IBP1410_12 REMOO DE COMPOSTOS SULFUROSOS DE SISTEMA BIFSICO CONTENDO COMBUSTVEL SINTTICO POR Rhodococcus erythropolis ATCC 4277 Danielle

Maass1, Antnio Augusto Ulson de Souza2, Selene M. A. Guelli Ulson de Souza3

Copyright 2012, Instituto Brasileiro de Petrleo, Gs e Biocombustveis - IBP Este Trabalho Tcnico foi preparado para apresentao na Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012, realizado no perodo de 17 a 20 de setembro de 2012, no Rio de Janeiro. Este Trabalho Tcnico foi selecionado para apresentao pelo Comit Tcnico do evento, seguindo as informaes contidas no trabalho completo submetido pelo(s) autor(es). Os organizadores no iro traduzir ou corrigir os textos recebidos. O material conforme, apresentado, no necessariamente reflete as opinies do Instituto Brasileiro de Petrleo, Gs e Biocombustveis, Scios e Representantes. de conhecimento e aprovao do(s) autor(es) que este Trabalho Tcnico seja publicado nos Anais da Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012.

Resumo
A queima de combustveis fsseis tem liberado uma grande quantidade de poluentes na atmosfera. Entre os mais nocivos encontra-se o dixido de enxofre (SO2), que ao reagir com a umidade do ar se transforma em cido sulfrico, sendo, portanto, o causador da chuva cida. A chuva cida extremamente prejudicial para a fauna e flora; acelera os processos de corroso de prdios e monumentos; e gera graves problemas de sade para o ser humano. Em vista disso, muitos pases tm reformulado sua legislao a fim de exigir a comercializao de combustveis com teores baixssimos de enxofre. Os processos de dessulfurizao existentes no so capazes de remover o enxofre a nveis to baixos. Por isso, tem-se desenvolvido um novo processo denominado biodessulfurizao. Nesse processo, a degradao do enxofre se d atravs da ao de micro-organismos que atuam como catalisadores. A bactria Rhodococcus erythropolis vem despontando como uma das mais promissoras na biodessulfurizao, pois remove o enxofre dos organossulfurados sem quebrar os anis benznicos, mantendo assim o potencial energtico dos mesmos. Quando se utiliza o dibenzotiofeno como composto sulfurado modelo, os produtos finais da biodessulfurizao so 2-hidroxibifenila e sulfato. Nesse trabalho buscou-se analisar a capacidade da cepa nacional Rhodococcus erythropolis ATCC4277 de dessulfurizar o dibenzotiofeno em reator descontnuo utilizando concentraes de fase orgnica (n-dodecano) de 20 e 80% (v/v). O Rhodococcus erythropolis ATCC4277 foi capaz de degradar o DBT em 93,3 e 98,0% quando na presena de 20 e 80% (v/v) de combustvel sinttico, respectivamente. Alm disso, as maiores atividades especficas de dessulfurizao do dibenzotiofeno e de produo de 2-hidroxibifenila foram alcanadas no reator descontnuo contendo 80% (v/v) de combustvel sinttico. Portanto, concluiu-se que a melhor condio para realizar o processo de dessulfurizao do DBT em reator descontnuo pelo Rhodococcus erythropolis ATCC4277 utilizando 80% (v/v) de n-dodecano como fase orgnica.

Abstract
For decades the burning of fossil fuels released a lot of pollutants in the atmosphere. Among the most harmful is sulfur dioxide (SO2), which reacts with the moisture in the air and turns into sulfuric acid, being the main cause of acid rain. Acid rain is very harmful to animal and plant kingdoms; accelerates the corrosions processes of buildings and monuments, and causes serious health problems for humans. As a result, many countries have reformed their legislation to require the sale of fuels with very low sulfur content. The existing processes of desulfurization are not capable of removing sulfur so low. Therefore, there has developed a new process called biodesulfurization. In this process, the degradation of sulfur occurs through the action of microorganisms that act as catalysts. The bacterium Rhodococcus erythropolis has emerged as one of the most promising for biodesulfurization because it removes the sulfur without breaking the benzene rings, thereby maintaining the potential energy of the same. Using dibenzothiophene as a model of sulfur compounds, the products of the biodessulfurization process are 2- hydroxybiphenyl and sulfate. In this study we sought to examine the desulfurizing capacity of national Rhodococcus erythropolis strain ATCC4277 in a batch reactor using concentrations of organic phase (n-dodecane) of 20 and 80% (v/v). Rhodococcus erythropolis ATCC4277 was capable of degrading DBT in 93.3 and 98.0% in the presence of 20 and 80% (v/v) of synthetic fuel, respectively.

