NCLEO DE ESTUDOS E TREINAMENTO DA SBAC-PE

- NETSBAC-PE -

2005

BACTERIOLOGIA CLNICA
Jurandi David

MANUAL DE IDENTIFICAO DAS ENTEROBACTRIAS

TESTES BIOQUMICOS (SIMPLIFICADOS) E ASPECTOS MORFOCOLONIAL PARA IDENTIFICAO DAS Enterobacteriaceae: Escherichia coli Klebsiella Enterobacter Serratia Proteus Salmonella Shigella Providencia Citrobacter

Edwardsiella Hafnia Yersinia Famlia das ENTEROBACTERIACEAE A famlia das Enterobacteriaceae composta de numerosos gneros de bacilos Gram negativos, entretanto, cerca de 10 so responsveis pela maioria de infeces clnicas, incluindo-se: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Morganella, Citrobacter, Serratia, Salmonella, Shigella e Yersinia. Vrias espcies de Enterobacteriaceae colonizam o trato intestinal de humanos, porm, podem causar tanto infeces do trato intestinal como extraintestinal, especialmente em pacientes imunocomprometidos. As infeces extraintestinais mais comuns causadas pelas enterobactrias so: urinria, trato respiratrio, feridas e do sangue. Quatro gneros so conhecidos por causar infeces intestinais: Escherichia coli (enteropatogenicas), Salmonella, Shigellas e Yersinia. Um quinto gnero que tem sido implicado nas doenas diarricas, Plesiomonas, est em vias de ser includo na famlia das Enterobacteriacae. A famlia das enterobacteriaceae no formam esporos. Crescem bem sob condies aerbicas nos meios de rotina laboratorial, incluindo agar sangue. Geralmente, as enterobactrias crescem abudantemente depois de 18 a 24 h a 35O C. Alguns gneros apresentam caractersticas morfocolonial tpicas: Klebsiella pode se apresentar na forma de colnias mucides (Fig. 4); Proteus apresenta um vu espalhando-se por toda a placa; Yersinia, colnias pequenas e puntiformes, Serratia apresenta pigmentao vermelha quando incubada no meio de Mueller-Hinton a temperatura ambiente, devido a uma substncia conhecida como prodigiosina (Fig. 10). Enterobacter sakazakii apresenta pigmentao amarela. Os caracteres indicador, seletivo e diferencial dos meios de cultura utilizados no isolamento primrio das amostras para cultura, manifestam-se das seguintes formas: - Agar MacConkey: distingue os gneros fermentadores de lactose dos no fermentadores. Os que fermentam a lactose tomam a cor rosa ou avermelhada os que no fermentam apresentam-se incolor (Fig. 9). A cor rosa escuro que envolve as colnias de E.coli e outros gneros que fermentam a lactose, ocorre devido a precipitao dos sais de bile contido no meio (Fig. 9). O gar MacConkey no possui glicose em sua composio. - Agar Hektoen: ajuda a diferenciar patgenos entricos dos no patgenos. Devido constar em sua formulao salicina e citrato frrico amoniacal, a maioria dos gneros da flora normal do intestino fermenta a salicina produzindo uma cor salmom (Fig. 2), enquanto os entricos patognicos no fermenta a salicina e as colnias se apresentam na cor verde (Fig. 11). O citrato frrico amoniacal permite a deteco de H2S (gs sulfdrico) produzido pelas Salmonellas, manifestando-se 2

como pigmentao de cor escura (Fig. 12). O sorbitol adicionado ao gar MacConkey serve para identificar a E. coli O157:H7 em amostras de fezes sanguinolenta e auxilia o diagnstico da Sndrome uremica hemoltica (SUH). As colnias de E. coli O157:H7 apresentam-se incolores (sorbitol negativo) enquanto as outras espcies apresentam-se na cor rosa (sorbitol positivo) (Fig.8). A OXOID comercializa esse meio sob o cdigo CM 813 (Agar MacConkey sorbitol). As Enterobacteriaceae so muito ativas bioquimicamente. Fermentam a glicose e outros carboidratos, com ou sem, produo de gs, so oxidase negativa (se o gnero Plesionoma for includo ser uma exceo), catalase positiva e reduz nitrato a nitrito. Uma vasta bateria de testes bioqumicos pode ser utilizada para identificao das enterobactrias, porm na rotina laboratorial , sem prejuzo da segurana do diagnstico e por medida de economia, procuramos simplificar o nmero de testes desde que os mesmos nos conduza at a identificao do gnero bacteriano e muitas vezes identifica-se at a espcie (Ex: Shigellas). Testes propostos constitudos pelos seguintes meios de cultura: - Triagem - TSI (triple sugar iron) (ver fig. pg. 9) - onde se avalia a capacidade de a bactria fermentar ou no, glicose, lactose, sacarose; produzir ou no H 2S; produzir ou no gs (CO2 e H2) . Demais testes: - S I M - avalia a capacidade de a bactria produzir ou no, H2S; de produzir ou no indol e de ser ou no mvel. Uria - avalia a capacidade de a bactria hidrolizar ou no, a uria (ver fig. pg. 8). Citrato - avalia a capacidade de a bactria utilizar ou no o carbono (C) de uma fonte inorgnica que o citrato sdico (ver fig. pg. 8).

