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Samira Nogarol Yunes

AVALIAO DA FREQNCIA DE ABERRAES CROMOSSMICAS INSTVEIS EM GRUPOS DE INDIVDUOS RESIDENTES NO MUNICPIO DE MONTE ALEGRE PA EXPOSTOS DIFERENCIALMENTE AO RADNIO.

Dissertao aprovada para obteno do Grau de Mestre pelo Programa de PsGraduao em Radioproteo e Dosimetria do Instituto de Radioproteo e Dosimetria da Comisso Nacional de Energia Nuclear na rea de Biofsica das Radiaes.

Orientador: Dr. Carlos Eduardo Bonacossa de Almeida - IRD/CNEN Co-orientadora: Dra. Lene Holanda Sadler Veiga IRD/CNEN

Rio de Janeiro Brasil Instituto de Radioproteo e Dosimetria Comisso Nacional de Energia Nuclear Coordenao de Ps-Graduao 2010

Yunes, Samira Nogarol Avaliao da Freqncia de Aberraes Cromossmicas Instveis em grupos de indivduos residentes no municpio de Monte Alegre PA expostos ao radnio. Samira Nogarol Yunes [Rio de Janeiro] 2010 Xiv, 68 p. 29,7 cm: fig., tab. Dissertao (mestrado) - Instituto de Radioproteo e Dosimetria Rio de Janeiro, 2010. 1. Radiao Ionizante; 2. Aberrao Cromossmica; 3. Monte Alegre; I. Instituto de Radioproteo e Dosimetria II. Ttulo

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Samira Nogarol Yunes

AVALIAO DA FREQNCIA DE ABERRAES CROMOSSMICAS INSTVEIS EM GRUPOS DE INDIVDUOS RESIDENTES NO MUNICPIO DE MONTE ALEGRE PA EXPOSTOS DIFERENCIALMENTE AO RADNIO.

Rio de Janeiro, 17 de dezembro de 2010.

_________________________________________________________ Dr. IRD/CNEN

_________________________________________________________ Dr. IRD/CNEN

________________________________________________________ Dr. IRD/CNEN

_________________________________________________________ Dr. - UFRJ

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O presente trabalho foi desenvolvido no Instituto de Radioproteo e Dosimetria da Comisso Nacional de Energia Nuclear, sob orientao do Prof. Dr. Carlos Eduardo Bonacossa de Almeida e Coorientadora Dra. Lene Holanda Sadler Veiga no Laboratrio de Radiobiologia.

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Este trabalho dedico a meus pais, Jorge e Regina, que sempre acreditaram em mim, investiram nos meus sonhos.

Agradecimentos

A Deus, acima de tudo, por ser a fonte de todo amor, paz, justia e alegria da minha vida.

A meus pais, quem devo honrar para sempre por abdicarem de suas vidas por mim. Obrigada pelo grande amor, carinho e cuidado com o meu crescimento.

A minha grande e eterna famlia (Igreja Mananciais), que provam e manifestam de maneira pratica a cada dia o seu amor incondicional.

A meu orientador, Carlos, que me ensinou a correr atrs daquilo que acredito e enxergar alem do tubo aparentemente vazio, um exemplo de coragem e determinao.

amiga Monica, por sua pacincia e dedicao em passar suas experincias profissionais e pessoais, que foram fundamentais para o inicio, meio e fim deste trabalho.

As minhas amigas eternas, Cristiny e Isabelle, que fizeram do meu trabalho um lugar inesquecvel.

Aos amigos Amanda, Leonardo, Hugo, que sempre me incentivaram e ajudaram a chegar aqui.

As amigas Claudia e Cris, pelo carinho, amor e amizade, e a todos do DEMIN.

Aos rgos de apoio financeiro deste trabalho: IRD-CNEN e Fiocruz.

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Resumo

O municpio de Monte Alegre uma regio que apresenta radiao natural elevada devido presena do radionucldeo Urnio (238U) em seu solo, que atravs de seu decaimento d origem ao elemento Radnio (226Ra), um gs radioativo (. A radioatividade das rochas passou a constituir um problema para a populao de Monte Alegre, a partir do momento em que o material radioativo comeou a ser utilizado na construo de casas e pavimentao de ruas. Entre todos os biomarcadores relacionados a exposies ambientais e seus efeitos biolgicos, as aberraes cromossmicas so considerados bons biomarcadores como preditores do risco de cncer. Estudos sugerem que a freqncia de aberraes cromossmicas pode estar relacionada com a instabilidade gentica individual e/ou exposio radiao ionizante.Com isto nosso trabalho visou avaliar a freqncia de aberraes cromossmicas em indivduos na regio de alta radioatividade natural em Monte Alegre-PA. Como tambm correlacionarmos a anlise citogentica feita no presente estudo com os resultados da analise da freqncia de polimorfismos de genes de reparo do DNA realizada em outro estudo que resultou em outra dissertao. De acordo com a distribuio dos dados obtidos na caracterizao radiolgica ambiental e no clculo de dose, foram escolhidos residentes de domiclios com maior e menor exposio radiao. As amostras do sangue perifrico de 85 indivduos da populao residente da regio de Monte Alegre PA foram coletadas e uma analise previa de duas laminas por individuo foi realizada para verificao da qualidade da amostra. Atravs dessa avaliao determinamos que 33% do material coletado, ou seja, amostras de 28 indivduos estavam em condies adequadas para anlise quanto a freqncia de aberraes cromossmicas. Aps as coletas os linfcitos presentes na amostra foram cultivados de acordo com a metodologia proposta para obteno de clulas em metfase. Foram analisadas 6.177 metfases dos 28 indivduos dentre as quais foram encontrados 4 cromossomas dicntricos e 19 fragmentos. O numero de aberraes cromossmicas no ultrapassou o intervalo dos valores de referencia para a freqncia de dicntrico basal. Sendo assim a exposio a radiao, produzida pelo decaimento do Urnio (238U) , nas residncias de Monte Alegre no suficiente para aumentar a freqncia de aberraes tipocromossmicas instveis para o grupo de estudo. No podemos afirmar que a combinao de variaes polimrficas encontradas nos indivduos tiveram influencia no surgimento das aberraes, j que diversos fatores podem estar envolvidos para o aparecimento de aberraes cromossmicas espontneas.

Palavras Chave: Radiao Ionizante, Aberrao Cromossmica, Monte Alegre

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Abstract

The municipality of Monte Alegre is a region that presents natural radiation high due to the presence of the radionuclide uranium (238U) in its soil, which through its decay gives rise to element Rn, a gas. The radioactivity of the rocks has become a problem for the population of Monte Alegre, from the moment when the radioactive material began to be used in the construction of houses and paving of streets. Among all biomarkers related to environmental exposures and its biological effects, the chromosomal aberrations are considered good biomarkers as predictors of the risk of cancer. Studies suggest that the frequency of chromosomal aberrations may be related to the genetic instability individual and/or exposure to ionizing radiation. Our work aimed to evaluate the frequency of chromosomal aberrations in individuals in the region of high natural radioactivity in Monte Alegre-PA. As well as to correlate the cytogenetic analysis made in this study with the results of analysis of frequency of polymorphisms of genes of DNA repair carried out in another study that resulted in other dissertation. In accordance with the distribution of the data obtained in characterizing environmental radiological and in the calculation of dose, were chosen residents of homes with more and less exposure to radiation. The samples of peripheral blood of 85 individuals of the resident population of the region of Monte Alegre PA were collected and examine provided two slides for individual was performed to verify the quality of the sample. Through this evaluation we decide that 33% of the material collected, or is, samples of 28 individuals were in suitable conditions for analysis of the frequency of chromosomal aberrations. After the collections lymphocytes present in the sample were cultivated in accordance with the methodology proposed for obtaining of cells in metaphase. were analyzed 6,177 metaphases of 28 individuals among which were found dicentric chromosomes 4 and 19 fragments. The number of chromosomal aberrations exceeded the interval of the values of reference for the frequency of dicntrico basal. Thus the exposure to radiation, produced by decay of uranium, in the residences of Monte Alegre is not sufficient to increase the frequency of chromosomal aberrations-type unstable for the study group. We cannot say that the combination of variations polymorphic found in individuals had influences the emergence of aberrations, given that several factors may be involved to the emergence of spontaneous chromosomal aberrations.

Key Words: Ionizing Radiation, Chromosomal aberration , Monte Alegre

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ndice

1. INTRODUO

......................................................................................... ...........................................................

1 1 4

1.1. Fontes de exposio a radiao natural

1.2. Estudos em reas de radioatividade natural elevada no Brasil ........................ 1.3. O municpio de Monte Alegre, PA

................................................................. 6 8

1.4. Efeitos sade decorrentes da exposio `a radiao ionizante ......................

1.5. Aberraes cromossmicas como eventos preditores do risco de cncer ........ 9 2. OBJETIVO GERAL 2.1. Objetivo Especifico ......................................................................................... ......................................................................................... ......................................................................... 13 13 14 14 15 15 16 19

3. FUNDAMENTOS TERICOS

3.1. Linfcitos Humanos ......................................................................................... 3.2. Estrutura Cromossmica .................................................................................

3.2.1. Compactao da Cromatina .......................................................................... 3.2.2. Caritipo Humano 3.2.3. Ciclo Celular ........................................................................................ ........................................................................................

