PRACTICAS LABORATORIO MICROBIOLOGIA Prof.

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1.1. 1.2. 1.3.

Aprender y aplicar normas de bioseguridad en el laboratorio de microbiologa Aprender tcnicas bsicas de cultivo de microrganismos Reconocer los materiales, instrumentos y equipos bsicos de trabajo en el laboratorio de microbiologa

2.1. Normas de Bioseguridad. En las prcticas de laboratorio se manipulan organismos y mtodos que requieren ciertas precauciones tanto para evitar contaminaciones en las muestras o pruebas que se estn realizando, como riesgos para el personal, la comunidad o el ambiente que se encuentre en inmediaciones del laboratorio de microbiologa. De acuerdo a nivel de patogenicidad de los microrganismos presentes en las muestras procesadas en el laboratorio, el Centro de Control de Enfermedades (CDE) Y El Instituto Nacional de Salud han establecido 4 niveles de seguridad biolgica, determinado normas especficas para el trabajo en cada uno de ellos. Nivel I. Se trabaja con microrganismos no patgenos bien conocidos o patgenos oportunistas, como los que vamos a estudiara en este curso Nivel II. Se trabaja con microrganismos y muestras con un potencial de riesgo que va de moderado a alto, como los estudiados en laboratorios de enseanza de bacteriologa o microbiologa mdica, en laboratorios de diagnstico bacteriolgico mdico o microbiolgico de tipo ambiental o de alimentos Nivel III. Con microrganismos y muestras de alto riesgo como lo estudiados en laboratorios diagnsticos especializado Nivel IV. Microrganismos de altsimo riesgo o que son exticos en el pas y requieren mxima seguridad, como lo laboratorios del Instituto Nacional de Salud. Como unos de los propsitos que se busca en los laboratorios de microbiologa es cultivar y multiplicar muestras para obtener poblaciones mucho mayores a la muestra inicial, el microbilogo o persona que procese o estudie estas muestras esta continuamente expuesto a graves contaminaciones sino cumple las normas de bioseguridad establecidas.

Fig 1.1. Smbolo Internacional de Peligro Biolgico

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Cuadro 1.1. NORMAS DE BIOSEGURIDAD PARA LABORATORIOS DE NIVEL I 1 Es obligatorio utilizar la bata (siempre cerrada), como instrumento de proteccin de sustancias y compuestos y como aislante de contaminantes que viajan en su ropa Mantenga el cabello recogido y un poco remangadas las mangas de la bata, para evitar contaminaciones o accidentes con el mechero Trabajar con las ventanas y puertas cerradas No comer, beber, masticar chicle, ni fumar, ni tampoco maquillarse o cambiarse lentes de contacto Mantener el puesto de trabajo solo el material necesario (dejar las maletas y otros artculos atrs) Trabajar con el mechero prendido No poner ningn elemento en contacto con el cuerpo Evitar al mximo transitar por el laboratorio Evitar la formacin de aerosoles Descartar el material contaminado esterilizndolo primero, en bolsas y recipientes destinados para tal fin Pipetear aspirando con dispositivos adecuados, nunca con la boca Evitar el uso de joyas durante el trabajo Informar inmediatamente accidentes como cortaduras o quemaduras. En caso de que se rompa un recipiente con cultivo de microrganismos cubrir el material con solucin de hipoclorito al 2% o fenol al 5%, tapar con una hoja de papel peridico y dejar sedimentar los aerosoles durante media hora, luego recoger el material envolverlo en el papel y llevarlos esterilizacin antes de desecharlo. Lavar las manos ante de iniciar la prctica, si es necesario durante el procedimiento y al finalizar, con jabn y agua abundante cepillando las uas. Limpiar el rea de trabajo con solucin desinfectante antes y despus de la prctica No deambular con la bata fuera del laboratorio Lavar la bata y el gorro independientemente de otra ropa Trapear el piso con detergente e hipoclorito, no barrer en seco e inmediatamente antes de las prcticas, para evitar dispersar en el ambiente microrganismos sedimentados

2.2. Tcnicas de Cultivo Asptico. Uno de los principios de la microbiologa es obtener cultivos puros donde todos los organismos presentes pertenezcan a un slo grupo, para as poder estudiar sus caractersticas morfolgicas y fisiolgicas confiadamente. Adems de tener precauciones de seguridad en cuanto a la manipulacin y disposicin de los materiales e instrumentos utilizados es necesario mantener las condiciones de mayor asepsia durante el manejo y siembra de las muestras y cultivos, trabajando permanentemente con el mechero encendido, las manos muy limpias, y la superficie del mesn desinfectada, procurando no hablar y retirar cualquier material que sea fuente de contaminacin. En el momento de realizar los cultivos es necesario aprender tcnicas de manipulacin de las muestras, materiales y utensilios de manera que se evite cualquier contaminacin externa o accidente y se logre as obtener cultivos con colonias caractersticas para su posterior identificacin y purificacin. A continuacin se explican algunas de las tcnicas ms utilizadas: 2.2.1. Desinfeccin de los utensilios de siembra: Se debe remojar el utensilio (asa recta o redonda, agujas de diseccin, pinza o rastrillo) en agua limpia y luego en
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Fig. 1.2. Esterilizacin del Asa

