1

INTERAES ANTGENO-ANTICORPO IN VITRO

Essas reaes, no laboratrio, caracterizam os testes sorolgicos ( baseados na pesquisa de anticorpos ) So utilizados , geralmente, quando o microrganismo que causa uma infeco tem algum problema para ser cultivado. Exemplo: sfilis, hepatites, doenas causadas por vrus, etc. tambm utilizado para determinao de doenas auto-imunes, determinao de tipo sanguneo e HLA

A reao antgeno-anticorpo IN VITRO se processa em 2 estgios: 1- H a combinao especfica entre um determinante antignico e o anticorpo correspondente; 2- Ocorre o fenmeno visvel como precipitao ou aglutinao que se caracteriza pela formao de grumos. 1- PRECIPITAO Neste teste, os antgenos se encontram em soluo. O anticorpo liga-se s molculas de antgeno em propores variadas, mas a formao de um agregado ou malha ( ponto de precipitao ou insolubilizao) s ocorre quando as concentraes dos reagentes (antgenos e anticorpos envolvidos) forem equivalentes. 2. TIPOS DE PRECIPITAO: 2.1. REAO DE PRECIPITAO EM MEIO LQUIDO obtida da seguinte maneira: em uma srie de tubos, adiciona-se quantidade fixa de anticorpo e quantidade crescente de antgeno , de onde resultam 3 zonas: 1- Zona de excesso de anticorpo ou PR-ZONA:* Todo o antgeno precipitado e haver anticorpo livre no sobrenadante 2- Zona de equivalncia: H formao de complexos insolveis (Ag-Ac).MALHA DE PRECIPITAO 3- Zona de excesso de antgeno

O fenmeno PR-ZONA pode ocorrer no teste laboratorial para diagnosticar sfilis (VDRL) quando o paciente apresenta ttulos de anticorpos muito elevados.A diluio do soro produz um resultado positivo.

2.2 REAO DE PRECIPITAO EM GEL Pode ser realizado por :

Difuso simples; Difuso dupla; Em presena de um campo eltrico. 1- Difuso simples ou Imunodifuso radial de Mancini ou radial simples a- usado para medir IgG , IgM, componentes do complemento e outras substncias presentes no soro. b- Metodologia: Incorpora-se no gel o anticorpo especfico para determinado antgeno; Enche-se os orifcios do gel com 3 antgenos em concentraes padronizadas e outros com o antgeno em concentrao desconhecida; H difuso radial a partir do orifcio e, quando o antgeno estiver difundido, verifica-se a opacificao em forma de circular em torno do orifcio; Aps o trmino da difuso, faz-se a leitura dos halos correspondentes aos de precipitao dos padres e dos desconhecidos e traa-se a reta: Lana-se em ordenadas as concentraes ( mg ou UI) dos padres contra os quadrados dos dimetros dos respectivos halos. L-se a concentrao dos desconhecidos, a partir do quadrado do dimetro sobre a reta, a qual deve ser estabelecida para cada experimento.

2- Dupla difuso ou Imunodifuso radial dupla (Outcherlony) Na dupla difuso, antgeno e anticorpo so colocados em diferentes poos no Agar e difundem-se um contra o outro. Onde as propores so ideais , formam-se linhas de precipitao; - A curvatura estar dirigida sempre para o orifcio em que se encontra a substncia de maior peso molecular; - Esse mtodo indica se os antgenos so idnticos, relacionados, mas no idnticos , ou no relacionados; - Formam-se linhas de precipitao: - de identidade - de no identidade - de identidade parcial 3- Imunoeletroforese Uma amostra de soro colocada em um poo em agar ou lmina de vidro; Uma corrente passada pelo Agar e as protenas movem-se no campo eltrico de acordo com sua carga e tamnho; -

Uma canaleta cortada no Agar e preenchida com anticorpo; Como o antgeno e o anticorpo difundem-se um em direo ao outro, formam uma srie de arcos de precipitados
Indica auncia, presena ou padres incomuns de protenas do soro.Ex: protena do mieloma humano.

2. AGLUTINAO 2.1. Definio

Ocorre entre antgeno particulado ou entre uma partcula inerte e recoberta de antgeno solvel e seu anticorpo especfico A partcula inete pode ser: ltex ou hemcia

2.2. Classificao 2.2.1. Aglutinao direta

Detectam anticorpos contra antgenos celulares relativamente grandes como os da superfcie das bactrias e dos fungos

Exemplos de exames: Classificar sorotipos de Salmonellas: aps o crescimento em agar e a devida identificao das Salmonellas, pega-se um pouco da colnia crescida e, em uma lmina, adiciona-se os anti-soros correspondentes a cada sorotipo. O antisoro que aglutinar a colnia corresponde ao sorotipo da bactria

2.2.2. Aglutinao Indireta

Usa-se partculas de ltex ou hemcias.

Exemplos de aglutinao indireta usando ltex: Inibio da aglutinao passiva: prova para o diagnstico imunolgico da gravidez Exemplo de aglutinao indireta usando hemcias: Coombs direto e indireto O soro de Coombs um anti-anticorpo

Coombs direto: um teste laboratorial praticado com hemcias j sensibilizadas IN VIVO, ou seja, hemcias fetais que se quer saber se fixaram anticorpo materno; Coloca-se as hemcias do bb em um tubo devidamente lavadas e adiciona-se o soro de Coombs, que um anti-anticorpo. Coombs indireto:

O objetivo a pesquisa de anticorpos no soro de mes sensibilizadas ou de pessoas Rh negativas que receberam transfuso de sangue Rho(D)

Outros exemplos de reao de aglutinao:

