UMIVERDIDADE DE SAO PAULO FACULDADE DE CIENCIAS FARMACEUTICAS DEPARTAMENTO DE ANALISES CLNICAS E TOXICOLGICAS LABORATORIO DE BIOLOGAI MOLECULAR ALPLICADA AO DIAGNSTICO

Apostila de noes de Biologia molecular

Prof. Dr. Mario H. Hirata Profa. Dra Rosrio D. C., Hirata

1999

NDICE Tpico Pgina

Aula nmero 1: Introduo........................................................................................................................................ 2 Estrutura do DNA e RNA....................................................................................................................... 2 Replicao, transcrio e traduo...................................................................................................... 4 Organizao do genoma de eucariotos, procariotos e viral.................................................................. 7 Enzimas de restrio e suas aplicaes.............................................................................................. 10 Aula nmero 2: Extrao do DNA genmico ........................................................................................................... 13 Aula nmero 3: Princpios de eletroforese.............................................................................................................. 19 Fatores que influenciam na eletroforese....................................................................................... 20 Tipos de suporte............................................................................................................................ 22 Tipos de eletroforese..................................................................................................................... 22 Aplicaes da eletroforese nas tcnicas moleculares................................................................... 23 Aula nmero 4: Reao de polimerizao em cadeia (PCR).................................................................................... 28 Princpios da reao de PCR............................................................................................................... 28 Protocolo geral para PCR.................................................................................................................... 31 Fatores que influenciam na PCR......................................................................................................... 31 Escolha de iniciadores para PCR........................................................................................................ 35 Aula nmero 5: PCR no Diagnstico das Doenas genticas.................................................................................. 39 Polimorfismo e mutaes.................................................................................................................... 39 Diagnstico de alguns polimorfismos por PCR.................................................................................... 41 Polimorfismo de apolipoprotena......................................................................................................... 42 Polimorfismo de receptores da LDL..................................................................................................... 44 Aula nmero 6: PCR no diagnstico de Doenas infecto-contagiosas----------------------------------------------------------- 46 Meningites bacterianas------------------------------------------------------------------------------------------------------- 47 Tuberculose------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 50 Infeco pelo virus da Hepatite C------------------------------------------------------------------------------------------- 59 Infeco pelo virus HIV--------------------------------------------------------------------------------------------------------- 64 Aula nmero 7: PCR e RFLP na identificao de indivduos................................................................................... 68

APLICAO DA PCR EM LABORATRIO CLNICO E MEDICINA FORENSE

Aula nmero 1 Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata Prof. Assoc. Mario Hiroyuki Hirata

INTRODUO
Os avanos nos estudos da biologia molecular em eucariotos tem contribuido significantemente para

o entendimento da etiologia das doenas humanas. As tcnicas de recombinao dos cidos nucleicos tm permitido aos pesquisadores identificar os vrios genes responsveis por doenas hereditrias, avaliar os mecanismos de infeco dos microrganismos, conhecer os processos que regulam a diferenciao e proliferao celular (principalmente nos processos neoplsicos), entre outros. A biologia molecular vem tambm apresentando aplicao bastante expressiva na pesquisa de marcadores genticos teis no diagnstico laboratorial. Por outro lado, as diferenas nas sequncias do DNA, observadas entre as espcies ou entre os indivduos, so extremamente teis para as anlises forenses, os testes de paternidade, a identificao de antgenos de histo-compatibilidade, a identificao de allelos mutantes, a identificao de gneros e espcies de bactrias, fungos, leveduras, vrus e outros. Nesta apostila sero abordados os princpios bsicos de biologia molecular, bem como sero descritas as aplicaes da tcnica de PCR no diagnstico clnico e nos testes de identificao.

ESTRUTURA DOS CIDOS NUCLEICOS (DNA E RNA)

As informaes genticas so armazenadas nos cidos nucleicos. H dois tipos de cidos

nucleicos: cido desoxiribonucleico (DNA) e cido ribonucleico (RNA). O DNA encontrado principalmente nos cromossomos no ncleo das clulas, enquanto RNA est presente no citoplasma, havendo muito pouco nos cromossomos. Os cidos nucleicos consistem de cadeias de nucleotdeos. Cada nucleotdeo constituido por uma base nitrogenada, uma molcula de acar e um grupamento de fosfato (PO4=). H dois tipos de acar nos cidos nucleicos: 2-deoxiribose no DNA e ribose no RNA (Figura 1A). As bases nitrogenadas so as pirimidinas: citosina (C), timina (T) e uracila (U) e as purinas: adenina (A) e guanina (G). O DNA contm A, C, G e T, enquanto que o RNA contm U em vez de T. Em ambos DNA e RNA, os nucleotdeos esto ligados formando uma longa cadeia cadeia polinucleotdica. Essa cadeia formada por ligaes entre o grupo fosfato do carbono 5 de um nucleotdeo e o carbono 3 do acar do nucleotdeo adjacente (Figura 1B). Em geral, o RNA consiste de uma cadeia polinucleotdica simples, enquanto que o DNA composto de duas cadeias polinucleotdicas pareadas, dispostas em direo contraria, sendo denominadas antiparalelas (Figura 1B). As ligaes covalentes do esqueleto de acar-fosfato localizam-se na parte 3

externa da estrutura e as bases nitrogenadas esto projetadas para a parte interna. O arranjo das bases na molcula de DNA segue uma sequncia em que cada base de uma cadeia pareada com outra base na segunda cadeia, de modo que guanina em uma cadeia pareada com a citosina na outra cadeia e a adenina sempre pareia com a timina (Figura 1C). Dessa forma o DNA apresenta a estrutura tridimensional de dupla hlice, onde o ngulo e a distncia entre um nucleotdeo e outro sempre constante.

(A) 5 fosfato
C
5 4 2

(B) 3 hidroxila
O
H 2

H2 O

O
1

O H

O
P
C H 2

H 2

2-deoxiribose
C
5 4

H2 O

O
1

C
P

H 2

P
3 2

H 2

ribose
P

H 2

(C)
H
CH H N O
( p a r a a
3

H 2

C
P

H 2

O N

H H

N N H

N N

H H
a

N
N N O
a

O
N

N N
( p a r a

3 hidroxila
a c a d e ia )

5 fosfato

( p a r a

c a d e ia )

c a d e ia )

( p a r a

c a d e ia )

i m

i n

a A

i n

i t o

i n

aG

i n

Figura 1. Caractersticas estruturais das molculas dos cidos nucleicos. (A) Molcula do acar. (B) Representao diagramtica do arranjo antiparalelo das duas cadeias polinucleotdicas do DNA. P representa o grupo fosfato. (C) Pareamento da bases na molcula de DNA mostrando as pontes de hidrognio.

E. CHARGAFF, em 1951, verificou que na molcula de DNA a relao entre as purinas e pirimidinas era constante na maioria das espcies animais, ou seja, a quantidade da purina, adenina, igual a da pirimidina, timidina; da mesma forma, a quantidade da purina guanina igual da pirimidina citosina. Essa caracterstica importante definida pela propriedade fisico-qumica das molculas com formas semelhantes se atrairem mutuamente com significante afinidade (fora de atrao de Van Der Waals), somada fora de atrao entre os tomos de cargas opostas (ligaes inicas ou pontes de hidrognio). Essas propriedades so bastante especficas e no caso do DNA elas operam de forma conjunta e simultnea com significante energia de interao, como se fosse um molde perfeito. Em resumo, pode-se dizer que a lei de CHARGAFF se baseia na especificidade da interao das bases puricas e pirimidicas, onde a citosina pareia apenas com a guanina e a adenina pareia apenas com a timidina ou uracila. importante salientar 4

que a ligao entre a A e T ou U ocorre por interao de 2 pontes de hidrognio, enquanto que entre a C e a G a ligao se d por 3 pontes de hidrognio (ligao mais forte). outra (cadeia complementar). A estrutura secundria de dupla hlice (duplex) do DNA, descrita por Watson & Crick em 1953, est disposta linearmente. Entretanto, pode ser tambm circular como nas bactrias, plasmdeos e certos vrus, e pode ser tambm de fita simples como em alguns tipos de fagos. Entretanto, a disposio da molcula de DNA nos organismos superiores de particular importncia, onde a informao gentica est amplamente concentrada nos cromossomas dentro do ncleo. O comprimento total dos 46 cromossomas humanos tem menos que 0,5 mm, entretanto se extendido pode atingir muitos metros. Isto se deve a que o DNA compactado na forma super-enrolada em vrios nveis: primrio, duplex; secundrio, ao redor das proteinas ligadas ao DNA (histonas) formando os nucleossomos; tercirio, enrolado com os nucleossomas formando um cilindro ou estrutura solenoide; e finalmente quaternria, formando voltas ou loops. Esta disposio super-enrolada a forma natural do DNA. Devido a essa especificidade do pareamento entre as bases; a sequncia de uma das cadeias polinucleotdicas do DNA complementar a

Propriedades dos cidos nucleicos

Os cidos nucleicos podem ser dissociados e associados por processos fsicos e qumicos. Em condies fisiolgicas, a estrutura de dupla hlice do DNA bastante estvel. No entanto, se essa estrutura for submetida a alta temperatura (90C a 100C) ou a pH extremos (menor que 3,0 ou maior que 10,0), ela se separa em duas fitas simples, sofrendo o processo de dissociao, desnaturao ou melting. Da mesma forma, ao submeter-se essas fitas simples a condies de associao (temperatura a 65C, ou pH prximo de 7,0) por algumas horas, elas podem se reconstituir formando a dupla fita novamente, obedecendo a lei da complementariedade; ou seja a dupla fita somente se reassocia se as bases forem exatamente complementares. Esse fenmeno de associao tambm denominado de renaturao, hibridizao ou annealing. Esses processos de desnaturao e renaturao so essenciais para manipulao dos cidos nucleicos in vitro, principalmente do DNA, contribuindo enormemente para o isolamento, comparao e identificao desses compostos. Outra propriedade fsica muito importante dos cidos nucleicos a sua capacidade de absorver energia na regio do ultravioleta, apresentando o pico de absorbncia mxima em 260 nm. Esta propriedade til tanto para a quantificao quanto para avaliar a pureza dessas substncias.

REPLICAO, TRANSCRIO E TRADUO

Replicao
Toda vez que uma clula se divide, todo o seu contedo de DNA duplicado na ntegra, transmitindo em absoluto as informaes genticas contidas na clula precursora, esse processo denomina-se replicao. A replicao ocorrre de forma semi-conservativa, com as duas cadeias precursoras (DNA de dupla fita, dsDNA) servindo de molde para a sntese da nova cadeia (Figura 2). Dessa forma, para a 5

replicao ocorrer necessrio que dupla fita precursora se abra formando 2 cadeias independentes (fita simples, ssDNA). Esse um processo energeticamente desfavorvel e ocorre com a ao conjunta de uma proteina DNA-especfica e vrias enzimas; sendo as fitas simples precursoras replicadas, ento, de forma independente e separada. A replicao pode ter incio em vrios stios, mas cada origem de replicao utilizada uma vez, durante um simples ciclo celular. A fita filha sintetizada pela ao catalizadora da DNA polimerase III, enzima que utiliza como molde a cadeia precursora e incorpora os nucleotdeos de forma sequencial na nova cadeia, produzindo-a de acordo com a lei de pareamento das bases. Como essa polimerase sintetiza DNA na direo de 5' para 3', a sntese de uma das cadeias complementares realizada de forma contnua enquanto que a outra sintetizada discontinuamente. Os fragmentos da cadeia discontnua so ligados pela enzima DNA ligase. Muitas outras protenas esto envolvidas na estabilizao e manuteno da integridade das cadeias simples que so precursoras para a sntese da dupla fita, assim como no reconhecimento dos stios de iniciao. As DNA polimerases possuem tambm, alm da funo de sintetizar polinucleotdeos, atividade exonuclesica ou "a correo de leitura" na qual os nucleotdeos incorretamente incorporados so removidos. Essa propriedade fundamental para a manuteno a integridade da sequncia original.

Figura 2. Representao da molcula de DNA durante a replicao: as duas cadeias precursoras so separadas e as cadeias complementares que so sintetizadas.

Transcrio
A sntese protica no resultante da leitura direta da sequncia nucleotdica do DNA. Sabemos que o DNA est localizado no cromossoma do ncleo da clula e a sntese protica ocorre quase que na sua totalidade nos ribossomas, localizados no citoplasma. As informaes genticas contidas na sequncia nucleotdica do DNA tm que ser transferidas para uma molcula intermediria que pode mover-se para o citoplasma, o RNA mensageiro (mRNA), e que ordena, ento, a sntese da proteina. O processo de sntese de mRNA conhecido por transcrio e o tamanho da molcula de mRNA definido pela sequncia de aminocidos que o cido nucleico codifica. Apenas uma das fitas do DNA transcrita dando origem a uma nica sequncia de mRNA para cada gene. A indicao de qual fita do DNA deve ser transcrita orientada por uma sequncia especfica denominada promotor, localizada antes (upstream) da sequncia a ser transcrita, que reconhecida pela RNA polimerase (enzima sintetisadora de mRNA). Como a RNA polimerase adiciona sequencialmente 6

monofosfatos de ribonucleosdeo extremidade 3 da cadeia de RNA em crescimento, a polimerizao ocorre na direo 5 - 3. Isto significa que cada molcula de mRNA ser identica sequncia nucleotdica da fita de DNA que no transcrita. O mRNA transcrito transportado para os ribossomos (RNA ribossmico, rRNA) no citoplasma, onde ocorre a sntese protica. O material gentico de certos virus (retrovirus) o RNA e a informao gentica segue, portanto, a direo reversa (de RNA para DNA). Este processo conhecido por transcrio reversa, na qual a sintese de DNA dirigida pelo RNA e a enzima responsvel denominada transcriptase reversa. Essa enzima tem importante funo no ciclo vital dos retrovrus.

Traduo
A relao entre a sequncia de nucleotdeos do DNA e a sequncia de aminocidos da proteina correspondente denominada cdigo gentico. Esse cdigo universal e encontrado em todos os organismos vivos. O cdigo gentico lido em grupos de trs nucleotdeos, cada um codificando um aminocido (Tabela 1). Cada sequncia de trinucleotdeo denominada codon e a sequncia de condons que codifica um polipeptdeo especfico denominada cistron.

Tabela 1. O cdigo gentico

1a.base(5) U Phe Phe Leu Leu C Leu Leu Leu Leu A Isoleu Isoleu Isoleu Met* G Val Val Val Val * codon de iniciao U C Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Pro Treo Treo Treo Treo Ala Ala Ala Ala 2a. base A Tir Tir Terminao Terminao His His Glu Glu Asp Asp Lis Lis AcAsp AcAsp AcGlu AcGlu 3a.base (3) G Cis Cis Terminao Trip Arg Arg Arg Arg Ser Ser Arg Arg Gli Gli Gli Gli U C A G U C A G U C A G U C A G

O processo de decodificao pelo qual a informao gentica presente na molcula de mRNA dirige a sntese proteica denominado traduo. Esse processo envolve o mRNA, o rRNA e o RNA de transferncia ou tRNA, encontrado no citoplasma. Cada tRNA tem 70-90 nucleotdeos em comprimento e de fita simples, mas devido ao pareamento de bases dentro da molcula, adquire a forma de uma folha de trevo. Dentro dessa estrutura, um trinucleotdeo de sequncia varivel forma o anti-codon que pode parear com um codon da molcula de mRNA. Na outra extremidade da molcula de tRNA est uma sequncia para ligao a um aminocido especfico. Portanto, um codon particular no mRNA relacionado atravs de um 7

tRNA a um dado aminocido. Na traduo, o ribossoma liga-se primeiramente a um stio especfico na molcula de mRNA (codon de iniciao, ATG) que ajusta a fase de leitura ("reading frame"). O ribossoma, ento, se movimenta ao longo da molcula de mRNA, traduzindo um codon de cada vez usando tRNAs para adicionar aminocios ao final da cadeia polipeptdica em alongamento. A traduo finalizada quando o ribossoma reconhece na fita de mRNA o codon de terminao ("stop codon"). A direo da leitura de 5-3, sendo que a sequncia de nucleotdeos da fita de DNA corresponde sequncia de aminocidos da proteina traduzida na direo do N-terminal para o C-terminal. Em princpio as sequncias de bases nos cidos nucleicos devem ser traduzidas em qualquer fase de leitura diferente, dependendo onde o processo de decodificao se inicia. Para uma dada sequncia UUAGCAAAGCUGCGAAUG, as trs fases de leitura possveis so : UUA GCA AAG CUG CGA A UAG CAA AGC UGC GAA U AGC AAA GCU GCG AAU G Entretanto, o cdigo gentico no se sobrepe, pois a fase de leitura ditada pelas sequncias de iniciao e de terminao da traduo presentes na molcula de mRNA. A fase de leitura pode ser alterada por mutaes que removem ou inserem bases na sequncia nucleotdica. Esse tipo de alterao conhecido como descolamento de fase ("frameshift") e pode causar a perda total da funo da proteina produzida.

F x d ino m og n t ainr c lu r lu o a f r a e ic t a e la
R p a eTa s rc e lic o r n c i o d RA o N

Ta s r r n ci o

Rp a e lic o

DA N

RA N

Poe a r t in s Ta u r do

Ta s r r v r a r n ci o e es

ORGANIZAO DO GENOMA DE EUCARIOTOS, PROCARIOTOS E VIRAL

Estrutura Gnica
Os cromossomas constituem-se de uma longa e ininterrupta sequncia de nucleotdeos na qual esto dispostos muitos genes. O gene uma unidade de herana constituida por uma sequncia nucleotdeos que carrega as informaes necessrias para a sntese de um dado polipeptdeo. O gene uma entidade estvel mas pode sofrer mutaes, sendo que a nova forma do gene herdada de modo estvel, exatamente como a forma que lhe deu origem. Um gene pode existir em formas alternativas, denominadas alelos, que determinam a expresso de alguma caracterstica particular. Embora todos genes funcionais sejam transcritos, a maioria do DNA genmico no totalmente transcrito. A quantidade total de DNA nuclear no genoma haplide (gamtico) humano compreende 3 x 106 8

kb. Como a maioria dos genes tem 1 a 20 kb em comprimento, deveria haver 1 milho de genes, mas somente 3000 locos de doena foram identificados. Mesmo considerando todos os outros genes que conferem as caractersticas normais como altura e inteligncia, uma grande poro do DNA genmico no tem funo definida. Entretanto, mais e mais tem se observado que este DNA tem funes importantes, incluindo o controle de ao gnica. Genes que so responsveis pela sntese de enzimas especficas ou peptdeos so denominados de genes estruturais, enquanto que os genes reguladores modificam os efeitos dos genes estruturais.

Controle da expresso gnica

Nas clulas existem mecanismos moleculares que controlam o nmero e a quantidade das proteinas produzidas. As diferenas na sntese proteica resultam de sinais moleculares que controlam as taxas em que as molculas de mRNA so transcritas a partir do DNA (controle transcricional) ou traduzidas (controle traducional)

Processamento ps-transcricional do mRNA

A transcrio e a traduo nos procariotos so processos concomitantes mas nos eucariotos so processos temporal e espacialmente desconectados. Como vimos, nos eucariotos a transcrio ocorre no ncleo e a traduo no citoplasma. Durante a passagem do ncleo para o citoplasma, o mRNA transcrito (denominado pre-mRNA) deve ser processado para que seja obtido o mRNA maduro. Nos procariotos, a sequncia de nucleotdeos do gene colinear com a sequncia de aminocidos de uma dada protena, entretanto, nos eucariotos a sequncia codificante geralmente interrompida por sequncias adicionais. A maioria dos genes dos eucariotos so compostos por regies codificadoras denominadas exons e regies no-codificadoras denominadas introns. Estes introns so sequncias posteriormente removidas durante o processamento do transcrito primrio. Esse processo denominado processamento do RNA ou RNA splicing. Aps a remoo dos introns, a RNA polimerase II adiciona uma sequncia AAUAAA extremidade 3 do mRNA, conhecida como poli-A. A maioria dos mRNAs eucariticos possuem 100 a 200 resduos de adeninas ligadas extremidade 3', denominada cauda de poli-A, adicionada pela enzima poli-A polimerase. Antes que ocorra a remoo dos introns, o mRNA sofre a adio de resduos de 7-metilguanosina (Caps) na extremidade 5, denominada metilao Cap. Esse processamento sofrido pelo mRNA torna a molcula mais estvel e facilita o seu deslocamento para o citoplasma. Entretanto, mutaes que ocorrem nas regies de juno dos exons podem modificar o mRNA processado, produzindo um mRNA maduro que codifica para uma protena diferente da original. Alguns genes complexos tem molculas de mRNA muito grandes, que so processadas de diferentes formas para produzir diferentes mRNA maduros que so traduzidos em polipeptdeos diferentes. Esse processo denominado processamento alternativo (alternative splicing) e ocorre no mesmo tecido mas em diferentes estgios de desenvolvimento e diferenciao e pode tambm ocorrer em diferentes tecidos. 9

Estrutura gnica dos procariotos

Existem regies especficas no DNA, denominadas promotores que identificam o stio de incio da transcrio do RNA (regio na qual a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrio). Nos procariotos, os genes que codificam as enzimas pertencentes a uma mesma via metablica so adjacentes uns aos outros e agrupados ("cluster") ao longo do cromossomos junto com sequncias regulatrias. Este conjunto denominado operon, sendo que a sequncia que regula a expresso desses genes denominada operador. O operador encontra-se antes (upstream) da sequncia do promotor, nas posies de -35 a -10 antes do incio da sequencia codificante. Nos procariotos, a regulao destes operons obedece a condies nutricionais ou ambientais. O estmulo da expresso de uma enzima em resposta presena de um substrato particular denominada induo. A lactose, por exemplo, pode servir como fonte de carbono e energia para a Escherichia coli. O metabolismo deste substrato depende da hidrlise de seus componentes, glicose e galactose, pela enzima -galactosidase. A presena de lactose (indutor) induz a sntese de -galactosidase por ativao do operon da lactose (operon lac), aumentando a taxa de ligao da RNA polimerase ao DNA e a taxa de sntese do mRNA da -galactosidase. Na ausncia do indutor o operon reprimido pela ao do repressor. O repressor liga-se a uma sequncia especifica no operador, bloqueando a ligao da mRNA polimerase ao promotor, inibindo assim a sntese de mRNA que codifica para a galactosidase.