Normas que deben ser tenidas en cuenta si excepcin en todos las prcticas desarrolladas en la materia

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alcohol al 90% luego flamear todo el alambre hasta la base (se esteriliza por incineracin). Para evitar posibles contaminaciones cuando se han realizado varios siembras con el mismo utensillo es necesario limpiarlo de partculas de inculo o medio en exceso o quemadas, introducindolo en un frasco con piedritas (gravilla) que desprenden la partculas y luego se procede a esterilizar como se explico previamente. Para los rastrillos se tiene al agua y el alcohol en cajas de petri. 2.2.2. Siembra: Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porcin de muestra (inculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento. La siembra puede realizarse en medio lquido, slido o semislido, utilizando punta, asa, hisopo (palillo con algodn) o pipeta estril. a. Cultivo en medio lquido: Fig. 1.3. Manejo de Tubos de cultivo Habitualmente se realiza en tubos o en matraces, inoculando una asada o un volumen conocido de muestra (0.1-1 ml). El crecimiento se puede manifestar por enturbiamiento, por formacin de velo o pelcula, o por sedimento b. Cultivo en medio slido: Puede ser en tubos o placas. Tubos con agar inclinado. Para sembrarlos, se mueve el asa suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zigzag desde el fondo hasta la parte superior, cuidando de no daar el agar. Tubos sin inclinar. Se siembran introduciendo una punta en el centro del agar. Tambin se llama siembra por picadura.

Siembra en placas o cajas de petri. Puede ser en superficie o incorporada. En superficie: Existen 3 formas: Con Rastrillo: Se colocan 0.1 ml de la dilucin de la muestra con pipeta estril en el centro de la placa, y se distribuye con un rastrillo estril. Con Asa o Hisopo: Se toma un asada de muestra o un frotis de superficie con un hisopo y se distribuye sobre el medio como se explica ms adelante. Colocando un trozo de muestra: Con un bistur o tijeras estriles se cortan pedazos de la muestra y con las pinzas estriles se colocan distribuidos sobre el agar. Incorporada: Se coloca 1 mL de la muestra en una placa estril vaca, en el centro de la misma. Sobre ella

Fig. 1.4. Manejo de las Cajas de Petri

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se agregan 20 mL de medio de cultivo fundido y termostatizado a 45C; luego se agita la placa, movindola 4 veces en sentido de las manecillas del reloj y 4 en sentido contrario, una vez de arriba a abajo, una vez hacia los costados y una vez en sentido contrario. En todos los casos de siembra en placa, stas se incuban invertidas, ya que la alta concentracin de agua en el medio puede provocar condensacin durante la incubacin y si cae sobre la superficie del agar, se extiende dando un crecimiento confluente. En medio slido cada clula viable dar origen a una colonia y por lo tanto la siembra en placas se puede utilizar, no solo para cultivar microrganismos, sino adems para contar y aislar. En general cuando se quieren tener colonias aisladas a partir de un material determinado, es necesario diluir la muestra en tubos con suero fisiolgico estril. 2.2.3. Aislamiento. Es separar un tipo de microrganismo a partir de una poblacin que los contiene de varios tipos. En hbitats naturales, raramente encontramos a los microrganismos en cultivo puro (un solo tipo de microrganismo), por lo tanto es necesario hacer algn procedimiento de aislamiento para separar e identificar los distintos tipos de microrganismos presentes. El aislamiento se puede lograr directamente a partir de una muestra cuando el o los microrganismos estn en una proporcin adecuada. Cuando el microrganismo que se desea aislar e identificar se encuentra en baja proporcin en la muestra, o interesa un solo tipo de microrganismo, se lleva a cabo un procedimiento llamado bsqueda que involucra una primera etapa de aumento del nmero de microrganismos del tipo que se desea aislar en relacin al resto de la poblacin. Luego se asla por el mtodo de estras o por dilucin y se inicia el proceso de identificacin. En el aislamiento por estras con asa o hisopo existen tres tcnicas:

Fig. 1.5. Tcnicas de aislamiento en estra de colonias

Aislamiento por dilucin en medio slido. Se emplean tanto el mtodo de siembra incorporada como el de siembra en superficie. Suele ser necesario diluir la muestra. Para ello se puede preparar las diluciones decimales en condiciones aspticas usando suero fisiolgico o algn otro diluyente. La

