 400 um, sclerocystis 50- 350 y Glomus 10- 250. Morton (1988) resume 11 formas diferentes que las esporas de MA pueden tener (figura 2). Las esporas tienen caractersticas altamente variables, probablemente porque son afectadas por el medio ambiente fsico en el cual ellas se forman. Con excepcin de sclerocystis, en la mayora de los otros gneros las esporas son globosas o subglobosas, se han reportado proporciones de 44, 27 y 36% en Glomus, Acaulospora y Gigaspora respectivamente (Gonzalez- Chavez, 1989).

Figura 2: Diversidad en forma de esporas de todos los gneros de hongos micorrizicos arbusculares. A: globosas, B: subglobosa, C: ovoboide, E: elipsoidal, F: piriforme, G: irregular, H: oblonga, I: reniforme, J: fusiforme, K: clavada (Gonzlez- Chvez, 1989).

La diferencia del color de muchas especies, puede ser debido a pigmentos en la pared de la espora o pigmentos del interior de esta. Tendencias significantes en el grado de color de la espora son evidentes a nivel de gnero (Morton 1988). Esporas de Glomus, Acaulospora y Scutellospora presentan un rango de color hialino a negro, espora de Entrophospora exhiban variabilidad similar, pero cada una de las tres especies descritas de este gnero, tienen un diferente color. Esporas de Sclerocystis y Gigaspora tienen un rango ms restringido en color, siendo consistentemente caf en la primera y hialinas y amarillo plido en las ltimas.

El nmero de capas es una caracterstica importante que se considera para identificacin de esporas, aunque varan aun dentro de gneros. Glomus, sclerocystis y Gigaspora usualmente tienen 1-2 capas (80, 100 y 72% respectivamente). Ms de tres capas estn presentes en esporas de Acaulospora, Scutellospora y Entrophospora (75, 90 y 100% respectivamente, Morton 1986). A esta observacin, se adiciona la definicin de Walker (1983) que es el grupo de pared, entendido como la agregacin de capas, las cuales pertenecen en proximidad a otras a pesar de que la espora est rota. Observaciones de la ornamentacin de las capas ayuda de gran manera a la identificacin de las esporas. La ornamentacin de la capa en general se presenta en la capa laminada, nica y membranosa. Las ornamentaciones no han sido descritas en las capas de Gigaspora o sclerocystis. La ornamentacin de la capa

laminada puede ser: proyecciones reticulares, espinas agrupadas. Verrugas, retculos, etc. En la capa nica: espinas poligonales, pstulas, tubrculos, etc.

5. MATERIALES Y MTODOS

5.1 Obtencin de esporas nativas MA de cultivo de cacao.

5.1.1 Toma de muestras de suelo. Para esta fase se seleccion una plantacin de cultivo de cacao (Theobroma cacao) con rboles de diferentes edades (figura 3), se dividi el rea de estudio de la siguiente forma: Zona A, rboles de 1-5 aos Zona B, rboles de 5-15 aos Zona C, rboles de15-30 aos

Figura 3: Toma de las muestras de suelo en el municipio de Pueblo Bello- Cesar

Se tom de cada zona un promedio de 15 muestras de suelo y races que se homogenizaron para cada zona, estas se guardaron en bolsas plsticas de ziploc y se refrigeraron a -4 grados centgrados y posteriormente se secaron a

temperatura ambiente por tres das.

5.1.2 Preparacin del pre- Inculo Para la obtencin de las esporas del pre-inculo se utiliz el mtodo de tamizaje flotacin-filtracin propuesto por Sieverding, (1983) Del Centro De Investigacin De Agricultura Tropical (CIAT) y el mtodo de L-DRYING modificado de Tommerup y Kidby, (1979) para el secado de las muestras cuyo procedimiento es el siguiente

5.1.2.1 Tamizaje-flotacin-filtracin: Se pesaron 100g de suelo y se le agreg 1 litro de agua, se agit vigorosamente, luego se dej sedimentar por 5 minutos las partculas pesadas y se procedi a decantar a una serie de tamices de 150 um, 250 um, 65 u.m y 45 u.m uno colocado sobre el otro (figura 4). Despus se lav la muestra con un chorro fuerte de agua para que las partculas pequeas pasaran a los tamices de menor calibre. Estas fracciones fueron lavadas en un Beaker de 500 mL y se llen hasta partes con agua, luego se agit la suspensin fuertemente por 10-15 segundos,

posteriormente se dej sedimentar el suelo durante 2 min, se decant lentamente en un embudo de Buhner (figura 9) al cual se le coloc un papel filtro y se

complement con una bomba de vaco, de manera que todo el material que se encontr flotando en la superficie del agua qued atrapado en el papel filtro, se repiti el procedimiento con el suelo precipitado en el Beaker dos veces ms.

