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Introduccin

Este practico tiene como finalidad aprender la tcnica que se emplea para separar las distintas clulas sanguneas, en este caso nos basamos en la obtencin de clulas mono nucleares , las que se caracterizan por poseer un nico ncleo grande y redondo, como los monocitos y linfocitos (Agranulocitos), clulas que presentan un rol muy importante a nivel inmunolgico. Para lograr un frotis que nos permita observar e identificar la morfologa de las clulas mono nucleares, se obtuvo sangre venosa de dos alumnos, sta se deposito en un tubo de examen que contena EDTA para que no exista coagulacin por el bloqueo de Calcio, posterior a esto ocupamos 1ml de sangre por grupo y lo agregamos a un tubo que contena 1ml de histopaque (d=1077), procurando que no se homogenizara se llevo a centrifugar por unos 30 minutos aprox. ,donde finalmente logramos observar que la muestra ahora presentaba cinco fases (glbulos rojos, capa blanquecinas con clulas polimorfo nucleares, histopaque, nuble blanquecina con clulas mono nucleares y plasma), siendo primordial para el estudio la fase de nube blanquecina que encontramos superior al histopaque y bajo al plasma, pues estas son clulas mono nucleares (linfocitos y monocitos) .Luego de la separacin se saca el plasma y se extrae las clulas mono nucleares, con las que se hace el frotis tiendo la muestra con Tincin de May Grunwald-Giemsa y as finalmente poder observar la morfologa de las clulas a estudiar (monocitos, linfocitos), al microscopio. Para que se pueda lograr separar correctamente las clulas sanguneas, es fundamental agregar el histopaque, este es una preparacin no estril que se utiliza para el aislamiento de clulas mono nucleares para examen histolgico es para uso en diagnstico in Vitro es una solucin de polisucrosa y diatrizoato sdico, ajustada a una densidad de (1,077 0,001 g/ml.) La sangre venosa anticoagulada se agrego a un tubo con histopaque. Durante el centrifugado, los eritrocitos Agranulocitos son agregados por la polisucrosa, sedimentndose rpidamente, mientras que los linfocitos y otras clulas mono nucleares permanecen en la zona entre el plasma e histopaque. La contaminacin por eritrocitos es nfima. Un factor determinante del porque es probable realizar esta tcnica, es la diferencia que existe entre las densidades de las clulas sanguneas, quedando as los Glbulos rojos sedimentados seguidos por Basfilos, Neutrfilos y Eosinfilos (granulositos), luego por el histopaque, por la nuble blanquecina de Linfocitos y Monocitos y finalmente por el plasma.

Marco terico El sistema inmune consiste en varios rganos y diferentes clulas, que se encargan de proteger l organismos de agentes extraos que pueden significar un peligro para el mismo. En este laboratorio nos enfocamos en observar la morfologa de las clulas mononucleares, las que son de dos clases monocitos y linfocitos, las que son nombradas a continuacin: Monocitos: Estas clulas en conjunto con los macrfagos componen el sistema fagoctico nuclear (SFM), que cumple diferentes funciones como la remocin de clulas muertas, destruccin de microorganismos, participacin en reacciones inflamatorias y en la presentacin de antgenos, etc. Los monocitos contienen grnulos azurfilos que contiene hidrolasas acidas que en conjunto con mecanismos oxidativos participan en la destruccin de partculas fagocitadas. Linfocitos: Estas clulas son la base del sistema inmune especfico, son clulas pequeas que poseen un solo ncleo grande y excntrico y un reborde delgado de citoplasma azul claro. En el sistema inmune encontramos tres clases de linfocitos, clulas B, clulas T y las clulas NK (natural killer, destructores naturales)

Plasma Monocitos y linfocitos

Histopaque 1077 Eritrocitos y granulocitos

Materiales
Extraccin de sangre Un voluntario Jeringa Tubo Liga Algodn Guantes Alcohol

Segmentacin celular Tubo de segmentacin Histopaque - 1077 Sangre Centrfuga

Preparacin de la muestra Porta objeto Cubre objeto Gotario Tincin de May Grunwald Papel Nova

Vista de la muestra Microscopio ptico Aceite de Inmersin Cmara (para hacer registro de los resultados)

Desarrollo del Laboratorio

Extraccin de sangre Al inicio del laboratorio se pidi 2 voluntarios para la extraccin de sangre, la cual se realizo con las tcnicas de extraccin que no son motivo de discusin de este laboratorio, la sangre extrada se deposito en tubos de examen el cual contiene un bloqueador de calcio como anticoagulante. Este se espero y revolvi por unos instantes.