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siembra incorporada se realiza tal como se describi anteriormente. Tambin se pueden preparar las diluciones directamente en tubos de agar fundido y termostatizado (20 mL) se agita por rotacin entre las manos y se vierte en placas de Petri estriles. 2.2.4. Aislamiento de Microrganismos Anaerobios. Para aislar microrganismos anaerobios que son rpidamente destruidos por exposicin al oxgeno, las placas o tubos pueden ser preparadas en la forma usual, y luego de sembradas, incubadas en recipientes cerrados en atmsfera sin oxgeno. 2. Tambin se puede sembrar diluciones en tubos con agar fundido y termostatizado que luego se tapan con una capa de vaselina-parafina, para evitar el acceso de aire. Con anaerobios ms sensibles al oxgeno, se trabaja en cmaras anaerbicas, o tambin usando la tcnica del "roll-tube", que es un tubo en el que el agar se deposita en las paredes al hacerlo girar mientras se enfra; se trabaja gaseando el tubo continuamente con gas libre de O2 mientras el tubo est destapado. 2.2.5. Cultivo Puro. A partir de colonias aisladas en medio no selectivo se realiza un examen microscpico que debe mostrar clulas razonablemente semejantes respecto al Gram y a la morfologa. Las colonias deben describirse por examen macroscpico en funcin del tamao, la forma, el borde, la elevacin, la transparencia y el color. Esto resulta a veces muy til en la identificacin. En el caso de medios selectivos las colonias aisladas deben aislarse nuevamente en medio no selectivo por el mtodo de estras. Esto se conoce como re-aislamiento. 2.2.6. Bsqueda o Determinacin. Cuando se desea saber si un determinado tipo de microrganismo est presente o ausente en una muestra, o tambin si se quiere identificar una tipo de colonia prevaleciente en una muestra, debe llevarse a cabo el procedimiento conocido como bsqueda que comienza por aumentar el nmero del microrganismo que se desea determinar. Una bsqueda implica los siguientes pasos: a) enriquecimiento b) aislamiento por estras en medios selectivos y diferenciales c) reaislamiento (medio no selectivo) d) identificacin o determinativa morfolgica, bioqumica, serolgica o gentica La etapa de enriquecimiento puede subdividirse en dos: pre-enriquecimiento y enriquecimiento selectivo. El pre-enriquecimiento o enriquecimiento no selectivo suele hacerse solamente cuando los microrganismos buscados estn debilitados o daados y se usan siempre medios nutrientes lquidos, no selectivos. El enriquecimiento selectivo se realiza incubando la muestra en medios lquidos selectivos, ya sea en presencia de agentes qumicos o biolgicos que favorecen el desarrollo en particular del o de los microrganismos buscados. Luego de
Existen sistemas de anaerobiosis como el GasPak, que contienen 3 dispositivos: uno con hidrgeno que reacciona con el O2, uno generador de CO2 y uno que indica la anaerobiosis. En el laboratorio se puede fabricar "artesanalmente" un sistema parecido con un frasco grande de boca ancha donde se introducen los cultivos y se coloca una vela encendida en el interior, tapando hermticamente para consumir el oxgeno atrapado.
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cumplida la etapa de enriquecimiento se lleva a cabo la etapa de aislamiento, empleando la tcnica de estras en superficie y medios selectivos y diferenciales. El re-aislamiento en medios no selectivos para la obtencin de cultivos puros y la identificacin son las etapas finales de toda bsqueda. El informe de una bsqueda se hace siempre expresando PRESENCIA o AUSENCIA en los gr o ml de muestra sembrados en la primera etapa del procedimiento (enriquecimiento). 2.2.7. Recomendaciones. Antes y durante las prcticas recuerde: Estudiar la tcnica o procedimiento y su fundamento terico antes de las prcticas No trate de abreviar o cambiar las tcnica indicada sin consultar con el profesor previamente, pues los procesos presentados en cada prctica estn basadas en mtodos comprobados Llegar puntualmente, despus de 10 minutos de la hora se cierra la puerta. Si no se asiste al laboratorio son 3 horas de falla y la nota correspondiente a ese informe quedar en cero. Cada grupo deber contar en todas las prcticas con el siguiente material bsico: - Tincin de Gram, Lugol, Azul de metileno, Azul de lactofenol - Gradilla con un tubo con agua y otro con alcohol a 90% - 3 lminas y 3 laminillas - Frasco de mayonesa o compota con gravilla - Frascos medianos tomamuestra (mermelada con tapa), Bolsas plsticas tomamuestra de autosellado - Frasco grande de mayonesa (30 cms alto y 5 cms de ancho) - Botellas planas de 1/2 litro (canecas) - Asa redonda y recta, Pinzas con o sin garra, bistur, Esptula, Rastrillo bacteriolgico - Vinipel, Papel absorbente, Cinta de enmascarar - Lpiz o marcador rotulador - Jabn de manos antibacterial Ubique los materiales y reactivos que va utilizar antes de iniciar las prcticas, consulte cualquier duda antes de proceder Rotule los recipientes utilizados para evitar confusiones, traiga siempre marcador de vidrio o cinta de enmascarar. Marque los materiales en un sitio donde permita visualizar el cultivo. Al final de la prctica retire siempre las cintas para facilitar la limpieza del material. Tome apuntes claros y anote todas sus observaciones, realice siempre un diagrama de flujo del procedimiento, llene los formatos de resultados y este concentrado siempre en le desarrollo de la prctica para que pueda relacionar efectivamente los resultados obtenidos con los fundamentos tericos y sus conclusiones en los respectivos informes Nunca cambie los cultivos del sitio asignado, ni cambie las temperaturas de las incubadoras. Cualquier dificultad hable con el encargado Acuerde con tiempo el horario de lecturas de las muestras con los encargados del laboratorio

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1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) 9)