Na classificao sangunea, pacientes que apresentam antgeno D (Rh) em pequena quantidade na superfcie das hemcias so chamados D fraco; Os anticorpos IgG tero dificuldade em aglutinar esses antgenos D e promover uma reao com grumos visveis; A adio de um soro contendo anti-IgG (soro de Coombs) permite a aglutinao das hemcias

4- REAO DE FIXAO DE COMPLEMENTO

Pode ser usado para detectar quantidades muito pequenas de anticorpo; Anticorpos que no produzem uma reao visvel na precipitao ou aglutinao podem ser evidenciados por fixarem o complemento durante a reao antgenoanticorpo A fixao do complemento foi usada antigamente para o diagnstico da sfilis (teste de Wasserman) e ainda utilizada para diagnosticar determinadas doenas virais, fngicas e causadas por Riqutsias; Quando se forma um complexo Ag-Ac , h possibilidade que haja fixao de complemento; Somente os anticorpos IgM, IgG 1,2,3 so bons fixadores de complemento; O sistema indicador de fixao do complemento hemcia de carneiro conjugadas nas propores ideais ao seu anticorpo especfico preparado em coelhos (hemolisina) Se o soro no contm anticorpo para o antgeno em estudo ou se h anticorpo, mas o antgeno correspondente est ausente, no h fixao de complemento e ao misturarse o sistema indicador (EA), o complemento determina a hemlise.; Quando, para o antgeno em questo, o soro contm Anticorpo, o Complemento fixado e, ao se adicionar o sistema indicador, no ocorrer hemlise

5- IMUNOFLUORESCNCIA

A tcnica de imunofluorescncia combina corantes fluorescentes, como o isotiocianato de fluorescena, com anticorpos para que fluoresam quando expostos luz ultravioleta; So de 2 tipos: Imunofluorescncia direta e indireta IMUNOFLUORESCNCIA DIRETA

So usados geralmente para identificar um microrganismo em uma amostra clnica; Durante o procedimento ,a amostra contendo o antgeno a ser identificado fixada sobre uma lmina ;

So,ento, adicionados anticorpos marcados com fluorescena e a lmina incubada por um perodo curto sendo, a seguir, lavada para remover os anticorpos no ligadosao antgeno e, ento, examinada ao microscpio de fluorescncia para deteco de fluorescncia amarelo-esverdeada. IMUNOFLUORESCNCIA INDIRETA usado para detectar a presena,no soro, de anticorpos especficos aps a exposio a um microrganismo ; O procedimento consiste na fixao de um antgeno conhecido a uma lmina; Adiciona-se ento o soro a ser testado e, se algum anticorpo especfico contra o microrganismo estiver presente, esse vai reagir com o antgeno formando um complexo; Para que o complexo seja visualizado adiciona-se lmina uma antiimunoglobulina sria humana marcado com fluorescena; A antiimunoglobulina vai se ligar somente se o anticorpo especfico estiver formando complexo com o seu antgeno; Depois da incubao a lmina lavada para remover o anticorpo no ligado e examinada ao microscpio de fluorescncia; Se o antgeno fixado lmina aparece fluorescente, significa que o anticorpo especfico est presente no soro; No microscpio de imunofluorescncia , filtros adequados para evitar a passagem, pela ocular,de luz de baixo comprimento de onda,protegendo assim os olhos do observador.

6- ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)

Anticorpos ou antgenos podem tambm ser ligados enzima de maneira que, ao ser adicionado reao o substrato da enzima, gerado um produto colorido que poder ser medico por espectrofotometria; A reao desenvolvida em placas de plstico contendo sries de pocinhos onde so depositados os reagentes; Antgenos ou anticorpos, dependendo do objetivo do mtodo, so adsorvidos placa que, usualmente, feita de poliestireno ou polivinil, materiais que possibilitam maioria dos antgenos, adsoro adequada; Mtodos: indireto, sanduche, competitivo.

a- Indireto:

Usado para a deteco e medida de anticorpos; Nesse caso, o antgeno adsorvido placa; Aps lavagem, adicionado o soro problema que supostamente contm anticorpos especficos ao antgeno da reao; Depois do perodo de incubao e lavagem adiciona-se o substrato; O desenvolvimento de cor significa presena de anticorpos no soro problema; A variao de cor significa presena de anticorpos no soro problema; A variao de cor est relacionada quantidade de anticorpo neste soro. b- Sanduche

Usado para deteco e medida de antgenos; Nesse mtodo, o anticorpo especfico adsorvido placa; Aps lavagem, adicionada a soluo problema; Depois da incubao e lavagem aplicam-se anticorpos especficos marcados com a enzima; Aps a incubao e lavagem , coloca-se o substrato; A variao de cor proporcional quantidade do antgeno na soluo problema. c- Competitivo

Usado para a deteco e medida de antgenos; O anticorpo especfico adsorvido placa; Aps lavagem para remoo de protenas no fixadas, adicionada a soluo problema que supostamente contm o antgeno; O antgeno marcado com a enzima pode ser colocado aps breve perodo ou ento ser mistuado soluo problema; Depois do perodo de incubao e lavagem, adicionado o substrato Os poos contendo apenas o antgeno marcado (controle) desenvolvem cor; A inibio do desenvolvimento de cor nos poos que contm as amostras da soluo problema proporcional quantidade de antgenos nessas amostras.

7- WESTERN- BLOT

Mtodo padro confirmatrio de positividade de HIV; O DNA ou RNA de um agente etiolgico tratado com endonucleases para criar fragmentos de tamanhos diferentes; Os fragmentos do cido nuclico so separados por eletroforese em gel e depois transferidos para papel de nitrocelulose; Este papel depois colocado em contato com o soro do paciente suspeito de apresentar anticorpos contra um determinado microrganismo