3.3. Alteraes Cromossmicas induzidas por radiao ......................................... 20 3.4. Aberraes Tipo cromossmicas ..................................................................... 3.4.1. Aberraes instveis ................................................................................. 22 23

3.5. Vias de reparo de DNA de interesse 3.5.1. Reparo por exciso de bases (BER)

............................................................ 26 ............................................................ 27 ............................................... ............................................... 29 31 32

3.5.2. Reparo por exciso de nucleotdeos (NER) 3.5.3. Recombinao Homologa 4. METODOLOGIA

.........................................................................................

ix

4.1. rea de Estudo: Monte Alegre 4.2. Escolha dos indivduos 4.3. Coleta das amostras 4.4. Cultivo das clulas 4.4.1 Colheita e fixao das clulas 4.4.2. Preparo das laminas 4.4.3 Colorao das laminas 4.5. Anlise Microscpica 4.6. Purificao do DNA 4.7. Quantificao do DNA

........................................................................ 32 ........................................................................ 34 ........................................................................ 35 ........................................................................ 35 ........................................................................ 36 ........................................................................ 37 ........................................................................ 37 ........................................................................ 38 ........................................................................ 38 ........................................................................ 39 ............... 40

4.8. Amplificao pelo mtodo PCR (Polymerase Chain Reaction)

4.9. Polimorfismo no comprimento de fragmentos de Restrio - RFLP ............... 42 5. RESULTADOS 6. DISCUSSO 7. CONCLUSO ......................................................................................... ......................................................................................... ......................................................................................... .............................................................. 44 50 55 56

8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICA

Lista de Figuras Figura 1 Modelo de Compactao da Cromatina ................................................. 17 Figura 2 Ilustrao Esquemtica do Caritipo Humano .................................... 18

Figura 3 Imagem de dois cromossomos dicntricos e um anel cntrico com seus fragmentos acntricos associados (colorao Giemsa) .............................................. Figura 4. Mapa da Regio norte abrangendo Monte Alegre e cidades prximas ... Figura 5. Rogue cell -Metfase com trs dicentricos e dez fragmentos (colorao Giemsa). .................................................................................................................... 48 25 33

xi

Lista de tabelas e quadros

Tabela 1 - Condies fsicas dos genes no processo de amplificao das amostras. Tabela 2 - Primers especficos de cada gene para a realizao do PCR

41

............... 41 43

Tabela 3 - Genes e suas enzimas de restries correspondentes ............................. Tabela 4 - Tamanho dos fragmentos de interesse aps o corte com cada enzima de

restrio .................................................................................................................... 43 Tabela 5 Freqncia de Aberrao Cromossmica em linfcitos dos indivduos de Monte Alegre ..................................................................................................... 45 Tabela 6 - Correlao entre os dados obtidos da analise citogentica e analise molecular dos indivduos de Monte Alegre. .............................................................. 49

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Lista de Abreviaturas e Siglas

ARNE CNEN CNPq

rea de radioatividade Natural Elevada Comisso Nacional de Energia Nuclear Conselho Nacional de Desenvolvimento

Cientifico e Tecnolgico CPRM CPS DNA ICRP INB IR LPH PCR RFLP RNF SMR UFPA UNSCEAR Companhia de Pesquisas de Recursos Naturais Contagem por segundo cido desoxirribonuclico Comisso Internacional de Proteo Radiolgica Indstrias Nucleares Brasileiras Radiao Ionizante Linfcito Perifrico Humano Reao de polimerase cadeia Restriction Fragment Length Polymorphism Radiao Natural de Fundo Razo de Mortalidade Padronizada Universidade Federal do Par Comit Cientifico das Naes Unidas sobre Efeitos da Radiao Atmica UV Ultravioleta

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Lista de Smbolo

% g L Bq mSv

Porcentagem Gravidade Microlitro Bequerel Milisievert

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1. INTRODUO

1.1. Fontes de exposio radiao natural

A radiao natural de fundo (RNF) que tem origem no ambiente terrestre varia grandemente em todo mundo e tambm dentro dos pases. Os elementos radioativos primrios da crosta terrestre que leva exposio humana so Potssio (40K), Urnio (238U), Trio (232Th)e seus produtos radioativos de decaimento (Radio, Radnio, etc) (EISENBUD, 1997).

Uma rea com RNF alta definida como rea ou um complexo de residncias onde a soma de radiao csmica e a radioatividade natural do solo, gua, alimento, etc levam a situao de exposio crnica por exposies interna ou externa que resulta em uma dose efetiva anual ao publico acima de um nvel definido (CARDIS, 2005). A taxa da dose efetiva anual est classificada em quatro nveis: baixo, que significa = 5 mSv/ano (ou aproximadamente o dobro da media global de 2,4 mSv/ano); mdio (5 - 20 mSv/ano); alto (20 50 mSv/ano); e muito alto (> 50 mSv/ano). As reas mais estudadas com altos nveis de radiao terrestres esto no Brasil, China, ndia, Iran (SOHRABI, 1998, UNSCEAR, 1994).

A maior parte da radioatividade da atmosfera ao nvel do mar se atribui dois istopos de Radnio (222Rn e
220

Rn) e os seus filhos. O

222

Rn faz parte da serie de

decaimento de Urnio (U238). O

222

Rn um gs nobre emissor alfa que prontamente

difunde atravs de rochas e emana continuamente pelas paredes, o cho e teto de minas (KATHREN, 1998). As doses decorrentes da inalao de radnio e da exposio radiao gama terrestre contribuem com a maior frao de exposio radiao natural em seres humanos, sendo juntas cerca de 70% da dose total recebida anualmente pelo homem devido a fontes naturais. Geralmente, um aumento da exposio radioatividade natural est relacionado a uma maior exposio ao radnio e exposio radiao gama terrestre (NRC, 1988, GREENLEE, 2001).

A exposio radiao natural pode ser fortemente influenciada por atividades humanas e hbitos de vida. Isto particularmente importante para a exposio ao radnio e seus filhos de meia-vida reduzida, onde ela fortemente dependente do local onde um determinado grupo populacional est situado, do tipo de construo que caracteriza sua moradia, o tipo de material utilizado na construo e da ventilao destas construes (NRC, 1988).

Os principais efeitos na sade humana causadas pela intoxicao aguda por Urnio (238U) so falncia renal, problemas de desenvolvimento, crescimento retardado dos ossos, e danos no DNA (BRUGGE, 2005). O Radnio e seus produtos de decaimento j foram reconhecidos como carcingenos pulmonares. Porem, as doses para outros rgos e tecidos provenientes da inalao do radnio e seus produtos de

decaimento so baixas, pelo menos so de uma ordem de magnitude inferior s do pulmo. Estudos epidemiolgicos disponveis at o momento apontam risco de mortalidade por cncer de pulmo maior do que por quaisquer outras causas

(UNSCEAR, 2008). A energia das partculas alfa liberada pelos produtos de decaimento do Po218 e do Po214 so depositadas nas clulas do epitlio respiratrio, sendo consideradas as causadoras do cncer de pulmo associado exposio ao radnio. (KREWSKI, 2005)

Vrios estudos em trabalhadores de minas subterrneas expostos a radnio e seus produtos de decaimento tm demonstrado um aumento no risco de cncer de pulmo, quando comparado com um grupo no exposto (NRC, 1988). A exposio ao radnio universalmente reconhecida como a segunda causa de cncer de pulmo depois do fumo. No entanto, o risco deste tipo de cncer para o pblico em geral ainda era obtido atravs da extrapolao dos dados obtidos nos estudos em trabalhadores mineiros, uma vez que os estudos epidemiolgicos de radnio em residncias no foram capazes de demonstrar este risco. Somente recentemente, obtiveram-se evidncias diretas deste risco atravs da anlise combinada de diversos estudos conduzidos na Europa, Amrica do Norte e China (DARBY, 2005, KREWSKI, 2005, LUBIN, 2004)

1.2. Estudos em reas de radiatividade natural elevada no Brasil

Diversos trabalhos foram realizados no Brasil em reas ditas como de radioatividade natural elevada, devido ocorrncia de Urnio (238U) e trio em depsitos geolgicos, como areias monazticas e intruses vulcnicas alcalinas. Como exemplo de algumas destas reas temos o planalto de Poos de Caldas, a cidade de Guarapari, Meape, e Arax. (CULLEN, 1997, PENNA FRANCA, 1965, AMARAL, 1992)

VEIGA & KOIFMAN (2005), aps trs dcadas, avaliaram o padro de mortalidade por cncer de algumas regies brasileiras ditas de radioatividade natural elevada, como Poos de Caldas, Arax e Guarapari. Os resultados mostram que, para Poos de Caldas e Guarapari, a mortalidade por cncer maior do que esperada, tendo como base uma populao de referncia. Para Poos de Caldas, observou-se um

aumento significativo na mortalidade por cncer de estmago, pulmo, mama e leucemia. Em relao a Guarapari, um aumento significativo na mortalidade foi observado para cncer de esfago, estmago, pulmo e prstata, enquanto que para Arax, nenhum excesso de bito por cncer foi observado. Os autores ressaltam que estes resultados so importantes, uma vez que se desconhecia at ento o padro de mortalidade por cncer destas regies. Com estes dados, no se pode negar a existncia de um aumento na mortalidade por cncer em Poos de Caldas. No entanto, no se pode associar este aumento com a exposio a radioatividade natural, uma vez que deve-se levar em considerao os vrios fatores de risco associados ao cncer. Arax, que

reconhecidamente uma rea de radiatividade natural elevada, no apresentou excesso de bitos.

O principal objetivo destes estudos foi caracterizar a regio do ponto de vista da estimativa da exposio externa e contaminao interna, atravs da ingesto de alimentos cultivados no local, e inalao de radnio, tornio e seus filhos. O nico estudo que teve como objetivo avaliar possveis efeitos sade decorrentes da exposio crnica radiao ionizante foi um estudo realizado na dcada de 70, que realizou uma avaliao citogentica na populao residente em Guarapari. Este estudo revelou que a freqncia de aberraes tipo cromossmicas (0.11) (dicntricos e anis acntricos) na populao investigada aumentou significativamente quando comparada a um grupo controle (0.06) (BRANDOM et al., 1978, BARCINSKI et al., 1975).