Estrutura gnica dos eucariotos

Os promotores dos eucariotos so elementos que sinalizam o stio onde a transcrio deve iniciar-se e, possivelmente, controlam o nvel de expresso do gene associado. Geralmente esto localizados cerca de 30 bases upstream do codon de iniciao (ATG) e ompreendemsquencias denominadas boxes ou motifs. As mais frequentes so as TATA, CAT e CG boxes. Alm dos promotores, os genes dos eucariotos possuem sequncias regulatrias adicionais conhecidas como amplificadores ("enhancers"), que podem estar muito distantes do promotor (antes ou depois, upstream ou downstream) e que potenciam a taxa de transcrio. importante salientar que estes amplificadores no so especficos e potenciam a transcrio de qualquer promotor que estiver na sua vizinhana. A eficincia da expresso de um gene em um tecido especfico depende da adequada combinao e integrao dos amplificadores, dos promotores e das sequencias adjacentes. O genoma dos eucariotos pode apresentam os pseudogenes que so replicas de genes ativos mas no produzem um produto reconhecvel, geralmente ocorrem devido a mutaes acumuladas no gene. Transposons so elementos genticos mveis que se deslocam de uma regio para outra do genoma e, enzimaticamente, se integram a estes locais. Desta forma, a localizao destes segmentos de DNA no genoma instvel. Estes transposons contm os genes que codificam para as enzimas necessrias sua insero e para remobilizao para outro stio. Geralmente, a insero de um transposon produz mutao ou rearranjo cromossmico varivel que abole a funo do gene que recebe esse elemento mvel. 1 0

Polimorfismo de DNA A anlise do DNA humano progrediu na medida em que se conheceu a variabilidade de sequncias entre os indivduos. Mini e microsatlites so sequncias curtas, repetidas consecutivamente, que esto distribuidas ao longo dos cromossomas humanos, representando cerca de 40% do DNA. Sua natureza repetitiva faz com que sejam instveis durante a replicao do DNA de gerao para gerao. A consequncia que o nmero de repeties dentro de uma sequncia varia largamente entre os indivduos. Em funo dessa variabilidade (polimorfismo de DNA), cada indivduo, exceto gmeos idnticos, ter um padro ou perfil de DNA pessoal (Fingerprinting). Esses perfis so usados para estabelecer a identidade dos indivduos em diversas situaes. As sequncias de microsatlites mais comuns no DNA humano so CA ou GT, dependendo de qual das fitas de DNA est sendo lida, pois h milhares dessas sequncias espalhadas no DNA humano. O tamanho da repetio pode ser muito varivel e pode fornecer excelentes marcadores genticos para estudar o comportamento fenotpido das famlias. A maioria dessas sequncias repetitivas no produz efeito deletrio, entretanto foi demonstrado que uma forma de retardo mental em homens, a sndrome do X frgil, causada pela expanso de um triplete (CGG) contendo 6 a 54 repeties. Verificou-se tambm que disturbios neurolgicos na distrofia miotnica e na doena de Huntington, esto associados a alteraes no tamanho dos microsattiles. Esta descoberta forneceu a base cientfica para o fenmeno de antecipao no qual os disturbios genticos tornam-se mais severos nas geraes subsequentes.

IMPORTNCIA DAS ENZIMAS NA BIOLOGIA MOLECULAR

Muitas enzimas que atuam na replicao e transcrio tem sido purificadas e a sua atividade

biolgica usada in vitro para reaes moleculares especficas diretas. A maioria dessas enzimas isolada de bactrias, fungos, leveduras ou virus. Essas enzimas so utilizadas das mais diversas formas, a saber: clonagem e amplificao de genes de interesse, preparo de sondas de cidos nucleicos, ensaios de hibridizao, entre outras aplicaes. As nucleases representam uma categoria de enzimas especficas de cidos nucleicos que hidrolizam as ligaes fosfo-diester dos polmeros de cidos nucleicos, uma de cada vez. As nucleases podem requerer um grupamento hidroxil terminal livre (exonucleases), com especificidade de 3' para 5', ou podem atuar somente em ligaes internas (endonucleases). As nucleases podem ser especficas para DNA ou RNA. As nucleases DNA-especficas podem catalizar apenas cadeias nicas (por exemplo, a S1 nuclease) ou cadeias duplas (DNAse I). As endonucleases de restrio so nucleases encontradas naturalmente em bactrias e so denominadas enzimas de restrio porque restringem sua atividade a DNA estranhos. O DNA do hospedeiro no atacado porque os stios vulnerveis a suas prprias enzimas so protegidos por um processo denominado metilao do DNA. Cada enzima designada de acordo com o organismo do qual derivada. A EcoRI, por exemplo, uma enzima obtida de Escherichia coli cepa R e foi a primeira enzima 1 1

desse tipo isolada. A maioria das enzimas de restrio reconhecem sequncias de 4, 5 ou 6 nucletdeos. Muito poucas reconhecem sequncias maiores. Algumas so denominadas isosquisomeros, por clivar em diferentes stios dentro de uma mesma sequncia (Ex. XmaI e SmaI) e por clivar o mesmo stio mesmo sendo obtidas de diferentes microorganismos (Ex. HindIII e HsuI). Outras enzimas reconhecem diferentes sequncias com o mesmo stio interno (Ex. BamHI e Sau3A). Para cada regio da molcula de DNA onde a sequncia especfica ocorre, a enzima de restrio corta ambas as cadeias de forma reprodutvel, formando extremidades assimtricas ou coesivas (stick-end) ou simtricas ou cegas (blunted-end). Estas enzimas so utilissmas para cortar duplas fitas de grande tamanho em fragmentos reprodutveis e para preparar DNA de diferentes fontes utilizado em procedimentos de clonagem. As Ligases, como a DNA-ligase usada durante a replicao, catalizam a formao de ligaes fosfodiester entre dois segmentos de cidos nucleicos. As DNA ligases requerem a presena de um molde complementar, no entanto, as RNA ligases no tem essa exigncia para o processamento do mRNA. As Polimerases catalizam a sntese do polmero de cido nucleico complementar usando uma cadeia precursora como molde. Essas enzimas so fundamentais para a clonagem e ampificao de genes. A Taq DNA polimerase, por exemplo, uma enzima extremamente til para a amplificao do DNA in vitro pela reao de polimerizao em cadeia (PCR). A transcriptase reversa, presente apenas nos retrovrus, cataliza a sntese de DNA a partir de moldes de RNA ou DNA. Essa enzima tem importante funo no ciclo vital dos vrus, mas pode ser usada in vitro para procedimentos de clonagem e para o preparo de sondas de DNA a partir de mRNA. A transcrio reversa constitui-se um mtodo til para produzir uma copia complementar de um gene (denominado cDNA) a partir do mRNA. Dessa forma, o genoma dos retrovirus pode ser identificado em amostras biolgicas utilizando esse mtodo..

Enzimas de restrio e suas aplicaes

Tecnologia de DNA recombinante Como vimos, as endonucleases de restrio so enzimas que clivam a molcula de DNA em stios sequncia-especficos. A especificidade de cada enzima proporcionou o desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante. Isto significa que fragmentos de DNA de tamanho reprodutvel podem ser produzidos e esses fragmentos contendo um gene particular, por exemplo, podem ser removidos do restante da molcula de DNA e ser inseridos em um DNA carreador, produzindo molculas de DNA recombinado biologicamente funcionais. Nos primeiros experimentos de recombinao foram utilizados os vetores plasmidiais para carrear fragmentos de DNA estranhos. Plasmideos so pequenos pedaos de DNA circular extracromossmicos que ocorrem naturalmente no citoplasma das bactrias e se replicam independentemente do DNA bacteriano hospedeiro. Utilizando uma endonuclease particular, o plasmdeo pode ser aberto e um fragmento de DNA estranho pode ser inserido, por ao de uma DNA ligase, produzindo um plasmdeo recombinate. Os plasmdeos fornecem veculos teis para carregar fragmentos de DNA ou genes e, quando transfectados em bactrias (usualmente Escherichia coli), podem produzir clones que ao serem replicados in vivo, produziro cpias mltiplas do fragmento de DNA incorporado. 1 2

Identificao de genes O DNA extrado de um fragmento de tecido, de leuccitos ou de clulas do lquido amnitico, contm milhares de genes, embora em algumas clulas muitos destes genes estejam desligados ou reprimidos e somente relativamente poucos estejam ativos. A identificao de um gene ou sequncia nucleotdica especifica em todo esse DNA pode ser realizada atravs do mtodo de Southern blot (E.M. Southern, 1975). Nesse mtodo, as enzimas de restrio so utilizadas para fragmenttar o DNA e os fragmentos resultantes so separados por eletroforese e identificados por hibridizao de cidos nucleicos, utilizando uma sequncia de nucleotdeos especfica (sonda gentica) que capaz de reconhecer o gene de interesse. Polimorfismo de restrio Em muitas doenas, o defeito gentico desconhecido e a produo de sondas gene-especficas muito difcil ou no possvel. Entretanto, o gene produtor da doena pode estar muito proximo (ligado) a um stio de reconhecimento de uma enzima de restrio particular. Sabe-se que variaes nas sequncias de DNA ocorrem aleatoriamente atravs do genoma inteiro e no esto associados a uma doena especfica. Estas variaes (alteraes de bases) resultam na perda de um stio de restrio existente ou de aquisio de um novo sitio. Tais alteraes nas sequncias de DNA significam que os fragmentos, produzidos por uma enzima de restrio particular, tero diferentes comprimentos entre diferentes indivduos e podem ser reconhecidos por suas mobilidades em eletroforese. Eles so denominados polimorfismos de tamanho de fragmento de restrio (RFLP) e so herdados como caractersticas genticas simples obedecendo as leis mendelianas de herana. Se for demonstrado, em estudos de famlias, que um gene produtor de doena est ligado a um RFLP, este pode, ento, fornecer um meio de detectar o gene defeituoso sem efetivamente conhece-lo. Literatura recomendada Emery, A.E. An Introduction to Recombinant DNA in Medicine, 2a. Ed., 1995, A.E.H Emery & S. Malcon, eds., Johon Wiley & Sons Ltda, Chichester, England, 206 pg. Lewin, B. Genes V., B. Lewin, ed., 1994, Oxford University Press, New York, USA, 1272 pg. Strachan, T. Human molecular Genetics. T. Strachan & A.P.Read, eds., 1996, Bios Scientific Publications Ltd., Oxford, UK, 596 pg. Watson, J. Recombinant DNA, 2a. Ed., J. Watson, M. Gilman, J. Witkowrk, M. Zoller, 1992, Scientific American Inc., New York, USA, 626 pg.

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 Aula nmero 2

EXTRAO DE DNA GENMICO

Profa.Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata Marcos de Oliveira Machado

INTRODUO
O potencial de aplicaes das tcnicas de DNA recombinante em laboratrios de Bioqumica Clnica

esto se tornando altamente evidentes, especialmente para a anlise do diagnstico das vrias doenas genticas e de outras mais. Correntemente, as anlises de DNA para o diagnstico esto disponveis somente para algumas desordens genticas, mas o campo de estudo est rapidamente se expandindo e novas anlises esto sendo desenvolvidas. A maioria dos testes de DNA para o diagnstico envolve a extrao de DNA dos leuccitos humanos. Tradicionalmente essas tcnicas de extrao consomem muito tempo e possuem procedimentos pouco eficientes. A maioria dos mtodos populares para esse fim, envolve digesto com proteinase K, que leva aproximadamente dois dias, e requer um grande volume de sangue (1015 ml), ou utilizam solventes orgnicos como o fenol, clorofrmio e lcool isoamlico, os quais so altamente txicos. Embora esses mtodos consigam recuperar o DNA de alto peso molecular de uma grande variedade de amostras, eles requerem muitos passos e podem incluir a transferncia dos extratos de DNA para recipientes adicionais ou procedimentos de lavagem do material utilizando vrios filtros comerciais ou colunas. Estes passos adicionais permitem o aumento das oportunidades de transferncia cruzadas de amostras ou a introduo de contaminantes. Tais tcnicas no so bem apropriadas para o uso na rotina dos laboratrios clnicos. Portanto, um mtodo simples, rpido e econmico necessrio para a introduo das anlises de DNA nos laboratrios de Bioqumica Clnica. Os estudos de ligao gentica utilizando a tcnica de polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrio (RFLP), a reao em cadeia da polimerase (PCR), a tcnica de transferncia de DNA (Southern blot), e outras, necessitam que o DNA extrado esteja em boas condies de uso; ou esteja livre de contaminantes e interferentes que possam prejudicar a reao. O uso da tcnica de precipitao salina para a extrao de DNA utilizando como detergente o Triton X-100, evita o uso dos perigosos solventes orgnicos e o alto custo e demorada digesto da proteinase K. Esta tcnica envolve a desidratao e precipitao das protenas celulares com soluo de cloreto de sdio concentrada. O DNA extrado fica livre de RNA, de protenas e da degradao de enzimas. A quantidade e a qualidade do DNA extrado muito boa comparada com as outras tcnicas de extrao. O DNA apropiado para as tcnicas de biologia molecular, como as que utilizam o PCR e a digesto com enzimas de restrio.

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PREPARAO E ANLISE DE CIDOS NUCLEICOS

Os mtodos de isolamento e purificao dos cidos nucleicos consistem de trs etapas: (1) lise das

clulas e solubilizao do DNA ou RNA; (2) mdodo enzimtico ou qumico para remover as protenas contaminantes e outras macromolculas; e (3) precipitao alcolica para isolamento do DNA. Os protocolos bsicos geralmente so aplicveis a um ampla variedade de materiais.

1. Isolamento de DNA genmico de tecidos e clulas:

O mtodo bsico compreende a ruptura do tecido com um homogeinizador, a lise celular com o detergente inico SDS, extrao fenlica das proteinas e precipitao etanlica do DNA. Este mtodo til para preparao de DNA genmico de muitas amostras de tecido ou de linhagens celulares, com um mnimo de consumo de tempo e trabalho. O DNA genmico produzido adequado para amplificao por PCR ou para a disgesto com enzimas de restrio e anlise de transferncia de DNA. Uma quantidade substancial de RNA acompanha o DNA genmico, o que dificulta a quantificao por espectroscopia no UV. Algumas amostras de DNA no amplificam bem por PCR ou no so completamente digeridas com enzimas de restrico e devem, portanto, ser reextraidas. Outro mtodo compreende a solubilizao dos tecidos ou clulas com SDS, que inativa as DNAses endgenas. A proteinase K usada para digerir as proteinas celulares, seguida de digesto com Rnase para remover a maioria do RNA celular. O isolamento do DNA segue basicamente o princpio anterior. Este mtodo adequado para extrair DNA genmico para anlise de DNA por Southern blot ou construo de bibliotecas genmicas. Porm no adequado para extrair DNA de tecidos pois no h etapa de ruptura do tecido conectivo.. O protocolo mais adequado rotina laboratorial para avaliao de polimorfismos e mutaes genticas compreende a lise celular com SDS, remoo das proteinas por precipitao com cloreto de sdio concentrado (salting-out) e isolamento do DNA genmico por precipitao etanlica.

2. Isolamento de RNA de clulas ou de amostras biolgicas

A maioria dos procedimentos de purificao e concentrao de RNA so semelhantes aos utilizados na purificao de DNA, exceto que 2,5 volumes de etanol devem ser usados rotineiramente para precipitao do RNA. essencial que toda gua usada diretamente ou nos tampes seja tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) para inativar as RNases. O mtodo mais adequado para preparar RNA de boa qualidade envolve a solubilizao simultanea do tecido ou clulas e inativao de Rnases endgenas na presena de isotiocianato de guanidina, com subsequente separao do RNA do DNA e das protenas por ultracentrifugao em gradiente de cloreto de csio. Dois outros mtodos que no requerem ultracentrifugao podem se utilizados: (1) lise com detergente no-inico para proporcionar um mtodo rpido para preparao de amostras de RNA citoplasmtico e (2) lise celular com isotiocianato de guanidina, remoo das proteinas pela extrao fenlica em pH cido, seguida de precipitao do RNA. O segundo mtodo frequentemente utilizado para isolamento de genoma dos virus RNA a partir de amostras biolgicas

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Outros mtodos de isolamento e identificao do RNA podem ser : (1) isolamento do mRNA por cromatografia com oligo-dT celulose; (2) separao eletrofortica do RNA em gel de agarose contendo formaldeido para deteco e quantificao de espcies especficas de RNA por Northern blotting e hibridizao; entre outros.

3. Isolamento de DNA genmico de bactrias

As bactrias de uma cultura lquida saturada so lisadas e as proteinas removidas por digesto com proteinase K. Os debris de parede celular, polissacardeos e as proteinas remanescentes so removidas pela extrao fenlica e o DNA genmico recuperado do sobrenadante resultante pela precipitaao com etanol.

PURIFICAO E CONCENTRAO DE DNA DE SOLUES AQUOSAS

Os procedimentos de isolamento de dsDNA e ssDNA a partir solues aquosas so teis quando

proteinas ou solutos necessitam ser removidos, ou quando solues de DNA necessitam ser concentradas. O protocolo bsico apropriado para purificao de DNA a 1 mg/mL a partir de volumes menores que 0,4 ml.

1. Extrao fenlica e precipitao etanlica

Um dos mtodos mais teis e usados para isolamento e concentrao de cidos nucleicos de solues aquosas a extrao com fenol/clorofrmio seguida de precipitao com etanol. Durante a extrao orgnica, as proteinas contaminantes so denaturadas e mantidas na fase orgnica ou na interface entre as fases orgnica e aquosa, enquanto que os cidos nucleicos permanecem na fase aquosa. O fenol usado nesse protocolo deve ser tamponado para prevenir que os produtos oxidados presentes no fenol danifiquem os cidos nucleicos. Alcool amlico frequentemente adicionado mistura fenol/clorofrmio quando ocorre a formao excessiva de espuma durante a extrao. Durante a precipitao com etanol, os sais e outros solutos como os resduos da extrao fenol/clorofrmio permanecem em soluo enquanto os cidos nucleicos formam um precipitado que pode ser facilmente separado por centrifugao. Na presena de altas concentraes de ctions monovalentes (0,1 a 0,5 M), o etanol induz uma transio estrutural nas molculas de cido nucleico promovendo a agregao e precipitao das mesmas. Entretanto, como vrios sais e pequenas molculas orgnicas so solveis em etanol a 70%, a precipitao etanlica e lavagem do sedimento elimina os sais no DNA. Embora cloreto de sdio, acetado de sdio, e acetato de amonio sejam capazes de induzir a precipitao, mais difcil remover cloreto de sdio devido a sua baixa solubilidade em etanol a 70%. O sal recomentado para a maioria das aplicaes de rotina deste mtodo o acetato de sdio a 0,3 M (concentrao final), que mais solvel em etanol que cloreto de sdio a 0,3 M e, portanto, menos facilmente precipitvel com a amostra de cido nucleico. Para amostras contendo dodecil sulfato de sdio (SDS), o sal recomendado cloreto de sdio 0.2 M, pois o SDS solvel em etanol nessas condies. Solues de DNA diludas: quando solues de DNA esto diluidas (< 10 g/mL) ou quando menos que 1 g de DNA est presente, deve-se aumentar a proporo de etanol para o volume aquoso (3:1) e aumentar o tempo de precipitao (4 a 16 horas), incubando-se a -20oC (ou em gelo seco). A centrifugao

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para separao do DNA precipitado deve ser feita a baixa temperatura para assegurar o mximo de recuperao do DNA dessas solues. Pequenas quantidades de DNA (nanogramas): pode-se utilizar um cido nucleico carreador, como o tRNA de E. coli, levedura ou fgado bovino, em concentraes de 10 g/mL. Nessa condio o DNA coprecipitado com o tRNA. O tRNA no interfere com a maioria das reaes enzimticas, mas ser eficientemente fosforilado pela T4 polinucleotdeo quinase e no poder ser usado se esta enzima for usada em marcaes subsequentes. Recuperao de pequenas quantidades de fragmentos curtos de DNA e oligonucleotdeos pode ser aumentada pela adio de cloreto de magnsio a uma concentrao inferior a 10 mM antes da adio do etanol. Entretanto, o DNA precipitado de solues mais concentradas que 10 mM de ons magnsio ou fosfato so dificeis de dissolver e devem ser dulidas antes da precipitao com etanol. Se a amostra de DNA est em baixa concentrao em um grande volume, o volume pode ser reduzido pela extrao repetida com sec-butanol (2-butanol). Cabe lembrar que apenas a gua removida com essa extrao, todos os solutos e sais so concentrados com os cidos nucleicos. Aps essa etapa, o cido nucleico deve ser extraido com fenol/clorofrmio e precipitado com etanol. DNA em grandes volumes aquosos: a extrao pode ser simplesmente ampliada usando o mesmo procedimento. (tubos de poliestireno no resistem a mistura fenol/clorofrmio). As etapas de centrifugao temperatura ambiente no podem exceder velocidades de 2500 rpm (1200 x g), pro 5 minutos. O precipitado etanlico deve ser centrifugado em um tubo Corning de parede reforada por 15 minutos em fotor de angulo fixo a 10.000 rpm (8000 x g), a 4oC. Tubos de vidro devem ser siliconizados para facilitar a recuperao de pequenas quantidades de DNA (< 10g). Remoo de oligonucleotdeos e trifosfatos: Pequenos oligonucleotdeos (< 30 bp) e nucleotdeos no incorporados usados na marcao ou outras reaes de modificao do DNA podem ser efetivamente removidos das solues contendo DNA por duas etapas de precipitao com etanol na presena de acetato de amonia. Este procedimento no suficiente para remover completamente grandes quantidades de ligadores (linkers) utilizados nos procedimentos de clonagem. Acetato de amonia no recomendvel se a amostra de cido nucleico for fosforilada na extremidade 5 pela T4 quinase ou na extremidade 3 com a transferase terminal, pois os ons de amonio tesiduais inibem essas duas enzimas. Variaes do procedimento de precipitao: O isopropanol pode substituir o etanol, quando se deseja manter mnimo o volume dos cidos nucleicos precipitados. O isopropanol menos voltil que o etanol e , portanto, mais difcil de remover por evaporao. Alguns sais so menos solveis em para eliminar isopropanol, e podem ser precipitados com os cidos nucleicos. recomendado que a precipitao com isopropanol seja seguida imediatamente por uma precipitao onvencional com etanol isopopropanol residual e o sal. Alternativamente, cloreto de ltio pode ser usado como o sal de precipitao, pois o cloreto de ltio muito mais solvel no etanol e o precipitado resultante relativamente isento de sal. Cloreto de ltio deve ser evitado, entretanto, se o precipitado de RNA for usado como molde para a transcrio reversa aps precipitao. Grandes mRNA e rRNA podem ser purificados de dsDNS e pequenos RNAs (tRNA e 5S RNA) por duas etapas de precipitao seletiva com cloreto de ltio na ausencia de alcool, seguida de uma precipitao convencional com etanol.

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Solues concentradas de cidos nucleicos: se a concentrao de cidos nucleicos muito alta ( > 300 g/mL), um precipitado pode-se formar sem resfriamento durante a precipitao etanlica. Se um precipitado visvel formado, no necessrio esfriar a amostra ou aguardar algum tempo antes de separar o precipitado por centrifugao.

2. Fracionamento dos cidos nucleicos

Geralmente todos os protocolo em biologia molecular requerem, em alguma etapa, o fracionamento dos cidos nculeicos. Tcnicas cromatogrficas so apropriadas para algumas aplicaes e podem ser usados para separao dos plasmdeos do DNA genmico, bem como separao de DNA genmico dos debris no lisado celular. A eletroforese, entretanto, tem muito mais resoluo que mtodos alternativos e geralmente o mtodo de fracionamento de escolha. As separaes eletroforticas podem ser analticas ou preparativas e podem envolver fragmentos com peso moleuclar variando de menos que 100 Da a mais que 108 Da. Uma variedade de sistemas eletroforticos foram desenvolvidos para acomodar essa ampla faixa de variao. Alm disso, um fragmento individual pode ser identificado por tecnica de hibridizao aps a separarao eletrofortica de uma mistura complexa (Southern blot). Este mtodo tem contribuido grandemente para ao mapeamento e identificao de sequencias de cpia nica ou mltipla em genomas complexos, e facilitado os experimentos iniciais de clonagem de DNA eucarioto.