Del papel filtro se realiz la posterior obtencin, observacin y cuantificacin de las esporas al microscopio con los objetivo de 4X, 10X Y 40X. Para su respectiva multiplicacin.

5.1.2.2 Secado de las muestras El tamizado obtenido del suelo nativo se mezcl y se llev a un recipiente de vidrio para un posterior secado de las muestras, en esta etapa las muestras se llevaron a una estufa de secado a una temperatura de 38- 40 hasta que toda el agua se evapor. El suelo obtenido se macer y fraccion en porciones de 10g el cual se utiliz como inculo para las plantas trampa.

Figura 4: Tamizado de las diferentes muestras

5.2 Multiplicacin de las esporas nativas de hongos MA en plantas trampas de maz (Zea mays)

5.2.1 Material vegetal : Se utilizaron semillas de maz (Zea mays) variedad ICA-109. Las semillas

seleccionadas para la siembra se desinfectaron con 500 mL de una solucin de hipoclorito de sodio al 1% durante 1 minuto. (Figura 5). Se seleccion como hospedero de reproduccin de hongos MA, el maz (Zea mays) ya que la literatura recomienda, que para multiplicar organismos micorrizicos la planta trampa debe ser una gramnea, para disminuir el peligro de los patgenos que pueden ser iguales o muy parecidos (Sieverding, 1984). Adicionalmente, el maz es de rpido crecimiento, desarrolla una abundante raz que es rpidamente infectada (Hayman et al., 1976; Owusu-Bennoah y Mosse, 1979; Skipper y Smith, 1979).

Figura 5: Semillas de maz (Zea mays)

5.2.2 Preparacin de sustratos: la preparacin del sustrato tuvo la siguiente relacin 2:1; cascarilla de arroz. Se tom suelo de la zona en estudio y junto con la cascarilla de arroz se procedi a dividirse en fracciones de 1000g, cada una por separado se guardaron en recipientes de aluminio tapados con papel del mismo material. Posteriormente los recipientes fueron llevados a una estufa con una temperatura constante de 100C durante 2 horas para su esterilizacin con el fin de eliminar microorganismos que establecieran competencia y la posible presencia de propgulos de micorrizas ya establecidas. Despus de las 2 horas, los recipientes se retiraron de la estufa y se dejaron en reposo por 48 horas. (Figura 6) 2 de suelo y 1 de

Figura 6: Preparacin de los sustratos y tratamiento

5.2.3 Siembra Para el establecimiento del micro-cultivo se realiz la mezcla del sustrato teniendo en cuenta la relacin de 2:1; 2 de suelo y 1 de cascarilla de arroz. Se llevaron a unos 20 recipientes de icopor con capacidad de 1000g que sirvieron como macetas. Se plantaron 4 semillas de maz (Zea mays) por cada maceta teniendo un total de 80 semillas sembradas. (Figura 7)

Figura 7: Siembra y aplicacin del inculo en los diferentes tratamientos

5.2.4 Preparacin de los Tratamientos El experimento consta de tres tratamientos de los cuales, dos de ellos estuvieron inoculados con el pre-inoculo nativo obtenido de cultivo de cacao. El otro tratamiento no se vio afectado por ningn carcter externo y las plantas tuvieron la

oportunidad de desarrollarse por sus propios medios constituyndose en el tratamiento control. Estos tratamientos se designaron de la siguiente manera:

Tratamiento 1: Inoculadas fertilizadas Tratamiento 2: Inoculadas no fertilizadas Tratamiento 3: Testigo o control

5.2.4.1 Aplicacin de pre-inculo:

Se tomaron 10 macetas con semillas y a cada una de ellas se les aplic 10 gramos de pre-inculo a 5 centmetros de profundidad. Luego las otras diez macetas con sus respectivas semillas se dejaron sin inculo como tratamiento control.