Embora a radiatividade natural em algumas destas regies apresentasse valores mais elevados, as exposies a verificadas no eram representativas da exposio mdia de toda a populao que vive nestes locais, uma vez que os nveis de radiatividade mais elevados, geralmente, restringem-se s reas prximas s anomalias geolgicas. Estudos questionam a classificao das reas Brasileiras de Radioatividade Natural Elevada, tendo em vista que este tipo equivocado de classificao pode levar a um sentimento de radiofobia na populao e a uma associao equivocada com casos de cncer, m-formao congnita e outros agravos sade (VEIGA, 2007)

1.3. O municpio de Monte Alegre, PA

O municpio de Monte Alegre, localizado no Estado do Par, um dos mais antigos povoamentos da Amaznia. Possui uma populao estimada de cerca de 68.000 pessoas numa rea de aproximadamente 21.703 km2.

Desde 1977, levantamentos radiomtricos e caracterizaes geolgicas realizadas pela Companhia de Pesquisas de Recursos Naturais (CPRM), rgo do Ministrio das Minas e Energia, revelaram ocorrncias de Urnio (238U) na rea do Domo de Monte Alegre (PASTANA, 1999).

Trabalhos desenvolvidos pela extinta Nuclebrs, atual Indstrias Nucleares Brasileiras (INB), em Monte Alegre revelaram anomalias de Urnio (U3O8) no membro Barreirinha e em sedimentos de corrente na rea do Domo. A presena dessa ocorrncia uranfera foi investigada pela INB com o objetivo de avaliar a viabilidade econmica para explorao desse depsito. No entanto, a radioatividade das rochas passou a constituir um problema para a populao de Monte Alegre, principalmente na vila Ingls de Souza, a partir do momento em que o material radiativo comeou a ser utilizado, indevidamente, na construo civil, no revestimento interno de residncias, pavimentao de caladas e ruas.

Em 1995, equipes de gelogos e geofsicos da Universidade Federal do Par (UFPA) iniciaram um projeto para investigar os nveis de radioatividade natural na cidade. Medidas cintilomtricas (medies da radioatividade com aparelho denominado cintilmetro) foram realizadas em cerca de 1.600 residncias e instituies pblicas da cidade de Monte Alegre. Os valores reportados (300 a 2.000 cps) superaram o valor mdio de background (100 a 200 cps).

No mesmo ano da realizao destas medidas, a equipe da UFPA solicitou a colaborao da CNEN para investigar um possvel aumento da exposio radioatividade natural da populao de Monte Alegre. Um grupo de tcnicos da CNEN realizou amplo levantamento dos nveis de exposio ao radnio, nas residncias de Monte Alegre e de Ingls de Souza. Os resultados deste estudo mostraram que das 33 residncias monitoradas na cidade de Monte Alegre, a concentrao mdia de radnio no ar foi de 75 Bq/m3, variando de 22 a 188 Bq/m3. Na regio de Ingls de Souza, a mdia de concentrao de atividade de radnio nas 19 residncias monitoradas foi de 116 Bq/m3, variando de 40 a 338 Bq/m3 (MELO, 1992).

Embora a radioatividade natural em Monte Alegre (mdia de 227 Bq/m3 nas residncias) seja compatvel com os nveis encontrados em outras cidades do Brasil e do mundo, no havia nenhum estudo que tivesse avaliado a incidncia de cncer na regio, apenas rumores que refletiam o sentimento da populao, mantendo a idia de que os habitantes vm sendo vtimas fatais da radiao.

1.4. Efeitos sade decorrentes da exposio radiao ionizante

O cncer um efeito importante associado exposio radiao, tendo em vista os resultados dos estudos provenientes dos sobreviventes da bomba atmica, exposies mdicas e exposies resultantes de acidentes e testes nucleares. Estes estudos tm demonstrado claramente uma forte associao da exposio radiao ionizante em altas doses bem como altas taxas de dose com o desenvolvimento de vrios tipos de cncer. RON (1999) classificou os diferentes tipos de cncer, de acordo com o nvel de associao com a exposio radiao, em definitivo, provvel, possvel e apresentando poucas evidncias.

Os tipos de cncer que apresentam um nvel de associao definitivo com a radiao so: cncer de tiride, pulmo, mama feminina e leucemias mielocticas. Os que apresentam provveis evidncias so: glndulas salivares, estmago, clon, bexiga, ovrio, pele; aqueles com possvel nvel de associao: cncer de fgado esfago, mieloma mltiplo, linfoma no-Hodgkin; e finalmente, aqueles que possuem poucas evidncias de associao com a radiao so: leucemia linfoctica crnica, pncreas, doena de Hodgkin, cncer de prstrata, testculo e colo uterino.

1.5. Aberraes cromossmicas como eventos preditores do risco de cncer

Entre todos os biomarcadores relacionados a exposies ambientais e seus efeitos biolgicos, as aberraes cromossmicas so considerados bons biomarcadores como preditores do risco de cncer (PERERA, 2000, BONASSI, 2008). A anlise combinada dos dados de duas coortes prospectivas (nrdica e italiana), envolvendo 3541 pessoas encontrou uma associao significativa entre a freqncia de aberraes cromossmicas e o risco de cncer. Na coorte Nrdica, a razo de mortalidade

padronizada por idade (SMR) para cncer entre os membros da coorte com maior freqncia de aberraes cromossmicas, foi de 1,53 (95% CI=1,13-2,05), comparado com um valor de SMR de 2,01 (95% CI=1,35-2,89) na coorte italiana (HAGMAR 1998).

Na coorte italiana, o risco de cncer dos sujeitos com alta freqncia de aberraes cromossmicas foi maior para os cnceres hematolgicos do que para todos os outros cnceres: um valor de SMR de 5.49 (95% CI=1,49-140,5) foi calculado para cnceres linfticos e hematolgicos.

A contagem do nmero de aberraes cromossmicas instveis (dicntricos, anis, acntricos) utilizada para a reconstruo da dose em indivduos expostos a uma dose aguda de radiao ionizante de baixa transferncia linear de energia (BAUCHINGER 1998) . Entretanto, a utilizao da anlise citogentica para estimativa da dose no vista como um mtodo confivel para casos de doses fracionadas,

principalmente em situaes de exposio de corpo no-uniforme que o caso da exposio radnio. Por outro lado, fato estabelecido que populaes

ocupacionalmente expostas ao radnio apresentam uma alta freqncia de aberraes cromossmica instveis que grupos controle (POHL-RULING & FISCHER 1979; BRANDOM 1978, BILBAN 1998, SRAM 1993, BRANDOM 1972). Dados sobre efeitos a longo prazo do aumento de aberraes cromossmicas em indivduos expostos ao radnio so escassos. BRANDON et al, (1978) e POPP et al, (2000), mencionam que em grupos de mineiros com uma alta freqncia de aberraes cromossmicas, alguns biomarcadores de efeito precoce para cncer de pulmo tendem a estar aumentados. SMERHOVSKY et al, (2002) testaram a associao entre freqncia de aberraes cromossmicas e subseqente risco de cncer em uma coorte retrospectiva de mineiros com conhecida exposio ao radnio e conhecido resultado de anlise citogentica. Os resultados do estudo apontaram, atravs do modelo de regresso de Cox que levou em considerao a idade na poca da anlise citogentica, a exposio ao radnio e o fumo, para uma forte associao estatisticamente significativa entre a incidncia de cncer e a freqncia de aberraes cromossmicas.

Os resultados dos estudos citogenticos nas reas de radioatividade natural elevada so contraditrios. HAYATA et al (2004) analisaram a freqncia de aberraes cromossmicas de residentes de uma rea de radioatividade natural elevada (ARNE) em Guangdong, China e comparou com os resultados obtidos em residentes de uma rea controle. Uma mdia de 2600 clulas por individuo foram analisadas. 27 adultos e 6 crianas na ARNE e 25 adultos e 8 crianas na rea controle. Os autores relataram um aumento na freqncia de dicntricos e anis em residentes da ARNE, onde o nvel de radiao natural 3 a 5 vezes maior que na rea controle, mas no

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encontraram um aumento na freqncia de translocaes na ARNE, estando dentro da faixa de variao individual dos controles.

Por outro lado, estudos citogenticos realizados em Ramsar no Ir, conhecida como uma rea de radiao natural elevada onde se observa a maior dose de radiao natural (maior que 100 mSv ano-1), no mostraram diferenas significativas entre residentes da ARNE comparado com residentes de reas normais. Ensaios in vitro onde uma dose aguda de 1,5 Gy de radiao gama foi realizada nos linfcitos dos residentes das ARNE e da rea controle. A freqncia de aberraes cromossmicas induzida foi significativamente menor nos residentes da ARNE quando comparada com a rea controle. Especificamente, os habitantes da ARNE tiveram cerca de 56% do nmero mdio de aberraes cromossmicas induzidas dos habitantes da rea de radiao normal aps e exposio dose aguda. Os autores sugerem que a menor freqncia de aberraes induzidas pela dose aguda de radiao nos residentes de ARNE possa ser uma resposta adaptativa provocada pela exposio crnica a radiao ionizante (GHIASSE-NEJAD 2002).

Devido aos problemas econmicos e sociais causados ao municpio de Monte Alegre, a respeito dos riscos da exposio `a radiao ionizante, amplamente explorados pela imprensa local e nacional, o Ministrio da Sade atravs do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPQ) fomentou o desenvolvimento de investigaes na regio. Os objetivos de tais investigaes contemplam realizar uma ampla caracterizao radiolgica nas reas urbanas e rurais, assim como uma avaliao

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epidemiolgica, incluindo o estudo de biomarcadores genticos em residentes do Municpio de Monte Alegre.

Com isso o presente estudo contribuir para traar um perfil epidemiolgico da regio de Monte Alegre e responder de forma emprica, questionamentos que so apenas sugestivos aos possveis efeitos `a sade decorrentes desta exposio.

