Ultrassom pulsado de baixa intensidade no tratamento de lceras venosas crnicas: avaliao histopatolgica pelo ImageJ

Ana Elisa S. Jorge1 e Marco Andrey C. Frade1,2 1 Programa de Ps-Graduao Interunidades em Bioengenharia EESC/ FMRP/ IQSC USP, So Carlos, Brasil 2 Diviso de Dermatologia do Departamento de Clnica Mdica FMRP/ USP, Ribeiro Preto, Brasil anaelisa.jorge@gmail.com
Resumo - A lcera venosa representa a maior incidncia (70 a 80 %) das lceras de perna. Os impactos psicossocial e econmico dessas leses crnicas repercutem em elevados custos financeiros e em m qualidade de vida aos pacientes acometidos. Este artigo apresenta a avaliao histopatolgica de lceras venosas crnicas tratadas pelo ultrassom pulsado de baixa intensidade. Para tanto, durante 90 dias, lceras venosas (N = 8) foram irradiadas 3 vezes por semana com um aparelho de US (intesidade SATA de 30 mW/cm2; frequncia de ressonncia de 1,5 MHz; modo pulsado) elaborado pelo Programa de Ps-Graduao Interunidades em Bioengenharia da Escola de Engenharia de So Carlos/USP. As bipsias, realizadas na borda e no centro dessas feridas, foram colhidas no 1 (inicial) e 45 dias de seguimento teraputico. A partir das lminas processadas com hematoxilina-eosina, as imagens obtidas foram analisadas pelo software ImageJ para quantificao de fibroblastos, clulas inflamatrias e vasos sanguneos. Os resultados estatsticos (modelo de Poisson com efeitos aleatrios) apontaram diferenas significativas (p < 0,05) tanto entre as duas regies observadas (borda/centro) quanto nos diferentes perodos realizados (1/45 dias) para as diferentes variveis. Com isso, podemos afirmar que a aplicao da onda sonora estimula o reparo tecidual de lceras venosas crnicas por acelerar a fase inflamatria e ativar a fase proliferativa da cicatrizao. Palavras-chave lcera venosa, ultrassom, anlise histopatolgica, ImageJ.

fundamentais para a cicatrizao. Desempenha tambm um papel importante no recrutamento de fibroblastos [9] [11], os quais sintetizam matriz extra-celular para dar suporte ao tecido neo-formado. Alm disso, esse estmulo sonoro incrementa a angiognese local [12], [13], [14], o que contribui para a formao do tecido de granulao, que dar suporte migrao dos fibroblastos. Dessa forma, o US acelera as fases inflamatria e proliferativa da cicatrizao, o que favorece o reparo tecidual das lceras crnicas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficcia do tratamento de lceras venosas crnicas com US pulsado de baixa intensidade pela anlise histopatolgica - contagem de fibroblastos, clulas inflamatrias e vasos sanguneos. II.
MATERIAIS E MTODOS

I. INTRODUO s lceras venosas so feridas crnicas que advm da Insuficincia Venosa Crnica (IVC), caracterizada pela hipertenso venosa crnica. Tal deficincia ocasiona mudanas estruturais nos capilares sanguneos, edema, inflamao, necrose, ulcerao e fibrose da pele [1]. O objetivo das pesquisas no reparo dessas feridas desenvolver produtos, tcnicas e mtodos que estimulem e acelerem o processo cicatricial e evitem recidivas. Dentre as inmeras formas de tratamento das lceras venosas crnicas, o uso teraputico do ultrassom (US) pulsado de baixa intensidade est indicado como co-adjuvante. Desde a dcada de 60, pesquisas apontam evidncias considerveis sobre uso do US como recurso teraputico na cicatrizao dessas feridas [2] [7]. O US pulsado de baixa intensidade tido como um agente pr-inflamatrio, pois potencializa a resposta macrofgica [8] no stio da leso, facilitando o desbridamento de tecidos desvitalizados ou necrticos da ferida e aumentando a liberao de fatores de crescimento