Outras provas adicionais podero ser utilizadas quando se encontrar dificuldades na identificao utilizando apenas os meios acima descritos. Sugerimos os seguintes meios: LDC (lisina descarboxilase), ODC (ornitina descarboxilase), Malonato, fenilalania desaminase. CONSIDERAES GERAIS SOBRE OS SEGUINTES GNEROS: Escherichia , Shigella e Salmonella a) Escherichia coli E. coli enquadra-se no grupo entrico Escherichia coli-Shigella. Atualmente, o gnero Escherichia composto por 5 espcies, porm a nica de interesse clnico a E.coli. A E.coli encontrada normalmente no trato gastrointestinal de humanos e animais.

A disseminao de E. coli feita de pessoa pessoa pela rota fecal-oral ou por contaminao de alimentos, gua, leite e alimentos mal cozidos. Podem causar infeco gastrointestinal e extra-intestinal, nesta ltima, compreendendo: trato urinrio; septicemia; pneumonia nosocomial; meningites em recm-nascidos e infeco de feridas. As espcies de E.coli que causam gastroenterites ou enterites, podem ser agrupadas em 5 (cinco) diferentes apresentaes clnicas: 1) entorotoxigenica diarria do viajante ; 2) enteropatognica clssica causa de diarria em crianas no mundo inteiro, provocando febre, vmitos e diarria aquosa; 3) enteroinvasora doena diarrica ; 4) enterohemorrgica O157:H7 colite hemorrgica e se associa sndrome uremica hemoltica (HUS) em crianas e adolescentes . Produza a toxina Shiga-like; 5) enteroagregativa a mais recente, se associa diarria crnica e persistente. E. coli diferencia-se das demais enterobactrias pela reao MUG positiva (metilumberifenil--D-glucoronide). Esse teste utilizado na deteco de E. coli em amostras de gua. A maioria das E. coli mvel, com exceo da espcie enteroinvasora, que imvel (mobilidade negativa). Algumas espcies de E. coli pode no fermentar a lactose, podendo ser confundida com o gnero Shigella . A Shiga-like toxina produzida pela E. coli O157:H7, s pode ser identificada em cultura de clulas ou tcnicas moleculares. b) Shigella O gnero Shigella composto de 4 espcies dos sub grupos A, B, C e D. -A -B -C -D - S. dysenteriae; - S. flexneri; - S. boydii; - S. sonnei.

As Shigellas so anaerognicas (no produzem gs), no fermentam a lactose, com exceo de S. sonnei que fermenta tardiamente. Sintomas clnicos mais comuns: autolimitada, inicialmente com febre, clicas abdominais, diarria aquosa. Poucos dias aps a instalao do quadro as fezes apresentam muco e sangue, sugerindo que a bactria penetra na mucosa intestinal . Grande nmero de leuccitos PMN pode ser observado no Gram das fezes. 4