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2.

OBJETIVO GERAL

Caracterizao genotpica e avaliao da freqncia dos indivduos da populao de Monte Alegre quanto a instabilidade cromossmica.

2.1. Objetivo especfico

Avaliar a freqncia de aberrao cromossmica de um grupo populacional com maior exposio ao Radnio em relao a um grupo controle com menor exposio, residentes em Monte Alegre PA.

Avaliar a relao entre a freqncia de aberraes tipo cromossmicas e a presena de polimorfismos em genes de reparo de DNA no mesmo grupo de estudo.

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3.

FUNDAMENTOS TERICOS

3.1. Linfcitos Humanos

As clulas mais prontamente e acessveis para fazer uma anlise cromossmica em grande escala, que so capazes de crescer e se dividir rapidamente em cultura, so os linfcitos perifricos humanos (LPHs), especificamente os linfcitos T.

Os LPHs representam uma populao de clulas que esto predominantemente na fase pr-sinttica do DNA do ciclo celular (fase Go). Somente 0.2% ou menos dos LPHs esto inseridos no ciclo celular, estes provavelmente provem do grupo de clulas linfides grandes que representam linfcitos estimulados ou clulas plasmas maduras. As clulas deste grupo podem resultar numa mitose rara ocasionalmente encontrada no sangue perifrico.

A estimativa do numero total de linfcitos em jovens de aproximadamente 500 x 109 . Somente 2% ( 10 x109 ) destes esto presentes no sangue perifrico e os outros geralmente esto distribudos nos outros tecidos, com concentraes particulares no timu, linfonodos, tonsinas, tecido linftico do intestino, bao e na medula ssea. O tempo de vida dos linfcitos varia e a definio deste tempo pode significar que a clula morre ou se divide (AIRES, 1999).

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Para interpretar as aberraes cromossmicas induzidas in vivo em humanos, de extrema importncia que a maior parte dos linfcitos perifricos pertenam ao grupo de redistribuio. Ou seja, os linfcitos devem ter deixado o sangue perifrico, passado pelo bao, os linfonodos e outros tecidos, e voltar para circulao. A media de tempo que um linfcito do grupo de redistribuio fica no sangue perifrico mais ou menos 30 minutos. estimado que aproximadamente 80%, ou seja, 400 x 109 linfcitos, pertencem ao grupo de redistribuio e que o tempo geral de circulao de 12 horas. Isto significa que os linfcitos com aberraes cromossmicas que foram induzidos a qualquer parte do corpo esto presentes no sangue perifrico. Assim, com a anlise de linfcitos, no s as aberraes cromossmicas que foram induzidas nos linfcitos do sangue perifrico podem ser detectadas, como tambm aquelas que foram induzidas nos linfcitos distribudos pelo corpo em rgos diferentes (BOGEN, 1993).

3.2. Estrutura cromossmica

3.2.1. Compactao da Cromatina

Todos os organismos eucariticos apresentam formas elaboradas de compactar seu DNA em cromossomos. Este feito notvel de compactao realizado por protenas que enrolam e dobram o DNA em nveis cada vez mais altos de organizao. Estas protenas so divididas em duas classes gerais: as histonas e as protenas cromossmicas no-histonas que no so to bem caracterizadas, mas que parecem ser cruciais para o estabelecimento de um ambiente apropriado para garantir o comportamento normal dos

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cromossomos e a expresso apropriada dos genes. O envolvimento de tais estruturas internas na formao das aberraes cromossmicas ainda no foram elucidadas.O complexo das duas classes de protenas com o DNA nuclear chamado de um nucleossomo, que a unidade estrutural bsica da cromatina. A associao do DNA e histonas formando o nucleossomo j foi demonstrada com detalhes significativos, embora a associao das protenas no-histonicas com o nucleossomo ainda no tenha sido compreendida completamente. As estruturas internas tambm podem ser identificadas, como regies coradas pela prata, sob luz do microscpio, quando o cromossomo est em diferentes estgios mitticos (PAULSON 1977, CREMER 1996). Um modelo simples da organizao do cromossomo em metfase est representado na figura 1 .

3.2.2. Caritipo Humano

Com exceo das clulas da linhagem germinativa, todas as clulas que contribuem para o nosso corpo so chamadas de clulas somticas. Os 46 cromossomos das clulas somticas humanas constituem 23 pares. Destes 23 pares, 22 so similares em homens e mulheres e so chamados de autossomos, numerados em ordem decrescente do maior (cromossomo 1) at o menor (cromossomo 21 e 22). O par restante constitui os cromossomos sexuais (NUSSBAUM 2002). O Caritipo do homem est ilustrado na figura 2.

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Figura 1. Modelo de compactao da cromatina. Esta ilustrao esquemtica mostra algumas das muitas ordens de compactao da cromatina, postuladas para explicar a estrutura altamente condensada do cromossomo mittico.

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. Figura 2. Ilustrao esquemtica do caritipo humano.

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3.2.3. Ciclo Celular

As informaes importantes sobre os efeitos clastogenicos dos agentes qumicos e fsicos nas clulas interfsicas podem ser obtidos atravs da anlise de cromossomos no momento da diviso celular (chamada mitose para clulas somticas). As clulas somticas de interesse para a dosimetria Biolgica so os linfcitos perifricos. Essa diviso possui fases que podem ser identificadas pela aparncia e funo. Durante a mitose, fases como prfase, metfase, anfase e telfase so distinguidas. Na interfase, o material cromossmico duplica (isto , DNA e protena associada). Isto chamado a fase `S` (sntese) e precedida pela fase G1 (intervalo pr-sinttico) e seguida pela G2 (intervalo ps-sintetico) inserida na interfase. Nas clulas que no esto participando do ciclo, por exemplo linfcitos perifricos, a clula permanece Go (fase estacionria) (NUSSBAUM 2002).

A interfase metabolicamente a fase mais ativa do ciclo celular, e a maioria das reaes no ncleo que requerem energia acontecem nesta fase. A durao de cada fase da clula varia de acordo com tipo celular e as condies de crescimento. Nos linfcitos, o primeiro ciclo celular depois da estimulao quase sincronizado e estas clulas so convenientes principalmente nos estudos radiobiolgicos. Clulas em cultura de mamferos, no so sincronizadas, porem podem ser levadas a sincronia por tcnicas variadas. A sensibilidade das diferentes fases do ciclo celular variam na resposta `a ao de agentes qumicos ou radiolgicos, e os tipos de aberraes cromossmicas produzidas variam dependendo da fase em que foram tratadas. Assim, em estudos como

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estes importante analisar uma populao de clulas sincronizada (no mesmo estagio, ex. metfase), ou no mnimo ter uma estimativa das propores das clulas nas diferentes fases presentes no tempo de tratamento (CARRANO 1975).

3.3. Alteraes cromossmicas induzidas pela radiao

Nos anos 30, quando a organizao cromossmica asssim como a importncia do DNA na estrutura cromossmica ainda no era compreendida, Sax em 1940, props a teoria geral para produo de aberrao cromossmica pela radiao ionizante, que foi nomeada a teoria `breakage first`. Esta indicou que a radiao ionizante induz quebras nos cromossomos das quais a maioria so restitudas (reparadas), porem algumas permanecem abertas (no reparadas) e algumas voltam a juntar-se com outra quebra (erro de reparo). Essa teoria amplamente aceita at hoje, sendo que a frequncia desses eventos pode variar de acordo com outros fatores, como prdisposio gentica, hbitos de vida e fatores ambientais. Uma teoria alternativa , chamada teoria `contact first` presume que as trocas das cromtides ocorrem em regies pr determinadas que esto prximas no tempo de radiao, e uma falha na formao da troca aumenta os fragmentos (SAX 1941, REVELL 1955). Em 1960 foi demonstrado que os cromossomos se duplicam durante a interfase e o ciclo celular pode ser dividido em G1, S, G2 e M. A radiao ionizante induz aberraes tipo cromossmicas em G1, as aberraes tipo cromatidicas em G2 e uma mistura destes dois tipos na fase S. A maioria dos mutagnicos qumicos e UVC induzem aberraes

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tipo cromatidicas em todos os estgios do ciclo celular (inclusive na prxima diviso) indicando que as leses induzidas por estes agentes requerem a interveno da fase S para gerar aberraes (EVANS 1963). Baseado nessas informaes, os agentes de quebra cromossmicas (clastogenicos) podem ser amplamente classificados como S independente (radiao ionizante) e S dependente (UVC, agentes oxidantes) ( referencia). BENDER et al. 1974, props um modelo geral para explicar a formao de aberrao cromossmica por todos os tipos de agentes, que sugere que toda aberrao cromossmica surge pelo erro de reparo da quebra de fita dupla, e que esta quebra induzida direta (radiao ionizante) ou indiretamente (UVC, agentes oxidantes) pelo processo de reparo enzimtico (que pode converter leses de fita simples por quebra de fita dupla). NATARAJAN et al. 2008 , produziram evidencias experimentais para converso das leses de fita simples para quebra de fita dupla levando `as aberraes cromossmicas.

A quebra de fita dupla uma leso no DNA potencialmente perigosa, pois no h uma fita molde intacta para o reparo. Se essas leses no forem corrigidas ou tiver um erro de reparo, rapidamente resultam em degradao dos cromossomos em fragmentos menores, que poder resultar num rearranjo estrutural, formando uma aberrao cromossmica (NATARAJAN, 2008). Estudos comprovam que a radiao ionizante aumenta a instabilidade genomica em humanos, potencializando o desenvolvimento de cncer (STREFFER, 2010).