Segmentacin Celular En un tubo de segmentacin le colocamos 1 ml. de histopaque, en el cual introducimos con sumo cuidado y por las orillas del tubo 1 ml de los voluntarios obtenidas en el punto anterior, el cuidado es evitar la homogenizacin de la muestra para su correcta separacin. Este tubo se llevo hacia la centrifuga rotulado con el nombre del grupo, el cual se centrfuga unos 30 minutos.

Preparacin de la muestra Con la obtencin del tubo despus de haber pasado por la centrifuga obtuvimos cinco fases distintas, glbulos rojos en la base, arriba de ellos en un manto blanco clulas polimorfo nucleares, siguiente de histopaque un manto blanquecino con clulas mono nucleares, y plasma sanguneo. Las cual por inters de nuestro laboratorio trabajamos para visualizar las clulas mono nucleares, para esto con el gotario retiramos el plasma hasta casi el limite con la nube blanquecina dejamos lo menos posible pero dejamos para asegurarnos de la no perdida de muestra, lavamos el gotario y nos preparamos para la extraccin de la nuble blanquecina de nuestro estudio la cual extrajimos con su totalidad hasta tocar la histopaque, el tubo con el resto de las fases se almaceno por mientras transcurra el laboratorio para su correcta eliminacin, del gotario con la fase blanquecina ocupamos una gota por porta objetos que para nuestra experiencia fueron tres. En los porta objetos realizamos respectivamente los frotis, esparcindolos homogneamente con la ayuda del cubre objeto. Los frotis realizados se dejan secando, una vez secos se llevan hacia la tincin de May Grunwald que consta de tres envases y un lavado final con PBS, en cada frasco el frotis se inserta siete veces de forma seguida y constante, con una eliminacin de exceso entre cada frasco, despus del lavado con PBS se dejan secando para su observacin en el microscopio

Vista de la muestra Los porta objetos con su frotis y su tincin realizada y seca se colocan en el microscopio el cual se enfoca en 40X, al encontrar se coloca aceite de inmersin para llegar la aumento de 100X el cual registramos nuestra observacin de las clulas mono enucleadas.

Resultados 1. Extraccin de sangre Sangre en tubo de Examen

Sangre en tubo de segmentacin

2. Segmentacin Celular Segmentacin Celular

3. muestra

Preparacin de la

Frotis con tincin

4. Recopilacin de la muestra

Imagen 1.-En esta imagen se observan de cuatro Linfocitos (clulas mononucleares con escaso citoplasma ncleo prominente).La otras clulas que se observa (las ms pequeas, con forma de puntos) son plaquetas.

Imagen 2.-En esta imagen se puede observar claramente un monocito (reconocido por su ncleo arrionada y forma irregular),que en las muestras que obtuvimos se encontraban en pocas cantidades.

Discusin
Extraccin de sangre Para llevar a cabo este practico empleamos como anticoagulante el EDTA (acido etilendiaminotetracentico),este anticoagulante exgeno por excelencia acta como quelante del calcio, lo que impide su activacin y no deja producir coagulacin sangunea, adems no afecta la morfologa erotricitaria ni leucocitaria lo que nos permiti lograr el objetivo de observar las clulas mononucleares .Por otro lado tenamos la opcin de utilizar heparina, cadena de polisacridos que biolgicamente acta como cofactor de la antitrombina III, que es el inhibidor natural de la trombina. La heparina no la utilizamos por el simple hecho de que no necesitbamos observar la funcionalidad de las clulas. Segmentacin Celular Al momento de vaciar la sangre desde el tubo de examen al con histopaque es de gran importancia hacerlo con cuidado para procurar que estas no se homogenicen, pues si esto ocurre las capas no quedaran bien definidas. La base terica de esta tcnica est basada en que las clulas sanguneas poseen diferentes pesos especficos, densidades distintas, lo que permite que al centrifugar la muestra queden ordenadas en fases quedando as en el fondo del tubo los glbulos rojos.