______________________________ 1 Mestre, Engenheira Qumica Universidade Federal de Santa Catarina 2 PHD, Engenheiro Qumico Universidade Federal de Santa Catarina 3 PHD, Engenheira Qumica Universidade Federal de Santa Catarina

Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012 Therefore, it was concluded that the best condition to carry out the desulfurization process in a batch reactor by the Rhodococcus erythropolis ATCC4277 is using 80% (v /v) of n-dodecane as the organic phase.

1. Introduo
O petrleo um combustvel fssil que possui uma composio complexa, que engloba quatro famlias de compostos, os hidrocarbonetos alifticos, cclicos, aromticos e molculas contendo tomos de nitrognio, enxofre ou oxignio na sua estrutura. Os compostos orgnicos contendo enxofre constituem uma pequena, mas importante frao do petrleo bruto. A presena de enxofre no desejvel aps o processo de refino do petrleo, pois em sua combusto ocorre a liberao de dixido de enxofre (SO2), que um dos principais poluentes atmosfricos e responsvel pela acidez nas chuvas. Quando presente em altas concentraes na atmosfera terrestre torna-se extremamente prejudicial ao homem e aos reinos animal e vegetal. Cientes de tal questo muitos pases, principalmente europeus, modificaram sua legislao a fim de exigir uma baixa concentrao de enxofre nos combustveis comercializados (Onaka et al., 2001). A estratgia mais adequada para atenuar a emisso de SO2 na atmosfera a remoo do enxofre dos combustveis fsseis antes de sua combusto. No entanto, os processos empregados pelas indstrias petroqumicas no so capazes de remover o enxofre a concentraes to baixas. Nesse sentido a biodessulfurizao (BDS) apontada como uma soluo verde e mais eficiente em relao ao processo de hidrodessulfurizao, onde a remoo do enxofre se d sob temperatura e presso muito elevadas. A BDS representa um enorme avano tecnolgico em relao aos processos j existentes, uma vez que o enxofre removido por micro-organismos sem que haja a necessidade de se adicionar produtos qumicos ou grandes dispndios de energia (Oldfield et al., 1998). Outra vantagem desse mtodo que os produtos obtidos pela ao dos microorganismos atravs da rota metablica conhecida como 4S se apresentam sob uma forma tratvel (sulfato) e no ocorre uma diminuio do potencial energtico do combustvel tratado. O dibenzotiofeno (DBT) vem sendo utilizado como composto modelo para representar os demais organossulfurados presentes nos combustveis fsseis e, ao final da dessulfurizao pela via metablica 4S, sintetizado no composto 2-hidroxibifenila (2-HBP). A obteno de biocatalisadores de elevada estabilidade em ambiente industrial e que produzam um alto rendimento na remoo do enxofre pode tornar o processo de BDS em uma ferramenta biolgica de fundamental importncia no tratamento em larga escala nas indstrias petroqumicas. Nesse sentido, a bactria Rhodococcus erythropolis vem despontando como uma das mais promissoras, pois se utiliza da via metablica 4S e resistente aos compostos sulfurados presentes nos combustveis (ALVES et al., 1999). Portanto, buscou-se analisar a capacidade da linhagem Rhodococcus erythropolis ATCC4277 de dessulfurizar o DBT em reator descontnuo utilizando concentraes de fase orgnica (n-dodecano) de 20 e 80% (v/v), bem como a atividade especfica de dessulfurizao.

2. Metodologia
2.1 Reagentes 2-Hidroxibifenila (2-HBP) 99% (Sigma-Aldrich), DBT 98% (Sigma-Aldrich), metanol UV/HPLC (JT Baker), n-dodecano 99% (VETEC). 2.2 Micro-organismos e Meio de Manuteno A bactria Rhodococcus erythropolis ATCC4277 foi adquirida da Fundao Tropical de Pesquisas e Tecnologia Andr Tosello, Campinas, So Paulo, Brasil. A mesma foi cultivada no meio Yeast Malt Extract (YM) que composto por 3,0 gL-1 de extrato de levedura, 3,0 gL-1 de extrato de malte, 5,0 gL-1 de bacto peptona, 10,0 gL-1 de glicose e 2,0 gL-1 de carbonato de clcio, por 48 h a 28 C. Posteriormente, o meio foi centrifugado a 5.000 x g durante 600 s. Recuperaram-se as clulas descartando o sobrenadante e lavando-as com uma soluo 0,1 M de fosfato buffer (pH 7,0). Essas clulas foram transferidas para placas de Petri contendo meio YM slido e mantidas sob refrigerao de 10 C. 2.3 Preparao do Biocatalisador Prepararam-se as clulas do Rhodococcus erythropolis ATCC4277 em frascos erlenmeyers de 0,5 L contendo 0,1 L de meio YM, 5% (v/v) de inculo e 0,5 mM de DBT. Esses frascos foram mantidos em uma incubadora com agitao orbital de 150 rpm a 28 C por 18 h. As clulas eram recuperadas por centrifugao a 5.000 x g durante 600 s, descartando-se o sobrenadante e lavando-as com 0,1 M de fosfato buffer (pH 7,0) (Davoodi-Dehaghani et al., 2010). 2.4 Dessulfurizao do DBT Utilizando Clulas Livres de Rhodococcus erythropolis ATCC4277 A fim de se investigar a capacidade de dessulfurizao da linhagem ATCC4277, empregou-se um combustvel sinttico composto por n-dodecano, como representante dos hidrocarbonetos presentes no petrleo (fase orgnica), e 2

Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012 DBT como composto sulfuroso modelo (Ohshiro et al., 1996). Para determinar a influncia da concentrao do combustvel sinttico no percentual de dessulfurizao do DBT, testaram-se as concentraes de fase orgnica de 20 e 80 % (v/v). Realizaram-se os ensaios de dessulfurizao em frascos erlenmeyers de 0,5 L contendo um volume total de meio reacional de 0,2 L onde as propores de fase orgnica e aquosa encontram-se descritas na Tabela 1. Possuam ainda uma concentrao celular inicial de 1,0 gL-1 e uma concentrao de DBT de 3,0 mM. Esses frascos permaneciam em incubadora com agitao orbital de 200 rpm a 28 C por 20 h. A seguir, separavam-se as duas fases por centrifugao a 7.000 x g durante 600 s. Alquotas eram retiradas em intervalos de 2 h durante a reao de dessulfurizao para mensurar o crescimento celular por turbidimetria a 600 nm e determinar as concentraes de DBT e 2-HBP por HPLC. A atividade especfica de dessulfurizao foi baseada na degradao de DBT por quilograma de clula seca por hora (mmol DBTkgCS-1h-1) e a atividade especfica de produo foi determinada pela produo de 2-HBP por quilograma de clula seca por hora (mmol 2-HBPkgCS-1h-1). Todos os experimentos foram repetidos, e cada valor apresentado nas figuras a mdia de trs replicatas. Tabela 1. Condies dos ensaios de dessulfurizao do DBT com clulas de Rhodococcus erythropolis ATCC4277. Concentrao da fase orgnica % (v/v) 20 80 Volume meio YM (mL) 160 40 Volume n-dodecano (mL) 40 160

2.5 Anlises As concentraes de DBT e 2-HBP foram determinadas no cromatgrafo de fase lquida de alta eficincia (HPLC) Ciola & Gregori, conectado a um detector UV/visvel modelo CG 437-B e coluna Nucleosil C18 fase reversa de 25 mm, dimetro interno de 4,6 mm. Empregou-se como fase mvel uma mistura 8:2 de metanol:gua a 1,0 mLmin-1, e a deteco se deu atravs do detector UV/visvel a um comprimento de onda de 254 nm.

3. Resultados e Discusses
3.1 Dessulfurizao em Sistema Bifsico Contendo 20% (v/v) de n-dodecano Na Figura 1 tem-se o cromatograma do combustvel sinttico ao final da reao de dessulfurizao, onde possvel observar que o Rhodococcus erythropolis ATCC4277 reduziu a concentrao inicial do DBT de 3,0 mM (ou 500 mgL-1) para 0,18 ( 0,3)mM (ou 34,91 mgL-1), sendo convertido em 2-HBP a uma proporo estequiomtrica de 1:1 (dados no apresentados). Essa proporo estequiomtrica de 1:1 significa que a linhagem ATCC4277 capaz de metabolizar grande parte do DBT disponvel pela via 4S no implicando assim na perda do potencial energtico do composto. 3.2 Dessulfurizao em Sistema Bifsico Contendo 80% (v/v) de n-dodecano No sistema bifsico contendo 80% (v/v) de combustvel sinttico a concentrao de DBT passou de 3,0 mM (ou 500 mgL-1) para 0,058 ( 0,002)mM (ou 10,71 mgL-1). Com isso, o percentual de dessulfurizao foi de 98%, conforme evidenciado na Figura 2, onde se tem o cromatograma no instante final da reao. Houve, portanto, um acrscimo de aproximadamente 5% no percentual de degradao do DBT quando se compara com os resultados obtidos com 20% (v/v) de fase orgnica. Pode-se constatar que o emprego de uma maior quantidade de fase orgnica torna a degradao do DBT superior (Maghsoudi et al., 2001).