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3.4. Aberraes tipo cromossmicas

Como foi visto anteriormente, os rearranjos estruturais resultam de quebra cromossmica, seguida de reconstituio em uma combinao anormal. A troca cromossmica ocorre espontaneamente em uma frequncia baixa e tambm pode ser induzida por agentes quebradores (clastognicos), tais como radiao ionizante, algumas infeces virais e muitos agentes qumicos (AWA, 1986). A populao de linfocito perifrico (clula utilizada no presente estudo) que estimulado mitogenicamente normalmente se encontra na fase Go (fase estacionria em G1) do ciclo celular. Consequentemente as aberraes cromossomicas induzidas pela radiao sero do tipo cromossomico, ou seja, envolvem ambas cromatides do cromossomo. J se sabe que a radiao ionizante um clastgeno S independente, diferente da radiao UV e agentes qumicos que so S dependentes. Ento, com a radiao ionizante, as aberraes tipo cromossomicas e cromatidicas so induzidas nas clulas Go/G1 e G2/S respectivamente. No entanto, UV e agentes qumicos induzem somente as aberraes tipo cromatidicas em todas as fases do ciclo celular. Se as aberraes tipo cromatidicas forem observadas em clulas G0/g1 que foram expostas a radiao ionizante, pode se presumir que estas no foram induzidas pela radiao ou j passaram por um segundo ciclo celular in vitro. Algumas aberraes cromossomicas so estveis, capazes de passar inalteradas por divises celulares mitticas e meiticas, enquanto outros so instveis. Para ser estvel, um cromossomo rearranjado deve ter elementos estruturais normais, incluindo um centrmero funcional e dois telmeros. (NATARAJAN, 2002; ROMM, 2009)

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3.4.1. Aberraes instveis

Dicntrico

O Dicntrico (figura 3) a aberrao principal usada para biodosimetria. uma troca entre as peas centromricas de dois cromossomos quebrados, a qual em sua forma completa acompanhada por um fragmento composto das peas acntricas destes cromossomos. Particularmente aps doses altas, configuraes multicentricas podem formar-se. Tricentricos so acompanhados por dois fragamentos, quadricentricos por trs fragmentos, etc. Existem algumas vantagens para utilizar a anlise de dicentrico como indicador de radiao ionizante, estas so: baixo nvel background; especifico para radiao ionizante; rpida avaliao para dose estimada; boa reprodutibilidade e etc (ROMM 2009).

Anis cntricos

Em linfcitos humanos, os anis cntricos so muito mais raros que os dicntricos. Alguns pesquisadores os combinam com os dicntricos enquanto outros escolhem por ignora-los para estimativa de dose. O anel cromossmico uma troca 23

entre duas quebras em braos separados do mesmo cromossomo acompanhado de um fragmento acntrico (figura 3).

tambm

Acntricos

Aberraes acntricas podem ser formadas independentemente das trocas descritas acima e normalmente se refere a elas acntricos excesso. Elas podem ser terminais, ou delees intersticial de vrios tamanhos mas no sempre possvel determinar sua origem e, ento, so combinadas (figura 3) (NUSSBAUM, 2002).

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Figura 3. Dois cromossomos dicntricos e um anel cntrico com seus fragmentos acntricos associados (colorao Giemsa).

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3.5.Vias de reparo de DNA de interesse

As vias de reparo de DNA so necessrias para manter a estabilidade genmica e garantir a sobrevivncia do organismo, frente aos efeitos deletrios causados por fatores endgenos e exgenos (LIMA, et al 2001). As quebras duplas e simples das fitas podem ser formadas direta e/ou indiretamente em resposta ao de agentes endgenos e exgenos, tais como radiao ionizante (DRISCOLL e JEGGO, 2006). Uma vez que o dano seja localizado, molculas especficas de reparo de DNA so enviadas ao local e se ligam regio ou nas proximidades do local do dano, incluindo outras molculas para ligar e formar um complexo que habilita o reparo a agir no local. Se a taxa de danos no DNA exceder a capacidade da clula em repar-los, o acmulo de erros pode subjugar a clula e resultar em senescncia, apoptose ou cncer (VODICKA et al, 2004).

A presena de polimorfismos genticos em genes relacionados a manuteno da estabilidade do genoma pode influenciar na variao individual da capacidade de reparo do material gentico. Desta forma, a presena de polimorfismos pode estar associado a um maior risco de desenvolver o cncer (BERWICK, 2000, MOCELLIN, 2009, ZIENOLDINNY, 2006).

Os principais mecanismos de reparo podem ser divididos em : MMR (MisMatch Repair), BER (Base excision repair), NER (Nucleotide excision repair), Reparo por Recombinao Homloga alm do NHEJ (Non-Homologous End-Joining ) que so geralmente conhecidos como unio terminal no-homloga (HOEIJIMAKERS, 2001).

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3.5.1. Reparo por exciso de bases (BER)

O reparo BER (Base Excision Repair ou reparo de exciso de bases) lida com danos em bases individuais realizando o reparo de leses geralmente ocasionadas por processos oxidativos. Esse tipo de reparo tem incio com a ao de DNA glicosilases que reconhecem e removem bases lesadas da cadeia do DNA pela quebra da ligao Nglicosil, a qual mantm a base nitrogenada associada com o esqueleto de acar-fosfato (FRIEDBERG et al., 1995). A maioria das DNA glicosilases reconhecem leses especficas como a adenina metilada na posio 3 (STEINUM & SEEBERG, 1986) ou a 8-hidroxiguanina (BOITEAUX et al.,1992). . Aps a retirada da base lesada gera-se no DNA um stio apurnico ou apirimidnico (AP) que ser reparado por AP endonucleases (DOETSCH & CUNNINGHAM, 1990). Os stios AP tambm podem ser gerados por hidrlise natural do DNA. As AP endonucleases geralmente so conhecidas por realizarem a quebra do esqueleto acar-fosfato na regio 5 deste. O resultado dessa quebra gera duas terminaes: uma 3-OH e outra 5-fosfato-desoxirribose. Essa etapa realizada pela enzima DNA desoxirribo-fosfodiesterase (dRpase), para que uma DNA polimerase possa reconhecer e complementar a lacuna gerada pela retirada do nucleotdeo (FRIEDBERGE et al.,1995).

O gene hOGG1 chamado de 8-oxoguanine DNA glycosylase (Homo sapiens). Seu produto (DNA glicosilase/AP liase) catalisa a exciso da base modificada do DNA,

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8-hidroxiguanina (8-oxoG), durante o processo de reparao por exciso de bases (BOITEUX e RADICELLA, 2000). Essa leso surge como resultado da exposio do DNA a espcies reativas de oxignio (ERO) e radiao ionizante. Trata-se de uma leso extremamente mutagnica levando a transverses GC--TA (SHINMURA e YOKODA, 2001).

A enzima hOGG1 relacionada ao reparo por exciso de uma base, uma pea fundamental no sistema de preveno de danos oxidativos e o gene hOGG1 tem sido alvo de estudos j que possvel admitir que clulas sem o alelo funcional desse gene mostraram um fentipo distinto, podendo, a partir desse, iniciar ou acelerar o processo carcinognico (SHINMURA e YOKODA, 2001).

O gene XRCC1 (X-ray repair cross complementing group 1) um dos mais de 20 genes que participam da via de reparo por exciso de bases (BER). Ele codifica uma protena cuja funo auxiliar na reparao de quebras de fita dupla, que so as leses de DNA mais comuns (THOMPSON,2000). Evidncias biolgicas e bioqumicas indicam que XRCC1 interage com um complexo de protenas de reparo de DNA, incluindo a poli(ADP-ribose) polimerase (Parp), a DNA ligase-3 e a DNA polimerase- (CALDENOTT, 1995). H aproximadamente oito diferentes Polimorfismos de Nucleotdeo nico (em ingls, SNP) em XRCC1, trs dos quais so comuns e levam substituio de aminocidos nos cdons 194 (exon 6, base C para T, aminocido Arg para Trp), 280 (exon 9, base G para A, aminocido Arg para His) e 399 (exon 10, base G para A, aminocido Arg para Gln) (http://egp.gs.washington.edu). Por ser localizado em uma regio dentro do domnio de interao com a poli (ADP-ribose) polimerase, o

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polimorfismo Arg399Gln tem sido intensamente investigado, tanto por sua funo como por sua associao com o risco de cncer. A presena do alelo variante Gln399 mostrou estar associado a uma reduzida capacidade de reparo de DNA, sendo avaliada pela persistncia de adutos no DNA, elevados nveis de troca de cromtides irms, mutaes em p53 e atraso prolongado do ciclo celular (SHEN, 1998).

3.5.2. Reparo por exciso de nucleotdeos (NER)

Muitas vezes, o reparo por exciso de bases (BER) insuficiente para lidar com certos tipos de danos de DNA, dessa forma, o reparo por exciso de nucleotdeos (NER) age como uma via alternativa para o reparo. NER tem sido um dos sistemas de reparo mais estudados em humanos, o qual reconhece os danos baseando-se na estrutura anormal da dupla hlice, assim como da estrutura qumica (LIEBERLING, 2006).

Este reparo consiste em um mltiplo processo, no qual as leses de DNA so reconhecidas e demarcadas atravs do desenovelamento da dupla hlice. Em seguida, um trecho de aproximadamente 28 pares de base (pb) de DNA contendo o oligonucleotdeo danificado retirado. A lacuna formada preenchida usando-se como molde o DNA no danificado da outra fita (HASHIMOTO, 2009). As consequncias de um NER defeituoso so demonstradas por trs sndromes recessivas e autossmicas: xeroderma pigmentosum D (XPD), Sndrome de Cockayne (SC) e tricotiodistrofia (TTD). Os pacientes com XPD demonstram uma severa sensibilidade ao sol, 29

apresentando sardas e cncer de pele ainda durante a infncia. Pacientes com SC tambm apresentam sensibilidade ao sol, severas anormalidades neurolgicas e nanismo. Indivduos com TTD apresentam deficincia de enxofre nos cabelos e nas unhas, o que resulta em seu estado quebradio. Alm disso, esses pacientes apresentam atraso no crescimento e retardo mental, assim como fotossensibilidade cutnea, embora sem predisposio ao cncer (STARY, 2002).