S. dysenteriae, causa disenteria, sendo a mais severa forma de Shigelose devido a produo de toxina Shiga. A sndrome uremica hemoltica uma das mais srias complicaes da infeco. rara ser isolada no Brasil. Humanos so os reservatrios naturais das Shigellas que se disseminam pelo contato de pessoa-pessoa ou por via de alimentos e gua contaminados. Cerca de 10 (dez) bactrias podem causar uma infeco, comparando com 100.000 (cem mil) de Salmonella ou outro patgeno entrico, para causar uma infeco. Por tal razo, Shigelose a mais comum infeco entre o pessoal que trabalha em laboratrio . S. sonnei a espcie mais comum causadora de Shigelose em pases em desenvolvimento, seguida de S. flexneri. Isolados de S. dysenteriae difcil de ser encontrado, caso seja identificado, o fato dever ser levado ao conhecimento das autoridades sanitrias. c) Salmonellas O gnero Salmonella composto de duas espcies: S. entrica e S. bongori , existindo atualmente, mais de 2.400 membros antignicos distintos das duas espcies. S. entrica subespcie entrica (I) isolada de humanos e do sangue de animais de campo. A maior parte das infeces por Salmonellas so causadas por contaminao alimentar ou da gua. Outros reservatrios inclui contato com os animais colonizados pelo microrganismo e contato humano. As infeces so autolimitadas; causam diarrias que se alogam por uma semana. S. typhi causa sria sepse conhecida como febre tifide. Os sintomas inclui febre e dor de cabea, normalmente sem diarria. A infeco mais comum em pases em desenvolvimento. Infeces similares so comuns por Salmonellas sorotipos paratyphi A, B e C. Surtos de infeco causados por Salmonellas sorotipo Enteritidis tem aumentado nos EUA e geralmente est associado a contaminao alimentar, incluindo a ingesto de ovos crus ou mal cozidos. As Salmonellas sorotipo Typhimurium so mais resistentes a ao dos antimicrobianos. O meio de cultura Agar bismuto sulfito, o preferido para isolamento primrio da Salmonella typhi (Fig. 16). CONSIDERAE GERAIS SOBRE OS GNEROS: Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Pantoea e Raoultella a) Klebsiella Recentemente as espcies de Klebsiella: ornithinolitica, planticola e terrigenea , foram transferidas para um novo gnero criado: Raoultella. Ficou definido tambm, que as espcies ozanae e rhinoscleromatis so subespcie de Klebsiella pneumoniae. 5

Espcies de Klebsiella encapsuladas produzem colnias mucides devido a grande quantidade de polissacardeos presentes na cpsula. b) Enterobacter Existe atualmente 14 espcies do gnero Enterobacter, das quais, 10 tm sido encontradas em amostras clnicas. E. agglomerans foi transferido para o novo gnero Pantoea. As duas espcies de Enterobacter mais comuns nos isolados de amostras clnicas, tm sido : E. aerogenes e E. cloacae. c) Citrobacter Duas novas espcies foram includas recentemente no gnero: gilleni e murliniae. Ficou definido que a denominao do Citrobacter diversus passa a ser Citrobacter koseri. As espcies mais comuns isoladas na clnica so: freundii; braaki e youngae . Vrias espcies de Citrobacter produzem H2S, porm, outras no. d) Serratia Sete espcies de Serratia tm sido isoladas de amostras clnicas. As espcies marcescens, rubidae e plymutica produzem um pigmento vermelho devido a substncia denominada prodigiosina. Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter e Serratia, causam uma grande variedade de infeces, principalmente em pacientes hospitalizados. Tais bactrias so conhecidas por causar sepses, infeces respiratrias e raramente, meningites. Podem disseminar-se por transmisso de pessoa- pessoa, fluidos intravenosos e processos mdicos invasivos. Espcies multiresistentes aos antimicrobianos tm causado surtos hospitalares, geralmente localizando-se em pacientes de UTI. CONSIDERAES GERAIS SOBRE OS GNEROS: Yersinia, Proteae (tribo), Edwardsiella e Hafnia a) Yersinia Compreende trs espcies patgenas: pestis, enterocolitica e pseudotuberculosis. Existe mais 6 espcies que tm sido isoladas de amostras clnicas . Todas as espcies so mveis, exceto a Y. pestis. Vamos nos referir apenas espcie enterocolitica. Esta espcie encontrada no mundo inteiro e as infeces devido a mesma, so adquiridas pela ingesto de alimentos e gua contaminados. Y. enterocolitica pode causar enterocolite em humanos e mimetizar apendicite aguda pelo quadro que apresenta de linfodenite mesentrica e dores abdominais. 6