Transcurridos 15 das despus de la siembra se procedi a realizar el corte (raleo) de las plantas mas pequeas dejando las mas desarrolladas en cada maceta con el fin de evitar competencia.

5.2.5 manejo de los tratamientos Se aplicaron soluciones nutritivas o iniciadoras buscando ajustar el nivel de nutrientes para el desarrollo de los hongos, ya que segn Brundrett, et al (1996) el

sustrato debe poseer un nivel moderado de nutrientes para estimular la asociacin entre el hongo y la planta. (Figura 8).

Para caracterizar al tratamiento 1

se preparo una solucin del fertilizante

Nutrifoliar, al 40% de concentracin. Que se le aplico al tratamiento 1 cada 15 das a partir de los 45 das de edad, hasta los 90 dias de edad. Las plantas tenan una altura promedio de 23.5 cm . La composicin del fertilizante nutrifoliar se muestra en el cuadro 2.

Elemento Nitrgeno total Fosforo asimilable Potasio soluble Magnesio Azufre Cobre Hierro Manganeso Molibdeno Zinc

g/L 200,0 g/L 100,0 g/L 50,0 g/L 10,0 g/L 14,0 g/L 1,5 g/L 2,5 g/L 1,0 g/L 1,0 g/L 0,03 g/L

Cuadro 2: Composicin del fertilizante Nutrfoliar por g/L

La duracin del desarrollo de las plantas de maz fue de tres meses, en condicin de vivero.

Figura 8: Aplicacin de las soluciones nutritivas a los tratamientos

5.3 Evaluacin de la infectividad y efectividad de la multiplicacin de los hongos MA nativos Las variables respuesta a utilizar son los nmero de esporas por gramo de suelo, porcentaje de infeccin y el desarrollo vegetativo (altura y peso seco) de las plantas.

5.3.1 Numero de esporas por gramo de suelo utlilizando el mtodo de Flotacin Filtracin planteado por el CIAT. Se pes 10g de suelo tamizado y se llev a un beaker de 500 ml, se le agreg 300 ml de agua y luego se agit la suspensin fuertemente por 10-15 segundos, posteriormente se dej sedimentar el suelo durante 2 min. Se decant lentamente en un embudo de Buhner (figura 9) al cual se le coloc un papel filtro y se complement con una bomba de vaco, de manera que todo el material que se encontraba flotando en la superficie del agua pas al papel filtro (figura 10). Luego se repiti el procedimiento con el suelo precipitado en el beaker unas dos veces ms. Para cada fase de decantacin se cambi el papel filtro, enumerndolos para una posterior obtencin, observacin y cuantificacin de las esporas al microscopio con los objetivo de 4X, 10X Y 40X.

Figura 9: Mtodo Flotacin- filtracin de las muestras de suelo

Figura 10: Papel filtro con los sedimentos despus del filtrado y corte del mismo para observar al microscopio

5.3.2 Determinacin de porcentaje de infeccin

Para hallar el porcentaje de infeccin se dividi en dos etapas; la primera consisti en la tincin de las races de los diferentes tratamientos y la segunda etapa en calcular la infeccin mediante el mtodo de interceptos de McGonigle et al (1990) para determinar porcentaje de MA

5.3.2.1 Tincin de las Races Se tomaron las races de las plantas trampas del tratamiento 1 y el tratamiento 2 por separado, las races se lavaron con abundante agua con la ayuda de un tamiz convencional para eliminar todo el suelo, luego se introdujeron en un tubo de ensayo al cual se agreg una solucin de hidrxido de potasio (KOH) al 10% hasta cubrir las races por completo y se llev al bao de mara a una temperatura de 97 C por un tiempo de una hora con el fin de despigmentar las las races. Transcurrido este tiempo y con ayuda de unas pinzas se lavaron las races con agua corriente, luego se adicion acido clorhdrico (HCl) al 10% hasta taparlas completamente. Se dejaron reposar 15 minutos, pasado este tiempo se escurri el exceso de cido pero sin lavar las races. Se le adicion el colorante (azul de tripn en lactoglicerina) y se llevaron las races a bao de mara durante 5 minutos. Posteriormente se decant el colorante y se filtr para reutilizarlo, las races teidas se conservaron en lactoglicerina limpia para su posterior observacin al microscopio. (Figura 11)