A protena XPD, tambm chamada ERCC2 (Excision Repair Crosscomplementing Group 2), um componente chave da maquinaria responsvel por NER e pelo reparo acoplado transcrio (RAT) de DNAs danificados (BECK, 2008). XPD uma helicase que funciona como uma subunidade do complexo de transcrio TFIH. Ela promove a formao de uma bolha no sitio de DNA onde se encontra o dano, gerando o desnovelamento do DNA como preparao para os passos subseqentes (WU, 2009). Para isto, XPD assume uma conformao apropriada para interagir com o DNA e com outros componentes do complexo TFIH. O domnio C-terminal de XPD o stio de interao com a protena ativadora do complexo TFIH (LEHMANN, 2008). neste domnio onde ocorre um dos mais comuns SNPs, o qual resulta na substituio do aminocido Glutamina (Gln) pela Lisina (Lys) no resduo 751(BENHAMOU, 2005).

Embora os dados ainda sejam inconsistentes, evidncias epidemiolgicas e experimentais sugerem que o polimorfismo em XPD pode alterar a capacidade de reparo de DNA e o risco de cncer. Dessa forma, teoricamente possvel que esse polimorfismo seja responsvel por alterar a estrutura do domnio C-terminal e

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conseqentemente a funo da protena XPD, perturbando a interaes protenaprotena e seu papel no reparo de DNA.

3.5.3. Recombinao Homloga

Esse tipo de reparo consiste em um processo de rearranjo fsico que ocorre entre duas cadeias de DNA. considerada como um tipo de recombinao gentica que envolve o alinhamento de sequncias similares, formao de uma juno de Holliday (juno mvel de quatro cadeias de DNA) alm de quebra e reparo, conhecido como resposta do DNA para produzir troca de material entre cadeias. A recombinao homloga constitui uma das vias de reparo de fitas de quebra dupla causadas pela RI, assim como por inibidores de topoizomerase II, na qual so utilizadas como molde as sequncias homlogas das cromtides irms (OLIVEIRA, 2006).

O gene X-Ray Repair Cross Complementing 3 (XRCC3) codifica uma protena que est relacionada via de reparo por recombinao homologa. A protena XRCC3 interage com RAD-51 formando um filamento de nucleoprotena que permitir o alinhamento de regies homlogas de DNA para o reparo (HOEIJMAKERS, 2001; CHRISTMANN et al., 2003).

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4. METODOLOGIA

O projeto da pesquisa foi elaborado segundo as normas dispostas na Resoluo 196/96 do Conselho Nacional de tica em Pesquisa, tendo sido submetido e aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa da Escola Nacional de Sade Pblica, Fiocruz. Este projeto teve suporte financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico CNPq atravs do edital MCT-CNPq/MS-SCTIE-DECIT/CT-Sade N 24/2006 e da Comisso Nacional de Energia Nuclear - CNEN atravs da concesso de bolsa de Mestrado.

4.1. rea de Estudo: Monte Alegre

O municpio de Monte Alegre apresenta as seguintes coordenadas geogrficas: 02 00' 15"S e 54 04' 45"W Gr (figura 4). Possui uma populao de 63.543 pessoas numa rea de aproximadamente 21.703 km2 (IBGE, 2008).

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Figura 4. Mapa da Regio norte abrangendo Monte Alegre e cidades prximas

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4.2. Escolha dos indivduos

De acordo com a distribuio dos dados obtidos na caracterizao radiolgica ambiental e no clculo de dose, foram utilizados os valores dos tercis desta distribuio para comparar os residentes de domiclios com maior (3o tercil) e menor (1o tercil) exposio radiao.

De acordo com o numero de domiclios em cada tercil, foi selecionado o maior nmero possvel de residentes para a avaliao de freqncias de aberraes

cromossmicas. Os critrios de incluso no estudo citogentico sero: a) ter mais de 14 anos; b) no ter diagnstico de cncer; c) estar residindo no mesmo local por pelo menos 5 anos; d) No ter sido exposto exames radiolgicos nos ltimos 3 meses. Cada participante elegvel assinar um termo de consentimento para a pesquisa e responder a um questionrio onde sero obtidas informaes pessoais, tempo de residncia, hbitos de fumo e, consumo de lcool, uso de medicamentos).

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4.3. Coleta das amostras

Para o presente estudo, foram coletados 10 ml de sangue venoso, em tubo vacutainer estril contendo o anticoagulante heparina, de 85 indivduos distribudos pela populao de Monte Alegre. As coletas foram realizadas em agosto de 2008, sendo 39 amostras de homens entre 15 e 78 anos e 46 amostras de mulheres entre 15 e 72 anos de idade no domicilio de cada individuo.

4.4. Cultivo das clulas

A amostra de sangue de cada individuo foi cultivada em garrafas de cultura de 75 ml (previamente identificada com o cdigo da amostra), onde foram adicionados 2 ml de sangue perifrico em 20 ml de meio para caritipo (RPMI 1640, HEPES, Soro fetal bovino e Fitohemaglutinina) (Cultilab). A cultura foi incubada por 47 horas a 37C em estufa umidificada e atmosfera de 5% de CO2.

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4.5. Colheita e fixao das clulas

As clulas foram interrompidas na mitose na fase de metfase com a adio de 400 l da soluo de colchicina (0,16mg/ml) em seguida a cultura foi incubada a 370C por mais 3 horas. Posteriormente a cultura foi transferida para um tubo de centrifuga de 50 ml (identificado com o cdigo da amostra) e centrifugada a 200 xg por 10 minutos `a temperatura ambiente. Descartado o sobrenadante, foi adicionado a soluo hipotnica (KCl 0,075M) previamente aquecida a 37C, at o volume de 32 ml, sob agitao mecnica. Em seguida o tubo foi incubado a 37C por 20 minutos em banho Maria e centrifugado a 200 xg por 10 minutos `a temperatura ambiente. Aps ter descartado o sobrenadante, foi adicionado o fixador (3:1-metanol/cido actico) gelado, sob agitao mecnica, gota a gota at completar 8 ml e depois completar rapidamente at o volume de 32 ml. Os tubos foram mantidos em refrigerao a 4 C por 24 horas e centrifugados a 600 xg por 3 minutos. Descartado o sobrenadante, foi adicionado o fixador at o volume de 20 ml e os tubos foram centrifugados novamente a 600 xg por 3 minutos. Aps repetir a lavagem, foi adicionado o fixador at o volume de 8 ml e os tubos centifugados a 600 xg por 3 minutos. Em seguida foi descartado o sobrenadante e o volume foi completado at 2 ml de fixador. Os tubos foram guardados a 20 C por 48 horas.

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4.6. Preparo das laminas

As laminas foram previamente lavadas com extran 5% e mergulhadas no coplin contendo uma soluo de etanol absoluto/acido clordrico (4:1). Aps 1 h, as laminas foram lavadas e colocadas a 20 C por 10 minutos. Durante esse perodo, a suspenso de clulas foram descongeladas e concentradas para 1 ml de soluo em um tubo de centrifuga de 2 ml. Em seguida com auxilio da pipeta Pasteur foram pingadas de 2 a 3 gotas da amostra em cada lamina previamente mantida a 4 C. Aps secarem, as laminas foram identificadas com o cdigo da amostra e guardadas na geladeira para anlise posterior.

4.7. Colorao das laminas

As laminas escolhidas para anlise microscpica foram mergulhadas em coplin pequeno contendo 50 ml de tampo fosfato (8,9 g de Na2HPO4.2H2O em 500 ml de gua destilada + 6,9 g de NaH2PO4.H2O em 500 ml de gua destilada) e 1,5 ml de soluo Giemsa, por 5 minutos. Em seguida, as laminas foram lavadas com gua corrente.

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4.8. Anlise microscpica

A varredura das laminas foi realizada pelo Microscpio semi automatizado Zeiss Axioplan 2 e com auxilio do programa Zeiss Metafer, as imagens das metfases foram capturadas com localizador automtico. Uma vez que as metfases foram encontradas, cada uma foi analisada individualmente e manualmente. Para cada indivduo 200 metfases foram contadas a fim de verificar a presena de aberraes instveis tipo-cromossmicas (i.e. dicntricos, anis cntricos, e fragmentos acntricos)( LLOYD 1981).

4.9. Purificao do DNA para RFLP

Foi coletada saliva dos mesmos indivduos estudados na analise citogenetica para analise molecular. A coleta foi realizada atravs do Kit Oragene DNA SelfCollection Kit da DNAGenotek. Foi realizada a coleta, preservao, transporte e purificao do DNA.

Cada amostra de saliva contendo o material gentico foi incubada por 1 hora a 50C, para a desnaturao das protenas. Subsequentemente foram adicionados 20L do 38

purificador Oragene a 500L da amostra de saliva em um tubo Eppendorf utilizou-se o vortex por cerca de 10 segundos para garantir a mistura da amostra com o purificador. Em seguida essa mistura foi incubada no gelo por 10 min, para melhor eliminao das impurezas. Aps o esfriamento, centrifugou-se 5 minutos a 13.000 rpm x g, onde o sobrenadante foi usado enquanto que o pellet contendo impurezas foi descartado. Adicionou-se 500L de etanol a 95% ao tubo para a precipitao do DNA, com durao de 10 minutos para a visualizao da nuvem de DNA. Para a finalizao do processo, as amostras foram centrifugadas por 2 min a 13.000 rpm e logo aps foi removido o sobrenadante de cada amostra e adicionados 100L de gua milli-Q em cada tubo de eppendorf ao pellet contendo o material de interesse para anlise molecular.

