Barros C et al

Rev. bras. hematol. hemoter. 2006;28(4):269-274

Artigo / Article

Avaliao de reagentes anti-D na deteco dos antgenos D fraco e D parcial

Evaluation of anti-D reagents in the detection of weak D and partial D antigens

Clayton Barros1 Mrcia Otta2 Valeria L. Wakim2 Mrcia Zaqueroni2 Wilson Baleotti Jnior3 Lilian Castilho1

Anti-soros monoclonais anti-D IgG e IgM tm sido produzidos para substituir os policlonais na determinao do antgeno D. No entanto, pouco se conhece a respeito da utilizao destes reagentes na deteco dos antgenos RhD fraco e RhD parcial. Estudos moleculares e sorolgicos que possam esclarecer a expresso do antgeno D so importantes para a seleo adequada dos reagentes anti-D utilizados na fenotipagem RhD. Foram analisados anti-soros anti-D monoclonais IgG e IgM quanto capacidade de deteco dos antgenos D fraco de alta e baixa densidade antignica e dos antgenos D parciais que reagem como D fraco em 56 amostras de sangue caracterizadas como D fraco. O anti-D IgM foi analisado pela reatividade de aglutinao temperatura ambiente enquanto o anti-D IgG foi analisado pela reatividade pelo teste da antiglobulina humana. Os tipos de D fraco foram caracterizados molecularmente, e a densidade antignica dos antgenos RhD identificados foi determinada por citometria de fluxo. Todas as amostras que continham os tipos de D fracos mais freqentes (DF1, DF3 e DF4) foram detectadas temperatura ambiente (TA) com anti-D IgM enquanto as amostras DF2 e D parcial foram detectadas com anti-D IgG reativo pelo teste da antiglobulina humana (AGH). Nossos resultados demonstram que o anti-D IgM no detecta antgenos D parciais reativos como D fraco e antgenos D fraco de baixa densidade antignica e, portanto, pode ser utilizado na rotina de pacientes. O anti-D IgG detecta a maioria dos tipos de D fraco e associaes D fraco parcial e deve ser utilizado na rotina de doadores. Rev. bras. hematol. hemoter. 2006;28(4):269-274. Palavras-chave: Reagentes anti-D; D fraco; D parcial; sistema Rh, RhD, RHD.

Introduo O antgeno RhD o mais importante do sistema Rh devido ao seu envolvimento na doena hemoltica perinatal e nas reaes transfusionais hemolticas. O antgeno RhD considerado como um mosaico composto de 37 eptopos, onde pelo menos nove eptopos (epD1-epD9) j foram definidos por diferentes anticorpos monoclonais.1 Alguns indivduos RhD-positivo podem desenvolver aloanticorpos antiD dirigidos contra um ou mais dos eptopos ausentes, definindo-se, assim, as categorias do antgeno RhD parcial (DII,

DIII, DIV, DV, DVI, DVII, DFR, DBT, RoHar) que so diferenciadas umas das outras de acordo com a presena ou ausncia de um ou mais eptopos.2 A anlise molecular das variantes do antgeno RhD mostrou que a perda da expresso de certos eptopos RhD est associada a mutaes de ponto no gene RHD ou a rearranjos gnicos entre os genes RHD e RHCE. As variantes DII, DIIIa, DIVa, DVII, DMH, DNU, DHR, DHMi, DFW, R0Har, DAR e DAU ocorrem pela presena de mutaes de ponto no gene RHD enquanto as variantes DIIIb, DIIIc, DIVb, DVa, DVI, DFR, DBT e DCS ocorrem pela formao de genes hbridos,

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Hemocentro Unicamp Campinas-SP, Brasil. Asem-NPBI So Paulo-SP, Brasil. 3 Hemocentro Faculdade de Medicina Marlia-SP, Brasil. Correspondence: Lilian Castilho Hemocentro, Unicamp Rua Carlos Chagas, 480 Caixa Postal 6198 13081-970 Baro Geraldo Campinas-SP, Brasil Tel.: (55 19) 3788-8749 Fax: (55 19) 3788-8600 E-mail: castilho@unicamp.br