O meio de cultura gar CIN (Cefsulodina-irgasan-novobiocina) o mais especfico e indicado para o isolamento da Yersinia enterocolitica. . As colnias de Aeromonas spp no meio CIN apresentam similar aparncia Yersinia, sendo diferenciado pelo teste da oxidase (Aeromona +). As espcies de Yersinia: frederiksneii, intermdia, mollarettii, bercorvier, rohdei e Kristensenii, tm sido isoladas de amostras clnicas, porm suas patogenicidades no foram estabelecidas. Se forem isoladas em amostras fecais devem ser reportadas como no patognicas. b) Tribo Proteae, Proteus, Providencia e Morganella So normalmente encontrados no trato gastrointestinal de humanos e podem causar infeces do trato urinrio, podendo tambm ser encontrados em outros tipos de amostras. Atualmente existe 4 espcies de Proteus: mirabilis, vulgaris, penneri e myxofaciens. 5 espcies de Providencia: rettgeri, stuartii, alcalifaciens, rustigianii e heimbachae. 1 espcie de Morganella: morganii. O Proteus mirabilis o mais freqente isolado dessa tribo. Causa infeco no trato urinrio, infecta feridas e provoca septecemias. Est sempre associado s infeces hospitalares. Todos os gneros da tribo Proteae so fenilalanina desaminase positivo. Os gneros Proteus, Morganella e Providencia rettgeri so urease positivo. Morganella morganii e Providencia sppso virtualmente resistentes a ampicilina e cefalosporinas de 1 e 2 geraes por produo de beta-lactamase cromossmica AmpC. O teste do citrato til para distinguir o gnero Morganella (-) do gnero Providencia (+). CONSIDERAES GERAIS SOBRE OS GNEROS: Edwardsiella e Hafnia a) Edwardsiella (ver fig. pg. 13) Existe 3 espcies, porm a Edwardsiella tarda a que mais se associa doenas humanas. causadora de um quadro de enterocolite similar a Salmonella, especialmente em crianas e adolescentes. Edwardsiella lembra muito a Salmonella nos seus aspectos morfocolonial e bioqumico, sendo diferenciado com os testes de indol (+) e citrato (-) b) Hafnia Possui apenas uma espcie: alvei. encontrada no trato intestinal de humanos, sendo responsvel por uma variedade de infeces oportunistas. Anteriormente, era classificada no gnero Enterobacter, porm Hafnia lactose negativa (ver fig. pg 12) e Enterobacter lactose positiva. So muito similares em suas reaes bioqumicas, exceto no teste do citrato: Hafnia citrato negativo . 7

Interpretao dos testes

1 Aspectos morfocoloniais nos meios seletivos e indicadores gar MacConkey (MC) e gar Hektoen (HE) MC

Colnias lactose negativa (incolores)

Colnias lactose positiva (rsea)

HE

Colnias amarelas, fermentadoras de lactose e salicina, normalmente no patognicas entricas

Colnias verdes, no fermentadoras de lactose, caracterstica do gnero Shigella (Plesiomonas shigelloides apresenta as mesmas caractersticas sendo diferenciada de Shigella pelo teste de oxidase positivo)

Colnias verdes com pigmentao escura, caractersticas dos gneros: Salmonella, Proteus, Edwardsiella e Citrobacter

2 Testes bioqumicos Meio de SIM

3 gotas do reagente de Kovac

Teste da urease

Teste de mobilidade
O indicador de mobilidade utilizado foi o cloreto de trifeniltetrazolio (TTC)

+
Teste do citrato

Triagem no TSI: cido/cido com gs

Fig. 1

Fig. 2

Fig. 3

Fig. 4

Fig. 5

E. coli

Klebsiella Enterobacter

Yersinia

Gnero Citrobacter koseri* E. coli Enterobacter spp Klebsiella spp** Yersinia enteroltica

Indol V + -

Mobilidade + +*** + -

Uria + + +

Citrato + + + -

Sorologia especfica X X X X +

V varivel. * C. freundii indol positivo. ** K. ozaenae uria negativa. *** E. coli enteroinvasora imvel (mobilidade -). MacConkey figuras 1, 4 e 5. 10

Hektoen figuras 2 e 3.

Triagem no TSI: cido/cido com gs e H2S

MacConkey
Citrobacter Serratia

Hektoen
Citrobacter (colnias escuras)

Fig. 6

Fig. 7

P. vulgaris

Citrobacter

Gnero Proteus vulgaris Citrobacter spp * C. koseri indol +.