3. Purificao e isolamento de DNA

Os protocolos utilizados para purificao de DNA so geralmente divididos em trs categorias: (1) eluio do DNA de um gel de agarose por dilise, (2) dissoluo do gel de agarose e recuperao do DNA por ligao a partculas de vidro, e (3) eluio pelo aquecimento da agarose de baixo ponto de fuso a 70 oC, e recuperao do DNA pela extrao fenlica e precipitao etanlica ou usando uma matrix que liga especificamente o fragmento de DNA. Atualmente, h vrios sistemas de purificao de fragmentos de DNA no mercado. Esses sistemas diferem no tamanho e o tipo de cido nucleico que pode ser eficientemente isolado; nos efeitos dos sais, dos solventes orgnicos e de outras substncias na eficincia de ligao da matriz; e no tipo de solvente que usado para eluir o oligonucletdeo ou o polinucleotdeo da matriz. Matriz de slica (vidro) - na presena de iodeto de sdio, DNA e RNA ligam-se seletivamente matriz de slica. Outras substncias presentes (sais, solventes, nucleotdeos, proteinas, nucleotdeos etc) so lavados com uma soluo de etanol tamponada. O polinucleotdeo ligado eluido em um reduzido volume de tampo Tris-EDTA (TE) ou gua. Resina de purificao - uma resina de purificao com propriedades similares aos sistemas de matriz de slica (Magic1, Promega). Esta matriz liga polinucleotdeos de dupla fita mais eficientemente que os de fita simples, e pouco eficientemente os RNAs pequenos (tRNA), DNA de dupla fita de menos que 220 bp ou oligonucleotdeos. Adsoro - um sistema de purificao de cidos nucleicos, que contm um adsorvente estvel (NENSORB 20, DuPont-NEN) que liga quantitativamente proteinas, RNA e DNA, incluindo oligonucleotdeos contendo menos que 12 resduos. A ligao no afetada por altas concentaes de sais, ureia, ou outras substncias, mas inibida por alguns solventes orgnicos. O material no ligado removido com gua e o DNA ou RNA (mas no proteinas) quantitativamente eluido com um solvente alcolico. 1 8

Gel filtrao - os cidos nucleicos podem ser purificados, separados e fracionados usando colunas de gel filtrao ou colunas de centrifugao (spin columns).

QUANTIFICAO DOS CIDOS NUCLEICOS

A concentrao de DNA ou RNA pode ser estimada por espectrofotometria de absoro no UV ou a

concentrao de DNA pode ser realizada por espectroscopia de fluorescencia. Cubetas de quartzo devem ser utilizadas para a espectrofotometria no UV, enquanto que as de plstico ou vidro podem ser usadas para a regio do visvel. Um mtodo alternativo o mtodo de placa de brometo de etdio agarose. . Literatura recomendada Davis, L.G. Basic Methods in Molecular Biology. 2a. Ed., L.G. Davis, W. M. Kuehl, J.F. Battey, Eds. 1994, Appleton & Lange, Norwalk, CN, USA, 777 p. Ausubel, F.M. Short Protocols in Molecular Biology, 2nd ed., F.M. Ausubel, Ed.; Green Publising Associates and John Wiley & Sons, 1992, New York, NY. Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratorial manual. J. Sambrook, E.F. Fritsch & T. Maniats, 3 volumes, 2nd ed., 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY.

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 Aula nmero 3

PRINCPIOS DE ELETROFORESE
Prof. Assoc. Mario Hiroyuki Hirata Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata

INTRODUO
Eletroforese uma tcnica de separao que envolve o movimento de partculas com cargas em

soluo, sob ao de um campo eltrico. Portanto, qualquer partcula ou molcula carregada pode se mover nessas condies, e consequentemente podem ser separadas, desde que tenham diferentes cargas. A separao eletrofortica das partculas pode ser realizada em meio lquido(eletroforese livre de Tisellius) ou em um suporte inerte. A carga eletrica aplicada sob a soluo realizada atravs de eletrodos que so colocadas na soluo. Um ion migra atravs da soluo na direo ao eletrodo de carga oposta. Portanto, uma partcula carregada positivamente(catiosn) migra para o polo negativo (catodo), enquanto as partculas negativas(anions) migram para o polo positivo(anodo).

PRINCPIOS BSICOS DA ELETROFORESE

Terminologia:
nion: partcula carregada negativamente ou on ction: partcula carregada positivamente tampo: Uma mistura de substncias que doam e aceitam proton com a funo de manter a concentrao do proton (pH) constante ou dentro de um valor prximo. Um tampo pode ser feito com uma mistura de um cido fraco com o respectivo sal. Ex: cido actico e acetato de sdio. Condutividade: a propriedade de uma substncia conduzir a corrente eltrica. Numa soluo inica, a soma do produto da concentrao da carga e a mobilidade da mesma. eletrodos: substncias em contato com um condutor. A substncia esto conectadas a fonte eltrica. Fonte eltrica: Equipamento que transforma corrente alternada em corrente contnua, que possa ser a tenso eltrica (em Volts), a corrente controlada por um potenciometro, que permite variar a tenso, a corrente, a carga eltrica que se quer aplicar no sistema. Esse equipamento, pode medir eltrica(Amperagem), e a potncia eltrica (Watts). eletro-osmose; tendncia da soluo se mover em relao a uma substncias estacionria adjacente, quando uma diferena de potencial aplicada. fora inica: a soma da concentrao de todos ions na soluo, medido pelo quadrado de suas cargas. mobilidade: a velocidade de uma partcula ou ion que dado pela voltagem aplicada. Uma medida relativa de quanto rpido um ions se movimenta em um campo eltrico. 2 0

Mobilidade efetiva: A real mobilidade de uma substncia sob certas condies. Geralmente menor que a mobilidade devido a menor carga, ou resistncia do suporte ou meio. poder de resoluo: E a habilidade de separar substncias que migram muito prximas. gel: uma malha de fibras, ou de polmeros que slida, mas retm uma grande quantidade de solventes nos poros ou nos canais internos das malhas.

FATORES QUE INFLUENCIAM NA SEPARAO E MOBILIDADE ELETROFORTICA

A aplicao de um campo eltrico a uma soluo que contm partculas carregadas pode separ-los. A separao depende de vrios fatores que influenciam e que podem ser resumidas em: Fora aplicada nas partculas (voltagem), carga da partcula, pH do meio, condutividade do meio, resistncia da matrix, conformao da partcula, fora inica do meio, temperatura, eletroendosmose, etc 1. Fora na partcula A fora exercida em uma partcula carregada depende do campo eltrico, voltagem ou volts por centmetro, e a carga da partcula, Q. A fora sob a partcula carregada o produto:

Feletrica=QV
A fora eltrica, Feletrica, quando exercida na partcula, causar o seu movimento. No entanto, o movimento da partcula no solvente ser tambm influenciado pela resistncia, devido a viscosidade, a resistncia, a qual exerce uma fora proporcional a velocidade:

Fresistncia= fv
A constante de proporcionalidade, f chamada de coeficiente de frico (medida de resistncia de uma partcula oferece quando em movimento em um solvente). 2. Coeficiente de frico depende da viscosidade do solvente e do tamanho, e forma da partcula Quanto maior a viscosidade, menor o movimento. Quanto maior ou mais assimtrica a partcula, menor seu movimento atravs do solvente. O coeficiente de frico de uma grande partcula tais como proteinas uma propriedade caracterstica de cada elemento. 3. Mobilidade da partcula Quando um campo eltrico aplicado em uma partcula carregada, ela inicia a migrao. A fora eletrofortica e a fricional se ope uma a outra, e a velocidade dessa aumenta at as foras se igualarem (Feletrico = Fresistencia ). A velocidade, v, que uma particula alcana em um campo eltrico, V, determinado por duas propriedades das partculas - sua carga e seu coeficiente de frico. Consequentemente, o valor de v/V tambm uma propriedade caracterstica das partculas e importante o suficiente para receber o seu prprio nome: mobilidade. 4. Efeito do pH do meio 2 1

Cada on possui sua carga e mobilidade muito particular. No entanto, quando a soluo contm uma substncia a qual o pK prximo do pH do meio, esta substncia ocorre em ambas as formas: a carregada e a no carregada. A frao com uma carga ser dependente do pK da substncia e o pH da soluo. Quando o pH igual ao pK de um cido fraco, somente 50% das partculas estaro carregadas. Uma unidade de pH abaixo da pKa, 90% das partculas estaro sob a forma carregada. Desde que a carga efetiva de uma substncia varia com o pH, a sua mobilidade efetiva tambm varia com o pH. O pH da soluo escolhido de tal forma, que a partcula a ser separada pela eletroforese, se mantenha em um estado mximo de carga, para sua mxima separao. Os tampes so substncias inicas por si, portanto, exercem a funo de manterem o pH o mais prximo possvel da ideal e fazem parte do processo. 5. Condutividade e movimento dos ons Em qualquer sistema eltrico, a corrente produzida proporcional a voltagem aplicada;

V = resistncia X Corrente

ou

V =

corrente___ condutividade

Na eletroforese, a corrente um fluxo de ons(em ambas direes). A condutividade a soma das concentraes multiplicado pela mobilidade efetiva de todos os ions presentes. Um on com maior mobilidade efetiva carreia uma maior frao da corrente A voltagem, condutividade, e a corrente portanto esto todos relacionados. Se a condutividade est aumentada pelo aumento da concentrao salina a corrente se mantm constante, a voltagem deve decrescer. Se decresce a voltagem reduz a fora eltrica, Feletrica, nas partculas carregadas, diminuindo o movimento das macromolculas. O aumento do tempo seria necessrio para uma separao, e a resoluo diminui devido ao aumento da difuso. Se a condutividade est aumentada numa voltagem fixa, a corrente deve aumentar, portanto aumentando o calor eltrico gerado pelo sistema, desde que o aquecimento proporcional ao quadrado da corrente. O excesso do aquecimento produz distrbios convectivo nas solues, a qual distorce o padro eletrofortico e pode tambm desnaturar as macromolculas. Desde que o aumento da condutividade mesmo em voltagem fixa ou corrente tenha efeito deletrio, resultados timos podem ocorrer quando se conserva a concentrao dos ions e portanto a condutividade em valores moderados. 6. Carga e conformao Como j se discutiu, o que determina a migrao eletrofortica a carga da partcula que se quer separar. Muitas vezes, a distribuio das cargas no esto desvinculadas a sua conformao estrica, portanto, pode-se alterar a carga de uma partcula dependendo de sua conformao, principalmente em se tratando de macromolculas. As macromolculas, em seu estado relaxado, tendem a apresentar alguns eletrlitos ligados fortemente, portanto levando a uma alterao na sua mobilidade. 7. Atmosfera inica e o potencial zeta Contra-ons, ou ons de carga oposta, naturalmente tendem a circundar prximos a grupos carregados das macromolculas. No entanto, eles no chegam a neutralizar as cargas das macromolcuals mas, por sua vez esto localizados prximos dos grupos carregados das macromolculas, formando uma dupla camada de carga em torno dessas, denominadas de atmosfera inica. 2 2

As macromolculas movem-se com a camada de hidratao e com os contra ions. Esses reduzem a carga efetiva das macromolculas, a um nvel dado pelo potencial zeta. Esse potencial significa a energia produzida pela carga efetiva das macromolculas na superfcie de contato, que a regio limite do complexo macromolecular na soluo e o material que o est envolvendo. 8. Suportes A grande meta da eletroforese a separao de uma mistura heterognea de substncias inicas seja ela macromolculas ou ons simples, em zonas completamente identificveis. Os suporte devem permitir a penetrao do material a ser separado o mximo possvel e ainda delimitar o fluxo de volume (eletroforese convencional). A maioria dos suportes oferecem esse princpio determinando o tamanho do poro para o movimento eletrofortico das macromolculas. O tubo capilar tambm exerce esse efeito. 9. Eletroendosmose O suporte no deve interagir com as molculas a ser separadas, isso poderia impedir ou inibir a separao. Uma interao comum que pode ocorrer, no a adsoro usual do material. Mais comumente o efeito dos grupos carregados que esto ligados ao suporte, que resulta em eletro-endosmose. Como exemplo tpico temos o suporte gar, que muito utilizado na eletroforese. O gar uma mistura de agarose e agaropectina. A agaropectina tem um nmero relativamente grande de grupos carboxil, que em pH neutro tem contra-ons. Se o campo eltrico for aplicado, os contra-ons iro se mover, mas o grupo carboxil ligados a matrix (agar) no migraro. Os contra-ons carreia solvente o suficiente para que produza um fluxo significativo nesta direo, esse fenomeno denomina-se de eletro-osmose, que as vezes denominado de endosmose.

TIPOS DE SUPORTE

Os tipo de suporte podem variar desde uma soluo de sacarose at em substncia pouco solveis como fibras de celulose. Os suportes de meio contnuo mais comuns so: agar, agarose, poliacrilamida e amido. A porosidade ou a mdia do tamanho do poro em alguns suportes fixo. Entretanto, em alguns suportes podem ser controlados. Como exemplo, a mudana da concentrao do gel de agarose, agar e amido, pode mudar o tamanho do poro. O tamanho dos poros do gel de poliacrilamida mais utilizados para macromolculas est em torno de 5% a 10%, que separam protenas de 15.000 a 250.000 Daltons. Esse tipo de suporte separa tanto pelo tamanho do poro como por carga eltrica.

TIPOS DE ELETROFORESE.

a. Dependendo da matrix Eletroforese livre de Tiselius Eletroforese em acetato de celulose Eletroforese em gel de agar Eletroforese em gel de agarose Eletroforese capilar

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b. pH de separao pH cido pH neutro pH alcalino

APLICAES DA ELETROFORESE NAS TCNICAS MOLECULARES

1. Gel de Agarose
Um dos mtodos eletroforticos mais comuns utilizados na prtica diria em biologia molecular a de gel em agarose. Essa tcnica muito simples, rpida, prtica e apresenta boa resoluo na separao dos fragmentos de DNA, se comparados com outras bem mais demoradas como a separao por ultracentrifugao em gradiente de densidade de sacarose. Uma boa separao eletrofortica do DNA utilizando gel de agarose depende de vrios fatores: 1.1. Tamanho molecular do DNA. As molculas lineares, dupla fita de DNA migram inversamente proporcional ao log10 do peso molecular atravs do gel de agarose. 1.2. concentrao da agarose. O fragmento do DNA migra em diferentes proporo atravs do gel contendo diferentes concentrao da agarose. Existe uma relao linear entre a mobilidade logaritimica do DNA e a concentrao do gel que baseada numa equao matemtica(Helling e cols , 1974) figura 1. Log=logo- Kr Onde o a mobilidade eletrofortica livre e Kr o coeficiente de retardamento, = a constante que relacionada as propriedades do gel e o tamanho e a forma da molcula em migrao. Baseada nessa correlao podemos separar vrias molculas de DNA (de variado tamanho) nas diferentes concentraes de agarose. Porcentagem de agarose 0,3% 0,6% 0,7% 0,9% 1,2% 1,5% 2,0% intervalo da efficincia da separao da molcula de DNA em Kb 5 a 60 1 a 20 0,8 a 10 0,5 a 7 0,4 a 6 0,2 a 4 0,1 a 3

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1.3. Conformao do DNA A forma circular (forma I), forma circular contorcida(forma II) e forma linear (forma III) do DNA com a mesmo peso molecular migra atravs do gel de agarose em diferentes posies (Thorne, 1966, 1967). A mobilidade relativa das 3 formas so dependentes primariamente da concentrao do gel, mas so tambm influenciados pela corrente aplicada, fora inica do tampo e da densidade superhelicoidal da toro na forma I do DNA (Johnsom and Grossman , 1977). Em algumas condioes, a forma I do DNA migra mais rpido que a forma III, em outras condies pode ser de ordem inversa. Um mtodo geral para identificar as diferentes conformaes do DNA utilizar na corrida eletrofortica em agarose diferentes concentraes de brometo de etdio(concentrao crescente). Quanto mais brometo de etidio mais se liga ao DNA. As tores superhelicoidal negativas da a forma I do DNA vo sendo progressivamente removida e seu ndice de migrao diminui. Numa concentraao crtica do corante livre, onde no permanece a forma superhelicoidal, o ndice de migrao da forma I do DNA esta no seu mnimo valor. Se ainda mais brometo de etdio for adicionado, tores superhelicoidais positivas so gerados e a mobilidade da forma I do DNA aumenta rapidamente. Simultaneamente, as mobilidades das formas II e formas III do DNA so diferentemente diminuidas como consequncia da neutralizao da carga e da maior tenacidade dada ao DNA pelo brometo de etdio. Para a maioria das formas I de DNA, a concentrao critica do brometo de etdio livre de 0,1 a 0,5 g/ml A corre nte aplicada: A baixa voltagem, a razo da migrao dos fragmentos de DNA linear proporcional a da voltagem aplicada. Entretanto, a medida que a carga eltrica aumenta, a mobilidade dos fragmentos de DNA de alto peso molecular aumenta diferentemente. Dessa maneira o intervalo efetivo da separao do gel de agarose decresce a medida que a voltagem aumenta. Para obter a mxima resoluo dos fragmentos de DNA, o gel deve ser submetido a uma corrente de no mximo 5V/cm Composio das bases e temperatura: O comportamento eletrofortico do DNA em gel de agarose no significantemente afetado pela composio das bases do DNA ou pela temperatura do gel na corrida. Dessa forma, os geis de agarose e a mobilidade eletrofortica dos fragmentos de DNA de diferentes tamanhos no muda entre 40C a 300C. Em geral, os geis de agarose so submetidos a corrida em temperatura ambiente. No entanto, em concentraes muito baixas (0,5%) os gis agarose de baixo ponto de fuso(low melting agarose). so pouco consistentes, sendo convenientes trabalhar em baixas temperaturas, pois esses gis ganham mais firmeza, da mesma forma os gis de

1.4. Tampes utilizados Existem uma variedade de tampes que podem ser utilizados para separao eletrofortica de DNA.

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TAMPES Tris-acetato (TAE)

CONCENTRAO 0,04M Tris acetato 0,01M EDTA 0,08M Tris-fosfato 0,002M EDTA 0,089M Tris borato 0,089M ac. brico 0,002M EDTA

FORMULAO 50X 242g tris base 57,1 ml cido actico 100ml EDTA 0,5M(pH8,0) 10X 108 g Tris Base 15,5ml de ac. fosfrico 85% 40ml EDTA 0,5M (pH8,0) 5X 54g Tris-base 27,5g c. brico 20 ml EDTA 0,5M (pH8,0)

Tris-fosfato (TPE)

Tris-borato (TBE)

1.5. Tipos de Agarose Muitos tipos de agarose esto disponveis, o que se recomenda para uso dirio o tipo II, baixa eletroendosmose. O inconveniente desta agarose que possue contaminantes de polissacrides sulfatados que inibem enzimas, como ligases, polimerases, e endonucleases. No entanto, a sua utilizao muito difundida, pois o DNA pode ser purificado e ser utilizado com sucesso nas clonagens e como substratos de reaes com essas enzimas 1.6. Colorao do DNA em gel agarose O mtodo mais conveniente para visualizar o DNA no gel de agarose a colorao por brometo de etidio, que fluoresce sob luz ultra violeta. Esse composto contm um grupo planar, que intercala entre as bases do DNA. A posio fixa do grupo e sua proximidade s bases causa uma ligao do corante com o DNA, que se destaca com um aumento da fluorescncia comparada com o corante em soluo sob a forma livre. A radiao UV absorvida pelo DNA a 260 nm transmitida para o corante, ou a irradiao absorvida a 300 nm e 360 nm pelo corante ligado propriamente dito, emitido a 590nm na regio da cor vermelho alaranjada, do espectro visvel. O brometo de etdio pode detectar tanto os cidos nucleicos de simples ou de dupla fita. No entanto, a afinidade do corante pela fita simples relativamente baixa, e a fluorescncia emitida fraca. Geralmente o brometo de etdio incorporado no tampo de corrida e no gel a 0,5ug/ml. Nesse caso devemos considerar que a mobilidade linear das fitas duplas est reduzida na presena do corante em aproximadamente 15%. Uma vantagem deste procedimento a possibilidade de visualizar o gel durante a separao eletrofortica, sem a necessidade de remover o gel do suporte e da cuba, simplesmente incidindo a luz UV sob o gel. Mas, se houver necessidade da colorao posterior basta imergir o gel numa soluo de brometo de etdio, no prprio tampo de corrida, po r 45 minutos a temperatura ambiente. A descolorao normalmente dispensada, exceto se houver excesso de corante. Quando a quantidade de DNA muito reduzida, a pouca fluorescncia do brometo de etdio pode interferir na visuallizao da banda de DNA. Neste caso recomenda-se imergir o gel em uma soluo de sulfato de magnsio a 1mM por uma hora, a temperatura ambiente 2 6

1.7. Documentao: O gel de agarose facilmente documentado, utilizando um sistema de fotografia instantnea ou sistema automatizado de captura de imagem. Polaroid, tipo 57 ou 667, asa 3000. O filme mais sensvel para essa finalidade fornecida pela Sob a luz UV de no mnimo 2500uW/cm 2 e uma boa mquina ,

utilizando filtro laranja, expe-se por alguns segundos. Recomenda-se para a mquina Polaroid modelo DS 34 uma abertura de 5,6 ou 8 e uma velocidade de 4 ou 8 segundos, mas pode variar com a intensidade das bandas e do tamanho do gel. Para padronizao tente vrios tempos de exposio com vrias aberturas.

2. Gel de poliacrilamida
O gel de poliacrilamida um suporte bastante utilizado em biologia molecular para separao e caracterizao de fragmentos de tamanho menores de DNA, que se tem dificudade por geis de agarose. Descrito por Raymond & Weintrab em 1959. O produto de polimerizao da acrilamida, que o monmero, com a N.N'metilenobisacrilamida, que realiza a reao de "cross linking" ou reao cruzada, gera o suporte de poliacrilamida. A polimerizao ocorre por ligao vinlica, sob ao de catalisadores, o perssulfato de amnia, cuja fonte de radicais livres o N,N,N'N' tetrametilenodiamina(TEMED). Portanto, o oxignio um inibidor da reao. O polmero formado so cadeias lineares de poliacrilamida, cuja reao cruzada entre elas dada pela bisacrilamida. O comprimento mdio das cadeias determinado pela concentrao relativa da acrilamida e a quantidade de bisacrilamida. Portanto a relao entre a quantidade de acrilamida e bisacrilamida determina as propriedades fsicas do gel, que daro subsdios para separao nesse tipo de gel. O gel de poliacrilamida utilizado para os fragmentos menores que 1kb. Eles podem ser preparados em uma variada concentrao (3,5% a 20%), dependendo do tamanho do fragmento de interesse para a separao e identificao. ACRILAMIDA (%) 3,5 5,0 8,0 12,0 20,0 INTERVALO DE SEPARAO (NUCLEOTDEOS) 10-1000 80-500 60-400 40-200 10-100

Os gis de poliacrilamida devem ser preparados entre duas placas de vidro, pois necessita de um ambiente isento de oxigncio para se polimerizar. O tamanho do gel pode variar de 10cm de altura por 10cm de largura at 20 a 30cm de largura por 40 a 100 cm de altura dependendo da necessidade do sistema; de espessura normalmente para DNA utilizase 0,75 a 1,5 mm.