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em que um fragmento do gene RHD substitudo por um fragmento genmico do gene RHCE. Estes genes codificam protenas hbridas RhD-CE-D de 417 aminocidos que conservam alguns eptopos RhD, mas que podem, ocasionalmente, expressar novos eptopos detectveis sorologicamente. Estas alteraes ocorrem nos segmentos extracelulares da protena RhD, as alas onde esto localizados os eptopos Rh, mudando a sua conformao e a exposio dos eptopos de RhD. Este fato explica por que os indivduos com o fentipo RhD parcial perdem a expresso de alguns eptopos do antgeno RhD e podem desenvolver aloanticorpo anti-D, ao entrar em contacto com hemcias RhD-positivo normais.3-8 Uma outra variante do antgeno RhD, o antgeno RhD fraco, apresenta fraca expresso do antgeno RhD e, dependendo do anti-soro anti-D utilizado, reage apenas pelo teste da antiglobulina humana. O antgeno RhD fraco surgiu como uma conseqncia de mutaes de ponto missenses em diferentes xons do gene RHD.9 Atualmente, mais de 30 tipos j foram descritos (Site RHESUS: www.uni-ulm.de/~wflegel/ RH/). As substituies dos aminocidos dos diferentes tipos de RhD fraco esto localizadas nos segmentos transmembranares e intracelulares da protena RhD. Este fato explica a fraca expresso do antgeno RhD na membrana da hemcia, bem como a ausncia de aloanticorpo anti-D na maioria dos indivduos RhD fracos.9,10 O mecanismo relacionado com a expresso reduzida do antgeno RhD fraco no est totalmente esclarecido, e sua expresso difere dependendo do tipo presente na membrana da hemcia. Mutaes missenses que ocorrem no gene RHD fraco parecem envolver regies importantes relacionadas com a integrao da protena Rh com a membrana das hemcias ou com a glicoprotena RhAG.11 A genotipagem RHD tem sido cada vez mais utilizada para diferenciar os antgenos RhD normal, RhD fraco e RhD parcial devido s limitaes dos reagentes utilizados nos testes de hemaglutinao.12,13 As tcnicas moleculares permitem distinguir as hemcias que perdem ou apresentam eptopos alterados (RhD parcial) daquelas que possuem nveis reduzidos do antgeno RhD (RhD fraco). Esta diferenciao importante para prevenir a aloimunizao em pacientes e gestantes, uma vez que indivduos com o fentipo RhD parcial apresentam risco de aloimunizao, enquanto que a maioria dos indivduos RhD fraco no produzem anti-D. No entanto, so poucos os laboratrios que dispem desta metodologia e, portanto a classificao sorolgica ainda extremamente importante. O reconhecimento de amostras com fraca expresso do antgeno RhD depende do mtodo e da qualidade do reagente anti-D empregado. A utilizao de anti-D monoclonais de baixa afinidade e a dificuldade na obteno de anti-D policlonais de boa qualidade tm causado discrepncias entre os resultados da fenotipagem RhD e algumas vezes deixado de detectar antgenos RhD fraco com baixa densidade antignica. 270