Figura 11: Mtodo para la tincin de las races

5.3.2.2 Evaluacin de la colonizacin micorrizica por el Mtodo de Interceptos de McGonigle Etal (1990)

Se tomaron las races ya teidas y se arreglaron los segmentos en las lminas portaobjetos a lo largo (figura 12). Luego se le coloco un cubreobjeto suavemente para evitar la formacin de burbujas, y se llev al microscopio. El campo ptico del microscopio se movi a travs de la lmina, se utiliz el indicador de ocular como lnea de interseccin. En cada interseccin se registr algunas de las siguientes posibilidades.

Figura 12: Races de las diferentes plantas en laminas portaobjetos

La lnea puede interceptar: NI=seccin no infectada A=arbsculos V=vesculas H=hifas micorrizicas (exclusivamente) Se debe tener en cuenta que:

1.

Arbsculos (A) y vesculas (V) pueden ser interceptados a la vez, en este caso se sum un registro para cada categora, pero se campo para el total de intersecciones observadas. sum un solo

2.

Las hifas micorrizicas pueden tambin fueron interceptadas en A y V pero no se sumaron a H ya que en esta categora se registraron solo los casos de presencia exclusiva de hifas en la interseccin.

3.

Las hifas que se registraron en H fueron solo las que se consideraron micorrizicas basndose en caractersticas morfolgicas.

4.

Las intersecciones con hifas de las que no se tuvo la certeza de que eran micorrizicas o bien con hifas claramente pertenecientes a otros hongos no micorrizicos se registraron como NI.

Se examinaron 100 intersecciones para cada muestra de raz asignando cada interseccin en una de las categoras mencionadas: NI, A, V y H. El porcentaje de micorrizacin (%M.A) se calcul de la siguiente manera. %M.A= (# Intersecciones NI) x 100 / # Intersecciones observadas.

5.4

Identificacin de esporas de hongos MA multiplicados en el

cultivo trampa Las plantas se midieron cada 15 das a partir de los 45 das hasta completar los tres meses (90 das), realizndose en total 4 mediciones por tratamiento, posterior a esto se eliminaron los riegos para inducir un estrs hdrico con el objeto de estimular la esporulacin de los hongos durante una semana. Mas tarde se procedi a medir y a separar la planta en hojas, tallo (parte area) y raz. (Figura 13, 14). Este material vegetal fue pesado e introducido en bolsas de papel previamente identificadas, luego se colocaron dentro de una estufa de secado a una temperatura de 70C por un perodo de 48 horas hasta obtener un peso constante, luego el material vegetal fue pesado nuevamente para determinar los indicadores de peso seco.

Figura 13: Corte de la raz y parte area de la planta

Figura 14: Peso de las races y parte area de las plantas

5.4

identificacin de los hongos nativos

multiplicados en las plantas

trampas de Maz.

Para la identificacin taxonmica de las esporas de MA se tuvieron en cuenta las caractersticas morfolgicas de las hifas de sostn, el tamao de las esporas, la forma y el color de las mismas. Segn el catalogo ilustrado de micorrizas arbusculares de la amazonia colombiana (Pea-Venegas C. P., Cardona G. I., Mazorra A., Arguellez J. H., Arcos A. L. Catalogo Ilustrado. Instituto Amaznico de Investigaciones Cientficas SINCHI, 2006.). (Schenck. Norman, the international culture collection of va mycorrhizal fungI (INVAM), Florida, 1985)