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Figura 1. Cromatograma do combustvel sinttico aps biotransformao em sistema bifsico contendo 20% (v/v) de fase orgnica.

Figura 2. Cromatograma do combustvel sinttico aps biotransformao em sistema bifsico contendo 80% (v/v) de fase orgnica. 4

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3.3 Atividades Especficas de Dessulfurizao A grande diferena entre os processos de dessulfurizao utilizando 20 e 80% (v/v) de combustvel sinttico est nos valores das atividades especficas de degradao do DBT, segundo o que se pode observar na Figura 3. No sistema reacional utilizando 80% (v/v) de fase orgnica os valores das atividades especficas de dessulfurizao do DBT foram duas vezes maiores do que os alcanados pelo sistema reacional contendo 20% (v/v) de n-dodecano durante a fase log do crescimento microbiano, sendo que o maior valor foi de 44 mmolDBTkgDCW-1h-1. E as atividades especficas de produo da 2-HBP foram at cinco vezes maiores durante a fase log do crescimento microbiano. Esses valores so superiores aos descritos por outros autores e esto mais prximos de um valor que torne a aplicao desse processo vivel industrialmente.

Figura 3. Comparao entre as atividades especficas de degradao do DBT e produo da 2-HBP pelo Rhodococcus erythropolis ATCC4277 em reator descontnuo contendo 20 e 80 % (v/v) de n-dodecano.

4. Concluses
A bactria Rhodococcus erythropolis ATCC4277 mostrou-se capaz de dessulfurizar o DBT dissolvido em ndodecano pela via metablica 4S, uma vez que o produto obtido foi a 2-HBP. A concentrao de combustvel sinttico em reator descontnuo que apresentou os melhores resultados foi a de 80% (v/v). Onde o percentual de dessulfurizao do DBT foi 98% em relao concentrao inicial do mesmo e a maior velocidade especfica de dessulfurizao do DBT foi de 44 mmolDBTkgDCW-1h-1. Em um mbito industrial, os resultados supracitados so muito promissores quando se pensa em uma futura aplicao industrial desse mtodo, uma vez que no seriam necessrios grandes dispndios de recursos com um meio de crescimento para o micro-organismo e com a separao da mistura clulas/produto.

5. Agradecimentos
Ao Programa de Formao de Recursos Humanos da Agncia Nacional do Petrleo, Gs Natural e Biocombustveis - ANP, atravs do PRH-09/MECPETRO, por propiciar o desenvolvimento deste trabalho. Ao Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica da Universidade Federal de Santa Catarina PosENQ/UFSC. Ao LABMASSA Laboratrio de Transferncia de Massa, EQA UFSC, pela infraestrutura disponvel. 5

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6. Referncias
ALVES, L., MESQUITA, E., GRIO, F. M. Dessulfurizao bacteriana de combustveis fsseis. Biotec. Amb., n. 62, p. 3-8, 1999. DAVOODI-DEHAGHANI, F.; VOSOUGHI, M.; ZIAEE, A. A. Biodesulfurization of dibenzothiophene by a newly isolated Rhodococcus erythropolis strain. Bioresource Technol., v. 101, p.11021105, 2010. MAGHSOUDI, S.; VOSSOUGHI, S; KHEIROLOMOOM, A., TANAKA, E., KATOH, S. Biodesulfurization of hydrocarbons and diesel fuels by Rhodococcus sp. strain P32C1. Biochem. Eng. J., v.8, p. 151156, 2001. OHSHIRO, T.; HIRATA, T.; HASHIMOTO, I., IZUMI, Y. Characterization ofibenzothiophene desulfurization reaction by whole cells of Rhodococcus erythropolis H-2 in the presence of hydrocarbon. J. Ferment. Bioeng., v. 82, n. 6, p. 610-612, 1996. OLDFIELD, C.; WOOD, N. T.; GILBERT, S. C., MURRAY, F. D., FAURE, F. R. Desulphurization of benzothiophene and dibenzothiophene by actinomycete organisms belonging to the genes Rhodococcus, and related taxa. A. Van Leeuw. J. Microb. v. 74, p. 119-132, 1998. ONAKA, T., KONISHI, J., ISHII, Y., MARUHASHI, K. Desulfurization characteristics of termophilic Paenibacillus sp. strain A11-2 against asymmetrically alkylated dibenzothiophenes. J. Biosci. Bioeng., v. 92, no 2, p. 193 196, 2001.