Una vez realizadas las lecturas se deben anotar en la tabla correspondiente de la gua y tambin en el tablero o sitio acordado para que los otros grupos tengan los datos y puedan hacer los anlisis de resultados y conclusiones respectivos. Slo guarde en nevera los cultivos estrictamente necesarios que le haya indicado el profesor, el resto de los materiales deschelos oportunamente para su limpieza y desinfeccin. El plazo para entregar los informes es de 8 das, en el siguiente laboratorio, en el cual se puede hacer una discusin en grupo o evaluacin individual. Estos informes deben presentar la siguiente informacin: Ttulo del Laboratorio Nombres de los integrantes del grupo Objetivos de la prctica Diagrama de flujo del procedimiento desarrollado Resultados (tablas, dibujos, grficos) Anlisis de resultados y otras observaciones Cuestionario Conclusiones (respecto a objetivos y resultados) Bibliografa Informes sobre salidas (entregar 8 das mximo despus de realizada la salida) Descripcin general del sitio visitado (Ubicacin, Temperatura...) Diagrama de flujo del proceso observado Observaciones Conclusiones

1) 2) 3) 4)

3. 3.1. 3.2.

3.3.

Ubicar y reconocer en el laboratorio los lugares y fuentes posibles de contaminacin Conforme su grupo de laboratorio (mximo 3) ojal con compaeros con intereses de investigacin afines, ubique el rea de trabajo de cada grupo y el sitio para colocar sus maletas y otros materiales fuera de dicha rea. Identificar materiales, instrumentos, equipos y reactivos de uso comn en el laboratorio, sealando su utilidad, manejo y cuidados

4.1. 4.2. 4.3.

Cul es la utilidad de un cmara de flujo laminar en el laboratorio de microbiologa, qu tipos existen, cmo funciona y cmo se utiliza? Revise las principales partes y funciones del microscopio ptico En qu consiste la coloracin de Gram, que tipo de coloracin es?

Prximo Laboratorio. Acordar salida para toma de muestras de diverso origen, conseguir frascos y bolsas tomamuestra y materiales de aseo y uso comn en el laboratorio.

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1.1. 1.2. 1.3.

Recordar y aplicar fundamentos de microscopia y tcnicas de tincin Establecer caractersticas macro y microscpicamente que indican la presencia de diversos microrganismos en ecosistemas naturales o artificiales Aplicar tcnicas de cultivo asptico para la siembra de preenrequecimiento y aislamiento de muestras de diferentes ambienes
Cuadro 2.1. Precauciones con el Microscopio. No limpiar los lentes con etanol No limpiar los lentes con papel ordinario o con algodn. Use xilol si el aceite de inmersin se ha quedado adherido y seco No limpiar las lentes internamente con papel pues esto desprender la capa antirreflejante. Utilizar slo pincel No guardar el microscopio en lugares hmedos y poco ventilados, pus se favorece el crecimiento de hongos No dejar aceite de inmersin en los lentes Nunca coger el microscopio por el brazo par transportarlo, cogerlo con una mano por la base y con la otra por el brazo

. 2.1 Microscopia. La invencin y desarrollo del microscopio y sus diferentes tipos y aplicaciones ha permitido el desarrollo de la microbiologa, siendo el principal instrumento de trabajo en el laboratorio es necesario conocer los principios bsicos de la microscopia y las precauciones al hacer uso del mismo.

El microscopio es un instrumento ptico que amplifica la imagen de un objeto pequeo y nos permite observar objetos no perceptibles a simple vista. Mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminacin se puede hacer visible un objeto microscpico. Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamao original. Actualmente existen dos tipos de microscopios: el ptico y el electrnico. En el microscopio ptico el aumento del objeto se consigue usando un sistema de lentes que manipula el paso de los rayos de luz entre el objeto y los ojos. El microscopio electrnico utiliza un rayo de electrones controlado por un campo magntico. Los microscopios de este tipo generalmente producen un aumento de 1000 veces el tamao original. El lmite lo tienen en unas 2000 veces.

Cuadro 2.2. Tcnicas de observacin en el Microscopio Optico Colocar una preparacin. Abrir el diafragma de la fuente de luz al mximo. Abrir el diafragma del condensador al mximo y llevar el condensador al mximo de su trayectoria. Colocar el objetivo de menor aumento ej. 10x. Prender la fuente de luz y ajustarla a una intensidad confortable. Ajustar los binoculares a la distancia interpupilar y ajustar el foco de cada ocular si el microscopio lo permite. Enfocar la preparacin. Gradualmente cerrar el diafragma de la fuente de luz hasta ver una imagen poligonal. Bajar el condensador hasta que los bordes del polgono se vean ntidos. Ajustar el enfoque. Si la imagen poligonal no est en el centro, centrarla utilizando los tornillos del condensador. Abrir el diafragma de la fuente de luz hasta que la poligonal apenas salga del campo, no tocarlo mas. No tocar mas la altura del condensador. Elegir el contraste ptimo ajustando el diafragma del condensador. Verificar la iluminacin quitando los oculares y mirando por el tubo hacia los objetivos ajustar el diafragma a 2/3 abierto. (2/3 del campo iluminado). Para cambiar el contraste regular el diafragma del condensador y para ajustar el brillo modificar la intensidad de la fuente luminosa o colocar filtros. No cambiar la distancia del condensador. Al cambiar de objetivo solo modificar el diafragma de la fuente de luz y el diafragma del condensador a la apertura del objetivo.