6. RESULTADOS Y DISCUSION

6.1 Porcentaje de Infeccin Micorrizal:

Se obtuvieron segmentos radiculares con presencia de micelio y de estructuras representativas de los hongos MA (arbsculos y vesculas). (Figura 15, 16,17). El anlisis de varianza realizado a la variable del porcentaje de infeccin mostr diferencias significativas entre porcentaje de infeccin del tratamiento 1 y el tratamiento 2. En los datos obtenidos se pudo observar que la infeccin de los hongos micorrzicos se ve influenciado por la cantidad de nutrientes presentes en el sustrato utilizado es decir, que el porcentaje de infeccin micorrizal es inversamente proporcional a la cantidad de nutrientes presentes en el suelo, tal como se observa en las graficas 14,15,16. El tratamiento con MA no fertilizado alcanz los valores mas altos en cada uno de los indicadores de infeccin micorrizal (Hifas, Arbsculos y vesculas). En relacin a este punto de vista algunos autores han sealado que el grado de micorrizacin y colonizacin del sistema radical se ve influenciado por factores como el grado de fertilidad del suelo y el pH (Barea, J. M. Y Azcon Aguilar, C. 1982). Esto se corrobor con un anlisis fisicoqumico realizado al sustrato de cada uno de los tratamientos (Anexo 13). Con respecto a los nutrientes del suelo, especficamente a la cantidad de fsforo se encontr que todos los tratamientos

mostraron niveles altos de este elemento, pero numricamente dentro de los tratamiento inoculados con MA, el tratamiento 2 se mostr con valores de 133,6 ppm; mientras que el tratamiento 1 tuvo un porcentaje de fsforo de 138,6 ppm, estos valores llamaron la atencin ya que diversos autores sealan que a medida que los niveles de fsforo en el suelo aumentan, se disminuye la infeccin micorrizal, esto se refleja en una diminucin del porcentaje de infeccin, tal como se aprecia en las plantas de tratamiento 1 las cuales presentaron los niveles de infeccin micorrizal ms bajos.

Figura15: Vescula observado en el objetivo 10X

Figura 16: Arbsculos observado en el objetivo 10X

Figura 17: Hifas observado en el objetivo 10X

Grafica 1: Porcentaje de infeccion por hifas

Para el porcentaje de infeccin por hifa los valores ms altos fueron alcanzados por las plantas del tratamiento 2 con un nivel de infeccin de 30,5 %, frente al tratamiento 1 con valores de 12,16% (Grafica 1)

Para el porcentaje de infeccin por arbsculos los valores ms altos fueron alcanzados por las plantas del tratamiento 2 con un porcentaje de infeccin de 2,333 %, mientras que en el tratamiento 1 no se encontraron dichas estructuras (grafica 2). Los arbsculos son un conjunto de hifas intracelulares que forman un enrollamiento con un alto potencial metablico el cual sirve como centro de intercambio bidireccional entre el hongo y la planta. Estos arbsculos tienen un perodo de vida muy corto que oscila entre 2 y 15 das, cuando un arbsculos muere o sucumbe es reemplazado por otro ms joven, este relevo se repite mientras el intercambio de nutrientes esta activo, cuando este intercambio cesa todos los arbsculos mueren y, de la colonizacin interna solo quedan las

vesculas que son estructuras de reserva de nutrientes del hongo. Este fenmeno se pudo apreciar en el tratamiento 1 en el cual no se encontraron arbsculos, pero si se detect la presencia de vesculas las cuales aparecen durante el periodo de vida de los arbsculos, evidenciando la presencia previa de arbsculos en el tratamiento 1 pero desaparecieron cuando ces el intercambio de nutrientes, debido a que el exceso de P, Mn, Fe, Cu y otros elementos, induce a una

disminucin en la asociacin simbitica del hongo MA- Planta. Y la planta se ve forzada a utilizar su propio sistema radical para la obtencin de estos elementos disminuyendo asi la infeccin micorrizal

Grafica 2: Porcentaje de infeccin por arbsculos

Para el porcentaje de infeccin por vesculas los valores ms altos fueron alcanzados por las plantas del tratamiento 2 con un porcentaje de 15.5, mientras que en el tratamiento 1 fue de 4.66. (Figura 3). Las vesculas son estructuras globosas cuya funcin es de almacenamiento o de reserva, ya que en su interior se encuentra densas gotas de grasa (Hodge A. 2000). La formacin de vesculas es posterior a la de los arbsculos y tiene lugar a partir del hinchamiento de una hifa generalmente terminal. Esta

estructura es muy comn en las especies del gnero Glomus Acaulospora, Archaespora, Entrophospora excepto Gigaspora y Scutellospora (honrubia et al 1992). En el gnero Glomus las vesculas se caracterizan por que pueden llegar a engrosar sus paredes y convertirse en esporas. Debido a que la produccin de vesculas depende de las actividades de los arbsculos, se puede afirmar que la cantidad de vesculas es directamente proporcional a la cantidad de arbsculos.

