INGENIERA GENTICA. IDEAS IMPORTANTES: La tecnologa de DNA recombinante no se desarroll con rapidez.

Se inicio con los pr imeros trabajos sobre la gentica de algunas bacterias y los virus que infectan a las mismas. Vectores: Los bacterifagos, Plsmidos, Csmidos, Cromosomas artificiales de levadura. Las bacterias han proporcionado a los investigadores enzimas especiales conocida s como enzimas de restriccin. Polimerasas de DNA, son enzimas que permiten la elaboracin de copias idnticas de m olculas de DNA en Vitro a travs de bacterias y virus. La tecnologa de DNA recombinante depende de una propiedad fundamental de los cidos nucleicos: la capacidad de las secuencias de nucletidos complementarios de parea rse por medio de enlaces de hidrgeno especficos. Recordar las bases nitrogenadas que forman la molcula de DNA. Concepto de complementariedad. DNA RECOMBINANTE CARACTERSTICAS: Se entiende por DNA recombinante: cualquier molcula de DNA formada por la combina cin de genes de diferentes organismos. Se requiere de una molcula vectora. Los vectores ms comunes son. DNA de bacterifagos y plsmidos. Por medio de esta tecnologa se ha podido generar organismos genticamente modificad os. Se da en vitro. Su objetivo es que una vez que se introduzca en el organismo husped el DNA hbrido, este se multiplique, se propague y eventualmente se exprese. BIBLIOTECA DE ADN:

Se le denomina genoma al ADN total de una clula. Una biblioteca genmica es la coleccin de fragmentos de DNA ms o menos representati os de la totalidad del genoma. Tambin se le conoce con el nombre de genoteca. Contiene secuencias que se transcriben y secuencias que no se transcriben. Las bibliotecas de DNA se mantienen en bacterias. Para elaborar una biblioteca de ADN se requiere de: 1. vectores, 2. DNA de estudio, 3. ligasas, 4. enzimas de restriccin, 5. bacterias. Una genoteca contiene el genoma completo de un organismo cortados en pequeos frag mentos. Para elaborar una biblioteca de DNA se requiere de los siguientes pasos: Identificar el DNA que se va a estudiar. Cortar el DNA con una enzima de restriccin; esto genera una poblacin de fragmentos de DNA.

Estos fragmentos varan en tamao e informacin gentica que portan. Todos los fragmentos tienen extremos adhesivos idnticos. Introducir los fragmentos de DNA en un plsmido que ser el vector. Por transformacin bacteriana introducir los plsmidos a una bacteria, que va a repl icarse y as formar miles de copias de fragmentos que lleva el vector. El DNA del plsmido se corta con la misma enzima de restriccin que el DNA en estudi o de manera que el plsmido y el DNA de estudio tienen los mismos extremos adhesiv os; de tal forma que los extremos sean complementarios. Para que se unan se deben crear las condiciones que favorezcan la formacin de enl aces de hidrgeno entre bases complementarias del ADN en estudio y el plsmido. Agregar ligasas para unir las cadenas de DNA, es decir es decir unir las cadenas del plsmido y las del DNA en estudio y as crear molculas de ADN recombinante. Para identificar un plsmido que contenga una secuencia de inters, el plsmido debe er amplificado o clonado. Esto ocurre cada vez que la clula crece y se divide, para lo cual se le agregan a l plato Petri los nutrientes necesarios para formar colonias. Cuando cada clula se reproduce da origen a una colonia. Cada colonia constituye u n ADNr iguales entre s pero diferentes a los de otras colonias. La tarea principal es determinar cual colonia contiene el fragmento clonado de i nters. CONCLUSIONES: Una biblioteca genmica contiene redundancias, es decir muchas secuencias se han d uplicado varias veces. Generalmente cada plsmido recombinante individual contiene un fragmento del DNA t otal. Cada fragmento suele ser menor que un gen. Para estudiar el gen completo es necesario aislar varios fragmentos. HIBRIDACIN:

Consiste en la desnaturalizacin del DNA; es decir la molcula bicatenaria se vuelve sencilla, es decir se fusiona. Puede ocurrir por calentamiento en una solucin salina diluida, ( NaCl, 0.01M); y Por elevacin del pH por arriba de 11. En una mezcla de cidos nucleicos slo las hebras simples complementarias( o hebras que contienen regiones complementarias) se reasocian. La hibridacin puede tener lugar entre dos hebras complementarias de DNA o RNA o e ntre DNA y RNA. PASOS: Se desnaturalizan molculas de DNAr clonado y se adosan las hebras simples a un so porte slido, generalmente un filtro de nitrocelulosa. Cuando se seca una solucin que contiene cidos nucleicos monocatenarios sobre una d e estas membranas, las hebras aisladas se unen de forma irreversible al soporte slido, de modo tal que las mayora de las bases quedan disponibles para unirse por hibridacin a una hebra complementaria. Luego la membrana se incuba en una solucin que contiene una sonda de DNA o RNA mo nocatenario con marca radiactiva, complementaria a algunos de los aminocidos unid os a la membrana. Bajo condiciones de hibridacin: Ph casi neutro 40-65C 0.6MNaCl Con las condiciones de hibridacin la sonda marcada se une por hibridacin al aminoc do complementario unido a la membrana. Toda sonda en exceso no hibridada se elimina por lavado. Los hbridos marcados se detectan mediante autorradiografa del filtro. AUTORRADIOGRAFA

La autorradiografia, es una tcnica semicuantitativa para la deteccin de molculas con marcas radioactivas en clulas, tejidos o geles de electroforesis. En este mtodo la radiacin produce el aspecto de granos plateados oscuros en pelcul especial de rayos X. En Ia autorradiografia se marca una clula o un constituyente celular con un compu esto radiactivo y luego se cubre son una emulsin fotogrfica sensible a la radiacin. Las marcas en las placas de rayos X corresponden a la localizacin de los fragment os en el gel que le son complementarios. Lo que permite regresar a la placa original y tomar las colonias de inters, culti var las clulas y analizar el DNA que contienen.