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Las lentes de un microscopio ptico son el condensador, el objetivo y el ocular. La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparacin y para esto se utiliza el condensador. Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de luz y elegirse una posicin que consiga el foco preciso. El objetivo es la lente situada cerca del objeto que se observa. El aumento primario del objeto es producido por la lente objetivo y la imagen se transmite al ocular, donde se realiza el aumento final. Los microscopios que se usan normalmente en microbiologa estn equipados con tres objetivos: bajo poder, alto poder y objetivo de inmersin. Estos objetivos estn montados sobre una pieza que se llama revolver que puede rotarse para alinear el objetivo deseado con el condensador. La imagen formada por el objetivo es finalmente aumentada por el ocular. El aumento total de un microscopio compuesto es el producto del aumento de su objetivo y de su ocular. El microscopio compuesto es capaz de conseguir aumentos considerablemente mayores que el microscopio construido con una sola lente. Este ltimo, llamado microscopio simple, se usa principalmente como lupas y cristales de aumento. Adems del aumento, una propiedad importante de un microscopio es su poder resolutivo; esto es la capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos. Cuanto mayor sea el poder resolutivo, mayor ser la definicin de un objeto. Los microscopios de gran poder resolutivo son especialmente buenos para ver pequeas estructuras. El poder resolutivo de un microscopio compuesto depende de la longitud de onda utilizada y de una propiedad ptica de la lente conocida como apertura numrica. Como los microscopios pticos utilizan luz visible, la longitud de onda est fijada y es por lo que la resolucin de un objeto es funcin de la apertura numrica; cuanto mayor sea la apertura, el objeto resuelto ser ms pequeo. 2.2. Tcnicas de Observacin y Tincin de microrganismos . Los microrganismos estn presentes en todos los medios naturales y en algunos artificiales, hacen parte del mundo como flora saprfita (inocua que no causa dao o enfermedad) o como flora patgena. Algunas veces es posible observar a simple vista caractersticas macroscpicas como presencia de crecimiento sobre las superficies y por lo tanto podemos describir dichas caractersticas en cuento a color, forma, textura, grosor, si es duro, pegajoso, polvoso, si es una costra, etc., pudindose tambin anotar otras caractersticas como el olor (teniendo cuidado de aspirar o acercarse mucho a la muestra) y los cambios fsicos sobre la superficie donde estamos encontrando el microrganismo, cambios en el color, la forma, la continuidad, etc. En todos los casos cuando se quiere identificar dichos microrganismos adems de la observacin macroscpica inicial es necesario realizar frotis y coloraciones, para obtener una rpida informacin sobre otras caractersticas bsicas que permitan identificar el tipo de microrganismo y el proceso posterior para su cultivo y caracterizacin taxonmica o bioqumica si fuera necesario. Para observar al microscopio es necesario realizar frotis o extensiones de la muestra seleccionada, estos frotis pueden observase en fresco y/o realizar coloraciones par aumentar

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el contraste con la luz y facilitar la observacin de las muestras, segn el alcance de la identificacin que se quiera realizar. Tcnicas de tincin: En general, el proceso seguido en todas las tinciones conlleva las siguientes etapas: extensin, fijacin, tratamiento con colorantes y observacin. a. Extensin: se realiza con el asa redonda y recta sobre un portaobjetos que ha de estar totalmente limpio. Si la muestra es lquida se hace directamente y, si es slida, hay que resuspenderla previamente en una gota de agua limpia. La extensin se deja secar primero al aire antes de la fijacin b. Fijacin: tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos y desnaturalizar las protenas para facilitar la accin del colorante. Normalmente se realiza con calor, pasando con unas pinzas la muestra extendida repetidamente a 10 cm de la llama del mechero. c. Tincin: Las formas y estructuras microbianas se pueden observar ms claramente por medio de las coloraciones ofreciendo un medio de contraste para los microrganismos que por lo general son incoloros, estos colorantes son absorbidos por las clulas ya que presentan caractersticas qumicas al medio que las rodea. Se realizan aadiendo los colorantes sobre los microrganismos sometidos a los procesos anteriores. Puede ser de varios tipos segn el tipo de colorantes empleados: Los colorantes son sales, clasificados en: a. Colorantes cidos o aninicos cuando el in coloreado es el cargado negativamente, como ocurre en el Eosinato de sodio (se ioniza como sodio + y esosinato - ), combinndose con las estructuras celulares con carga positiva y b. Colorantes bsicos o catinicos cuando el in coloreado es cargado positivamente como el Azul de Metileno(se ioniza en cloruro - y en azul de metileno +)., el Cristal Violeta y la Safranina. Ya que la las envolturas externas de las clulas estn por lo general cargadas negativamente, estos colorantes son los ms utilizados al combinarse con los componentes estructurales de la clula de tipo cido como son los polisacridos y cido nucleicos. De acuerdo a la complejidad y objetivo de la coloracin se clasifican: a. Negativa: Los colorantes no tien el microrganismo, sino el entorno, aumentando de este modo su contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante. Ej. Nigrosina. b. Simples (con un slo colorante) Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la tincin negativa, slo nos permite observar la forma, el tamao y el tipo de agrupacin de las clulas. Ej. Azul de metileno o Azul de lactofenol c. Diferencial: Intervienen dos o ms colorantes y cada uno diferencia una estructura celular o tie diferencialmente a diferentes microrganismos. El colorante que se usa en segundo lugar es de color diferente al del primero, denominndose colorante de contraste, se utiliza adems sustancias decolorantes y fijadoras. Ej: Coloracin de Gram, Ziel Neelsen, donde las clulas se tien diferencialmente segn su tipo,