A no deteco destes antgenos em doadores de sangue pode causar aloimunizao anti-D nos pacientes RhD-negativo transfundidos com estas hemcias.14,15 Por outro lado, muitos indivduos classificados sorologicamente como RhD fraco so na verdade RhD parcial.16,17 Como a diferenciao entre os antgenos RhD fraco e RhD parcial difcil de ser caracterizada na rotina sorolgica, muitos pacientes tm produzido anti-D pelo fato de terem sido considerados RhDpositivo. Anti-soros monoclonais anti-D IgG e IgM tm sido produzidos para substituir os policlonais na determinao do antgeno D. No entanto, pouco se conhece a respeito da utilizao destes reagentes na deteco dos antgenos RhD fraco e RhD parcial uma vez que no existe um limite bem definido entre os antgenos RhD fraco e RhD parcial que perdem eptopos especficos e podem estar associados aloimunizao anti-D. Devido sua importncia clnica e considerando que o antgeno RhD o mais imunognico do sistema Rh e que apresenta diversas variantes, estudos moleculares e sorolgicos que possam esclarecer sua expresso so importantes para a seleo adequada dos reagentes anti-D utilizados na fenotipagem RhD. Mtodos Reagentes e amostras Foram analisados anti-soros anti-D monoclonais IgG (clone MS26) e IgM (clone MS201) (Smart Kit, Asem-NPBI, So Paulo, Brasil) quanto capacidade de deteco dos antgenos D fraco de alta e baixa densidade antignica e dos antgenos D parciais que reagem como D fraco em 56 amostras de sangue caracterizadas como D fraco. Fenotipagem RhD A fenotipagem RhD foi determinada pelo teste de hemaglutinao clssico em tubo utilizando-se 50 l do antisoro anti-D e 50 l de suspenso de hemcias a 3% em salina. O anti-D IgM foi analisado pela reatividade de aglutinao temperatura ambiente enquanto o anti-D IgG foi analisado pela reatividade pelo teste da antiglobulina humana. Extrao de DNA O DNA foi extrado de leuccitos de sangue perifrico utilizando-se os mtodos Easy DNA Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) e o Genome Star System (Biosystems) de acordo com os protocolos recomendados pelos fabricantes. Genotipagem RHD Devido alta homologia existente entre os genes RHD e RHCE, a estratgia utilizada na genotipagem RHD levou em considerao as diferenas existentes entre eles em duas regies genmicas: intron 4 e xon 10. No intron 4, o gene RHCE possui 600 pb a mais que o gene RHD, enquanto na

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regio 3' no traduzida do exon 10, o gene RHD possui 47 pb a mais que o gene RHCE. Assim, foram utilizados primers 18 que permitem determinar a presena do gene RHD, pela anlise direta do produto de PCR, aps eletroforese em gel de agarose a 1,5% (Figura 1). As seqncias dos primers utilizados encontram-se descritas na Tabela 1.
Tabela 1 Seqncia dos primers utilizados na genotipagem RHD Primers RHI41 RHI42 RHI43 EX10F RHD3'-UTR RHCE3'-UTR Seqncias 5' -GTG TCT GAA GCC CTT CCA TC -3' 5'-GAA ATC TGC ATA CCC CAG GC -3' 5'ATT AGC TGG GCA TGG TGG TG 3' 5'-TTT CCT CAT TTG GCT GTT GGA TTT TAA -3' 5'-GTA TTC TAC AGT GCA TAA TAA ATG GTG -3' 5'-CTG TCT CTG ACC TTG TTT CAT TAT AC -3'

Figura 2. Genotipagem RHD fraco. Linha 1: Marcador molecular de 100 pb. Linha 2: D fraco tipo 1. Linha 3: D fraco tipo 2. Linha 4: D fraco tipo 3. Linha 5: D fraco tipo 4. Linha 6: Controle interno:HGH

Caracterizao molecular dos antgenos RhD fraco e RhD parcial com fraca expresso A caracterizao molecular dos antgenos RhD fraco D parcial HMi e D parcial categoria VI foi realizada por tcnicas de PCR alelo-especfico10 e PCR-multiplex,19 que permitem determinar os tipos mais freqentes de D fraco e a presena dos genes DHMi e DVI, pela anlise direta do produto de PCR, aps eletroforese em gel de agarose a 1,5% e gel de poliacrilamida a 8% respectivamente (Figuras 2 e 3). As seqncias dos primers utilizados encontram-se nas Tabelas 2 e 3. A caracterizao molecular do antgeno RhD parcial DAR foi realizada utilizando-se uma tcnica de PCR-RFLP previamente descrita.13 As seqncias dos primers utilizados encontram-se na Tabela 3. Os produtos de PCR amplificados foram digeridos overnight com a enzima de restrio Hph I e os fragmentos analisados aps eletroforese em gel de poliacrilamida a 8% (Figura 4).

Figura 3. (A): Genotipagem RHD parcial (genes hbridos). Linha 1: Marcador molecular de 100 pb. Linhas 2 e 3: Amostras RHD+ normal. Linha 4: Amostra RHD parcial categoria VI. (B). Genotipagem RHD parcial DHMi. Linha 1: Marcador molecular de 100 pb. Linha 2: Amostra RHD parcial HMi. Linha 3: Controle interno (HGH)

Figura 1. Genotipagem RHD em duas regies genmicas: intron 4 (Linhas 1 a 3) e exon 10 (linhas 6-8). Linhas 1 e 3: Amostras RHD+, Linha 2: Amostra RHD-. Linha 5: Marcador molecular de 100pb. Linhas 6-8: Amostras RHD +, Linha 7: Amostra RHD-.