4.9.1. Quantificao de DNA

Neste processo foi determinada a quantidade de DNA baseada na absoro de energia radiante (luz) utilizando-se o espectrofotmetro ThermoSpectronic Genesys 10 UV. As medies foram realizadas em 260nm, 280nm, pois no comprimento de onda de 260nm o DNA absorve luz e no de 280nm as protenas absorvem. Para cada amostra analisada foram diludos 10L de DNA purificado para 90L de gua milli-Q em uma cubeta. A concentrao de DNA em g /L foi determinada atravs do clculo A260 x 10 (fator de diluio) x 50 (fator de converso). Nesse sentido, a relao absorbncia de 260nm/280nm fornece um parmetro de qualidade do DNA, chamado de pureza. A razo entre 1,8 e 2,2 considerada ideal. Valores inferiores a 1,8 indicam excesso de

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protenas e valores superiores, excesso de solventes orgnicos. As amostras apresentaram uma mdia de 1,7 para a razo de pureza, estando este valor prximo do ideal para a anlise e uma mdia de DNA igual a 120g/L, tambm considerada adequada, j que a quantidade ideal em torno de 100g/L (QUIAGEN, 2008).

4.9.2. Amplificao PCR

As reaes para a amplificao foram preparadas atravs do kit PCR Mastermix da Promega contendo 50 unidades por mL de Taq Dna polimerase, 400M de: dATP, dGTP, dCTP, dTTP e 3mM de MgCl2,. Adicionou-se a 12,5L (1X) do Kit, 2,5L de primer R a concentrao de 10M e 2,5 de primer F tambm a 10M, mais a quantidade de DNA e H2O de acordo com a quantidade encontrada de DNA em cada amostra, totalizando, 25L de reao para a amplificao. Aps esse processo, cada amostra foi colocada em condies fsicas especficas no total de 25 e 35 ciclos de acordo com cada gene (Tabela 1). Os primers correspondentes a cada gene foram selecionados de acordo com a regio de interesse onde ocorrem os polimorfismos (Tabela 2).

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Tabela 1 - Condies fsicas dos genes no processo de amplificao das amostras

Genes

Desnaturao Inicial

Desnaturao

Anelamento

Extenso

Extenso Final

Ciclos

XRCC1 XPD hOGG1 P53 XRCC3

94 oC / 4 94 oC / 4 94 oC / 4 95 oC/ 5 94 oC / 4

94 oC/ 1 94 oC/ 1 94 oC/ 30 95 oC/30 94 oC/ 30

58oC/ 50 65 oC/30 60 oC/30 65 oC/1 60 oC/30

72oC/45 72oC/45 72oC/130 72 oC/1 72 oC/ 30

72oC/5 72oC/5 72 oC/5 72 oC/5 72 oC/5

35 35 25 35 25

Tabela 2 - Primers especficos de cada gene para a realizao do PCR


Locus XRCC1 Forward Primer Reverse Primer

5-TTGTGCTTTCTCTGTGTCCA-3

5-TCCTCCAGCCTTTTCTGATA-3

XPD

5-CCCCTCTCCCTTTCCCTCTGTT-3

5-GCTGCCTTCTCCTGCGATTA-3

p53 XRCC3 hOGG1

5`TTGCCGTCCCAAGCAATGGATGA 5`GCTCGCCTGGTGGTCATCGACTCG 5`CCCAACCCCAGTGGATTCTCATTGC

5`TCTGGGAAGGGACAGAAGATGAC 3 5`AAGAGCACAGTCCAGGTCAGCTG-3 5`GGTGCCCCATCTAGCCTTGCGGCCCTT-3

41

4.9.3. Polimorfismo no comprimento de fragmentos de Restrio - RFLP

O RFLP entendido por polimorfismo no comprimento de fragmentos obtidos por corte da fita dupla de DNA, que evidenciado pela fragmentao do DNA atravs do uso de enzimas de restrio. Para que o polimorfismo seja detectado, necessrio que as sequncias de nucleotdeos nas fitas de DNA de dois ou mais indivduos comparados sejam distintas. A tcnica baseia-se na hidrlise do DNA com enzimas de restrio e posterior separao, por eletroforese, dos fragmentos gerados, que correspondem a padres de restrio especficos. Alm disso, a tcnica de RFLP vem sendo utilizada para rastreamento epidemiolgico (NAVEDA, 2001).

Os genes de interesse foram escolhidos segundo sua importncia para reparo de danos no DNA (bases oxidadas, quebras simples e duplas de DNA) resultantes da exposio s radiaes ionizantes. Os fragmentos dos genes amplificados foram digeridos com as enzimas de restrio especificas de cada gene. Para o gene hOGG1 utilizamos a enzima SatI (Fnu4HI Fermentas-Brasil), que tem como regio de corte a seguinte sequncia: 5'-GC NGC-3'. Para o gene p53 a enzima Bsh1236I (BstUIFermentas-Brasil) com a sequncia para corte 5'-CGC G-3' e a enzima Hin1I(Hsp92II Fermentas-Brasil) para o gene XRCC3 cortando em 5CATG 3. Cada enzima de restrio especfica para cada regio de corte dos genes estudados (Tabela 3). Os tamanhos diferentes dos fragmentos determinam o gentipo do indivduo (Tabela 4).

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Tabela 3 - Genes e suas enzimas de restries correspondentes

Gene alvo XRCC1 XPD p53 XRCC3 hOGG1

Tipo de polimorfismo Arg399Gln Lys751Gln Arg72Pro Thr241Met Ser326Cys

Enzima utilizada PCR-RFLP (MspI) PCR-RFLP (PstI) PCR-RFLP(BstUI) PCR-RFLP(Hsp92II) PCR-RFLP(Fnu4HI)

Tabela 4 - Tamanho dos fragmentos de interesse aps o corte com cada enzima de restrio

Genes alvos XRCC1

RFLP 615pb 221 e 374pb 221,374 e 615pb

Gentipo Gln-Gln Arg-Arg Gln-Arg Lys-Lys Gln-Gln Lys-Gln Pro-Pro Arg-Arg Arg-Pro Thr-Thr Met-Met Ser-Ser Cys-Cys Ser-Cys

XPD

272pb 86 e 186pb

fdsf

86, 186 e 272pb p53 199bp 113bp, 86bp 199, 113 e 86bp XRCC3 335bp 233, 102bp hOGG1 213bp 164 e 49bp 213, 164 e 49bp

335, 233 e 102bp Thr-Met

43

5. RESULTADOS

As amostras foram classificadas de acordo com a mdia da dose (mSv/ano) encontrada. O tercil com menor mdia foi classificado como tercil 1 e a maior mdia de dose como tercil 3. As mdias das doses foram de 2,0151 e 4,1827 (mSv.year-1) calculadas pela equipe da Fiocruz e IRD.

Uma anlise prvia de 2 lminas por individuo foi feita para os 85 indivduos, para verificao a qualidade da amostra. Atravs dessa avaliao determinamos que 33% do material coletado, ou seja, amostras de 28 indivduos estavam em condies adequadas para anlise quanto a freqncia de aberraes cromossmicas. Podemos sugerir que essa deficincia nas amostras est associada ao processamento das mesmas, a coleta, ao transporte, devido ao difcil acesso ao local das residncias e as causas inerentes dos indivduos (ex. leucopenia).

Foram analisadas 6.177 metfases dos 28 indivduos dentre as quais foram encontrados 4 cromossomos dicntricos e 19 fragmentos acntricos.

A tabela 5 apresenta os dados por indivduo com o nmero de metfases analisadas e de aberraes cromossmicas instveis encontradas no grupo mais exposto radiao (tercil 3) e no grupo menos exposto (tercil 1).

44

Tabela 5 . Metfases numero de clulas analisadas por individuo; Dic dicntrico; AC anel cntrico; A fragmento acntrico; Tercil 1- rea de exposio `a menor dose de radiao na regio; 2- rea de exposio `a maior dose de radiao na regio.

45

A freqncia de aberrao cromossmica encontrada por individuo e do grupo estudado est dentro do intervalo dos valores de referencia para o background da freqncia de dicentrico reportados, variando estes entre 0.09 e 2.99 por 1000 clulas (ROMM 2009). Apesar do individuo 55 ter apresentado 3 dicntricos e 10 fragmentos acntricos em uma clula (figura 5), nomeada pela literatura rogue cells, estudos afirmam que esta ocorrncia no esta relacionada com radiao ionizante e ocorre esporadicamente em humanos por diferentes fatores como uma infeco viral (AWA 1986). Embora outros trabalhos com rogue cells sugiram que a exposio crnica a baixo nvel de radiao pode aumentar a susceptibilidade gentica para efeito clastognico de algumas viroses (NEL,1998; ROZGAJ et al.,2002). No individuo 83 foi encontrado um dicntrico porem no podemos correlacionar esse evento somente com a exposio a radiao, j que sabido na literatura que o valor mnimo de dose equivalente, para ser detectado por aberraes tipo cromossmicas 0,1 Sv (LLOYD 1981). No podemos determinar a origem dos fragmentos acntricos quando isolados, ou seja, no combinados a outra aberraes, como observado no individuo 38.

Podemos observar tambm que no houve correlao entre os indivduos fumantes (87 e 93) com o aumento da freqncia de aberraes cromossmicas.

A tabela 6 apresenta os dados obtidos por indivduo com numero de aberrao cromossmica e a presena ou no de polimorfismos nos alelos dos genes estudados. Ao ser encontrado polimorfismo em um alelo, classificou-se esse grupo de pessoas como sendo heterozigotos (Hetero). Quando h polimorfismo nos dois alelos, nomeouse homozigotos variantes (Homo var). No caso em que os dois alelos so normais (no

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polimorficos), os indivduos foram classificados como Homo wt (homozigotos tipo selvagem -wild type). O x representa amostras que no amplificaram pelo mtodo PCR.