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Literatura recomentada Kaplan, L.A. & Pesce, A.J. Clinical Chemistry: Theory, Analysis, Correlation, 3a. Ed., J.F. Shanahar & J. Roche, eds., 1996, Mosby-Year Book, Inc., St Louis, USA. Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratorial manual. J. Sambrook, E.F. Fritsch & T. Maniats, 3 volumes, 2nd ed., 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY.

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 Aula nmero 4

REAO DE POLIMERIZAO EM CADEIA (PCR)

Prof. Assoc.Mario Hiroyuki Hirata Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata

PRINCPIOS DA REAO DE PCR

A reao de polimerizao em cadeia (Polimerase chain reaction, PCR) a tcnica que permite a amplificao do DNA ou RNA in vitro, utilizando-se basicamente de uma reao enzimtica catalizada pela polimerase (enzima termoestvel) cuja atividade depende de ions Mg++, e ocorre em 3 etapas: Melting(ou desnaturao que consiste na separao da dupla fita do DNA a ser amplificado), annealing( anelamento ou hibridizao- ligao do iniciador ou primer ao DNA a ser amplificado) e extension(extenso ou seja a polimerizao propriamente dita) Metodologicamente a tcnica de PCR requer trs passos (SAIKI et al., 1.988): 1. Desnaturao - Inicialmente necessrio que as duas fitas de DNA a ser amplificado sejam separadas. A elevao da temperatura entre 90 a 95 C promove a separao da fita dupla de DNA em duas fitas simples. Este procedimento chamado Desnaturao ou melting, e muitas vezes a temperatura de desnaturao determinada empiricamente e depende de alguns fatores como a quantidade de guanina e citosina (GC) do fragmento DNA alvo ou de interesse. 2. Anelamento - A polimerase para assumir suas funes, isto , anexar as bases complementares, transformando as fitas simples em fitas duplas, necessita de um fragmento de DNA j ligado na regio previamente escolhida. A soluo, ento, demarcar as extremidades do DNA-procurado ou de interesse nas duas longas fitas simples, tornando-as duplas, apenas nesse intervalo. Para isso adicionam-se, soluo, os primers ou iniciadores que so pequenos fragmentos sintticos de DNA de fita simples, oligonucleotdeos de 20 a 30 bases nitrogenadas de comprimento, que so sintetizados in vitro baseado na sequncia do DNA a ser amplificado sendo eles complementares seqncia do segmento de DNA de interesse. O conhecimento da seqncia procurada naturalmente pr-requisito para a sntese dos primers. Os primers perseguem na reao as regies, as quais foram escolhidas, para hibridizar-se s seqncias complementares nas duas fitas simples (usualmente 5). Nas duas fitas surgem, assim, um pequeno fragmento de DNA de dupla fita intacta. A hibridizao dos primers descrito como Annealing (do ingls), deve ser feito a uma tempertura inferior da desnaturao (45 a 60 C). 3. Extenso - Quando os primers encontram e ligam-se aos segmentos complementares, a DNAPolimerase pode assumir sua funo. Inicia-se a partir dos pequenos fragmentos de DNA de fita dupla (resultado do anelamento do primer), incorporando um a um os nucleotdeos correspondentes, isto , as bases juntamente com as molculas de acar e fosfato. A DNA-Polimerase liga os nucleotdeos entre si, completando assim as fitas simples e tornando-as duplas (extenso). A DNA-Polimerase no reconhece apenas o bloco de incio como tambm consegue diferenciar as duas extremidades dos primers (3 e 5). 2 9

Ela inicia a reao sempre pela extremidade 3 do primer, completando a fita simples da em diante, portanto, sempre na direo do fragmento procurado. Os fragmentos de DNA recm-formados fornecem mais moldes para a montagem de novas fitas nos ciclos subseqentes, no entanto, com regio j determinada, resumindo, temos uma reao em cadeia. Aps cada ciclo, o nmero de fragmentos se duplica: de um formando-se 2, e ento novamente 4, 8, 16, 32, 64, 128... de tal forma que pode ser definida matematicamente por: N = No 2n N = nmero de molculas amplificadas No = nmero de molculas iniciais n = nmero de ciclos de amplificao O modelo terico considera que a eficincia do processo de amplificao corresponde a 100%, o que no observado na prtica. Experimentalmente, a eficincia da reao est abaixo da ideal e gira entorno de 78% a 97%, dependendo do gene amplificado. Teoricamente aps 20 ciclos tm-se cerca de um milho; aps 30 ciclos, cerca de um bilho de cpias do fragmento de DNA de interesse. Automao da PCR O procedimento da PCR foi to aperfeioada desde a sua primeira descrio, que na atualidade transcorre de forma totalmente automtica. Uma importante condio para isto foi a substituio da DNAPolimerase originalmente utilizada (extrada de E. coli) por uma DNA-Polimerase termoestvel extrada da bactria Thermus aquaticus (Taq-polimerase). Desta forma, os vrios ciclos transcorrem, seguidamente, em um nico tubo de ensaio, sem necessidade de interrrupo para a adio de nova DNA-Polimerase ativa. Todos os reagentes necessrios (o DNA-template, os primers, a DNA-Polimerase, e os dNTPs) so misturados com uma soluo tampo que ajusta o pH timo da reao. Um aparelho de PCR ou um termociclo repete o correspondente programa de temperaturas. O operador deve apenas programar e dar incio para que transcorra a amplificao. Um ciclo dura em mdia trs minutos. Assim, em uma hora, podem ser produzidas cerca de um milho de cpias e, em menos de duas horas, cerca de um bilho de cpias da seqncia de DNA de interesse. O produto amplificado pode alcanar aproximadamente 106 cpias em 30 ciclos e pode ser realizado em 2 horas. A PCR uma ferramenta na biologia molecular to poderosa quanto a descrio das enzimas de restrio e o Southern blot. Anunciado na Conferncia da Sociedade Americana de Gentica Humana de 1985, a tcnica de PCR tem sido utilizada de forma multidisciplinar com um nmero crescente de publicaes por ano(exemplo de 1985 a 1990 mais de 600). Tcnicamente muitas mudanas tem sido introduzidas melhorando cada vez mais e ampliando a sua utilizao. No entanto, preciso salientar que para cada situao experimental, novas modificaes tm de ser introduzidas, de tal forma que muito difcil

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descrever um nico procedimento para um uso generalizado. Por outro lado, fundamental o conhecimento bsico das etapas envolvidas na tcnica, para um desenho experimental com sucesso. A utilizao de PCR to ampla que podem ser editados compndios sobre a metodologia de PCR em cada especialidade diagnstica. Na aplicao diagnstica e, particularmente, na Microbiologia a atuao da biologia molecular muito ampla, apesar de estar ainda no cunho de afirmao e de uso restrito pesquisa e ao ensino. Porm, muitas doenas infecciosas dependem de um diagnstico rpido e seguro, que com certeza a nica soluo est na PCR. A liberao para uso rotineiro no laboratrio clnico ainda no permitido para toda as possveis aplicaes, no entanto, a necessidade de meios mais sensveis e precisos faro com que a tcnica de PCR se torne uma ferramenta impressindvel e quase obrigatria no diagnstico precoce de vrias doenas, apesar do custo ainda estar um pouco elevado. A tcnica de PCR to sensvel que capaz de amplificar uma simples molcula de DNA e tal a sua especificidade, que uma simples cpia de gene pode ser extraida de uma mistura complexa da sequncia genmica de forma rotineira e visualizada como uma simples banda no gel de Agarose. Como se pode notar, a sensibilidade e a especificidade que o mtodo pode oferecer algo singular. A PCR utilizando DNA polimerases termoestveis foi descrita pela primeira vez por Kary Mullis e patenteada nos EUA sob o n 4.683.195, em julho de 1987 e n 4.683.202. Saiki e cols, 1985, Mullis e cols,1986, Mullis e Faloona 1987 introduziram as diversas aplicaes do PCR para a comunidade cientfica e atualmente inesgotvel a sua aplicao prtica tanto na pesquisa bsica como na aplicada. Em termos prticos, podemos dizer que um protocolo geral pode ser seguido, mas com a ressalva da necessidade da optimizao para cada tipo de aplicao. Os principais problemas citados na literatura para a padronizao pode-se assim resumir: No deteco do produto, baixo rendimento do produto desejado, presena de bandas no especficas devido a mispriming ou misextension dos primers, formao de dmeros dos primers que competem pela amplificao com o produto desejado, mutao ou heterogeneicidade devido a erro de incorporao. Primer: um seguimento de DNA ou RNA de 15 a 40 bases, geralmente baseado na sequncia j conhecida do cido nucleico, geralmente sintetizado quimicamente por instrumentos automticos, que podem ser adquiridos no comrcio para fins j definidos ou se escolhe a regio desejada do DNA ou RNA a ser amplificada. Sonda (probe): um segmento de DNA ou RNA que foi marcado seja com enzimas, substratos antigenicos, substncias quimioluminescentes ou radioativas, que podem ligar-se com alta especificidade a uma sequncia complementar do cido nucleico alvo (escolhido).

PROTOCOLO GERAL PARA PCR

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1. A reao pode ser realizada no volume de 100l ou 50l. Escolha o volume a ser usado. 2. Para o volume de 100l, colocar em um tubo de 0,5 ml com tampa com fechamento hermtico. 2.1. DNA a ser amplificado 105 a 106 molculas(target DNA ou Template) 2.2. 20 pmol de cada primer (ou iniciadores,Tm>55C preferido) 2.3. 20 mM Tris-HCl (pH8,3, 20C) 2.4. MgCl 2 1,5 mM 2.5. Kcl 25 mM 2.6. Tween 20 a 0,05% 2.7. 100g/ml de gelatina autoclavada ou albumina bovina livre de nuclease 2.8. 50 M de cada dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 2.9. 0,2 a 2 unidades de Taq polimerase 3. Pr-incubar (se for DNA genmico) 10 minutos a 94o C 4. Programar o termociclo em: Desnaturao: 96 C (pode variar de 94 a 96C), por 15 segundos a 2 minutos Hibridizao (Primer Annealing): 55 C (pode variar de 45 a 62C), por 30 segundos a 2 minutos Polimerizao (Extension): 72C(pode variar de 55 a 72C) por 1,5 minutos Extenso final do programa: de 25 a 30 ciclos, de 72C por 5 a 10 minutos Estabilizao e parada de reao: 4C ou adio de 10 mM de EDTA.

FATORES QUE INFLUENCIAM A PCR

1. Atividade enzimtica da Taq polimerase Se os outros componentes da reao estiverem optimizados, de 1 a 2,5 U so suficientes

para uma boa amplificao em 100l de volume total. Quando em etapa de optimizao, as quantidades da enzima a serem utilizadas coompreendem o intervalo maior entre 0,5 a 5 U/100l. Obs: A quantidade de enzima necessria varia com as caractersticas do template e do primer. Se a concentrao de enzima for muito alta, ocorre o aparecimento de produtos inespecficos que podem se acumular; e ao contrrio, se baixo, a quantidade de produto desejado ser insuficiente.

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A origem comercial da Taq polimerase um importante fator, se a aquisio for de vrios fornecedores, pode-se obter resultados diferentes, devido as diferentes formulaes, diferentes condies de ensaio e pode diferir na definio da unidade. 2. Deoxinucleotdeo trifosfato: Se a soluo de uso for preparada a partir de soluo estoque necessrio neutralizar para pH 7,0, seguida de determinao espectrofotomtrica da concentrao. A soluo primria deve ser preparada a 10mM, distribuida em alquotas e estocada a -20C. A soluo de trabalho recomendada de 1mM de cada dNTP. A estabilidade dos dNTPs aps os vrios ciclos de amplificao permanece em aproximadamente 50% da concentrao inicial. Na reao, a concentrao recomendada varia de 20 a 200M para um resultado com boa especificidade e reprodutibilidade. Deve-se utilizar as mesmas concentraes de dNTP ou valores equivalentes, isto minimiza os erros de incorporao. Quanto menor a concentrao de dNTPs menor o risco de mispriming ou erro de incorporao de nucleotdeos. A quantidade mnima recomendada de 20M de cada dNTP para 100l de reao, quantidade suficiente para sintetizar 2,6 g de DNA ou 10pmol de uma sequncia de 400bp. Ultimamente se estabeleceu que 2M foi capaz de dar uma alta sensibilidade de deteco e amplificao de pontos de mutao do gene ras. De qualquer modo, para cada experimento deve-se encontrar uma quantidade tima. 3. Concentrao de Magnsio. A concentrao de magnsio bastante importante, pois afeta a hibridizao(annealing), a temperatura de separao do DNA alvo (melting), o produto de PCR, a especificidade do produto, a atividade da enzima Taq, leva formao de dimerizao de primer, prejudicando a fidelidade do experimento. A concentrao dos ions Mg++ deve estar entre 0,5 a 2,5 mM acima da concentrao total do dNTPs. Sempre deve-se considerar a concentrao de EDTA na amostra que pode interferir na concentrao dos ons Mg++. 4. Outros componentes O tampo recomendado para o PCR o TRIS-HCl na concentrao de 10 a 50 mM com pH entre 8,3 a 8,8 medido a 20C. Este tampo dipolar tem um pKa de 8,3 a 20C e um pKa de -0,0021/C, portanto, o pH verdadeiro de 20mM de TRIS pH 8,3 a 20C varia de 7,8 e 6,8 durante as condies de termociclagem. Pode-se adicionar cerca de 50mM de KCl na mistura de reao para facilitar a hibridao dos primer. O Cloreto de sdio a 50 mM, ou KCl abaixo de 50 mM inibe a atividade da Taq polimerase. O DMSO (dimetilsulfoxido) util para a reao de amplificao com Klenow fragmento de E. coli DNA polimerase I; 10% de DMSO inibe a atividade da Taq polimerase em 50%, apesar de Chamberlain e cols. o recomendarem para amplificao de sequncias multiplas, na mesma reao.

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A gelatina, a protena (albumina bovina, 100(g/ml) e o detergente no inico como o Tween 20(0,05-0,1%) podem ser utilizados para estabilizar as enzimas, mas muitos protocolos tem dispensado a sua utilizao.

5. HIbridao dos iniciadores (Primer Annealing) A temperatura e tempo requerido para o hibridao de primer depende da composio em bases, do comprimento e da concentrao. A temperatura bsica aplicvel seria de 5C abaixo da Tm verdadeira dos primers. Devido a Taq DNA polimerase ser ativa abaixo do intervalo de temperaturas, a extenso dos primers ocorrer em baixas temperaturas, incluindo a etapa de hibridao. O intervalo de ao da atividade enzimtica varia na ordem de 2 vezes a magnitude entre 20 a 85C. A temperatura de annealing no intervalo de 55 a 72C, geralmente d melhor resultado. Numa concentrao tpica de primers(0,2M), o annealing s requer poucos segundos. O aumento da temperatura de annealing aumenta a discriminao contra os erros de hibridizao dos primers mispriming, reduzindo a extenso ou polimerizao dos nucleotdeos incorretos no final 3 dos primers. Portanto, as temperaturas de annealing mais estringentes, especialmante nos primeiros ciclos poder aumentar a especificidade. Para se obter uma especificidade mxima, no incio dos ciclos aumenta-se a temperatura de annealing e adiciona-se a Taq polimerase aps a primeira etapa de desnaturao e annealing do primer. Baixas temperaturas de etapas de extension com altas concentraes de dNTPs favorecem os erros de polimerizao, ou seja, os nucleotdeos so incorporados erroneamente, motivo pelo qual alguns autores recomendam a utilizao de primers mais longos e de 2 temperaturas para o PCR. As temperaturas so de 55 a 75C para annealing e extension e 94 a 97C para desnaturao e separao de cadeias. 6. Extenso (ou polimerizao) O tempo de polimerizao ou extension tambm depende de alguns fatores como a concentrao e o comprimento do DNA a ser amplificado. A extenso dos primers tradicionalmente realizada a 72C, porque esta temperatura prxima do timo para extenso de primers no modelo de DNA do M13. A mdia de incorporao dos nucleotdeos a 72C varia de 35 a 100 nucleotdeos por seg-1 dependendo do tampo, pH, concentrao salina e natureza do DNA alvo. O tempo de 1 minuto a 72C considerado suficiente para a extenso de produtos de at 2kb. No entanto, tempos mais prolongados podem ser teis em casos de poucos ciclos e se a concentrao do substrato for muito baixa e tambm em ciclos prolongados quando a concentrao do produto ultrapassa a concentrao da enzima. 7. Tempo e temperatura de desnaturao 3 4

A maioria das causas de insucesso do PCR a incompleta desnaturao do DNA a ser amplificado ou do produto de PCR. Uma temperatura tpica de desnaturao 95C por 30 segundos, ou 97C por 15 segundos, porm, temperaturas mais altas podem ser apropriadas especialmente para DNA ricos em G+C. Apenas alguns segundos so necessrios para desnaturar e separar as cadeias de DNA, porm, um maior tempo necessrio para se atingir a temperatura dentro do tubo de reao. Seria desejvel a monitorao da temperatura dentro do tubo de reao utilizando uma sonda trmica de medida exata. A desnaturao incompleta reduz a possibilidade hibridizao entre o DNA alvo e os primers, diminuindo o rendimento do produto do PCR. Por outro lado, a desnaturao por longo tempo ou alta temperatura leva a perda de atividade da Taq polimerase, que maior que 2 horas, 40 minutos e 5 minutos nas temperaturas de 92,5; 95 e 97,5C, respectivamente. 8. Nmero de ciclos. O nmero de ciclos depender da quantidade de DNA inicial, quando todos os parmetros esto optimizados. Um erro comum que se comete um excesso de nmero de ciclos. Segundo Kary Mullis Se voc tem que ir mais que 40 ciclos para amplificar uma simples cpia de gene, existe alguma coisa seriamente errada com o seu PCR. Muitos ciclos pode aumentar a quantidade e a complexidade de produtos no especficos. Obviamente, um nmero muito baixo dar um baixo rendimento do produto desejado. 9. Iniciadores (Primers) A concentrao dos primers entre 0,1 a 0,5 mM so, na maioria das vezes, satisfatrios. Concentraes maiores podem promover mispriming e acmulo de produtos no especficos e podem aumentar a probabilidade de gerar um artefato independente do template denominado de primerdimer(dimerizao de primer). Produtos no especficos e dimerizao de primer so por si s substratos para o PCR e competem com o produto desejado pela enzima, dNTPs, e os primers, resultando em baixo rendimento do produto desejado. Algumas das regras gerais para um bom desenho de primers eficientes seriam: de 18 a 28 nucleotdeos em comprimento, tendo cerca de 50 a 60% de G+C na sua composio. A temperatura de melting (Tm) dos pares de primers deve ser adequada. Para esse propsito, pode-se usar a regra da prtica de 2C para o A ou T e 4C para o G ou C. Dependendo da aplicao, o Tm entre 55C e 80C so os recomendados. Deve tambm evitar a complementaridade na poro 3 do par de "primers", pois isso pode promover a formao de artefatos de dimerizao de primers e reduzir a produo do produto desejado. Outra observao evitar trs ou mais C+G na poro 3 dos primers que pode promover mispriming na sequncia rica em G+C. Deve-se evitar, quando possvel, a presena de sequncias palindrmicas dentro dos primers. Se ainda, depois desses cuidados, continuar a falhar, salutar ento tentar outro par de primers. Uma razo menos bvia para alguns primers falharem a presena de estrutura secundria no DNA template. Neste caso, substituir com 7-deasa-2deoxiGTP o dGTP e avaliar. O desenho de primers 3 5

para propsitos especiais tambm podem ser elaborados tais como a adio de stios de enzimas de restrio, mutao in vitro, ATG start codon, e outros. 10. Efeito Plateau O termo efeito plateau usado para descrever a atenuao exponencial da taxa de formao de produto de PCR, que pode ocorrer durante a fase tardia do PCR concomitantemente com o acmulo de 0,3 a 1 pmol do produto desejado. Dependendo das condies da reao e da ciclagem trmica, um ou mais parametros podem ser afetados: 1)utilizao dos substratos (dNTP ou primers), 2)estabilidade dos reagentes(dNTP ou enzimas), 3)inibio por produto formado(pirofosfato,DNA duplex), 4)competio por reagentes pelos produtos inespecficos ou dimerizao de primers, 5) reannealing de produto especfico na concentrao acima de 10-8 (pode diminuir a eficincia da extenso ou o processamento da Taq DNA polimerase ou causar subdiviso na migrao das cadeias e deslocamento de primers) e 6) incompleta desnaturao dos templates ou DNAs formados ou separao do produto em alta concentrao. Um importante fator que determina o aparecimento do efeito plateau a presena inicial de baixas concentrao de produtos desejado com presena de produtos no especficos resultantes de eventos de mispriming que podem continuar a ser amplificados preferencialmente. A optimizao do nmero de ciclos de amplificao a melhor maneira de evitar a amplificao de produtos indesejveis.

ESCOLHA DOS INICADORES PARA PCR

A. Protocolo bsico para desenhar um iniciador (primer) 5para 3( sense)
Regras gerais: Determinar a prioridade da utilizao(clonar, PCR, hibridizar, outros) Se for para clonar: analisar a sequncia do cDNA estudando as enzimas de restrio do DNA alvo e seguir o protocolo a seguir: 1. Copiar a sequncia e regio desejada do cDNA de interesse (no mais que 6 aminocidos ou 18 bp) 2.Adicione no incio 6 bases aleatrias 3.Adicione a sequncia a enzima de restrio desejada (Hind III, EcoRI, etc) 4. Acrescentar a sequncia que codifica o incio da sntese de aminocido(metionina -ATG) 5. Checar a sequncia em voz alta e verificar a porcentagem de Base C+G, que no deve ultrapassar 50% 3 6

Caso o primer for utilizado para outras finalidades como: hibridizao, PCR diagnstico etc, omita as etapas 2, 3, 4. e acrescente mais pares de base para ajustar a relao C+G se necessrio(no > 30). Ex 5 AAA AAT CTA AAA TCT CCT 3 GAT ATG CAT ATG AAA AAT CTA AAA TCT CCT 3 random NdeI+iniciador

B. Protocolo bsico para desenhar um iniciador (primer) 3para 5 (anti-sense)

Regras gerais: Determinar a prioridade da utilizao Se for para clonagem seguir os mesmos critrios acima para o sense primer 1. Copiar a sequencia da regio desejada do cDNA de interesse( no mais que 6 aminocidos ou 18 bp) 2. Adicione a sequncia que codifica o stop codon no final da sequncia(TAG TAA) 3. Adicione a sequnicia da enzima de restrio 4. Adicione 6 bases aleatoriamente(acertar a relao C+G) 5. Faa a complementar dessa sequncia 6.Copie a sequencia complementar em direo oposta ou seja do 5 para o 3(pois o sintetizador sempre iniciado 5) 7. Checar a sequncia em voz alta, calcular a relao C+G, no deixando ultrapassar 50% (aceite com as base aleatrias acrescidas). 8. Se no usar para clonagem apenas copie a sequencia desejada, faa a complementariedade e copie a sequencia inversa, checando a sequencia em voz alta. Ex. 5 CGC AAA GCT CAG ATT GGT 3 5CGC AAA GCT CAG ATT GGT TAG TAA AAG CTT AGA AGC STOPSTOPHindIII bases aleatrias 3 GCG TTT CGA GTC TAA CCA ATC ATT TTA GAA TCT TCG 5 5GCT TCT AAG ATT TTA CTA ACC AAT CTG AGC TTT GCG 3 Recomenda-se avaliar o primer desenhado em um programa de computador, para avalia-los adequadamente antes de requerer a sntese.