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d. Coloraciones especiales que se utilizan para evidenciar y observar algunas estructuras como pared celular, cpsulas, endosporas, flagelos y ncleos. Ej: Wayson (esporo), Leifson (flagelos) Rojo congo (Glicocalix, cpsula), Van Stoltembreg (grnulos metacromticos) Veamos un ejemplo con la tcnica de Tincin de Gram Es la tcnica de tincin diferencial ms importante que se utiliza en bacterias. El primero en describirla fue el dans Christian Gram en 1884, con sta tcnica se logro separar las bacterias en dos grupos bacteriano: positivas y negativas. El procedimiento se basa en la habilidad que tienen algunos microrganismos para retener el cristal violeta despus de un decoloracin con alcohol. Se utiliza como mordiente o fijador el Lugol, que forma un complejo ente el cristal violeta no fijado, formando un precipitado que es fcilmente removido por el etanol de las bacterias Gram negativas pero no de las Gram positivas. Se considera que la naturaleza qumica de la pared celular de la Gram + impide la precipitacin del complejo Cristal Violeta-Lugol al contener un porcentaje menor de lpidos que la pared de las Gram -. , tambin las paredes de stas ltimas son ms delgadas y frente a la accin del alcohol liberan sus lpidos y permiten la salida del complejo CV-Yodo, en cambio las Gram + se deshidratan por sus bajo contenido de lpidos, los poros disminuyen y retienen el complejo CV-Yodo. Adems se ha descubierto que existe mayor cantidad de peptidoglicano en la pared de las Gram + que en las Gram-, lo que hace que stas ltimas tengan poros mayores y ms susceptibles de la accin del alcohol permitiendo la extaccin del complejo. Una vez realizado el frotis, se va cubriendo completamente con las siguientes soluciones cubriendo el en orden y dejando los tiempos especificados con la mayor exactitud: Cuadro 2.3.: Coloracin de Gram Tiempo Reaccin y apariencia de las clulas Gram positivas Gram negativas 1. Cristal violeta 1 min La clula se tie de violeta La clula se tie de violeta Lavar con agua para 2 seg retirar el colorante no fijado 2. Solucin de Yodo 3 min Se forma complejo CV-I dentro Se forma complejo CV-I dentro yodurada (Lugol), actua de la clula las bacterias de la clula las bacterias como mordiente permanecen violeta permanecen violeta 3. Etanol 96 , decolora 20 seg Las clulas permanecen violeta, Se decoloran las clulas . las clulas que no fijaron se ha fijado el colorante. Las Se ha n extrado los lpidos de las el colorante pared celulares se deshidratan , paredes se aumenta la porosidad se cierran los porros , el y el complejo CV-I sale de la complejo no puede salir bacteria 4. Safranina , tincin de 1-2 min Las bacterias no afectadas Las bacterias decoloradas toma constraste permanecen violetas este colorante y se tien de rojo Solucin aplicada Luego de realizar la coloracin se procede a realizar la observacin teniendo en cuenta las tcnicas de observacin microscpica. Las tcnicas de coloracin y estudio microscpico son tiles para identificar forma, tamao, agrupacin,

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comportamiento tintorial y la presencia de estructuras subcelulares dentro de lo que se ha denominado anatoma o citologa microbiana. El estudio de la anatoma o citologa microbiana adems de ser una herramienta valiosa para caracterizar morfolgicamente los microrganismos, nos permite integrar las propiedades estructurales y funcionales de la clula para llegar a entender la funcionalidad e importancia ecolgica, biolgica y de aplicacin de dichas propiedades en el mundo actual. Existen tambin algunas tcnicas de microscopia para contar y establecer poblaciones de microrganismos aunque no son muy exactas.

Figura 1. Formas bacterianas

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Figura 2. Morfologa Hongos

Todos los microrganismos, excepto los virus, pueden ser observados mediante microscopios pticos, por lo que nos vamos a limitar a describir las tcnicas ms comnmente usadas para realizar preparaciones para microscopios pticos. Preparacin en fresco: para poder observar la movilidad de un microrganismo es preciso que no est fijado. Consiste en suspender una gota, tomada directamente de la muestra, sobre un portaobjetos y cubrindola, sin formar burbujas de aire, con un portaobjetos y se observa al microscopio principalmente en el de fases Las formas microbianas dependen del tipo de microrganismo y del estado dentro de su ciclo biolgico, como tambin de la edad del cultivo o de las condiciones medioambientales en la cuales se encuentra. El primer aspecto a identificar es si

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en la muestra encontramos organismos procariontes, eucariontes o una mezcla de ellos, adems de comparar el tamao y la cantidad de cada organismo/campo observado y frotis. Luego es importante detallar las formas y algunas estructuras bsicas como membrana, forma y posicin del ncleo, etc. Recordemos que el tamao de los microrganismos pude variar mucho pero en general se usa como medidas de referencia el micromtro o micra m 10 -6 m (0.000001 m) y el nanmetro nm 10 -9 m (0.000000001 m).