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Figura 5. Rogue cell - Metfase com trs dicentricos e dez fragmentos (colorao Giemsa).

48

No. coleta
1 11 12 14 16 20 22 35 36 38 47 48 49 50 51 54 55 58 75 77 82 83 84 85 87 88 93 95

Tercil
1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 3 3 1 1 1 1 1 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Ab. Cromo.
9 frag. 3 dic.+ 10 frag. 1 dic. -

XRCC1
hetero hetero hetero homo wt homo wt homo wt homo var hetero homo var homo var hetero homo var hetero homo var homo var homo var hetero hetero homo wt hetero hetero homo var hetero hetero x x homo wt homo wt

HOGG1
x homo wt homo wt homo wt homo wt x homo wt x homo wt homo wt homo wt homo wt homo wt homo wt homo wt homo wt homo var homo wt homo wt homo wt homo wt homo wt x x hetero homo wt hetero homo wt

XRCC3
x homo wt homo wt hetero homo wt x homo wt x homo wt hetero homo wt homo wt homo wt homo wt homo wt homo wt

P53
x hetero hetero homo wt homo wt x hetero x hetero homo wt hetero homo wt homo wt homo var homo var homo var

XPD
homo wt hetero homo wt homo wt hetero homo wt hetero homo wt hetero homo wt hetero hetero homo wt hetero hetero hetero hetero

homo wt homo wt homo wt homo wt homo wt homo wt homo wt x x homo wt homo wt homo wt

homo var hetero homo wt homo var homo wt homo wt homo var homo wt hetero homo wt x homo wt x homo wt homo wt x hetero homo wt homo wt hetero homo wt homo var hetero

Tabela 6. Correlao entre os dados obtidos da analise citogentica e analise molecular dos indivduos de Monte Alegre (HOZUMI 2009, DUARTE 2010). Dic representa o numero de dicentrico e frag. o numero de fragmento encontrado por individuo.

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6. DISCUSSO

O Radnio (222Rn) um gs radioativo da srie de decaimento do urnio, o qual encontrado difuso em rochas. Em Monte Alegre, a maioria das casas so construdas por rochas removidas da crosta terrestre nas florestas onde h reservas de urnio. A concentrao do
222

Rn dentro dessas casas varia entre 88 80 a 338 19 Bq m-3

(concentrao mdia 116 84 Bq m-3). Em outras reas na Amaznia a concentrao de radnio encontrada dentro das casas foi consideravelmente mais baixa (28 3 Bq m-3; MELO 1999).

A exposio domstica ao urnio e aos seus produtos de decaimento uma via importante de contaminao humana. Estudos anteriores indicaram a possvel associao entre casos de leucemia linfoctica aguda e exposio radiao gama em indivduos que residiam em casas construdas com concreto contendo urnio na Sucia (AXELSON 2002). Anlise de aberraes cromossmicas instveis em linfcitos perifricos de moradores das casas com elevadas concentraes de 222Rn (>200 Bq m-3), revelou um aumento estatisticamente significativo de aberraes tipo cromossmicas (dicntricos) quando comparado aos indivduos controle (no expostos)

(BAUCHINGER et al. 1994; OESTREICHER et al. 2004). Estudos revelam que a freqncia de aberraes cromossmicas instveis em linfcitos perifricos tem sido aplicada como biomarcadores preditores da carcinogenese (NORPPA et al. 2004).

50

A ICRP 65 sugere que o nvel de interveno para reduzir os nveis de radnio nas residncias s se justificar com concentraes superiores a 600 Bq.m-3 ou doses anuais de 10 mSv. As doses encontradas em Monte Alegre variaram entre a menor dose de 3 mSv a maior dose de 8 mSv, sendo assim os valores medidos em Monte Alegre no apresentariam riscos `a sade da populao pelo ponto de vista da proteo radiolgica, segundo a ICRP. Porm, os efeitos citogenticos da exposio crnica `a baixos nveis de radiao at hoje no esto claros (CHANG 1999, MILLER 2005). A exposio `a dose de baixo nvel de radiao no influencia a sade humana diretamente; porm a predisposio gentica encontrada em alguns indivduos contribui para o aumento da radiossensiblidade dos mesmos, conseqentemente colabora com a instabilidade gentica, e assim contribuindo para o desenvolvimento do cncer (MILACIC, 2004, STREFFER, 2010).

Uma vez que reas com radiao natural de fundo alta, como apresentou algumas residncias em Monte Alegre PA, tem a probabilidade da incidncia de cncer, a utilizao de biomarcadores de efeitos assim como de exposio (aberraes cromossmicas instveis) se torna uma importante ferramenta para avaliao epidemiolgica.

Apesar de no encontrarmos um aumento na freqncia de aberraes cromossmicas instveis no grupo estudado, os resultados dos estudos citogenticos nas reas de radioatividade natural elevada so contraditrios. Estudos afirmam que populaes ocupacionalmente expostas ao radnio apresentam uma freqncia de aberraes cromossmicas instveis significativamente maior que em grupos controle

51

(POHL-RULING & FISCHER, 1979, BRANDOM et al, 1978, BILBAN et al, 1998, SRAM et al, 1993, BRANDOM et al, 1972). Por outro lado, estudos relataram que a freqncia de aberraes cromossmicas induzidas pela radiao foi menor do que `as encontradas nas reas de controle (GHIASSE-NEJAD et at, 2002).

Com isso precisamos levar em considerao outros fatores que influenciam o aumento da freqncia de aberrao cromossmica instveis como a variabilidade gentica individual, como tambm a correlao da mesma com a exposio s radiaes ionizantes. Estudos afirmam que a predisposio gentica para efeitos clastognicos aumenta a suscetibilidade individual do desenvolvimento do cncer (GOODE et al, 2002). No caso especifico de Monte Alegre, por exemplo, a combinao entre variantes polimrficas ocorridas em genes relacionados com a manuteno da estabilidade do genoma poderia conferir maior risco ao cncer de pulmo em pessoas expostas a altos nveis de radnio.

Em nosso laboratrio tambm foi determinada a presena de polimorfismos para os mesmos indivduos em estudo (HOZUMI 2009, DUARTE 2010). O polimorfismo gentico uma variao natural no gene e est presente num valor superior a 1 % da populao e essa mutao pode influenciar no fentipo de algumas clulas interferindo no seu funcionamento normal (GENE TESTS, 2009). Quando este polimorfismo est presente em genes responsveis pelo reparo do DNA a clula est mais vulnervel aos efeitos clastogenicos sejam estes endgenos ou exgenos como a radiao ionizante (MOCELLIN, 2009). O reparo errneo do DNA pode causar o aumento da freqncia de aberrao cromossmica e esse efeito deve ser avaliado como um aumento do risco

52

de cncer (NATARAJAN 2008). KIURU et al. (2005) revelou em seu estudo com polimorfismos de genes de reparo em residentes expostos ao radnio na Finlndia, o aumento significativo em duas vezes a taxa de dicentricos em indivduos portadores do gene polimrfico XRCC1. Muito embora no haja descrio do aumento de dicntricos em indivduos polimrficos para os outros quatro genes, eles participam de vias metablicas relacionadas a reparo de leses induzidas pelas radiaes ionizantes. Logo de grande importncia correlacionarmos os resultados dos trabalhos feitos em nosso laboratrio no grupo de indivduos de Monte Alegre exposto e no exposto a radiao.

Os genes polimrficos envolvidos nesse estudo esto relacionados em regular a progresso do ciclo celular (p53) e em reparar o DNA. Os genes XRCC1 e HOGG1 so responsveis pelo processo de reparao por exciso de bases. Onde o produto do hOGG1 responsvel por remover o dano no DNA, e o produto do gene XRCC1 participa do complexo de protenas de reparo. O gene XPD est relacionado ao reparo por exciso de nucleotdeos. O gene XRCC3 est relacionado ao reparo por Recombinao homologa. Como cada um tem um papel especifico no sistema de reparo, a associao desses genes polimrficos em um individuo e exposio a agentes genotxicos pode potencializar o comprometimento do mecanismo celular de responder s leses no DNA. Assim de grande valia avaliarmos separadamente a resposta individual do grupo do presente estudo.

O individuo 55 apresentou trs variaes polimrficas, incluindo XRCC1 e hOGG1, e a presena de aberraes cromossmicas. O individuo 38 apresentou duas

53

variaes polimrficas, XRCC1 e XRCC3, e a presena de aberrao cromossmica. Estudo com trabalhadores expostos a agentes genotoxicos que apresentavam variantes de XRCC3 apresentaram um aumento significativo de fragmentos acntricos (MATEUCA et al., 2005). O individuo 83 apresentou duas variaes polimrficas, XRCC1 e p53, e a presena de aberrao cromossmica. Podemos observar que a variao polimrfica do gene XRCC1 est presente nos trs indivduos que apresentaram aberrao cromossmica, porem no podemos afirmar esta correlao, j que existem outros fatores como infeco viral, alimentao e at a tcnica utilizada que interferem na produo espontnea de aberraes cromossmicas instveis.

54

7. CONCLUSO

Nossos estudos sugerem que a exposio a radiao, produzida pelo decaimento do Urnio, nas residncias de Monte Alegre no suficiente para aumentar a freqncia de aberraes tipo-cromossmicas instveis para o grupo de estudo.

A combinao dos alelos polimrficos dos genes estudados no influenciou na produo de dicntricos nos indivduos analisados.

Os dados obtidos no presente estudo colaboram para o acervo de estudos epidemiolgicos em reas de radioatividade natural elevadas e para uma resposta a populao de Monte Alegre, aos questionamentos levantados em relao `a radioatividade natural, reiterando que a mesma no est ocorrendo um aumento da freqncia de aberraes tipo-cromossmicas instveis na sua populao.

55

8. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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