Literatura recomendada 3 7

Chamberlain, J.S. et al 1988. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res, 16:11141-11156. Ehln T. & Dubeau, L. 1989. Detection of ras point mutations by polymerase chain reaction using mutation-specific,m inosine containing oligonucleotide primers. Biochem Biophy. Res. Commun. 160:441-7. Mullis, K.B. & Faloona, F.A. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed reaction. Methods Enzymol.155:335-50. Mullis K.B. et al 1986. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-73. Saiki, R.K.& Gelfand, D.H. 1989. Introducing amplitaq DNA polymerase . Amplifications1:4-6. Saiki R.K. et al 1985. Enzymatic amplification of (globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350-1354.

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MODELO DE PROTOCOLO DE PCR Data: ___/ ___/ REAGENTES ORDEM DE ADIO GUA ESTRIL Tampo PCR 10X dATP (___mM) .... dCTP (___mM) ..... dGTP (___mM) ..... dTTP (___mM) ..... Primer 1 _________ Primer 2 _________ MgCl2 25 mM Dimetilsulfoxido DNA ( amostra) DNA (controle +) gua (controle - )... Taq DNA polimerase 1 2 . 3 4 . 5 6 7 8 9 10 11 12 .13......... 12 ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ VOLUME CONCENTRAO FINAL

Se necessrio fazer um mistura dos reagentes comuns evitando contaminao e erros na pipetagem.

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 Aula nmero 5

PCR NO DIAGNSTICO DE DOENAS GENTICAS

Marcos de Oliveira Machado Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata Prof. Assoc. Mario Hiroyuki Hirata

DOENAS GENTICAS
Atualmente j foram mapeados aproximadamente de 800 a 2800 locos gnicos. As doenas genticas so causadas por alteraes, denominadas mutaes, nesses locos ou em outros a serem ainda mapeados.. A maioria das doenas genticas so raras, mas a ocorrncia de uma doena em particular representa um urgente problema para uma famlia afetada. As doenas determinadas geneticamente no so apenas um grupo marginal para a medicina, mas representam juntas uma considervel proporo de todos os processos das doenas mdicas. At o presente, em torno de 2800 genes foram mapeados nos cromossomas autossmicos humanos, e aproximadamente 230, no cromossoma X. Mutaes nestes genes levam a doenas genticas monognicas. Para mais de 800 desordens clnicas a leso intragnica conhecida. Os mtodos de mapeamento so muitos e variados, e eles complementam um ao outro. Dos vrios mtodos desenvolvidos para isolar e identificar os genes defeituosos (Ex: loco no qual as mutaes causam uma doena), os seguintes tem sido mais freqentemente utilizados: (1) posio do clone baseado na posio conhecida do cromossomo, (2) estratgia do gene candidato, onde um gene previamente conhecido com um papel funcional normal sabe-se conter mutaes, e (3) mapeamento de pequenas regies para verificar delees ou para analisar pontos de ruptura (breakpoints) com translocaes de cromossomas. Numerosas doenas so clinicamente similares (fentipo similar), mas tem diferentes causas (princpio da heterogeneidade gentica). A heterogeneidade allica (devido a diferentes alelos mutados em um loco gentico) e heterogeneidade hetero-allica (devido a mutaes em diferentes locos genticos) podem ser diferenciadas. Na prtica, isto importante para o diagnstico e aconselhamento gentico, j que o modo da herana e o curso da doena podem diferir.

POLIMORFISMOS E MUTAES
A sequncia de nucleotdeos do DNA determina uma correspondente sequncia de aminocidos atravs da transcrio e traduo. Se a sequncia de DNA sofre mutaes, a sequncia de aminocidos pode estar alterada no stio correspoondente (mutao nvel protico). Assim, toda mutao tem uma posio definida. O cdigo do DNA e seu correspondente polipeptdeo so colineares. Uma mutao na sequncia de bases do DNA produz um cdon dferente. A posio onde resultou a mudana da sequncia de aminocidos corresponde a posio da mutao. 4 0

Basicamente, h trs diferentes tipos de mutao envolvendo um s nucleotdeo (mutao pontual): substituio (troca), deleo (perda), e insero (adio). Na substituio o codon alterado e pode codoficar para um diferente aminocido. Dois tipos de substituio podem ocorrer: transio (troca de uma purina por outra purina ou uma pirimidina por outra) e transverso (mudana de uma purina por uma pirimidina ou vise versa). Uma substituio pode alterar um cdon de modo que um aminocido diferente estar presente neste stio, mas isto no tem efeito na fase de leitura, caracterizando a mutao de sequencia trocada (missense mutation), enquanto que uma deleo ou insero causam uma mudana na fase de leitura (mutao de sequencia descolada ou frameshift mutaion). Na mutao de sequencia deslocada, as sequncias seguintes no codificam para um produto gentico funcional (mutao de sequencia interrompida ou nonsense mutation). As mutaes podem ocorrer em vrios stios do DNA, mas existem determinados stios em que ela ocorre com maior frequncia - os chamados pontos quentes (hotspots). A maioria dos pares de base incorretamente formados durante o processo de polimerizao no se torna permanentemente incorporados ao DNA. As DNA-polimerases possuem uma atividade exonuclesica 3 5 que garante uma remoo de praticamente todo nucleotdeo erroneamente pareado. Alm disso, cerca de um em cada dez nucleotdeos corretamente pareados removido pela atividade de exonuclesica 3 5da DNA- polimerase III, que exerce funo de revisar a polimerizao. Todos os seres vivos sofrem um certo nmero de mutaes como resultado de funes celulares normais ou interaes aleatrias com o ambiente, denominadas de mutaes espontneas. Alguns agentes podem aumentar o grau de mutaes, os agentes mutagnicos, e as modificaes que eles causam so denominadas mutaes induzidas. Estes agentes podem ser qumicos (ex: cido nitroso) ou fsicos (ex: raios U.V.). Os agentes qumicos possuem estruturas suficientemente similares s bases normais para serem metabolizadas e incorporadas ao DNA durante a replicao. Contudo, elas so suficientemente diferentes para aumentar a frequncia de pareamento errado e, portanto, de mutao. As radiaes aumentam a excitabilidade dos tomos presentes no DNA, e isto a base dos efeitos mutagnicos da luz ultravioleta e da radiao ionizante. Na natureza, os organismos das mesmas espcies usualmente diferem em alguns aspectos quanto a sua aparncia. As diferenas so geneticamente determinadas e so denominadas de polimorfismo. Em muitos locos gnicos, dois ou mais alelos podem ocorrer, constituindo o polimorfismo gentico. O polimorfismo gentico definido como a ocorrncia em uma populao de dois ou mais fentipos alternativos determinados geneticamente devido a diferentes alelos, pelo qual o menos frequnte alelo no pode ser mantido somente por repetidas mutaes. Um loco gentico definido como polimrfico se o (s) alelo (s) raro (os) tem uma frequncia de pelo menos 0,01 (1%), e como um resultado, heterozigotos para tais alelos ocorrerem com uma frequncia de pelo menos 2%. O polimorfismo pode ser observado nvel do indivduo como um todo (fentipo), em formas variantes de protenas e substncias de grupos sanguneos (polimorfismo bioqumico), caractersticas morfolgicas dos cromossomos (polimorfismo cromossomal), ou nvel de diferenas na sequncia de nucleotdeos do DNA (polimorfismo de DNA ou gentico). 4 1

Geralmente, o polimorfismo no perceptvel pelo fentipo. Os mtodos laboratoriais so o meio pelo qual ele detectvel. Diferenas individuais nas sequncias das bases dos nucleotdeos do DNA podem ser determinadas. Se a diferena na sequncia levar a uma mudana no cdon, um diferente aminocido ser incorporado no stiocorrespondente, Isto pode ser demonstrado pela anlise do produto do gene. O polimorfismo de uma protena (produto do gene) pode ser demonstrado por eletroforese em gel quando a forma variante difere de outras pela presena de um aminocido com carga eltrica diferente. Neste caso, o alelo forma um produto gnico que pode ser distinguido devido sua diferente velocidade de migrao em um campo eltrico (eletroforese). O polimorfismo que no leva a uma mudana na carga eltrica no pode ser identificado dessa maneira. nvel molecular, o polimorfismo pode ser identificado pelo uso de enzimas de restrio que reconhecem no DNA determinadas sequncias de bases nucleotdicas (stios), especficas para a sua atividade de clivagem. Cada enzima (obtidas de uma ampla variedade de bactrias) tem em particular um alvo na dupla fita de DNA, geralmente uma sequncia especfica de 4 a 6 bp. A mudana em uma das bases da sequncia determinar a atividade ou no da enzima naquele stio especfico. Dessa forma, pode-se identificar este tipo de polimorfismo, aps a atividade dessas enzimas, por eletroforese em gel.

ANLISE DO POLIMORFISMO DE DNA POR PCR

O surgimento de novas tcnicas em Biologia Molecular tem alterado significativamente as formas de abordagem dos problemas bsicos e aplicados nessa rea. O desenvolvimento da tcnica de amplificao de segmentos de DNA utilizando a reao de polimerizao em cadeia (PCR) abriu enormes perspectivas para a anlise de genes, diagnstico de doenas genticas, deteco de agentes infecciosos, entre outros exemplos. A anlise do polimorfismo de DNA por PCR realizada a partir de iniciadores adjacentes a uma determinada regio polimrfica do DNA, tornando possvel amplificar-se um segmento de DNA que pode ser ento, analisado de diferentes formas, como por exemplo, por sequnciamento direto do DNA, por clivagem com endonucleases de restrio (RFLP), ou por hibridizao com sondas genticas. A anlise do produto de PCR por determinao da sequncia de nucleotdeos a mais informativa em relao aos polimorfismos. Quando j se tem informao sobre a presena de polimorfismo em um determinado loco, em nvel da sequncia de nucleotdeos, mtodos rpidos e simples podem ser utilizados para deteco dos produtos de PCR por tcnicas de hibridizao com sondas genticas especficas, usando-se condies em que a diferena de uma nica base pode ser detectada. Esse mtodo tem sido aplicado na deteco de mutaes em doenas genticas, como a anemia falciforme, talassemias e fibrose cstica, bem como na tipagem de HLA. O polimorfismo de DNA tambm pode ser detectado diretamente na reao de PCR. Nesse caso, iniciadores contendo a regio 3correspondente sequncia polimrfica so utilizados e somente ocorre a amplificao quando h o pareamento correto das bases na regio 3. 4 2

A tcnica de PCR foi utilizada, pela primeira vez, na amplificao de DNA genmico para a deteco de anemia falciforme. Desde ento, vrias outra doenas, como a - Talassemias, distrofia muscular de Duchenne, sndrome de Lesch-Nyham, fenilcetonria, fibrose cstica, doena de Tay-Sachs e doena de Gaucher, tem sido diagnosticada por PCR. Para algumas doenas em que a predisposio gentica bastante alta, tais como doenas cardiovasculares e doenas auto-imunes, o uso da PCR tem sido de grande utilidade. Mutaes no gene do receptor da lipoprotena de baixa densidade (LDL) e polimorfismos nos genes da apolipoprotena B e E (Apo B e Apo E) tm sido detectados por PCR e relacionados com o risco de doenas cardiovasculares. Doenas auto-imunes, como a diabete melito insulina-dependente, esclerose mltipla e artrite reumatide, esto associadas aos alelos especficos dos locos HLA classe II.

POLIMORFISMO DE APOLIPOPROTENAS
Apolipoprotena B A apo B ocorre no plasma em duas formas primrias designadas apo B-100 e apoB-48, que possuem massa molecular relativa (Mr) de 513 Kda e 246 kDa, respectivamente. A apo B-100 uma das maiores protenas j conhecidas, contendo 4536 resduos de amino cidos e 8-10% de carboidratos. Defeitos genticos da apo B tm sido descritos, como a hiperapoliproteinemia B (hiperapo-B) e a apo B defeituosa familiar, que podem resultar em diminuio da remoo plasmtica dos remanescente de VLDL e das LDL. A hiperapo-B consiste em uma alterao do gene da apo B-100, resultado da substituio da arginina, da posio 4019 na sequncia primria da molcula de protena, pelo triptofano. A hiperapo-B caracterizada pelo aumento de partculas de LDL pequenas e densas, devido a uma superproduo de LDL, secundria ao aumento da sntese de apo B-100 e na remoo plasmtica da LDL. Essas alteraes metablicas esto fortemente associadas com a doena coronariana prematura, embora alguns pacientes com hiperapo-B apresentem nveis normais de colesterol e triacilgliceris no plasma. A apo B Defeituosa Familiar ocorre por substituio do amino cido arginina (Arg) pela glutamina (Gln) no resduo 3500. Essa mutao altera a corformao do domnio de ligao da apo B-100 aos receptores da LDL, prejudicando a interao da LDL com esses receptores. Com isso h uma reduo na remoo plasmtica da lipoprotenas, que se acumula no plasma, levando a hipercolesterolemia moderada ou severa que importante fator de risco para o desenvolvimento de doenas aterosclerticas. Recentemente, a clonagem e o sequnciamento do gene da apo B, localizado no brao curto do cromossoma 2 (2p 23-24), tem permitido estudar a variao do gene nvel de DNA. As endonucleases (enzimas de restrio) reconhecem sitios especficos na sequncia de nucleotdeos do DNA (stios de restrio), onde se ligam e cortam, produzindo diversos fragmentos de acordo com o nmero de stios para aquela enzima. O polimorfismo ocorre quando as mutaes na sequncia de DNA criam ou abolem um stio de restrio. Analisando estes fragmentos de restrio polimrficos, pode-se identificar alelos de um loco gentico em particular que esto associados com um 4 3

fentipo clnico, caracterizando o polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrio (RFLP). A associao do polimorfismo gentico com uma dada doena ou com um fator de risco pode existir por algumas das seguintes razes: o polimorfismo por s s pode constituir uma mutao funcional; pode no ter um efeito direto, mas estar acoplado a um desequilbrio atravs da mutao funcional; ou a associao pode ser devido a outros fatores. Alguns desses RFLP podem estar associados com variaes nos nveis plasmticos de lipdeos e aterosclerose. Diversos RFLP da apo B foram descritos. A mais consistente associao entre os RFLP e os lipdeos plasmticos envolve o polimorfismo XbaI, localizado na terceira base do cdon 2488 do gene da apo B. Uma nica mudana na terceira base deste cdon, sem alterao na sequncia de aminocidos da apo B, suficiente para determinar dois tipos de alelos para este tipo de polimorfismo, os quais podem ser detectados pela enzima XbaI: o alelo X+ (presena do stio de restrio) e o alelo X- (ausncia do stio de restrio); formando assim trs gentipos: X-X-; X-X+ e X+X+. Muitos estudos foram feitos relacionando os alelos e/ou gentipos do polimorfismo XbaI com os nveis plasmticos de colesterol total, colesterol da LDL, apo B e triglicerdeos. Alguns dados revelam que a LDL de indivduos com o gentipo X-X- possuem maior afinidade pelo receptor da LDL quando comparada com a LDL de indivduos com o gentipo X+X+. Outros RFLP do gene da apo B, tais como o polimorfismo EcoRI, MspI e Ins/Del, tambm vem sendo pesquisados com relao a eventuais influncias no mecanismo das doenas coronarianas aterosclerticas e no seus fatores de risco ambientais, como a dieta. Apolipoprotena E A apo E o principal constituinte protico das VLDL e possui um papel importante no metabolismo das lipoprotenas. Ela tambm est presente nos quilomcrons e seus remanescentes, e nas IDL. A sua principal funo est na contribuio para a interao das lipoprotenas com os receptores celulares responsveis pela captao destas lipoprotenas. A funo da apo E no desenvolvimento da aterosclerose no est totalmente esclarecida e especialmente o mecanismo de regulao dos nveis de colesterol atravs desta apolipoprotena ainda obscuro. Por outro lado, tem se observado que o polimorfismo da apo E influncia na concentrao de colesterol da LDL em diferentes popula!es. A estrutura e conformao da apo E em soluo, e especialmente sua topografia na superfcie das partculas lipoproticas, provavelmente influnciam no metabolismo dessas lipoprotenas sob condies normais e patolgicas. O catabolismo de partculas ricas em triglicerdeos, atravs de receptores pelos quais a apo E serve como ligante, podem desta maneira ser modulados pela conformao da apo E, a qual pode influnciar na afinidade pelo receptor ligante. A apo E o nico ligante para o receptor da VLDL em algumas lipoprotenas tais como os quilomcrons e seus remanescentes. Em outras lipoprotenas, incluindo a VLDL e a LDL, a apo E divide a propriedade de ligante-receptor com a apo B-100. Em humanos o gene da apo E est localizado no cromossoma 19 cercado nas proximidades pelos genes da apo C-I e C-II e bastante distante do gene do receptor da LDL. Dois tipos de polimorfismos da apo E tem sido detectados, um nvel de gene e outro nvel de ps-traduo; o primeiro polimorfismo da apo E 4 4

 devido a presena de trs alelos comuns (2, 3 e 4) presentes em um nico loco. A determinao desses alelos pode gerar seis diferentes gentipos, sendo trs heterozigticos (E3/2, E4/2 e E4/3) e trs homozigticos (E2/2), E3/3 e E4/4). O gentipo E3/E3 o mais comum e est presente em 60% da populao. No primeiro tipo de polimorfismo da apo E, o gentipo E2/2 (associado ao fentipo E2) difere do E3/3 (E3) pela substituio da arginina pela cistena na posio 158 da sequncia de amino cidos da apo E, enquanto que o gentipo E4/4 (E4) difere do E3/3 por substituio da cistena-112 pela arginina. Essas diferenas na estrutura primria influenciam na capacidade de ligao da apo E pelo receptor da LDL (B,E), sendo que o fentipo E2 possui afinidade aproximadamente 100 vezes menor por esse receptor, que o E3. Os indivduos que apresentam o fentipo E2 tm nveis plasmticos das VLDL e de seus remanescentes aumentados, que esto associados com a disbetalipoproteinemia familiar (Hiperlipoproteinemia tipo III) e representam riscos em potencial para o desenvolvimento da aterosclerose. No fentipo E4 a capacidade de ligao do receptor da LDL, normal, porm os nveis plasmticos de colesterol e de LDL esto aumentados. Esse polimorfismo da apo E tambm pode ser analisado pela tcnica da PCR seguido do uso de enzimas de restrio, especficas para estas regies polimrficas.

POLIMORFISMO DO RECEPTOR DA LDL

Alm das apolipoprotenas os receptores celulares das lipoprotenas tambm esto relacionados com as variaes nos nveis sricos lipdicos e lipoproticos. Os receptores so estruturas glicoproticas que esto agrupados em regies definidas da membrana celular, onde a lipoprotena se liga por intermdio da apolipoprotena. Eles fazem parte do mecanismo de remoo das lipoprotenas do plasma e fornecimento do colesterol e triacilglicerdeos para as clulas. Por isso so responsveis pela manuteno da homeostase dos lipdeos e das lipoprotenas no plasma e nos tecidos e, ao mesmo tempo, protegem as clulas do acmulo desses lipdeos, principalmente do colesterol. Uma variedade de clulas humanas contm receptores de alta afinidade para a LDL, tambm denominados receptores B,E. A LDL liga-se a estes receptores por intermdio da apo B-100 presente nas partculas. O receptor da LDL humano constitudo de 839 resduos de amino cidos e apresenta cinco domneos. Mutaes no gene do receptor da LDL causa uma doena hereditria do metabolismo lipdico chamada de Hipercolesterolemia Familiar (FH). A deficincia funcional no receptor da LDL na FH resulta no acmulo de LDL no sangue. O resultado deste alto nvel de LDL induz enfim a uma aterosclerose prematura e ao infarto do miocrdio. Alguns anos atrs um grupo de pesquisadores sugeriu que os genes normais do loco do receptor da LDL poderiam contribuir para variao populacional nos nveis sricos de colesterol. Nos meados de 1980, com o advento da tecnologia do DNA, surgiram novas possibilidades para examinar este problema. 4 5

O gene do receptor humano para a LDL foi clonado e mapeado no cromossoma 19p 13-2. Um amplo espectro de mutaes localizadas na parte estrutural do gene do receptor-LDL tem sido analisadas. Vrios RFLP foram encontrados no gene do receptor da LDL. Estudando tais polimorfismos detectou-se correlao com os nveis de colesterol total e LDL alterados. O alelo P- (ausncia do stio de restrio PvuII), do polimorfismo PvuII do gene do repector da LDL, foi associado ao aumento dos nveis sricos de colesterol total e da LDL em vrias populaes europias. Outros mostraram que a frequncia do alelo N- do polimorfismo NcoI) foi significantemente maior em pacientes com FH do que nos indivduos do grupo controle. Tambm, uma alta frequncia do alelo A- do polimrfismo AvaII foi encontrada em pacientes brancos Africanos com FH. A ligao entre o polimorfismo do loco do receptor da LDL e um perfil lipoprotico aterognico sugere que uma mutao no gene do receptor da LDL deve ser responsvel por este fentipo. Diante de todos estes dados podemos concluir que o polimorfismo gentico das apolipoprotenas B e E, e do receptor da LDL contribuem de alguma forma para a elucidao dos casos em que ocorrem respostas individual e populacional diferentes frente a determinados fatores de risco, como a dieta, para as doenas cardiovasculares. Literatura recomendada HALLMAN, D.M., VISVIKINS, S., STEINMETZ, J., BOERWINKLE, E. The effect of variation in the apolipoprotein B gene on plasma lipid and apolipoprotein B levels: A likelihood-based approach to cladistic analysis. Ann. Hum. Genet., v. 58, p 35-84, 1994. PASSAGLIA, L.M.P. Mutao, mecanismos de reparo do DNA e recombinao. In: ZAHA, A. coord. Biologia molecular bsica. Porto Alegre. Mercado Aberto ed. cap. 6, p. 116-155, 1996. PASSAGLIA, L.M.P., ZAHA, A. Tcnicas de DNA recombinante. In: ZAHA, A. coord. Biologia molecular bsica. Porto Alegre. Mercado Aberto ed., cap. 15, p. 307-331, 1996. PASSARGE E. Color atlas of genetics/Eberhard Passarge, Thieme ed. p. 46,156-158. 1995 WATSON, J.D., HOPKINS, N.H., ROBERTS, J.W., STEITZ, J.A. & WEINER, A.M. Molecular Biology of the Gene. 4rd ed. Menlo Park: The Benjamin/Cummings Publishing, Inc., 1987

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 Aula nmero 6

APLICAO DO PCR NO DIAGNSTICO DE DOENAS INFECTO-CONTAGIOSAS

Prof.Assoc. Mario Hiroyuki Hirata Moseley e colaboradores, em 1980, foram os pioneiros da aplicao de tecnologia de DNA em doenas infecciosas. Eles mostraram no primeiro estudo que a bactria E. coli poderia ser detectada por Hibridizao de DNA-DNA em amostras impregnadas em papel de filtro e incubadas uma noite em placa de agar MacConkey, mostrando sensibilidade e especificidade quando comparados com os mtodos de cultura at ento conhecidos. Na dcada seguinte probes de DNA capazes de identificar varias bactrias patognicas j eram disponveis no mercado. A seguir surgiram probes dirigidos para DNA de virus, fungos, parasitas e helmintos patognicos. Ultimamente, a utilizao de tcnicas em biologica molecular tornou-se importante em muitos laboratrios inclusive para diagnstico em cortes histolgicos. Com o aparecimento dos sintetizadores automticos de oligonucleotdeos houve um grande avano na tecnologia de probes sintticos baseados nas sequncias publicadas e disponveis nos bancos dos genes.