Oito pacientes com lceras venosas crnicas (caracterizadas clinicamente pelos sinais de IVC, como edema, varicosidades, eczema e lipodermatoesclerose) foram tratados no Ambulatrio de lceras da Dermatologia (AUD) do Centro Sade Escola (CSE) da Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto/USP. Este estudo foi aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa do CSE conforme processo nmero 019/2008. O tratamento consistiu na troca do curativo diariamente (comumente realizado apenas com gazes e soro fisiolgico 0,9%) e na aplicao do US, realizada pelo fisioterapeuta responsvel. A. Aplicao do US O Programa de Ps-Graduao Interunidades em Bioengenharia da Escola de Engenharia de So Carlos/USP forneceu o aparelho de US com as seguintes caractersticas: baixa intensidade (30 mW/cm2); modo pulsado com burst de 1,5 MHz; largura de pulso 200 s; frequncia de repetio de pulso de 1 kHz e dimetro do transdutor de 22 mm. Aps assepsia com lcool 70%, o transdutor foi coberto por um filme de PVC a fim de promover higiene adequada na interface aparelho/paciente. Como agente acoplador, foi utilizado um gel estril base de gua, demonstrado pela Fig. 1.

D. Anlise Estatstica O modelo de Poisson com efeito aleatrio foi utilizado para analisar a contagem de Fibroblastos, Clulas Inflamatrias e Vasos Sanguneos nos diferentes dias analisados (1 e 45 dia) e em ambos locais da ferida (borda e centro). Para tanto, os testes foram estabelecidos com 95% de potncia (p < 0,05) a fim de verificar possveis diferenas significantes entre os grupos. III.
RESULTADOS E DISCUSSO

Fig. 1: Aparelho de US e seu transdutor devidamente acondicionado.

A anlise estatstica dos dados obtidos pela contagem de fibroblastos, clulas inflamatrias e vasos sanguneos encontram-se nas Fig. 3, 4 e 5, respectivamente.

O US foi aplicado sobre o leito da lcera na tcnica estacionria durante 3 minutos at cobrir toda extenso dessa ferida. B. Estudo Histopatolgico As bipsias foram executadas pelo dermatologista responsvel do AUD em duas etapas: 1 dia (prtratamento) e aps 45 dias. Com um punch de 6 mm foram colhidos fragmentos da borda e do centro das lceras, para posterior processamento, emblocagem e confeco das lminas, coradas por Hematoxilina-Eosina (HE). As imagens dessas lminas foram capturadas pela cmera Leica DFC 280 embutida no microscpio ptico Leica DM 4000B e processadas pelo software LAS Leica Application Suite - verso 3.2.0 (Leica Microsystems - Wetzlar, Alemanha) no Laboratrio da Dermatologia da FMRP/USP. Com aumento de 400 vezes, foram obtidos 10 campos (264 x 211 m) aleatrios de cada lmina para posterior quantificao no ImageJ. C. Anlise das Imagens Para anlise das imagens foi utilizado o programa ImageJ verso 1.36. Esse software, de acesso livre, processa e analisa imagens em computadores que possuam Java. Com as imagens obtidas pelo software LAS, foi possvel fazer a contagem do nmero de fibroblastos, clulas inflamatrias e vasos sanguneos do tecido ulcerado a partir do ImageJ, como mostra a Fig. 2.

Fig. 3 Amostragem para a varivel Fibroblasto.

Fig. 2 - Contagem de fibroblastos, clulas inflamatrias e vasos sanguneos corados com HE (400x).

Fig. 4 Amostragem para a varivel Clulas Inflamatrias.