Preparacin de la muestra Luego de retirar el tubo de la centrfuga procedimos con ayuda de la pipeta Pasteur a sacar la capa de plasma para posteriormente hacer lo mismo con la capa de las clulas mononucleares con el propsito de utilizarla para realizar el extendido que se colorear con tincin hematolgica. Para tal efecto, se obtuvo una gota de la capa de clulas mononucleares ,la cual se dej sobre el portaobjetos y se realizo el frotis, observndolo finalmente bajo el microscopio. En esta etapa nos complicaba el poco manejo que tenamos con la tcnica, pues si no extraamos con cuidado tanto el plasma como la fase de la nube, estas se podan mezclar con las dems capas haciendo que posteriormente sea muy complicado observar los linfocitos y monocitos. Vista de la muestra Para observar el frotis de sangre en primera instancia, tal como lo requera el prctico, utilizamos el objetivo de 40x donde no visualizamos las clulas en cuestin. Finalmente al cambiar el objetivo a 100x y usando el correspondiente aceite de inmisin observamos lo siguiente: Encontramos grandes cantidades de linfocitos, los que apreciamos fcilmente por la presencia de un citoplasma pequeo adems de un ncleo circular y grande, la tincin hematolgica le confiere una tonalidad azul violcea. En cuanto a la visualizacin de monocitos, fue ms compleja su identificacin, pues se encontraban en escazas cantidades, pero que a pesar de ello logramos constatar la presencia de estas enfocandondonos en la teora que dice que su ncleo es arrionado. Adems en la muestra observamos varias plaquetas que se mezclaron al momento de extraer la nube de clulas mononucleares

Aplicaciones
La tcnica que empleamos en el laboratorio para separar las clulas mononucleares de sangre perifrica se puede utilizar con diferentes fines, ya sea para el estudio de las mismas en cuanto es a su morfologa o funcionalidad, como para realizar otros estudios hematolgicos. A continuacin se nombraran algunas de estas aplicaciones. Extraccin de clulas madre Para llevar a cabo este procedimiento es necesario aplicar la tcnica de separacin de clulas sanguneas. Citometra de flujo La citometra de flujo (CMF) es un procedimiento altamente eficiente para caracterizar poblaciones celulares que se encuentren en suspensin. En un principio, se utilizaba fundamentalmente para identificar el fenotipo celular, es decir la expresin diferencial de antgenos en la membrana plasmtica, pero hoy da son muchos los parmetros estructurales y funcionales que se pueden medir por CMF (Figura 1). Entre las muchas ventajas que presenta en relacin a la microscopa de fluorescencia se encuentran la posibilidad de analizar un nmero muy elevado de clulas en pocos segundos y la posibilidad de cuantificar la

intensidad de fluorescencia. La principal desventaja radica en el alto costo de la adquisicin y mantenimiento del clitmetro de flujo. Para poder realizar este estudio es necesario previamente hacer una separacin de clulas sanguneas las que luego llevaran a el estudio, un ejemplo es del estudio de leucocitos de sangre perifrica humana. Microlinfocitotoxicidad en placas de TerasakiFundamento: Este mtodo se basa en el empleo de anticuerpos especficos contra diferentes alelos del HLA (molculas de clase I y de clase II). Cuando estos anticuerpos reconocen al antgeno contra el cual son especficos, y en presencia de complemento, se produce la lisis celular. El ensayo se realiza en placas plsticas de 60 fosas denominadas placas de Terasaki y la muerte celular se cuantifica mediante una tincin diferencial de clulas viables y muertas. Etapas: 1. Extraccin de sangre del paciente 2. Aislamiento de clulas mononucleares 3. Siembra de clulas en fosas de placas de Terasaki previamente sensibilizadas con sueros policlonales contra diferentes alelos del HLA.21 4. Incubacin (unin de los Ac a las molculas de clase I o de clase II del HLA) 5. Agregado de fuente de complemento (suero de conejo) 6. 6. Incubacin y lisis de clulas que unieron Ac en la etapa anterior 7. 7. Agregado de un colorante de contraste para diferenciacin de clulas vivas y muertas (diacetato de fluorescena) 8. Observacin microscpica y clasificacin.

Conclusin
A travs de esta experimentacin logramos aprender la tcnica de laboratorio con la cual podemos separar las diferentes clulas sanguneas basndonos en la teora de que cada clula presenta diferentes densidades, adems hay que recordar que es primordial la utilizacin del histopaque, el cual, dependiendo de su densidad, se va a interponer entre las clulas quedando as las de mayor densidad bajo el histopaque y las de menor densidad arriba del histopaque, adems logramos hacer un frotis sanguneo y continuar practicando con la tincin hematolgica correspondiente, para despus analizar en el microscopio las clulas objetivo de nuestro laboratorio, las clulas mononucleares, es decir, monocitos y linfocitos.

Anexos