Tcnicas disponveis de PCR de importncia epidemiolgica

PCR para pesquisa de bactrias patognicas Neisseria menigitidis Mycobacterium tuberculosis Richettsia rickettsii Borrelia burgdorferi Yersinia pestis Treponema pallidum Chlamydia trachomatis Mycoplasma pneumoniae Legionella pneumophila Genes de toxinas de Vibrium cholerae 01 Genes de toxinas de termosensvel e termolbil de Shiga-like em E. coli Espcies de Shigella enteroevasiva e de E. coli Helicobacter pylori PCR para deteco de locus de resistncia a antibiticos Rifampicina em Micobacterium tuberculosis e M. leprae Eritromicin e methicilina para Staphylococcus aureus Penicilinase em N. gonorrhoeae Aminoglycoside modifying enzyme Beta lactamases de espectros estendidos. PCR para pesquisas de Virus HIV I Hepatite B RNA de Hepatite C Herpes simplex Epstein-Barr Cytomegalovirus Varicella-Zoster Parvosvirus B19 Rotavrus Adenoviroses Rubeola Enteroviroses Papilomavrus Papilomavrus tipo 16 e 18 mRNA E6 e E7 por 3S PCR para pesquisa de parasitas Trypanosoma cruzi Leishmania sp Plasmodium sp Entamoeba histolytica Babesia microti Giardia lamblia Microsporidium Toxoplasma gondii

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PCR NO DIAGNSTICO DAS MENINGITES BACTERIANAS

Professora Dra. Elza Masae Mamizuka Jane Atobe A meningite um conjunto de sndromes cujo denominador comum a inflamao menngea (Gomes, 1991). O perodo de incubao varia de acordo com o agente etiolgico (bactrias, vrus, fungos, protozorios, helmintos ou espiroquetdeos), sendo as bactrias causadoras mais frequentes de meningite. As meningites bacterianas constituem um srio problema de sade pblica em todo o mundo. Elas representam um captulo de importncia pelos altos ndices de morbi-mortalidade, principalmente em crianas. A meningite bacteriana a mais notvel e comum infeco que ataca o Sistema Nervoso Central (SNC). Dados da literatura relatam que 70% das ocorrncias se do em menores de 5 anos de idade e a taxa de mortalidade chega a 28% (Kilpe et al., 1993). As sequelas variam desde os problemas de comportamento at danos cerebrais irreversveis. O risco de morte muito alto, especialmente quando no se realiza um tratamento adequado. Assim sendo, fundamental que o diagnstico e tratamento apropriados realizem-se especifica e prontamente (Radstrom et al., 1994). No Brasil, o problema se agrava devido ao baixo nvel scio-econmico da populao, e seus determinantes: pobreza, falta de higiene e baixa nutrio que contribuem para a disseminao e implantao da meningite, alm do precrio sistema de Sade Pblica que dificulta o diagnstico precoce e o tratamento adequado. Na Grande So Paulo, o coeficiente de incidncia das meningites meningoccicas, no ano de 1995, foi de 7,95 casos/100 mil habitantes, com uma letalidade de 20,42% (Dados provisrios do Centro de Vigilncia Epidemiolgica - CVE). O diagnstico da meningite meningoccica inicia-se com a suspeita clnica, porm a confirmao feita pelo isolamento e identificao da Neisseria meningitidis em amostras biolgicas como tecido, sangue e lquor, ou pela deteco de diplococos Gram - negativos. A cultura de sangue apresenta-se positiva em, aproximadamente, 50% dos pacientes. A mortalidade dos indivduos com doena meningoccica reduzida quando os antibiticos so administrados em casos suspeitos, antes da admisso em hospital. Entretanto, na vigncia da antibiticoterapia, a taxa de isolamento do meningococo no sangue ou no lquor reduzida de 50% para menos de 5% (NI et al., 1992). Atualmente, o mtodo de Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) tem sido empregado para amplificar e detectar DNA microbiano em amostras clnicas. Alm da alta sensibilidade, a vantagem deste mtodo a deteco de bactrias mortas ou inibidas pelo antibitico. Como a meningite bacteriana deve ser tratada de imediato, h necessidade de rpida deteco de microrganismos para o diagnstico clnico. As desvantagens da microscopia direta e dos testes imunolgicos para deteco de antgenos, so bem conhecidos no que diz respeito sensibilidade e especificidade (Gray & Fedorko, 1992). O mtodo mais especfico para diagnosticar a meningite bacteriana atravs do isolamento do patgeno em cultura, seguida de identificao (necessidade de 12 a 24 horas de incubao). 4 8

Para o diagnstico da meningite meningoccica, emprega-se, atualmente, trs estratgias de PCR. A primeira emprega o PCR para detectar o DNA de um nico patgeno na amostra biolgica. Essa estratgia tem sido utilizada para detectar DNA de Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes (Kilpi et al., 1993) e de Haemophilus influenzae (Ketil et al., 1990). O DNA do meningococo pode ser especificamente detectado pela amplificao do gene da hidropteroato sintetase (dhps) . Esse gene foi clonado a partir do DNA isolado de cepas de Neisseria meningitidis sulfonamida sensvel e resistente pertencentes aos sorogrupos A, B e C. O sequenciamento desse gene permitiu construir dois iniciadores para a amplificao do gene dhpa por PCR, denominados NM1 e NM2. O produto de amplificao tem 950 bp de tamanho.. Outro gene que pode ser utilizado para deteco de Neisseria meningitidis por PCR o 1S1106, descrito por Ni, H. et al. (1992). Nesse caso so utilizados iniciadores adjacentes extremidade 5 do gene na posio 850 e na extremidade 3 na posio 1445 do gene, produzindo um fragmento de 596 bp. A segunda estratgia utilizar duas etapas de amplificao que permitem a deteco de amplo espectro de patgenos (Radstrom et al., 1994). A primeira etapa de amplificao utiliza um par de iniciadores, denominados marcadores universais de eubactrias, correspondente a um gene de uma regio conservada no genoma como o gene da subunidade 16S do rRNA. A finalidade desta etapa de detectar qualquer agente bacteriano na amostra biolgica. Na segunda etapa, os produtos da primeira etapa so amplificados utilizando iniciadores especficaos para Neisseria meningitidis,, atravs da tcnica de PCR "semi-nested" ou so hibridizados com sondas de DNA espcie-especficas. Dados da literatura mostram que o mtodo de PCR como teste de triagem permite uma rpida deteco do DNA bacteriano de vrias espcies que causam meningite (Greiser et al., 1994). A terceira estratgia a amplificao por PCR multiplex, empregando-se iniciadores universais para amplificar o gene de qualquer tipo de bactria gram-negativa (ex. sonda universal COR28), e iniciadores especficos para N. meningitidis (ex., sonda RDR 47D1). Na PCR multiplex , as duas sequncias (universais e espcie-especficas), de 370 bp (universal) e 279 bp (N. meningitidis) so amplificadas em uma nica etapa de PCR, o que reduz consideravelmente o tempo utilizado na deteco do meningococo. Devido sua alta sensisibilidade e especificidade, a prova da PCR em lquor um teste rpido, extremamente til para a confirmao precoce do diagnstico da meningite meningoccica e em situaes onde a cultura dificultada devido prvia terapia antimicrobiana muitas vezes necessria ou imprescindvel. Estudos demonstram que cerca de 23% dos casos com diagnstico clnico de meningite aguda no apresentam confirmao em exames microscpicos ou em culturas (Grey & Fedorko, 1992). Pela gravidade da enfermidade, justificada tanto pela letalidade como pelo grau de sequelas neurolgicas, de suma importncia que o diagnstico etiolgico seja determinado o mais rpido possvel, orientando, desta maneira, a conduta clnica e teraputica. Literatura recomendada Gomes, M. C. O. - Como diagnosticar e tratar meningite. Rev. Bras. Med. 48: 9-27, 1991. Greisen, K.; Loftelholz, M.; Purohit, A.; Leong, D. - PCR primers and probes for 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J. CLin. Microbiol. 32: 335351, 1994. 4 9

Ketel Van, R. J.; Wever, B.; Alphen Van, L. - Detection of Haemophilus influenzae in cerebrospinal fluids by polymerase chain reaction DNA amplification. J. Med. Microbiol. 33: 271-276, 1990. Kilpi, T.; Antiba, M.; Markku, J. T.; Pitold, M. - Length of prediagnostic history related to the course and sequele of childhood bacterial meningitis. Pediat. Infec. Dis. 12: 184-188, 1993. Kristiansen, B. E.; Ask, E.; Jenkins, A.; Fermer, C. ; Radstrem, P.; Skold, O. - Rapid diagnosis of meningococcal meningitis by polymerase chain reaction. Lancet. 337: 1568-1569, 1991. Gray, L. D.; Fedorko, D. P. - Laboratory diagnosis of bacterial meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 5: 130-145, 1992. Ni, H.; Knight, A. I.; Cartwright, K.; Palmer, W. H.; MacFadden, J. - Polymerase Chain Reaction for diagnosis of meningococcal meningitis. Lancet. 340: 1432-1434, 1991. Rasdtrom, P.; Backman A.; Qian, N.; Kragsbjerg, P.; Pahlson, C.; Olcen, P. - Detection of bacterial DNA in cerebrospinal fluid by an assay for simultaneous detection of Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae and Streptococci using a seminested PCR strategy. J. Clin. Microbiol. 32: 2738-2744, 1994.

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PCR NO DIAGNSTICO DA TUBERCULOSE

Prof. Assoc. Mario Hiroyuki Hirata Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata Profa. Dra. Elza Masae Mamizuka

INTRODUO
A infeco por micobactrias, acomete pacientes de qualquer idade, sexo ou grupo tnico e no

sendo tratada oportunamente poder ser fatal ou trazer consigo um alto risco de seqelas graves, principalmente nos casos em que a terapia seja retardada ou inadequada (VIAMONT, 1.992). Atualmente, com a Sndrome da Imunodeficincia Adquirida (AIDS), o ressurgimento de micobactrias no tuberculosas, tem aumentado dramaticamente, sendo as de maior interesse em sade pblica as pertencentes aos complexos M. avium e M. fortuitum que apresentam distinto significado clnico, tanto no tratamento como no prognstico dos pacientes acometidos, e principalmente com implicaes epidemiolgicas diferentes, (KIEHN & EDWARDS, 1.987, GUTHERTZ et al., 1.989). A tuberculose como doena continua a figurar entre as principais enfermidades que afetam a humanidade (BOOM et al., 1.990, BRISSON-NOEL et al., 1.991). Estima-se que aproximadamente 1/3 da populao mundial esteja infectada por M. tuberculosis, com incidncia anual de 8 milhes de casos novos da doena (KOCHI et al., 1.992). Simultaneamente ao aumento da incidncia da tuberculose, tambm surgiram cepas de M. tuberculosis multi-resistentes s drogas como a rifampicina e isoniazida. Os dados sobre resistncia primria ou secundria no Brasil variam de regio para regio, sendo de 16,5% no estado de So Paulo e de 19,1 % no Rio de Janeiro (CVE/SP, 1995). Sem dvida, os principais problemas que se enfrentam na tuberculose so: o problema scio-econmico, diagnstico clnico-laboratorial adequado e rpido, tratamento e controle profiltico da doena (WHITE WHELEN et al., 1.995; COOKSEY, et al 1.996). Os recentes avanos da biotecnologia vem sendo conhecidos nos pases subdesenvolvidos no entanto, ainda so escassos os recursos econmicos e a falta de apoio aos centros de pesquisa tecnolgica, especialmente aos pesquisadores que atuam na rea de sade. Entretanto, a tcnica de amplificao do DNA pela Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) tem sido aplicada nos vrios centros de pesquisa em diagnstico e indica ser um procedimento simples e rpido, onde os reagentes so estveis e os equipamentos de baixo custo (CLARRIGDE 1994). Estudos iniciais tm demonstrado que o custo de insumos e recursos humanos para a realizao da tcnica da PCR e da cultura so semelhantes. Em razo disso, a tcnica da PCR deve ser proposta tambm como tecnologia apropriada at para laboratrios de sade pblica do terceiro mundo. Com o aprimoramento de sondas genticas no radioativas especficas para deteco de micobatrias com emprego de tcnicas eletroforticas e de hibridizao, a PCR provavelmente, representa um instrumento alternativo interessante para o controle da infeco especialmente na deteco precoce da tuberculose e da identificao de cepas bacterianas resistentes aos quimioterpicos (KIRSCHNER et al., 1.993; KOX et al., 1.994; 1.995). Um fator bastante relevante na identificao de micobactrias a demora no crescimento bacteriano na cultura, alm da dificuldade da realizao dos testes de sensibilidade s drogas pelos 5 1 & GOLD, 1.992; WILLIANS et al., 1.994;

mtodos tradicionais. Outro problema que os mtodos tradicionais apresentam baixa sensibilidade e especificidade, alm de ter baixa reprodutibilidade. No entanto, o abandono do tratamento propicia o aumento de transmisso da doena e tambm contribui para o aparecimento de cepas resistentes por seleo de mutantes na populao das micobactrias. Considerando as dificuldades encontradas com esses mtodos e a gravidade atual da situao da tuberculose a nvel mundial, seria muito importante estabelecermos uma metodologia que gere diagnstico mais rpido com garantia de alta sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade. A introduo de tal tcnica na rotina diagnstica ser de grande utilidade no somente pela abreviao do tempo mas tambm, pela facilidade de treinamento tcnico para a formao de recursos humanos nesta rea (HERNANDEZ, 1996).

DIAGNSTICO LABORATORIAL DA TUBERCULOSE

Microscopia Direta
A microscopia ou baciloscopia um mtodo rpido para pesquisar micobactrias, mas requer

aproximadamente 104 bactrias/mL de amostra para ser detectado com segurana na maioria das espcies. A especificidade das baciloscopias positivas alta (84 - 100 %) (DANIEL, 1.990), mas esta porcentagem pode ser consideravelmente reduzida em zonas endmicas de infeces pelas bactrias do Complexo sem superar de forma Mycobacterium avium (MAC). A colorao fluorescente tem melhorado a sensibilidade da microscopia direta, considervel obtida com a colorao de Ziehl-Neelsen, que apesar de apresentar especificidade de 99 %, tem uma sensibilidade baixa, aproximadamente de 30 % a 40 % por necessitar de uma concentrao aumentada de bacilos na amostra a ser estudada. Exames mltiplos das amostras, aumentam a sensibilidade, melhorando o diagnstico (KENNEDY & FALLON, 1.979)

Cultura

A cultura um mtodo mais sensvel e especfico do que a microscopia, mas requer de 3 at 8 semanas para o crescimento. A optimizao de meios seletivos acoplados a mtodos radiomtricos (BATEC) de deteco de crescimento precoce de micobactrias, pode diminuir, consideravelmente, o tempo do diagnstico, especialmente se o inculo inicial alto e adequado. Entretanto, o alto custo do equipamento e a necessidade do
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C, torna-o inacessvel para a maioria dos laboratrios de mdio e pequeno porte. A

sensibilidade da cultura varia entre 20 e 90 %, dependendo da quantidade da amostra submetida cultura e da infraestrutura do laboratrio (KENNEDY & FALLON, 1.979; MOLAVI & LEFROCK, 1.985). De todas as desvantagens apresentadas pelos mtodos anteriormente mencionados, a biologia molecular pode ser considerada uma excelente alternativa no diagnstico deste gnero bacteriano.

PESQUISA DE MICOBACTRIAS POR TCNICAS MOLECULARES

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Os recentes avanos da engenharia gentica e da biotecnologia trazem interesse queles que esto familiarizados em inovao e desenvolvimento. E, com o aprimoramento de sondas genticas (DNA-Probe) no radioativas e iniciadores mais especficos para deteco com eletroforese, a PCR provavelmente, representar um instrumento alternativo para o controle da tuberculose nos pases em desenvolvimento. Dentre as principais tcnicas de biologia molecular, utilizadas no diagnstico de micobactrias conforme segue (CLARRIDGE et al., 1.991; 1.993):

Hibridizao de cidos Nuclicos

Esta tcnica est baseada nas propriedades de complementaridade e estabilidade das fitas do DNA.

A estrutura nativa do DNA mantida por pontes de hidrognio entre as bases complementares das duas fitas opostas. Entretanto, em temperaturas prximas a 100C, ou em pH alcalino, as pontes de hidrognio desestabilizam-se e as fitas separam-se. J as ligaes covalentes entre os nucleotdeos da mesma fita permanecem estveis. Nesta forma, o DNA dito desnaturado. A desnaturao no irreversvel, pois com a diminuio da temperatura da soluo para 50 C as duas fitas pareiam-se novamente, seguindo o princpio da complementariedade das bases (MUSIAL et al., 1.988). Durante a renaturao as fitas tanto podem ligar-se entre si como ligadas previamente, ou podem parear-se a qualquer outra seqncia de nucleotdeos, mesmo que seja RNA, desde que haja complementariedade de bases (TENOVER, 1.991). Uma aplicao comum da hibridizao de cidos nuclicos a identificao de um determinado segmento gnico em uma amostra. Procede-se desnaturao do DNA da amostra seguida da incubao com uma sonda gentica complementar ao segmento gnico de interesse. A sonda gentica pode consistir de oligonucleotdeos sintticos ou fragmentos de cDNA (DNA complementar). Em ambos os casos, alguns dos nucleotdeos da sonda sero marcados com elementos radioativos como 32P. Caso exista na amostra o segmento gnico procurado, a sonda ir hibridizar especificamente e ser detectada em auto-radiografia. H uma tendncia recente ao emprego de nucleotdeos marcados com enzimas ou compostos luminescentes, como a digoxigenina marcada, que no teriam os incovenientes inerentes ao uso de radioistopos (ROBERT et al., 1.991; SHANWAR et al., 1.993). A hibridizao com sondas marcadas , freqentemente, empregada na identificao dos fragmentos de DNA e de molculas de RNA separadas e imobilizadas pelas tcnicas de Southern e Northern blot, respectivamente. Dispondo de sondas apropriadas possvel investigar um determinado gene ou molcula de DNA ou RNA quanto presena do agente etiolgico na amostra. Como a hibridizao quantitativa, pode ser inferida a quantidade do mRNA em questo pela comparao da intensidade do sinal obtido na auto-radiografia utilizando densitometria (SOUTHERN, 1.975; FRIES et al., 1.991). Os cidos nuclicos podem ser hibridizados com sondas genticas, ainda que mantenha intacta a estrutura morfolgica dos tecidos, mediante a tcnica denominada hibridizao in situ. um mtodo extremamente sensvel, que permite a deteco de quantidades mnimas de cido nuclico no acessveis por outros mtodos. A hibridizao in situ evidencia a distribuio de um determinado gene ou RNA entre as vrias clulas de um mesmo tecido, o que no possvel por Southern ou Northern blot. H sondas comerciais disponveis para deteco de genoma de diversos microrganismos (COATES, 1.987). 5 3

Tambm os mtodos de hibridizao de cidos nucleicos podem utilizar sondas genticas de DNA que so capazes de hibridizar com seqncias complementares de RNA (35) ribossomal 16S, podendo estas apresentar uma alta especificidade e sensibilidade para detectar bactrias deste gnero (ROBERTS et al., 1.987; STOCKMAN et al., 1.993). As sondas genticas de DNA com capacidade de hibridizar com as seqncias de RNA ribossomal 16S para as espcies mais comuns do gnero Mycobacterium (M. tuberculosis, M. avium, e M. intracellulare), so comerciais e podem ser marcadas com elementos et al., 1.988; KEMP et al., radioativos ou no, diminuindo, consideravelmente, o tempo de deteco e quando associados aos mtodos de cultura radiomtrica podem reduzir o tempo em at 2 semanas (ELLENER 1.990). No entanto, a tcnica de hibridizao de cidos nucleicos limitada por sua baixa sensibilidade. Este mtodo requer (aproximadamente 104 bactrias para a deteco) quantidade similar a que necessita a baciloscopia, isto no to satifatrio para a identificao de micobactrias a partir de amostras clnicas, j que muito difcil encontrar tal quantidade de microrganismos na maioria destas amostras. O tempo gasto para o diagnstico pelo mtodo de hibridizao torna-se sempre dependente da cultura bacteriana e do inculo inicial (WILSON et al., 1.993), exceto por esses inconvenientes, a tcnica de hibridizao pode apresentar uma alta especificidade e sensibilidade (GONZALES & HANNA, 1.987) .

Endonucleases de Restrio e RFLP

A tecnologia atual da Biologia Molecular tornou-se possvel graas identificao e purificao de

enzimas nucleares. Merecem destaque, as endonucleases de restrio, pela ampla variedade de seus membros e pelas aplicaes prticas. So enzimas bacterianas com a propriedade de clivar molculas de DNA estranho, que porventura, penetram a clula. Representam, portanto, uma defesa primitiva de organismos procariontes. A clivagem da dupla hlice de DNA ocorre em pontos conhecidos como stios de restrio, que so seqncias de 4 a 8 nucleotdeos especficos para cada enzima. H uma grande variedade de enzimas de restrio que reconhecem uma ampla gama de stios de restrio. A distribuio dos stios de restrio num determinado gene especfica para a endonuclease, em funo da seqncia de nucleotdeos do gene. Este o princpio em que se baseia a tcnica de RFLP, que a sigla inglesa relativa a polimorfismo do tamanho de fragmentos gerados por endonucleases de restrio. Quando um segmento de DNA monomrfico, ou seja, no exibe variao individual na sua seqncia de nucleotdeos, o padro de fragmentos gerados por uma determinada endonuclease de restrio sempre o mesmo. Caso haja variao na seqncia de nucleotdeos, poder mudar alguns stios de restrio e conseqente h variao no nmero de fragmentos gerados pela respectiva endonuclease de restrio. Delees ou inseres fora dos stios de restrio podero tambm ser identificados por ocasionarem alteraes no tamanho de alguns dos fragmentos de restrio gerados (PLIKAYTIS 1.992; VAN ECHOUTTE et al., 1.993). O estudo do RFLP envolve tcnicas de digesto de DNA, separao eletrofortica, Southern blot e hibridizao de cidos nuclicos. A amostra de DNA a ser estudada inicialmente digerida por uma ou mais endonucleases de restrio e separada eletroforeticamente. Aps a transferncia para membranas de nitrocelulose ou nylon (Southern blot) e fixadas, sob luz UV ou calor, posteriormente esta incubada com a 5 4 et al.,

sonda gentica (marcada) complementar a segmentos do gene de interesse. A hibridizao da sonda identifica os fragmentos de restrio em um gene, o tamanho e nmero dos fragmentos gerados obedecer s variaes na seqncias de nucleotdeos. Esta variao pode ser normal no caso de regies polimrficas do genoma ou pode traduzir uma mutao especfica no caso de genes monomrficos. Boa parte dos estudos utilizando RFLP no analisa diretamente o gene de interesse, e sim regies polimrficas vizinhas, para as quais existem mapas de restrio definidos (TELENTI et al., 1.993).