Figura 4: Genotipagem RHD parcial DAR. Linhas 1 e 9: marcador molecular de 100 pb. Linhas 2, 4 e 7: Amostras D parcial DAR. Amostras 3, 5, 6 e 8. Amostras RHD fraco tipo 4.

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Tabela 2 Primers utilizados na tcnica de PCR alelo-especfico para RhD fraco e RhD parcial HMi Primers RHDF1 sense RHDF1 antisense RHDF2 sense RHDF2 antisense RHDF3 sense RHDF3 antisense RHDF4 sense RHDF4 antisense RHDF5 sense RHDF5 antisense HMi sense HMi antisense HGH sense HGH antisense Seqncias 5'aca cgc tat ttc ttt gca gAC TTA TGG 3' 5'GGT ACT TGG CTC CCC CGAC 3' 5'ctc caa atc ttt taa cat taa att atg cat tta aac agC 3' 5'gtg aaa aat ctt acC TTCCAGAAAACTTGGTCATC 3' 5'aca gag acg gac aca ggA TGA GATG 3' 5'CTT GAT AGG ATG CCA CGA GCCC 3' 5'AGA CTA CCA CAT GAA CAT GAT GCA CA 3' 5' CAG ACA AAC TGG GTA TCG TTG CTC 3' 5' GGT GCT GGT GGA GGT GAC GGA 3' 5' gag ctt ttg gcc ctt ttc tccc 3' 5'AGG AGG CGT GGC TGT GGC TAT 3' 5'GGT ACT TGG CTC CCC CGAC 3' 5'TGC CTT CCC AAC CAT TCC CTTA 3' 5'CCA CTC ACG GAT TTC TGT TGT GTTTC 3' 434pb Exon6/108pb Exon3/112pb Exon4/138pb Exon1/166pb Exon9/126pb Exon/pb Exon6/153pb

BS227, BS231, MS26, HM16 and LOR17-8D3 (Third International Workshop on Monoclonal Antibodies against Red Cell and related Antigens, 1996, Nantes, France).20-22 O anticorpo secundrio utilizado foi um anticorpo IgG antihumano produzido em cabra, fragmento Fab, conjugado com fluorescena (FITC). A fluorescncia obtida nas amostras RhD fraco foi comparada com a de hemcias controles com o fentipo RhD-positivo R1r (DCcee). O background da fluorescncia foi determinado com hemcias RhD-negativo. Resultados Resultados da genotipagem RHD, RHD fraco e RHD parcial Das 56 amostras estudadas, 40 (71%) foram confirmadas molecularmente como D fraco, 11 (20%) como RhD parcial e 5 (9%) apresentaram associaes de RhD parcial e RhD fraco. Os tipos de D fraco e D parcial identificados encontram-se na Tabela 5. Resultados da fenotipagem RhD com antiD monoclonal IgG e anti-D monoclonal IgM (SMART Kit) nas amostras D fraco e D parcial caracterizadas molecularmente Todas as amostras que continham os tipos de D fracos mais freqentes (DF1, DF3 e DF4) foram detectadas temperatura ambiente (TA) com anti-D IgM. As amostras D fraco tipo 2 e as que apresentaram antgenos D parciais (DAR, D categoria VI e DHMi) foram detectadas com anti-D IgG reativo pelo teste da AGH (Tabela 6).