Muestras tomadas por los alumnos Colorantes: Azul de Metileno, Gram, Azul de Lactofenol, Aceite de inmersin Asas bacteriologicas Escobillones Laminas y laminillas Lpiz de cera o marcador Tubos con CN3 y PDA4 Mechero Pinzas

4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. 4.6.

4.7. 4.8.

Tomar muestra microbiolgica con el asa del cultivo Preparar frotis sobre una lmina con una gota de agua, observar sin fijar. Realizar otro fijando con el mechero, colocar laminilla en todos lo casos Observar al microscopio desde el menor aumento al mayor. (recuerde utilizar aceite de inmersin en el 100X Realizar descripcin y dibujo de lo observado, tamao, nmero, formas, colores, clasificar en procariota o eucariota etc Preparar nuevamente frotis, fijarlo y colorearlo segn el tipo de muestra y colorante Observar al microscopio desde el menor aumento al mayor. (recuerde utilizar aceite de inmersin en el 100 X )Realizar descripcin y dibujo de lo observado, tamao, nmero, formas, colores, clasificar en procariota o eucariota, diferencias con los otros frotis. Intercambie lminas preparadas con su otros compaeros, comente en la clase los resaltados de las observaciones Realice siembra de pre enriquecimiento sobre medios de cultivo, CN y PDA teniendo en cuenta las tcnicas de cultivo asptico aprendidas en la prctica anterior, rotule debidamente los tubos de ensayo, nombre de la muestra, grupo y fecha e incube a 25 C , realice observaciones a las 2448-72 horas.

CN: Caldo Nutritivo, preenrequecimiento no selectivo, cada litro contiene: Extracto de carne 3 g, Peptona 5 g y Agua destilada 1000 ml 4 PDA: Papa Dextrosa Agar, cultivo selectivo para Hongos y Levaduras, cada litro contiene: Papa 200 g, destrosa 20 g, Agar 15 g y 1000 ml de Agua destilada , pH: 5.0 (ajustado con cido lctico al 2.5%)

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4.9.

A las 48 horas realice aislamiento por estras en cajas de petri de AN5 con los cultivos pre enriquecidos en CN e incube a 25 C hasta el prximo laboratorio.

a. Dibuje en el cuadro correspondiente las diferentes formas bacterianas y de hongos, reporte cuales encontr en las muestras b. Qu aspectos de las caractersticas macro y microscpicas le suministraron informacin clave que luego le permiti caracterizar los microrganismos en sus lminas, que relacin encontr con el tipo de muestra que haba tomado c. En qu aspectos fisicoqumicos y biolgicos se basa el proceso de coloracin celular d. Investigue las tcnicas de tincin de esporas, cpsulas y microrganismos cido resistentes e. Investigue las principales caractersticas, aplicaciones y alcances de los microscopios de luz, electrnico de transmisin, electrnico de barrido y de Fluorescencia Anote y dibuje de esta manera sus observaciones:

Morfologa Macroscpica: _________________________ Morfologa Microscpica:__________________________ Coloracin utilizada:_______________________________ Otras observaciones:_______________________________

AN: Agar Nutritivo, aislamiento no selectivo, cada litro contiene: Extracto de Carne 3g, Peptona 5 g, Agar 15 g, Agua destilada 1000 ml

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AN Caractersticas Macroscpicas del Cultivo: __________________________ _________________________________ Observaciones: 24 h: _____________________________ 48 h: _____________________________ 72 h:_____________________________

PDA Caractersticas Macroscpicas del Cultivo: __________________________ _________________________________ Observaciones: 24 h: _____________________________ 48 h: _____________________________ 72 h:_____________________________ 8 das:____________________________

MUESTREO PARA ANALISIS MICROBIOLOGICO La primera etapa del anlisis microbiolgico es la extraccin de la o las muestras de un lote y cualquier resultado carece de significado si la muestra no ha sido apropiadamente tomada. Es responsabilidad del laboratorio de control constatar que la muestra que se analizar es representativa del lote y rechazarla antes de realizar el anlisis si se tiene indicios de que no lo es. Generalmente en los textos especializados se describen los protocolos para el muestreo en las reas clnicas, de alimentos, de aguas y de medicamentos y es necesario referirse a ellos en primera instancia. Aqu sealaremos algunas consideraciones generales aplicables a las tres ltimas reas. El lote es el nmero de unidades o la cantidad de un producto que ha sido sometido a las mismas condiciones durante un proceso determinado. Esta es una consideracin terica puesto que es difcil asegurar la uniformidad durante la mayora de los procesos conocidos. Por ej. en una esterilizacin por vapor no todas las zonas del autoclave alcanzan la misma temperatura, sin embargo se considera que todos los recipientes sometidos a ese proceso en esa instancia constituyen un lote. Se considera que una muestra o un conjunto de muestras son representativas de un lote cuando reflejan, tanto como sea posible, la