Reao em Cadeia da Polimerase (PCR)

As limitaes dos mtodos de diagnstico utilizando cidos nuclicos, podem ser superadas com a

amplificao de fragmentos especficos destes cidos, mediante a Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) (SAIKI et al., 1.988). Introduzida em 1.986 por MULLIS & FALOONA (1.987). A PCR uma tcnica que permite a amplificao in vitro de um fragmento de DNA, milhes de vezes em poucas horas, pois com a sua utilizao possvel marcar todo e qualquer segmento de informao gentica entre, bilhes de unidades e reproduzi-lo milhes de vezes. O princpio da reao em cadeia da polimerase simples e baseia-se no mecanismo natural de duplicao do material gentico que ocorre sempre que uma clula se divide para formar duas novas. Portanto, na PCR, reproduz-se o processo de replicao natural do DNA com as vantagens de extrema rapidez e de ser possvel determinar, precisamente, o trecho do DNA a ser amplificado, ao passo que na replicao normal todo o genoma amplificado lentamente. Assim, a PCR deve satisfazer as condies bsicas do processo de replicao do DNA, realizado pelas DNA polimerases, enzimas que agem, exclusivamente, sobre fitas pareadas de DNA. Recentemente, vrios trabalhos tm descrito esta tcnica como uma boa alternativa para a identificao de micobactrias, discutindo-se melhorias na tcnica da PCR para a pesquisa dessas bactrias em material biolgico. Apesar do sucesso realizado nos laboratrios de pesquisa mediante a utilizao da PCR, esta tcnica enfrenta alguns problemas, como: a contaminao do produto amplificado (BOOM et al., 1.991), presena de inibidores da Taq - polimerase quando se preparam amostras de escarro para a obteno de uma boa purificao do DNA para a aplicao pela PCR (AMICOSANTE, et al., 1.995)

Deteco e Identificao de Micobactrias por Amplificao do DNA.

A deteco da presena ou ausncia de micobactrias pode ser feita por hibridizao de cidos et al., 1.987), sendo a quantidade do DNA presente na amostra, muitas vezes

nuclicos (DRAKE

insuficiente para ser detectada. Tm sido feitas pesquisas de novos mtodos que permitem a amplificao de seqncias de DNA especficas. Uma vez que o processo de amplificao detecta a presena de micobactrias no viveis, ou seja no haja necessidade de crescimento in-vitro, a sensibilidade desta tcnica pode superar a cultura. A amplificao da seqncia do DNA micobacteriano tem permitido a deteco e identificao rpida destas bactrias em amostras clnicas. O trabalho publicado por ALTAMIRANO et al. (1.992) para o diagnstico de tuberculose pulmonar, mostra uma sensibilidade e especificidade aumentadas sendo prximas a 100%. SHANKAR et al. (1.991), identificou M. tuberculosis em diferentes tipos de amostras de pacientes com diagnstico clnico presuntivo de tuberculose. KANEKO et al. 5 5

(1.990) utilizando a PCR detectou M. tuberculosis no LCR em 84% do pacientes com diagnstico clnico de meningite tuberculosa. Para a identificao de micobactrias foram elaborados alguns tipos de primers para detectar gnero ou espcies de micobactrias (HANCE et al., 1989; TAKEWAKI et al., 1.993). Tudo depende do nvel ou stio em que vo se ligar os primers e os genes que se procura, existindo tcnicas baseadas na amplificao de seqncias especficas de DNA ou RNA que esto presentes em todas ou em algumas espcies de micobactrias (BDDINGHANS et al., 1.990 a ) Existem primers que so utilizados para amplificar genes que codificam protenas conservativas nas diferentes espcies de micobactrias, como as protenas heat shock. Exemplificamos, os genes groEL e phoS, que codificam as protenas 65 e 38 KDa respectivamente (HANCE et al., 1.989) ou seqncias repetitivas de insero como as IS6110, IS6116 ou IS986, onde existem seqncias repetitivas de 1 a 20 vezes no cromossomo de membros do Complexo M. tuberculosis (EISENACH et al., 1.990; HERMANS et al., 1.990 a,b ; THIERRY et al., 1.990; SOINI et al., 1.992). Tambm esto sendo utilizadas seqncias de oligonucleotdeos da subunidade menor do ribosomas 16S (rRNA) para amplificar fragmentos de DNA capazes de hibridizar com sondas genticas gnero e espcie especficas. Estas zonas so empregadas devido capacidade de serem altamente conservativas nos diferentes grupos bacterianos (CHEN et al., 1.989). Esta alternativa est sendo utilizada para a identificao a partir de amostras clnicas das diferentes espcies de micobactrias (WOESE et al., 1.987; EDWARDS et al., 1.989; BDDINGHANS et al., 1.990 b; ROGALL 1.992; KIRSCHNER et al., 1.993 a,b; VUORINEN et al., 1.995). Outros autores classificam as reaes de amplificao existentes para micobactrias em geraes. As de primeira gerao incluem, principalmente, as reaes diretas, como a utilizao de genes que codifican protenas como a IS6110. As de segunda gerao incluem metodologias mais complicadas que geralmente constam de duas ou mais tcnicas: NASBA (nucleic acid sequence based amplification), TMA (transcription - mediated RNA amplification), SDA (Strand, displacent amplification) e em ambos casos podem ser utilizadas seqncias que codificam IS6110 e 16S rRNA, OLA (oligonucleotide ligation assay) (VAN SOOLINGEN et al., 1.991; MENDIOLA et al., 1.992; VANDER ULIET et al., 1.993; KENT et al., 1.995; KLATSER, 1.995). Os parmetros de sensibilidade da tcnica do PCR para identificar Mycobacterium spp. podem ser afetados diretamente pelos mtodos de extrao do DNA, j que se utilizam mtodos de extrao em condies extremas (exemplo: pH). Pela natureza qumica da bactria muitas vezes perde-se uma considervel quantidade de DNA, e isto agravado quando se processam amostras com um alto ndice de contaminao, onde existe a necessidade de se descontamin-los e concentr-los (exemplo: escarros, aspirado ganglionar). Teoricamente, sabe-se que para detectar micobactrias precisa-se de aproximadamente um fentograma de DNA bacteriano (o que equivalente a 1/5 do microrganismo) (PATEL et al., 1.993), embora em amostras clnicas como escarro seja necessrio de 100 a 1.000 organismos (HANCE et al., 1989; HERMANS et al., 1.990 b). 5 6 et al., 1.990; BTTGER et al.,

A sensibilidade pode ser recuperada se utilizarmos mtodos de extrao com digesto enzimtica, extrao com fenol clorofrmio e precipitao do DNA com etanol. Este procedimento mais recomendvel quando se processam amostras clnicas. J que as extraes com detergentes inicos resultam em uma queda da sensibilidade (SHANWAR et al., 1.993). A sensibilidade tambm pode ser afetada pelo tempo de deteco do produto ps-PCR. O procedimento mais comum a visualizao do produto em gel de agarose corado com brometo de etdio sob luz ultravioleta, tendo sempre um marcador de peso molecular como referncia para caracterizar as bandas de DNA observadas. Outro mtodo comumente utilizado a hibridizao com sondas genticas complementares as regies internas dos produtos amplificados. Geralmente os sistemas de hibridizao so variados, mas em geral, os produtos ps-PCR podemse ligar a uma matriz ou membrana de nylon ou nitrocelulose (dot-blot ou slot-blot), onde se adicionam as sondas genticas marcadas com radioistopos como o alcalina, digoxigenina, biotina - avidina (SHANWAR
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P, conjugados enzimticos ligados a fosfatase et al., 1.993) ou mtodos

et al., 1.993; WILSON

quimioluminescentes (BRISSON et al., 1.989, 1.991; KUSUNOKI et al., 1.991) e dependendo do sistema de revelao utilizado pode-se melhorar a sensibilidade em relao ao mtodo de colorao com brometo de etdio. Por combinao da hibridizao e PCR ou digesto do produto amplificado utilizando enzimas de restrio (RFLP) as micobactrias podem ser identificadas prontamente, seja a nvel de gnero ou espcie (PLIKAYTIS et al., 1.992; HAAS et al., 1.993; TAKEWAKI et al., 1.993). Estas aplicaes dependem das condies de cada laboratrio e de acordo com o tipo de identificao necessrio. A sensibilidade pode ainda ser melhorada submetendo-se os produtos ps-PCR a outra amplificao utilizando primers que sejam capazes de amplificar um fragmento interno do produto ps-PCR. A este novo processo denomina-se Nested-PCR ou segunda amplificao (SHANWAR 1.993; WILSON et al., 1.993). Para uma melhor ilustrao dos mtodos que esto sendo aplicados na identificao de micobactrias a partir de amostras clnicas, utilizando PCR, seja direto ou ligado a outros sistemas. A tabela 3 apresenta alguns resultados referentes ao tipo de primer utilizado (PAO et al., 1.988, 1.990; BRISSON et al., 1989, 1.991; EISENACH et al., 1.990; 1.991; COUISINS et al.,1.992; SHANWAR et al.,1.993; WILSON et al.,1.993; VUORINEN et al., 1.995), onde a sensibilidade varia de 55 a 100 %, mas a especificidade alta, variando de 95 a 100 %. et al.,

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Tabela 3: Deteco de M. tuberculosis diretamente de amostras clnicas Referncia PAO et al., 1.990 BRISSON, et al., 1.991 EISENACH et al.,1.991 COUSINS et al., 1.992 WILSON et al., 1.993 SHANWAR et al., 1.993 VUORINEN, et al., 1.995 Nmero de Amostras 248 514 162 177 171 389 243 Primers 65 k prot 65 k prot IS6110 IS6110 MPB70 prot IS6110 IS6110 rRNA 16S + Hibridizao Sensibilidade 100 % 80 - 97 % 100 % 97 % 75 - 92 % 55 - 74 % 86.2 % Especificidade 63 % * 95 % 76 % 99 - 100 % 95 - 98 % 100%

* No avaliado pelo excesso de culturas negativas das amostras PCR-positivas Como podemos verificar existe uma grande variedade de mtodos diagnsticos para

micobacterioses, e muitos deles apresentam alguns problemas na correlao da sensibilidade e especificidade (BOOM et al., 1.991, MANJUNATH et al.,1.991; BUCK et al., 1.992; WILSON et al., 1.993). Para superar os diferentes inconvenientes apresentados pelas tcnicas descritas na literatura,deve-se procurar optimizar as tcnicas tornando-as viveis para aplicao em laboratrios de rotina. A eleio dos primers baseada nos trabalhos de ANDREAS et al.(1.991), BTTGER (1989, 1.992); KIRSCHNER et al. (1.993)a,b; INDERLIED, et al., 1.993; CARPENTIER et al., 1.995; VUORINEN et al. (1.995) os quais identificam, seqncias especficas de oligonucleotdeos da subunidade menor do ribossoma 16S (rRNA). Os dois primeiros primers que sero utilizados (MB1 - MB2) permitem identificar o gnero Mycobacterium. A partir deste produto ps-PCR, poderemos identificar espcies, submetendo este produto a uma segunda amplificao (Nested-PCR) utilizando primers para os Complexos: M. tuberculosis e M. avium (esquema 1). Assim, poderemos contar com um mtodo rpido e relevante para a identificao atravs da amplificao gnica por PCR e Nested-PCR, utilizando fragmentos de nucleotdeos altamente especficos para o gnero Mycobacterium e espcies de micobactrias de importncia na medicina humana.

Literatura recomendada BOOM, R., SOL, C.J., SALIMANS, M., JANSEN P.M., WERTHEIM-VAN DILLEN, J. VAN DER NOORDAS. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol., Washington, v.28, p.495503, 1991. BRASIL, Ministro da Sade. MS/FNS/CRPHF/PNCT. Reunio de avaliao operacional e epidemiolgica do PNCT, na decda de 80 - 90. Braslia, p.15-27, 1992.

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PCR NO DIAGNSTICO DA INFECO PELO VRUS DA HEPATITE C (HCV)

Rozangela Verlengia, Msi Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata Prof. Assoc. Mario Hiroyuki Hirata A infeco pelo vrus da hepatite C uma doena infecciosa, usualmente crnica e comumente assintomtica por muitos anos, estando relacionada com o desenvolvimento de cirrose e carcinoma hepatocelular. O conceito e a importncia da hepatite no-A, no-B surgiram da observao que cerca de 2 20% dos pacientes transfundidos desenvolviam hepatite, dos quais 90% no apresentavam evidncia de infeco aguda pelo vrus da hepatite A (VHA), vrus da hepatite B (VHB), citomegalovrus (CMV) e vrus Epstein-Barr. Estas hepatites passaram a ter a denominao de hepatite no-A, no-B ps-transfusional (HNANB-PT). Doena idntica foi tambm verificada em pacientes expostos a derivados do sangue (especialmente nos receptores de fatores de coagulao, como o caso dos hemoflicos) e entre os usurios de droga endovenosas. Paralelamente, observou-se que alguns pacientes sem antecedentes de transfuso, com uso de drogas injetveis ou de outra forma de exposio parenteral tambm podiam apresentar clnica, laboratorial e histologicamente a doena identica hepatite transfusional. Tais casos passaram a ser denominados de "forma espordica". Atualmente, aps a identificao do agente etiolgico dessas hepatites e constatao de tratar-se de um agente nico, essas hepatites passaram a receber a denominao de hepatite C. A descoberta do vrus da hepatite C tem sido descrita como um evento totalmente dependente das tcnicas da Biologia Molecular. No final da dcada de 70, estudos baseados na transmisso da hepatite C chimpanzs, atravs do plasma de pacientes portadores de hepatite C, j haviam sugerido que o agente etiolgico dessa doena era um vrus. Porm, dificuldades relacionadas principalmente com a baixa concentrao do antgeno obtida, impediam de se obter resultados conclusivos nos ensaios imunolgicos empregados. Choo et al. (1989), utilizando tcnicas de Biologia Molecular, construiram uma biblioteca de cDNA a partir do cido nucleco proveniente do plasma de chimpanz infectado com hepatite C, obtida atravs do isolamento por ultracentrifugao e clonagem em bacterifago gt 11. A triagem dos fagos recombinantes gt 11 permitiram a identificao de dois clones positivos, denominados 5-1-1 e c100-3. Os quais, foram juntamente com outros antgenos clonados, utilizados no desenvolvimento de ensaios imunolgicos (ELISA e RIBA) para a deteco de anticorpos anti-HCV. Anlise da sequncia de DNA do HCV revelou que a organizao genmica e o perfil hidrofbico eram similares aos dos vrus pertencentes famlia do Flaviviridae. Consequentemente, o HCV foi classificado como um gnero separado dentro desta famlia. O genoma do HCV uma molcula de RNA fita simples, sense positiva de aproximadamente 9.400 nucleotdeos. O genoma do HCV contm uma nica e longa fase de leitura aberta (Open Reading frame, ORF), a qual codifica para uma poliprotena de 3.010 3.033 aminocidos. Esta poliprotena clivada em protenas funcionais atravs de proteases virais e do hospedeiro. A regio N-terminal codifica para as 6 0

protenas estruturais do ncleo (core) e do envelope (E1 e E2/ NS1). A regio C terminal codifica para as protenas no estruturais (NS) as quais esto envolvidas no ciclo de replicao. Uma das caractersticas dos vrus RNA a alta frequncia de mutaes devido a perda da atividade na correo de leitura proof reading da polimerase dependente de RNA. Como resultado, os vrus RNA in vivo forma populaes diversas, chamadas de quasispecies que contm uma ou mais sequncias principais e um largo espectro de variantes completamente relacionadas. Dentro deste contexto, estudos recentes indicam que o genoma do HCV heterogneo tanto entre indviduos quanto no mesmo indviduo. A diversidade na sequncia de nucleotdeos do genoma viral, possibilitou classificar o HCV em 9 grandes grupos e 28 subtipos. A fase aguda da hepatite C usualmente subclnica ou moderada e clinicamente indistinguvel de outras forma de hepatites virais. Pacientes apresentando sinais clnicos de doena heptica, tais como ictercia, so raros. Sintomas semelhantes a fadiga e sensibilidade heptica so eventualmente observados, porm a maioria dos casos so assintomticos por um perodo significativamente prolongado, at que se desenvolva disfuno heptica crnica. Apesar da manifestao clnica discreta, as infeces com HCV apresentam tendncia significativa em cronificar-se, cujo processo bastante lento. Alm do desenvolvimento de cirrose heptica, tem-se observado tambm a presena do carcinoma hepatocelular (HCC), associado a infeco crnica com o vrus C. A hepatite C transmitida principalmente via produtos do sangue, destacando a transfuso de sangue e seus derivados. O uso de drogas injetveis, tem-se apresentado como um fator de risco importante para a infeco com o vrus da hepatite C. A transmisso por outros fludos biolgicos, tais como, saliva, lgrima, urina, smem e secreo vaginal ocorre com menor freqncia, provalvelmente devido ao baixo ttulo do vrus C no sangue e no fludo biolgico dos portadores de HVC (10 2 a 107 cpias/ml). Recentemente foi mostrado que a transmisso do HCV a partir de mes infectadas para s crianas, estava relacionada ao ttulo do RNA do HCV na me. Neste estudo, as mes que apresentaram anticorpos antiHCV e que foram RNA negativas no transmitiram HCV para seus bebs. Mes RNA-HCV positivas, cujas crianas tornaram-se infectadas, mostraram uma tendncia a ter um ttulo 100 vezes maior do que mes RNA-HCV positiva, cujas crianas no adquiriram o HCV. Vale a pena salientar, que a exposio a uma quantidade relativamente pequena de sangue ou de outros fludos biolgicos pode tornar-se um fator significante de risco para HCV nos casos em que os nveis de vrus circulantes so elevados. O fato de ser uma doena transmissvel, somado alta taxa de cronificao com o desenvolvimento de cirrose e carcinoma hepatocelular, torna a hepatite C uma doena de importncia tanto social quanto mdica. A presena de anticorpos anti-HCV em pacientes infectados com o vrus C e a clonagem de vrios segmentos do genoma viral, por exemplo 5-1-1, c100-3, c-33c, c-22-3 e c-200, levaram ao desenvolvimento de ensaios imunolgicos, correntemente aprovados para a triagem do sangue dos doadores, possibilitando um grande avano na descoberta do controle da infeco por HCV, evitando uma disseminao desenfreada da doena. 6 1

O primeiro teste imunolgico a ser utilizado, foi um imunoensaio enzimtico de primeira gerao (EIA) contendo um antgeno recombinante, C 100-3, proveniente da regio no estrutural do vrus. A alta freqncia de resultados falso-positivo e falso-negativo (ambos acima de 20%), particularmente quando usado para triar populaes de baixo risco, tais como, doadores de sangue, levou a necessidade de se desenvolver novos ensaios. Atualmente, os imunoensaios consistem da deteco de anticorpos contra vrios antgenos recombinantes HCV-especficos fixados sob uma fase slida, denominados testes de ELISA de segunda e terceira gerao. Nos testes de segunda gerao, os antgenos utilizados so: C100-3; NS4; C33c (NS3) e C22-3 (core). J os de terceira gerao utilizam os antgenos: NS3; NS4; NS5/5N1S (core). Esses antgenos tem sido tambm empregados em ensaios denominados de RIBA (Radio imunoblot assay - Ortho Diagnosis, Raritan, N.J., USA) para confirmao da triagem de resultados anti-HCV. O RIBA consiste de uma fita de nitrocelulose contendo protenas recombinantes indviduais associadas com a protena Superoxido Dismutase (SOD), com as quais os anticorpos anti-HCV presentes no soro podem reagir. Nesse ensaio, introduzido um controle com a protena SOD sozinha, para detectar auto-anticorpos anti-SOD, que poderiam resultar em teste falso-positivo. Usando esses ensaios atuais de ELISA, a sensibilidade para a deteco dos anticorpos anti-HCV de cerca de 94% 100% e a especificidade maior que 97%. Entre as possveis causas de resultados falsonegativos com os ensaios correntes a heterogeneidade viral. Os testes so produzidos a partir de sequncias de gentipos predominantes de HCV (tipo 1a), cujos antgenos no reagem com anticorpos de pacientes infectados com gentipos menos comuns. J condies associadas com resultados sorolgicos falso-positivo incluem hipergamaglobulenemia e desordens do tecido conjutivo. Outras limitaes constadadas com uso dos ensaios imunolgicos so as relacionadas com o perfil de soroconverso. Normalmente a soro-converso do anti-HCV tardia, ou seja, ocorre aps o incio dos sintomas clnicos da doena ou a elevao das transaminases (ALT e AST), podendo ento o anticorpo antiHCV ser detectado entre a oitava e dcima semana aps o contato com o vrus. J no caso dos pacientes imunossuprimidos, este perodo torna-se mais significativamente prolongado, uma vez que, o tempo de soroconverso e a evoluo da resposta imune so manifestados tardiamente. Outro aspecto, o fato de que os ensaios de anticorpos podem promover evidncias de exposio ao HCV porm, so incapazes de diferenciar entre uma infeco presente ou passada. Pacientes na fase inicial da soro-converso apresentam resultados inconclusivos pelos ensaios imunolgicos. Claramente, pacientes infectados recentemente apresentam soro com reao fraca (indeterminada) que, ocasionalmente, torna-se positivo, com o passar do tempo se obtidas outras amostras em coletas posteriores. Comumente, a soro converso para o anti-HCV completamente tardia aps o incio da ictricia ou elevao dos nveis das transaminases e o anticorpo pode no ser detectado at 8 a 12 semanas aps a infeco. Neste estgio, a reao EIA fraca e deve ser confirmada atravs do RIBA ou Western blot. As falhas metodolgicas observadas nos ensaios imunolgicos para o diagnstico da hepatite C, definiu a necessidade de novos ensaios diagnsticos que proporcionem maior confiabilidade quanto: (i) 6 2

especificidade e sensibilidade (ii) definio de infeco passada ou recente e (iii) avaliao da atividade viral, em relao a doena heptica, seu prognstico e a convenincia a terapia antiviral. Considerando as limitaes observadas no uso dos ensaios imunolgicos e a ausncia de um sistema de cultura in vitro para o HCV, os mtodos de deteco do genoma viral devem ser mais indicados para solucionar estes problemas, aprofundando o conhecimento dos mecanismos das infeces por HCV e, teoricamente, oferecendo um parmetro mais adequado para diferenciar os pacientes virmicos dos pacientes sem virmia. Nesse campo de pesquisa, destaca-se a reao em cadeia da polimerase (PCR), onde ocorre a amplificao do genoma viral, para detectar o RNA-HCV no soro. A deteco do vrus da hepatite C processa-se atravs da transcrio reversa e subsequente amplificao do genoma viral atravs da PCR (RT-PCR), que possibilita o diagnstico da infeco pelo vrus C antes de qualquer outro mtodo tradicional. Por essa tcnica, o RNA-HCV pode ser detectado no soro uma a duas semanas aps a transfuso sangunea, antes do incio clnico da infeco ps-transfusional pelo HCV. A PCR, tambm, tem significativa aplicao nos casos onde o imunoensaio RIBA fornece resultados indeterminados ou no-reativos. Um ponto crucial na deteco do RNA-HCV a escolha dos iniciadores para o uso diagnstico, os quais devem corresponder as sequncias genmicas bem conservadas nas diferentes variantes do HCV, de modo a garantir uma boa sensibilidade. No caso do HCV, pesquisa-se a regio 5' no transcrita, que a mais conservada dentro do genoma viral. Todos os protocolos dependem da reao de transcrio reversa, que faz a cpia de DNA complementar (cDNA), a partir do RNA viral extrado. O cDNA pode ser, ento, amplificado pela PCR cujo produto pode ser analisado por eletroforese ou por um sistema de hibridizao. Alguns pesquisadores tem utilizado, alm da amplificao convencional, um ciclo adicional de amplificao com a utilizao de iniciadores internos (Nested PCR). especificiade e a sensibilidade da tcnica de PCR original. Cada vez mais, tem-se demonstrado a importncia da PCR na investigao da infeco pelo vrus da hepatite C, seja no reconhecimento do tipo de vrus infectante e posterior classificao ou na avaliao da carga viral. Estudos recentes tem sugerido que o gentipo do HCV e o nvel de viremia esto associados com o desenvolvimento clnico da doena. Com relao ao gentipo, o HCV tipo 1b parece estar particularmente associado com doena crnica do fgado mais severa, cirrose e carcinoma hepatocelular, com ou sem o passo intermedirio da cirrose. A quantidade de partculas virais no sangue tambm parece ser dependente do gentipo viral, uma vez que, pacientes infectados com HCV tipo 2 mostra um nvel significantemente menor de RNA-HCV circulante. Outra importante aplicao da PCR para o HCV o acompanhamento da resposta terapia antiviral em pacientes com hepatite C crnica, em particular ao interferon (IFN). O IFN promove o rpido decrscimo dos nveis sricos de alanina aminotransferase (ALT), a erradicao do genoma do HCV do soro e a melhora do estado de inflamao e necrose do fgado. Alta viremia do HCV (superior a 10 7 cpias/ml de soro) prognstico negativo para uma completa e adequada resposta ao tratamento com o IFN . Portanto, a avaliao da eficcia teraputica ao IFN mais adequadamente realizada pela quantificao do RNAHCV, que somente possvel por tcnicas moleculares. 6 3 Essa tcnica aumenta significativamente a