Tabela 3 Primers utilizados na tcnica de PCR para a determinao do antgeno D parcial categoria VI Primers MR364 MR474M MR496 MR621 MR648 Mrex5 MR898 Mrex6 MR973 MR1068 Mre9SD2 Seqncias 5 -TCG GTG CTG ATC TCA GTG GA-3 5 -ACT GAT GAC CAT CCT CAT GT-3 5 -CAC ATG AAC ATG ATG CAC A-3 5 -CAA ACT GGG TAT CGT TGC TG-3 5 -G TGG ATG TTC TGG CCA AGT T-3 5 -cac CTT GCT GAT CTT ACC-3 5 -GTG GCT GGG CTG ATC TAC G-3 5 -tgtctagtttcttac CGG CAA GA-3 5 -AGC TCC ATC ATG GGC TAC AA-3 5 -ATT GCC GGC TCC GAC GGT ATC-3 5 -aacagGT TTG CTC CTA AAT ATT-3 Exon9/71 Exon7/96 Exon5/57 Exon5/157 Exon4/126 Exon/pb Exon3/111

Densidades antignicas obtidas atravs da citometria de fluxo nas amostras D fraco e D MR1219 5 -A AAC TTG GTC ATC AAA ATA TTT AAC CT-3 parcial caracterizadas molecularmente Com a finalidade de determinarmos a densidade antignica dos antgenos RhD nos difeTabela 4 Primers utilizados na tcnica de PCR para a determinao do rentes tipos de antgeno RhD fraco encontraantgeno D parcial DAR dos, realizamos citometria de fluxo em pelo meSeqncias Tamanho Primers nos duas amostras de cada tipo de RhD fraco. Em nossa anlise, observamos que as densidaEx7F 5 TCA TAC TGT GGT CCG TAA AC-3 262pb des antignicas obtidas entre amostras de um EX7R 5CAA TCA TGA CCA TTG CC 3 mesmo tipo de D fraco so similares, enquanto entre amostras de diferentes tipos ocorre uma grande variao. O antgeno RhD fraco tipo 2 apresentou menor densidade antignica, seguido pelos tipos 1, 3 e 4. Citometria de Fluxo Entre os antgenos D parciais observamos que o antgeno D A densidade antignica dos antgenos RhD fraco e RhD parcial DAR apresentou menor densidade antignica, seguiparcial identificados foi determinada por citometria de fluxo do pelos antgenos DVI e DHMi. Os resultados obtidos atravs do citmetro FAScalibur (Becton Dickinson, San Jose, encontram-se na Tabela 6. Todas as amostras D fraco com CA), utilizando-se 6 anticorpos anti-D monoclonais BS221, 272