Indol + V*

Mobilidade + +

Uria + +

Citrato +

11

Triagem no TSI: Alcalino/cido

MacConkey - sorbitol
E. coli sorbitol negativo O157:H7 E. coli sorbitol positivo Shigella

MacConkey
E. coli

Fig. 8

Fig. 9

Hektoen
Shigella

Fig.10

Fig. 11

Shigella

Gnero E. coli K. rhinoscleromatis Morganella Proteus peneri Providencia spp Serratia spp Shigella Yersinia spp

Indol + + + -

Mobilidade +* + + + + -

Uria + + -** +

Citrato + + -

Pigment. vermelha +*** -

Sorologia especfica X X X X X X + +

* E. coli entoroinvasora imvel (mobilidade -). ** P. rettgeri uria +. *** No meio de Mueller-Hinton, temp. ambiente.

12

Triagem no TSI: Alcalino/cido com gs

Hektoen

Fig. 12

Salmonella spp

MacConkey
Hafnia

Fig.13

Hafnia

Gnero E. coli Citrobacter spp Enterobacter spp Hafnia Klebsiella spp Proteus myxofaciens Providencia alcalifaciens Salmonella entrica-para typhi Serratia spp

Indol + + -

Mobilidade + + + + + + + +

Uria + + -

Citrato + + + + + +

Sorologia especfica * X X X X X X + X

* Sorologia para os grupos: clssica e enteroinvasora.

13

Triagem no TSI: Alcalino/cido H2S

Hektoen

Colnias escuras (H2S +) so sugestivas dos gneros deste grupo

Fig. 14

Proteus mirabilis

Hektoen

Fig. 15

Edwardsiella

Gnero Citrobacter spp Edwardsiella tarda Proteus mirabilis Salmonella spp

Indol + -

Mobilidade + + + +

Uria + -

Citrato + +*

Sorologia especfica X X X +**

* S. typhi citrato -. ** Sorologia com soro polivalente para Salmonella.

14

Triagem no TSI: Alcalino/cido H2S fraco

gar bismuto sulfito
Colnias de Salmonella typhi

Fig. 16

H2S +

Salmonella entrica sorovar typhi

Gnero Salmonella entrica sorovar typhi

Indol -

Mobilidade +

Uria -

Citrato -

Sorologia especfica +*

* Sorologia com soro polivalente para Salmonella.

15

Bactrias consideradas agentes de infeco do canal alimentar

EXOGENO
Organismo Compylobacter Spp. Salmonella enteritidis Salmonella typhimurium Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei Doena Gastroenterite Gastroenterite Gastroenterite Desinteria bacilar Gastroenterite Gastroenterite Gastroenterite Colite hemorrgica, sndrome urmica hemoltica e falncia renal crnica e aguda Febre entrica tifide Febre entrica Clera Vomito (com diarria) Vomito (com diarria) lceras pptica/gstrica Malignidades Diarria associada ao uso de Mecanismo da doena In/Inf/P In/Inf In/Inf In/Inf In/Inf

ENDOGENO
Organismo BOCA Streptococcus sanguis Streptococcus mutans Prevotella spp Porphyromonas spp Fusobacterium spp INTESTINO Diverticulites, abcesso no apndice, sepses hepatobiliar e peritonites Idem Idem Idem Idem Idem Idem Crie dental e abscesso dental Crie dental e abscesso dental Gengivites, periodontites Gengivites, periodontites Gengivites, periodontites Doena

In/Inf In/Inf

Escherichia coli O157 Salmonella typhi Salmonella paratyphi Vibro cholerae Staphylococcu s aureus Bacillus cereus Helicobacter pylori Clostridium difficile

Streptococcus spp

P P T T T T/Inf T

Enterococcus spp Coliformes (Escherichia coli) Klebsiella spp Bacteroides spp Peptostreptococcu s Peptococcus spp Clostridium spp
LEGENDA: In invasiva; Inf inflamatria;

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antibitico

P penetrao; T toxina.

Bibliografia
MAZA, L. M. etal Color Atlas of Medical Bacteriology, 2004 ASM Press. Washington, D.C. STRUTHERES, J. Y. e WESTRAN, R. P. Clinical Bacteriology, 2003 ASM Press. Washington, D.C.

Contato
Jurandi David da Silva Prof. de Bacteriologia Clnica do NETSBAC-PE e-mail: davibac@ig.com.br jurandidavid@bol.com.br davibac@uol.com.br (81) 3469-1901 (81) 3421-7368 (81) 9172-2946

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