REFERNCIAS
[1] T. Mustoe, Understanding chronic wounds: a unifying hypothesis on their pathogenesis and implications for therapy The American Journal of Surgery, vol. 187, pp. 65S-70S, 2004. M. Dyson, C. Franks e J. Suckling, Stimulation of healing of varicose ulcers by ultrasound, Ultrasonics, vol. 14, n. 5, pp. 232236, Sept. 1976. M. J. Callam, A controlled trial weekly ultrasound therapy in chronic leg ulceration, The Lancet, vol. 2, pp. 204-206, July 1987. M. L. Hilrio, Radiao Ultra-Snica de Baixa Intensidade na Reparao Tecidual de lceras Trficas de Perna, Dissertao de Mestrado, Programa de Ps-Graduao Interunidades em Bioengenharia, EESC/FMRP/IQSC/USP, So Carlos, 153 pp., 1993 M. Weichenthal, P. Mohr, W. Stegmann e E. W. Breitbart, Lowfrequency ultrasound treatment of chronic venous ulcers Wound Repair and Regeneration, vol. 5, n. 1, pp. 18-22, 1997. M. A. D. J. Anastcio, Reparao Epitelial em lceras Vasculares aps Estimulao do Ultra-Som Pulsado de Baixa Intensidade, Dissertao de Mestrado, Programa de Ps-Graduao Interunidades em Bioengenharia, EESC/FMRP/ IQSC/USP, So Carlos, 89 pp., 2000. L. A. Santana, Tratamento de lceras venosas por ultra-som de baixa intensidade: avaliao por anlise de imagem e imunohistoqumica, Dissertao (Mestrado) Programa de PsGraduao Interunidades em Bioengenharia, So Carlos: EESC/FMRP/IQSC -USP, 127 pp., 2006. S. R. Young e M. Dyson, Macrophage responsiveness to therapeutic ultrasound, Ultrasound in Medicine and Biology, vol. 16, n. 8, pp. 809-816, 1990. S. R. Young e M. Dyson, Effect of therapeutic ultrasound on the healing of full-thickness excised skin lesions Ultrasonics, vol. 28, n. 3, pp. 175-80, 1990. S. Zhou, A. Schmelz, T. Seufferlein, Y. Li e J. Zhao, Molecular mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts The Journal of Biological Chemistry, vol. 279, n. 52, p. 54463-54469, 2004. D. F. Webster, J. B. Pond, M. Dyson e W. Harvey, The role of cavitation in the in vitro stimulation of protein synthesis in human fibroblasts by ultrasound Ultrasound in Medicine and Biology, vol. 4, n. 4, pp. 343-51, 1978. C. Uhlemann, B. Heinig e U. Wollina, Therapeutic ultrasound in lower extremity wound management, Lower Extremity Wounds, vol. 2, n. 3, pp. 152-7, 2003. M. Peschen, M. Weichenthal, E. Schpf e W. Vanscheidt, Lowfrequency ultrasound treatment of chronic venous leg ulcers in an outpatient therapy, Acta Dermatology and Venereology (Stockholm), vol. 77, pp. 311-4, 1997. S. R. Young e M. Dyson, The effect of therapeutic ultrasound on angiogenesis, Ultrasound in Medicine and Biology, vol. 16, n. 3, pp. 261-269, 1990.

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[7] Fig. 5 Amostragem para a varivel Vasos Sanguneos.

Em relao ao nmero de fibroblastos antes do tratamento e aps 45 dias, podemos afirmar que o US incrementou significantemente a proliferao dessas clulas, tanto na borda, quanto no centro da lcera. Essa observao corroborada pelo estudo de [9], que observaram um aumento significativo de fibroblastos em leso de pele de ratos tratada com US pulsado de intensidade SATA de 0,1 W/cm2. Devido a isso, o US pode acelerar a cicatrizao da lcera por atingir a fase proliferativa mais rapidamente, aumentando a sntese da matriz extra-celular (principalmente colgeno). J na varivel clulas inflamatrias, o estmulo sonoro diminuiu significantemente a quantidade do infiltrado inflamatrio do centro da lcera, onde inicialmente continha mais clulas. Isso ocorre porque o estmulo sonoro potencializa a resposta macrofgica, encurtando a fase inflamatria. Essa observao est de acordo com o estudo de [10], que tambm indica um aumento na resposta macrofgica em culturas de clulas irradiadas com US de intensidade baixa (0,5 W/cm2) e frequncia de 0,75MHz. O US apresentou tambm um papel angiognico [14], por aumentar significantemente o nmero de vasos sanguneos na borda da lcera, local em que ocorre a proliferao das clulas quiescentes que daro suporte reepitelizao da ferida. IV. CONCLUSO Podemos afirmar que a aplicao do US pulsado de baixa intensidade estimula o reparo tecidual de lceras venosas crnicas por acelerar a fase inflamatria e ativar a fase proliferativa da cicatrizao. AGRADECIMENTOS tcnica do Laboratrio da Dermatologia da FMRP/USP, Marilena Heredia e CAPES, pelo apoio financeiro.

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