La disminucin de vesculas en el tratamiento1 est corroborada por estudios previos (Smith y Gianinazzi-Pearsson1989,Hetrick et tal 1989, Sieveverding 1991) observaron, que en ocasiones la fertilizacin con niveles altos de fosforo reduce los porcentaje de infeccin y deprime el desarrollo de arbsculos, vesculas, hifas externas e internas y disminuye tambin el nmero de puntos de penetracin y de esporas (Figura 18)

Grafica 3: Porcentaje de infeccin por vesculas

6.2 Altura de las plantas Los anlisis de varianza y la prueba de media de Dunnett realizados a los tratamientos 1, tratamiento 2 y tratamiento 3 no mostr diferencias significativas. Sin embargo numricamente se not una diferencia en las

plantas del tratamiento 2 (inoculadas no fertilizadas) en el incremento de la tasa de crecimiento, superando a los otros dos tratamientos (Grafica 4, figuras 18 y 19 ).

Cuando las plantas se asocian con el hongo para formar micorrizas arbusculares (MA), se incrementa la absorcin del fsforo y otros nutrientes presentes en la solucin del suelo por parte de estas plantas hospederas, esto es debido a que las hifas del hongo se extienden y exploran un mayor volumen de suelo, que sera imposible explorar con los pelos radiculares. Por esta razn, las plantas micorrizicas alcanza un mejor desarrollo que las no micorrizadas en suelos con bajos contenidos de fsforo disponible. Resultados similares fueron reportados en muchos trabajos por autores como (Saif, 1977;Tinker, 1978; Fortn et al., 2002).

Las estimulaciones de los hongos MA en el crecimiento de la planta estn normalmente acompaado de un incremento en el contenido y frecuentemente la concentracin de algunos nutrientes minerales en los tejidos de la planta.

En numerosos trabajos experimentales se ha puesto de manifiesto que como consecuencia de la formacin de la MA, tiene lugar normalmente una considerable estimulacin al ritmo de crecimiento de la planta. La causa de tales acciones es fundamentalmente inducida por el hongo, aunque como consecuencia de la formacin de la MA se producen diversos cambios fisiolgicos que con mayor o menor grado pueden contribuir dicho incremento al crecimiento (Smith y Read, 1997)

Grafica 4: Altura de las plantas en los tratamientos 1, 2 y 3.

Figura 18: Comparacion altura de plantas del tratamiento 2 y tratamiento 3

Figura 19: Crecimiento de parte foliar y raz de las plantas con micorriza y sin micorriza

6.3 Determinacin de biomasa (peso seco)

El anlisis de varianza realizado a la variable peso seco mostr diferencias significativas entre los tratamientos. En la prueba de medias por Dunnett realizada a la parte area (hojas y tallos) se observ que el mximo valor fue obtenido por el tratamiento 2 con un peso de 1,876 gr. (Grafica 5), de igual manera el tratamiento 2 alcanz un valor de 0,296 gr, siendo el ms alto en la variable peso seco de la raz. (Grafica 6). Analizando las variaciones en el tamao de las plantas, no es extrao que las caractersticas morfomtricas de la variable en cuestin sean mayor en las plantas del tratamiento 2, ya que segn otros autores la presencia de MA hace aumentar la tasa de crecimiento y un incremento en la produccin de biomasa, y que este efecto es mayor en suelos de baja fertilidad o desequilibrados nutrimentalmente, especialmente cuando el contenido de fosforo asimilable es bajo (Smith y Read, 1997). El aumento de la materia seca es debido a que las hifas de las MA exploran un mayor volumen de suelo aumentando as la capacidad de absorcin de una de las plantas del

nutrientes en la planta. Se pudo observar que

tratamiento 1 logro una altura de 35,6 cm y aun as el tratamiento 2 logr superarlo en la cantidad de peso seco, teniendo plantas con alturas de 33,6 cm, esto se debe a que la planta del tratamiento 1 a pesar de que eran altas posean tallos muy delgados, mientras que en las del tratamiento 2 tenan una altura cercana 35,6 cm y posean tallos con mayor dimetro.