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totalidad del lote. Para determinar que la muestra es representativa y que no se ha alterado despus de la extraccin deben tenerse en cuenta las etapas de: recoleccin, transporte y preparacin para el anlisis propiamente dicho. a. Recoleccin. Los planes de muestreo determinan el nmero, tamao y zonas de recoleccin de la muestra. Se disean por criterios estadsticos teniendo en cuenta adems algunas caractersticas del producto tales como: Riesgo potencial para el consumidor, si el riesgo es alto se aumentar el nmero de muestras para disminuir la probabilidad de que llegue al consumidor una muestra contaminada Facilidad de homogeneizar el lote. Si la produccin es en batch (tandada) y el producto es fcilmente mezclable, como un lquido, se requiere menor nmero de muestras que si no lo es; si el lote es un conjunto de unidades y se presume que no es de calidad uniforme entonces se extraern muestras de los puntos donde se supone que la calidad es inferior los cuales se denominan puntos crticos (en el ejemplo del autoclave stos seran las zonas donde se alcanza menor temperatura). A su vez deber considerarse la homogeneidad dentro de la unidad o envase, por ej. en un alimento congelado hay un gradiente de temperatura durante el proceso de enfriamiento de tal manera que la zona central es la que tarda mas tiempo en alcanzar la temperatura de congelamiento. Posibilidad de controlar y registrar el tratamiento al cual ha sido sometido el producto; cuanto mayor sea la seguridad de que el tratamiento ha sido correcto para la totalidad del lote, se requiere menor nmero de muestras. Debe tenerse en cuenta que el aumento del nmero de muestras est restringido por el costo del anlisis y porque existe un lmite por encima del cual no hay un aumento significativo de los intervalos de confianza. La muestra se extrae de unidades cuyo envase externo est inalterado. La extraccin se realiza en forma asptica para evitar la contaminacin de la muestra y del resto del contenido del envase. La muestra debe identificarse con un nmero, fecha, origen, contenido e iniciales del extractor. b. Transporte. Para un producto almacenado en batch la muestra se toma y transporta en recipientes previamente esterilizados y hermticos. El transporte se realiza de acuerdo a las condiciones de almacenamiento. Si es un producto alterable debe transportarse refrigerado (0-4C) por no ms de 24hs. Si se trata de un alimento congelado debe conservarse a la temperatura de congelamiento. El recipiente de transporte no debe llenarse completamente (hasta un 75% de su capacidad) para permitir su homogenizacin antes del anlisis. c. Preparacin para el anlisis. Se debe realizar la observacin macroscpica de la muestra y del envase de transporte y registrar cualquier particularidad. Se procede a la homogeneizacin de la muestra mediante manipulacin asptica. Si es un slido o una pasta se diluye en buffer con el mismos pH de la muestra o agua peptonada estriles y se mezcla en una licuadora o en bolsas de plstico previamente esterilizados. Si es un producto oleoso (p.ej. una pomada) se termostatiza en el diluyente a 35C para lograr una emulsin. Si el anlisis se realizar por filtracin es necesario disolver el producto en un solvente orgnico

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inocuo para los microrganismos (p.ej.miristato de isopropilo). Para alimentos se recomienda que la toma no sea inferior a 10 g y que la relacin con el diluyente sea 1:10. Esta dilucin debe prepararse inmediatamente antes del anlisis. APLICACIONES. a. Muestreo de equipos y utensilios. Se puede realizar por varios mtodos: Enjuagado: Consiste en enjuagar el equipo con un volumen medido de medio de cultivo o de buffer, el cual es sometido al anlisis microbiolgico. Contacto de superficie: Consiste en pasar un hisopo embebido en buffer por un rea determinada del equipo y posteriormente descargar el hisopo en un volumen medido de diluyente el cual es analizado. Este mtodo es recomendado para zonas de difcil acceso, en cambio para reas planas se recomienda el contacto directo de la superficie a analizar con un cilindro de agar del dimetro de una placa de Petri el cual se corta aspticamente, y se expresa el resultado por rea de contacto (Replicate Organism Direct Agar Contact Plates). Inmersin: Los utensilios se sumergen en un volumen determinado de diluyente y se determina el nmero de microrganismos por unidad. b. Muestreo de aire. Sedimentacin: Se exponen placas de agar durante 15' a 2h dependiendo de la contaminacin del rea a analizar. Se detectan slo los microrganismos que estn adheridos a partculas sedimentables. Impacto: Se hace pasar un volumen determinado de aire mediante aplicacin de vaco a travs de una serie de tamices que retienen distinto tamao de partcula. Los tamices son incubados sobre agar y se puede determinar el nmero de microrganismos asociados a partculas de distinto tamao. Impregnacin de lquidos: Consiste en hacer burbujear un volumen determinado de aire a travs de un diluyente estril el cual retiene los microrganismos presentes.