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No possvel diferenciar os tipos do antgeno RhD fraco por mtodos sorolgicos e como nem sempre os laboratrios de Imunohematologia podem disN por de recursos moleculares, associamos cada tipo de D fraco D parcial D fraco/ D parcial Amostras RhD fraco caracterizado com o grau de aglutinao DF1 DF2 DF3 DF4 DHMi DVI DAR DF1/HMi DF4/DAR obtido na fenotipagem. Embora a reao de agluti56 15 5 7 13 2 4 5 2 3 nao dependa diretamente do reagente anti-D utilizado, acreditamos que estes resultados podem ser de Tabela 6 grande auxilio sorolgico na identificao do antgeno Tipos de D fraco e D parcial, graus de aglutinao e densidades antignicas RhD fraco e, conseqentemente, no direcionamento N Tipos de D fraco e Graus de Densidades da melhor conduta transfusional para pacientes RhD Amostras D parcial aglutinao antignicas fraco. Anti-D Anti-D Todos os tipos do antgeno RhD fraco encontraIgM IgG/AGH dos em nosso estudo foram associados aos graus de 15 DF1 3+ 4+ 1273 aglutinao obtidos temperatura ambiente com o anti5 DF2 0 2+ 462 D IgM e, pelo teste da antiglobulina humana, com o 7 DF3 3+ 4+ 1936 anti-D IgG (Smart Kit, Asem-NPBI, So Paulo, Brasil). 13 DF4 4+ 4+ 2184 Nossos resultados demonstraram que os tipos de RhD fraco 1, 2, 3 e 4 que foram detectados com o 5 DAR 0 (+) 988 anti-D IgM TA podem ser considerados como RhD 2 DHMi 0 1+ 1112 positivo, pois no foram associados ao antgeno RhD 4 DVI 0 1+ 1050 parcial. Assim, pacientes que apresentam o fentipo 2 DF1/DHMi (+) 3+ 1577 RhD fraco com esta reatividade podem ser trans3 DF4/DAR 0 2+ 1432 fundidos com sangue RhD positivo. Apesar deste trabalho ter sido o nico que relacionou os tipos de RhD fraco com o grau de aglutinao, a literatura relata9 que baixa densidade antignica e as amostras D parcial foram ainda no foi demonstrada aloimunizao anti-D em pacientes detectadas sorologicamente apenas pelo reagente anti-D portadores dos antgenos RhD fraco tipos 1, 2 e 3. monoclonal IgG atravs do teste da AGH com intensidades Os antgenos RhD fraco que apresentaram grau de de aglutinao de 1+ ou fraca (+). aglutinao inferior a 1+ pelo teste da AGH com anti-D IgG estavam, na sua maioria, associados ao antgeno RhD parciDiscusso al. Assim, nossa recomendao que pacientes que apresentam o fentipo RhD fraco com esta caracterstica devem A grande importncia em se caracterizar ser considerados RhD-negativo. Por outro lado, doadores molecularmente o antgeno RhD fraco deve-se ao fato de fenotipados como RhD fraco, independentemente do grau no ser possvel distinguir sorologicamente o antgeno RhD de aglutinao, devem ser considerados RhD-positivo pois fraco de alguns antgenos RhD parciais e no se conseguir j foi demonstrado previamente que, mesmo com baixa dendeterminar o tipo de antgeno RhD fraco presente na amossidade antignica, o antgeno RhD fraco pode ser imunotra. De acordo com a literatura, a maioria dos indivduos gnico.14,15 que apresentam o fentipo RhD fraco no desenvolve Nossos resultados demonstram que o anti-D IgM no anticorpos anti-D e pode ser transfundida com sangue RhDdetecta antgenos D parciais reativos como D fraco e antpositivo. No entanto, alguns pacientes com RhD fraco tigenos D fraco de baixa densidade antignica e, portanto pode pos 4.2, 7 e 15 podem se aloimunizar se receber sangue ser utilizado na rotina de pacientes. O anti-D IgG detecta a RhD-positivo.11 maioria dos tipos de D fraco e associaes D fraco parcial e, Considerando que os trs tipos do antgeno RhD fraco deve ser utilizado na rotina de doadores. mais freqentes em nosso estudo so os tipos 1, 3 e 4, que Acreditamos que estas recomendaes possam conno tm sido associados ao risco de aloimunizao,10,12 acretribuir na seleo adequada do reagente anti-D utilizado na ditamos que a transfuso com sangue RhD-positivo em pacirotina de fenotipagem do antgeno RhD para evitar entes com o fentipo RhD fraco ainda pode ser considerada aloimunizao. segura. No entanto, no est esclarecido se pacientes que apresentam antgenos RhD fraco com baixa densidade Abstract antignica quando expostos a hemcias RhD normal podem se aloimunizar. Alm disto, importante descartar a presena Monoclonal antibodies (MoAb) anti-D IgG and IgM are being do antgeno RhD parcial. developed in order to replace polyclonal antibodies. However, there
Tabela 5 Caracterizao molecular dos tipos de D fraco e D parcial nas amostras estudadas

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are few studies about the selection of these MoAb to routinely detect weak D and partial D antigens. A total of 56 weak D blood samples were analyzed with anti-D IgG and IgM MoAb in order to evaluate their reactivity. Molecular analyses were also performed to characterize the weak D types and the presence of partial D. Antigen densities were determined by flow cytometry. Weak D type 1, 3 and 4 samples with high antigen density were reactive with the MoAb anti-D IgM at room temperature while weak D type 2 and the partial D samples with low antigen density were detected with MoAb anti-D IgG using the indirect antiglobulin test. Our results show that antiD IgM does not detect partial D samples reactive as weak D and thus can be used for routine testing of patients. As the anti-D IgG detected all the weak D and partial D with low antigen density, it should be used in the routine testing of donors. Rev. bras. hematol. hemoter. 2006; 28(4):269-274. Key words: Anti-D reagents; weak D; partial D; RhD; RHD.

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Avaliao: Editor e dois revisores externos Conflito de interesse: no declarado Recebido: 12/04/2006 Aceito: 20/06/2006

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