Grafica 5: Porcentaje peso seco parte area

Grafica 6 : Porcentaje peso seco de la raiz

6.4 Anlisis de la diversidad de hongos micorrizicos

En la grafica 7 se presentan los conteos totales de las esporas correspondientes a 10 gramos de suelo seco. Para esta variable segn el ndice de margalef, que es una medida utilizada en ecologa para estimar la biodiversidad de una comunidad con base a la distribucin numrica de los individuos de las diferentes especies en funcin del nmero de individuos existentes en la muestra analizada. Tiene la siguiente expresin I=(s-1)/Ln N, donde I es la diversidad, s es el nmero de especies presentes, y N es el nmero total de individuos encontrados (pertenecientes a todas las especies). La notacin Ln denota el logaritmo neperiano de un nmero.

De acuerdo a este ndice la diversidad es baja para cada tratamiento. Pero en trminos generales el porcentaje de esporas por 10 gramos de suelo no es bajo para condiciones nativas, si tenemos en cuenta los datos reportados por Collins et al (1991) quienes encontraron entre 0 y 49 esporas en 1 gramo de suelo en un experimento en el que se evaluaron poblaciones MA asociadas en cultivos de maz y soya de cinco aos. Igualmente Douds et al (1995) encontraron entre 1 y 43 esporas por 50 gramos de suelo en cultivo de maz, soya y trigo en sistemas de labranza convencional y mnima.

A partir del aislamiento de las esporas se encontraron seis de los gneros conocidos: Glomus, Acaulospora, Entrophospora, Gigaspora, Archaeospora y

Scutellospora (figuras 20, 21,22, 23, 24) siendo el ms comn el gnero Glomus en cada uno de los tratamientos. Se logr incrementar el nmero total de esporas del suelo muestreado, pero no en todos los gneros se obtuvo la misma tasa de multiplicacin. Esto coincide con lo sealado por Morton y Benny (1990), quien observ que algunas especies presentes en los suelos pueden disminuir su

nmero o incluso desaparecer, cuando se les intenta multiplicar en macetas de propagacin, debido a factores ambientales desconocidos o a las condiciones del invernadero, otras especies raras o aparentemente inexistentes pueden en cambio incrementar su nmero.

Grafica 7: Numero de esporas por gnero en cada uno de los tratamientos

Figura 20: Entrophospora (Dvila, Rosales, Ramos)

Figura 21: Acaulospora (Rosales)

Figura 22: Glomus(Dvila, Ramos, Rosales)

Figura 23: Archaeospora (Dvila, Rosales)

Figura 24: Scutellospora (Dvila, Rosales)

Figura 25: Gigaspora (Dvila, Ramos, Rosales)

7. CONCLUSIONES

El suelo del municipio de Pueblo Bello es rico en diversidad de esporas de hongos MA.

Las plantas trampas de maz (Zea mays) inoculadas respondieron significativamente a la infeccin y esporulacin por los hongos MA nativos, mostrando mayores niveles de infeccin micorrizal y produccin de esporas MA en las plantas inoculadas no fertilizadas.

El mayor porcentaje de infeccin por hifas fue alcanzado por las plantas inoculadas no fertilizadas.

El mayor porcentaje de infeccin por Arbsculos fue alcanzado por las plantas inoculadas no fertilizadas

El

mayor porcentaje de infeccin por vesculas fue alcanzado por las

plantas inoculadas no fertilizadas

El mayor rendimiento en la tasa de crecimiento fue alcanzado por el tratamiento de las plantas inoculadas no fertilizadas

Los mayores rendimientos de porcentaje de materia seca fueron alcanzados por las plantas inoculadas no fertilizadas.

Existe una asociacin inversamente proporcional entre el porcentaje de infeccin y la cantidad de nutrientes presentes en el suelo.

El gnero micorrizico predominante con mayor abundancia relativa dentro de la poblacin de esporas aisladas en los tratamientos fue Glomus.

El tratamiento que mostr la mayor abundancia relativa de esporas fue el de las plantas inoculadas no fertilizadas.

Las plantas inoculadas sin fertilizante respondieron significativamente a la infeccin por hongos micorrizicos arbusculares con un alto contenido de fosforo, a pesar que la literatura dice que cuanto hay alto contenido de fosforo se inhibe la infeccin.

8. RECOMENDACIONES

Utilizar varias tipos de plantas trampas en la multiplicacin de estos hongos ya que los hongos MA no son altamente especficos en el momento de infectar a una planta determinada pero si existe afinidad o compatibilidad con ciertas especies vegetales.

Realizar nuevos aislamientos de hongos MA nativos en otras regiones donde se cultiva cacao con el fin de caracterizarlas, identificarlas y evaluar el comportamiento de las mismas, con el objeto de producir un pool de estos individuos como inoculo potencial.

Establecer cultivos monoesporicos con el fin de evaluar la multiplicacin, infectividad y efectividad de cada uno de los gneros individualmente.

Evaluar los factores que afectan el proceso de micorrizacin en condiciones naturales estableciendo la habilidad competitiva y estudiando su infectividad en las plantas

Continuar con este tipo de investigaciones con el fin micorrizas nativas en los diferentes cultivos agroforestales

de evaluar las

Realizar cultivos monoesporicos con cada uno de los gneros multiplicados para evaluar la infectividad y efectividad de cada uno de ellos.

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ANEXOS

Peso seco de la parte area de las plantas (en gr) Tratamiento 1 0,5 1 0,7 0 0 Tratamiento 2 2,63 1,5 1,5 0 0 Tratamiento 3 (control) 1,3 1,8 2,1 0 0

Anexo 1: Resultados del peso seco de la parte area de las plantas en los diferentes tratamientos

Peso seco Raz de las plantas (en gr) Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 (control) 0,1 0,2 0,1 gr gr

0,1 0,1 0,2 Gr Gr

0,35 0,3 0,24 gr gr

Anexo 2: Resultados del peso seco de la raz de las plantas en gramos

Altura 45 das Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 (control) 35 34 34 32 21

19 25 27 20 25

37 32 34 36 31

Anexo 3: Altura de las plantas a los 45 das de edad

Altura 60 das Tratamiento 1 24 31 33 24 30 Tratamiento 2 Tratamiento 3 (control) 40 38 37 38 25

45 34 37 42 0

Anexo 4: Altura de las plantas a los 60 das de edad

Altura 75 das Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 (control) 43 40 0 42 0

28 36 37 27 0

67 0 42 48 0

Anexo 5: Altura de las plantas a los 75 das de edad

Altura 90 das Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 (control) 45 42 0 44 0

32 40 0 0 0

70 0 46 52 0

Anexo 6: Altura de las plantas a los 90 das de edad

Nmero de esporas en 10 gr de suelo Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento X (suelo nativo) 77 86 79

309 115 165

224 344 233

Anexo 7: Nmero de esporas en 10 gr de suelo

Infeccin por hifas Tratamiento 1 22 8 6 2 23 12 Tratamiento 2 50 28 29 12 40 24

Anexo 8: Infeccin por hifas

Infeccin por arbsculos Tratamiento 1 0 0 0 0 0 0 Tratamiento 2 4 3 2 1 2 2

Anexo 9: Infeccin por arbsculos

Infeccin por vesculas Tratamiento 1 0 1 0 1 15 11 Tratamiento 2 14 16 17 10 15 21

Anexo 10: Infeccin por vesculas

Numero de vesculas por laminas Tratamiento 1 0 1 0 19 198 172 Tratamiento 2 251 282 322 202 261 439

Anexo 11: Numero de vesculas por laminas

Tabla 8: Numero de esporas por genero Genero Tratamiento 1 154 12 205 21 0 20 108 520 Tratamiento 2 364 78 61 48 0 67 92 710 Tratamiento X (suelo nativo) 144 22 10 13 0 17 25 231

Glomus Entrophospora Acaulospora Archaeospora Paraglomus Gigaspora Scutellospora total

Anexo 12: Porcentaje de esporas por genero