A quantificao do RNA viral, tem sido realizada por vrios mtodos de amplificao do RNA-HCV, o mais usualmente empregado a PCR competitiva (Roche Monitor Kit). Nessa tcnica, a amostra diluida seriadamente e cada diluio submetida reao de amplificao juntamente com um controle interno, com o qual compete, revelando diferentes sinais. Outro ensaio tambm disponvel o branched DNA (Quantiplex, Chiron Corp), um mtodo de amplificao de sinal de fase-slida. Neste mtodo, o soro adicionado sob um suporte slido, onde ocorre a lise do vrus, a captura e a hibridizao do cido nucleco a ser detectado e a amplificao do sinal. Embora essas tcnicas sejam muito sensveis, os resultados obtidos tem mostrado variao do nvel de viremia dos pacientes infectados. No caso do branched DNA, este demonstrou ser significativamente menos sensvel (deteco limite 350.000 cpias/ml) do que o PCR competitivo (deteco limite aproximadamente 2000 cpias/ml). Um estudo recente de comparao entre 31 laboratrios mostrou uma substancial variao de sensibilidade e especificidade desses mtodos. Portanto, verifica-se a necessidade de aprimoramento metodolgico e aplicao das tcnicas moleculares de forma mais rotineira na busca do diagnstico precoce e do acompanhamento teraputico adequado.

Literatura recomendada CHOO, et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science, 244: 359-62, 1989. DAVIS, G.L. et al. Quantitative detection of hepatitis C virus RNA with a solid-phase signal amplification method: definition of optimal conditions for specimen collection and clinical application in interferontreated patients. Hepatology, 19: 1337-41, 1994. DI BISCEGLIE, A. et al. Long-term clinical and histopathological follow-up of chronic posttrasnfusion hepatitis. Hepatology, 14: 969-74, 1991.13 MATTSSON, L. et al. Outcome of acute symptomatic non-A, non-B hepatitis: a 13year follow-up study of hepatitis C virus markers. Liver, 13: 274-278, 1993. McPHERSON, R.A. . laboratory Diagnosis of Human Hepatitis Viruses. J. Clin. Lab. Analysis. 8: 369-377, 1994. MILLER, R.H. PURCELL, R.H. . Hepatitis C virus shares amino acid sequence similarity with Pestiviruses and Flaviviruses as well as members of two plant virus supergroups. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 87: 2057-2061, 1990. OTHO, H. et. al. Transmission of hepatitis C virus from mothers to infants. N. Engl. J. Med. 300: 744-750, 1994. REICHARD, O. Treatment of chronic hepatitis C. Sacand. J. Infec. Diseases, 22 (4): 509, 1990. RUBIN, R. A. chronic hepatitis C Advances in Diagnostic testing and Therapy. Arch. Intern. Med. 154: 387392, 1994. RSTER, B. et al. Quantification of hepatitis C virus RNA by competitive Reverse Transcription and Polymerase chain Reaction using a modified Hepatitis C Virus RNA transcript. Analytical Biochemistry 224: 597-600, 1995. SHINDO, M. et al. Decrease in hepatitis C viral RNA during alpha-interferon therapy for chronic hepatitis C. Ann. Intern. Med. 115: 700-4, 1990. STEINHAUER, D.A. et al. Sequential change of the hypervariable region of the hepatitis C virus genome in acute infection. J. Med. Virol. 42: 103-108, 1987.

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PCR NO DIAGNSTICO DA INFECO PELO VRUS HIV

Claudio Mortensen

1. Deteco e Quantificao do Vrus HIV Por PCR:

1.1. Introduo:
O vrus HIV membro da famlia dos retrovrus sendo que, seus vrions (partculas individuais), possuem uma forma aproximadamente esfrica com algo em torno de 110nm de dimetro. um vrus contendo um envelope com nucleocapsdeo em forma de cone. O genoma viral composto por 2 molculas de RNA simples-fita, de 9,2kb, com polaridade positiva em relao a traduo (Fields). O genoma HIV j foi totalmente seqenciado e analisado, sendo que seu genes receberam a seguinte nomenclatura (6): gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nef. As protenas sintetizadas a partir do gene gag compem o ncleo (core) que envolve o genoma viral. O gene gag traduzido na forma de uma protena precursora Pr55gag, que posteriormente clivada para compor as protenas p17 (protena de matriz), p24 (protena estrutural do capsdio), p9 (protena do ncleocapsdio que se liga fortemente ao RNA viral) e p7. O gene pol tambm traduzido na forma de um precursor, Pr160 gag-pol e codifica para as enzimas virais: Protease (p10), Transcriptase Reversa e RNase-H (p51/66) e Integrase (p32). O gene vif (protena p23), parece atuar como um fator de infectividade, mas sua funo ainda no foi totalmente elucidada. A funo do gene vpr (protena p15) ainda no conhecida. A protena p14, codificada pelo gene tat, atua como transativador transcripcional, interagindo com fatores de transcrio celulares e a seqncia TAR viral, promovendo a iniciao e elongao dos transcritos virais. O gene rev (protena p19), indispensvel replicao viral, age como transativador ps-transcripcional, ligando-se seqncia RRE viral e fatores celulares, promovendo "splicing" e/ou transporte do mRNA viral. O gene vpu (protena p16) influencia a liberao das partculas virais e aumenta o turnover do antgeno CD4+. O gene env codifica a glicoprotena precursora gp160, que posteriormente clivada para formar a gp41, transmembranar, e a gp120, glicoprotena de face externa, responsveis pela ligao do vrus ao receptor celular. Por fim, o gene nef (protena p27) potencializa a infectividade viral (18).

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6 5

Em seu processo de replicao (produo de novas partculas virais), o HIV necessita da formao de uma molcula intermediria de DNA, a qual integra-se ao genoma celular, permanecendo como parte integrante deste, durante todo o perodo de vida da clula em questo. A informao gentica para a sntese dos componentes do vrus, inclusive do genoma RNA, proveniente deste DNA (denominado DNA pr-viral) integrado. Esta molcula intermediria de DNA sintetizada a partir do "molde" de RNA viral, pela enzima Transcriptase Reversa, codificada pelo vrus e transportada no interior da partcula viral. A seguir, atravs de mecanismos ainda no muito bem definidos, a molcula de DNA recm sintetizada, transportada para o ncleo celular onde ser integrada ao genoma por ao de outra enzima viral, tambm presente no vrion, a Integrase. Tanto a Transcriptase Reversa quanto a Integrase, so produtos do gene pol.

1.2. Deteco do Genoma Viral por PCR:

O mecanismo, bastante peculiar, de replicao dos retrovrus, possibilita dois caminhos para a deteco da presena do vrus HIV no organismo humano: a demonstrao da presena do DNA pr-viral integrado ao genoma celular e a deteco do RNA viral presente nas partculas livres circulantes. A este ponto, importante esclarecer determinados aspectos da histria natural da infeco pelo vrus HIV. At pouco tempo atrs, havia um certo consenso entre os cientistas e os clnicos de que muito poucas clulas estariam infectadas ou expressando o genoma viral e que existiria muito pouco vrus circulante, livre no plasma, durante a maior parte do curso clnico da doena. Sendo assim, foram desenvolvidos modelos para a doena AIDS, os quais consideravam um perodo de latncia virolgica durante a fase assintomtica da mesma. Entretanto, mais recentemente, trabalhos publicados por Ho, D. e Wei, X., demostraram que o vrus HIV replica-se muito mais rapidamente e muito mais precocemente do que era imaginado. Estes trabalhos provaram que o perodo de latncia na verdade clnico, pois o vrus replicase numa velocidade bastante alta, j imediatamente aps infectar a primeira clula e, um equilbrio entre esta produo de vrus e a reposio de clulas CD4+ acaba por estabelecer-se e, at que se esgote a capacidade do organismo em manter este dispendioso equilbrio, o paciente poder no apresentar sintomas. Em vista disso fica claro que em qualquer momento ps-infeco, podero ser encontradas partculas virais circulantes, contudo, necessrio que haja uma quantidade mnima de partculas virais para que a tcnica de PCR seja capaz de detect-las. Sob condies ideais, ou seja, tendo-se um protocolo muito bem otimizado para a reao de PCR, seu limite de sensibilidade ser de 200 cpias do genoma por ml de plasma. muito importante que se tenha conscincia destes dados, pois haver um perodo de tempo ps-contaminao, embora muito menor do que para os testes imunolgicos, em que no ser possvel detectar-se a presena do vrus. Este perodo de tempo foi estimado em aproximadamente 9 dias pscontaminao. Outro ponto que deve ser observado, com relao ao PCR aplicada AIDS, diz respeito ao diagnstico de crianas nascidas de mes portadoras do HIV. O risco de um recm nascido, de me portadora do HIV, ter sido infectado por via placentria (transmisso vertical) foi calculado em um valor 6 6

aproximado de 30%, portanto bastante importante que se possa diagnosticar o quanto antes o nvel de infeo da criana. Entretanto, os mtodos imunolgicos ficam sujeitos a resultados falso-positivos devido ao fato da criana, at 3-6 meses aps o nascimento, estar portanto anticorpos provenientes da me, herdados durante a gestao. Sendo assim, o mtodo mais seguro de detectar-se a presena do vrus, comprovar o genoma prviral integrado no genoma celular. A pesquisa de partculas livres no plasma da criana tambm poderia levar a resultados falsos, pois uma grande parte dos vrions produzidos pelas clulas, so inativos (no infectantes) e, sendo assim, a criana poderia portar partculas virais inativas em sua circulao, que no teriam estabelecido uma infeco produtiva, mas que estariam sendo detectadas pela alta resoluo da tcnica de PCR. Assim sendo, apresentamos aqui um mtodo de PCR para o diagnstico de infeco pelo vrus HIV que utiliza a tcnica de Nested PCR na deteco do DNA pr-viral integrado ao genoma celular. O protocolo descrito a seguir utiliza um conjunto de primers, desenvolvidos por este laboratrio, complementares a regies altamente conservadas, presentes na seqncia do gene gag, gerando um produto de amplificao de 495pb. O DNA isolado das clulas mononucleares do sangue perifrico utilizando-se o mesmo protocolo j descrito nesta apostila. Este DNA, normalmente estoca em geladeira ou freezer, aquecido a 58OC durante 20 min. antes de ser adicionado reao. Ao adicionar-se os componetes de reao aos tubos, importante seguir uma determinada ordem. Portanto, aps descongelar todos os componentes, o primeiro a ser adicionado a gua, a seguir o Tampo de Reao, dNTP, Primers e, s ento, o DNA, que pode ser mantido no banho-maria a 58 OC at o momento de ser adicionado aos tubos. Cuidados especiais devem ser tomados a este ponto, pois o DNA genmico humano uma molcula bastante grande, tornando a soluo em que est contida, muito viscosa. Recomenda-se utilizar ponteiras especiais de ponta larga ou, na falta destas, cortar as pontas para torna-las mais largas em sua abertura. Aps a adio do DNA aos tubos de reao, estes so transferidos ao aparelho de PCR para a primeira etapa de reao, o HOT START, ou pr-aquecimento da amostra a 98 OC durante 10min. O objetivo desta prtica desfazer possveis estruturas secundrias da molcula de DNA, as quais poderiam afetar sensivelmente a assessibilidade dos primers aos seus stios correspondentes. Quando terminados os 10min., aciona-se a funo PAUSA do aparelho, retira-se os tubos colocando-os em gelo imediatamente. No interior do fluxo laminar, adiciona-se a Taq DNA polimerase, retornando os tubos ao aparelho e liberando-se a funo pausa. A reao prosseguir por 35 ciclos. Finalizado o primeiro PCR, sero retirados 10l desta reao e adicionados em outra contendo o segundo conjunto de primers (nested), sempre respeitando a ordem de adio dos componentes. A diferena desta reao com a primeira, a inexitncia de HOT START, pois aqui as molculas alvo j possuem um tamanho milhares de vezes menor do que as da amostra inicial.

Literatura recomendada 6 7

Amato Neto, V.; Medeiros, E.A.S.; Kalls; E.G.; Levi, G.C.; Baldy, J.L.S.; Medeiros, R.S.S. (1996). AIDS na Prtica Mdica. Sarvier, So Paulo. Cohen, P.T.; Sande, M.A.; Volberding, P.A. (1994) The AIDS Knoledge Base. Second Edition, Little, Brown and Company, Boston. DeVita, V.T.; Hellman, S.; Rosemberg, S.A. (1991) AIDS: Etiology, Diagnosis, Treatment, and Prevention. Third Edition. J.B. Lippincott Company. Philadelphia. Fields, B.N.; Knipe, D.M.; Howley, P.M. (1996). Fields Virology, Third Edition. Lippincott-Raven, Philadelphia. Ho, D.D., Neumann, A.U., Perelson, A.S., Chen, W., Leonard, J.M., Markowitz, M. (1995). Rapid turnover of plasma virions and CD4+ lymphocytes in HIV-1 infection. Nature, 373: 123. Kwok, S.; Mack, D.H.; Mullis, K.B. (1987). J. Virol., 61: 1690. Phair, I.P., Wolinsky S. (1989). Diagnosis of infection with the human immunodeficiency virus. J. Infect. Dis., 159: 320. Varmus, H.E., Swastrom, R. (1985). Replication of retrovirus. in Weiss, R., Teich, N., Varmus, H.E., et al. (eds.): RNA Tumor Virus, ed. 2. Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory, pp 74. Wei, X., Ghosh, S.K., Taylor, M.E., Johnson, V.A., et al. (1995). Viral dynamics in human immunodeficiency virus type 1 infection. Nature, 373: 117. White, D.O.; Fenner, F.J. (1994). Medical Virology, Fourth Edition. Academic Press, San Diego.

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 Aula nmero 7

PCR E RFLP NA IDENTIFICAO DE INDIVDUOS

Prof. Assoc. Mario Hiroyuki Hirata Adriana Ozaki Erik Martins Ueda

Introduo

A necessidade de confirmar disputas de paternidade ou relacionamento familiar sempre existiram. O progresso no desenvolvimento de um meio seguro para a determinao de relacionamento tem ocorrido muito lentamente. A descoberta de Landsteiner do grupo sanguneo ABO em 1900, estabeleceu o que se tornou a base para os estudos de parentescos dos dias modernos, porm a aplicao da descoberta para a determinao de paternidade, s foi demostrado em 1910 por von Dungern e Hirszfeld, conhecida como herana Mendeliana do grupo sanguneo. O prximo evento significante ocorreu em 1927 quando o sistema MN foi descrito por Landsteiner e Levine. Este foi seguido pela descoberta, em 1939-1940, do sistema Rh-Hr por Levine, Stetsun, Landsteiner e Wiener. A aplicao do conhecimento desses sistemas fornece uma mdia de excluso da paternidade de aproximadamente 55% dos homens supostamente acusados. A combinao dos sistemas ABO, Rh e MN, tornou possvel excluir 70% dos homens caucasianos supostamente acusados da paternidade, e os testes de parentesco foram reconhecidos pelo seu valor de excluso, mesmo que estes tivessem alcance limitado. Apesar dessas deficincias, esses testes foram utilizados at fins de 1960 e meados de 1970, quando a utilidade do sistema de antgenos leucocitrios humanos (HLA) foi reconhecido legalmente e cientficamente como um mtodo para avaliao nos testes de paternidade. Os testes, usando mltiplos sistemas, incluindo o HLA, ento forneceram um meio prtico para a excluso de pelo menos 95% dos supostos pais, no entanto, ainda no totalmente adequada para esse fim. Recentemente, tcnicas baseadas no estudo de sequncias polimrficas do DNA tem dado de forma muito segura a definio adequada para a identificao de indivduos. A anlise de sequncias polimrficas no DNA , atualmente, a ferramenta mais poderosa para distinguir geneticamente os indivduos ou determinar nveis de relacionamento familiar. Os testes com DNA superam os resultados obtidos pelos mtodos tradicionais, e podem solucionar de forma segura os resultados tidos como inconclusivos pelos mtodos considerados tradicionais. Por essas razes, foram realizadas uma srie de estudos de marcadores genticos para determinar a real definio de um vnculo familiar. A crescente demanda de testes de identificao, estimulou a comunidade cientfica a desenvolver metodologias com maior grau de discriminao que permite com segurana incluir ou excluir a paternidade ou relao familiar. Esses marcadores genticos so caractersticas herdadas que diferenciam os indivduos uns dos outros e so controlados por genes localizados em um par de cromossomos, denominados alelos. Apenas dois alelos esto envolvidos na formao de uma caracterstica especfica, um do pai outro da me. Quando o par de genes for idntico, chamado de homozigoto; quando o par de genes for diferente, de heterozigoto.

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 necessrio tambm uma escolha adequada dos alelos para um estudo detalhado da ocorrncia, a fim de aumentar a preciso e exatido no resultado final.

Repeties Sucessivas de Nmero Varivel (VNTR) e Repeties Sucessivas Pequenas (STR)

Vrios locos de DNA so amplamente utilizados em anlises forenses, os mais utilizados so

aqueles contendo as denominadas Repeties Sucessivas de Nmero Varivel ((Variable Number Tandem Repeat). Estas sequncias no codificam um gene especfico, podendo assim serem utilizadas para anlises forenses sem nenhuma consequncia ao indivduo. Isto uma vantagem pois as VNTR so menos suscetveis a seleo natural, que poderia levar a diferentes frequncias de alelos em populaes diferentes. As VNTR tem sido tambm denominadas de minisatlites. Uma regio tpica de VNTR consiste de 500 a 10,000 bp, compreendendo vrias unidades de repeties sucessivas, cada uma com 15 a 35 bp em comprimento. O nmero exato de repeties assim como o comprimento da regio de VNTR, varia de um alelo para outro, e diferentes alelos podem ser identificados pelo seu comprimento. Os locos VNTR so particularmente convenientes como marcadores para identificao, pois eles possuem um grande nmero de alelos diferentes, geralmente 100 ou mais, embora apenas 15 a 25 possam ser distinguidas (A palavra alelo tradicionalmente aplicada como forma alternativa de um gene; entretanto, pode-se extrapolar o significado para regies no gnicas do DNA, como as VNTR). As VNTR tem uma alta taxa de mutao, levando as mudanas no comprimento. Uma mutao individual usualmente muda o comprimento por apenas uma ou poucas unidades de repetio. O resultado um grande nmero de alelos na populao com diferentes sequncias. O nmero de possveis gentipos em um loco muito maior que o nmero de alelos, e quando diversos locos so combinados, o nmero total de gentipos muito grande. Famlias de microsatlites de DNA compreendem arranjos de repeties consecutivas de pequeno tamanho (Short Tanden Repeat, STR), que apresentam sequncias simples (1-4 bp) e esto localizados ao longo do genoma. Normalmente repeties dos mononucleotdeos A e T, so comuns e juntos so responsveis por cerca de 10 Mb ou 0,3% do genoma nuclear. Em contraste, sequncias de G e C so bem mais raras. No caso de repeties de dinucleotdeos, arranjos de repeties CA (repeties de TG na fita complementar) so comuns, compreendendo 0,5% e so altamente polimrficos. Repeties CT/TG so tambm comuns, ocorrendo em cada 50 kb, em mdia, e sendo responsvel por cerca de 0,2% do genoma. Por outro lado, sequncias de CG/GC so raras. Isso se deve ao fato de que resduos de C ligados em sua extremidade 3 por um resduo G (CpG) so suscetveis metilao e desaminao, resultando em TpG (ou CpA na fita complementar). Repeties consecutivas de trinucleotdeos e tetranucleotdeos so rarssimas, porm altamente polimrficas, sendo candidatas a marcadores genticos do polimorfismo entre indivduos.

RFLP na Identificao de Indivduos

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A maioria do DNA no genoma humano no parece codificar genes especficos, mas parece ter um papel na integridade estrutural do cromossomo ou em sua replicao. Como vimos, o DNA no codificante contm vrias sequncias repetitivas, sendo possvel a anlise de DNA para identificao de indivduos. A garantia de que o DNA apresenta repetio nica para cada indivduo, ou polimorfismo, o torna singular pelo nmero caracterstico dessas repeties. Neste contexto, essa caracterctica muito singular pode servir como parmetro muito importante na caracterizao de um indivduo, porque diferentes tamanhos de fragmentos de DNA so encontrados, aps digesto do DNA com enzimas de restrio, e hibridizao com sondas alelo-especficas. Considerando a frequncia desses fragmentos polimrficos na populao e possveis variaes tnicas, o teste de DNA tem a capacidade de fornecer as probabilidades mais exatas de incluso ou excluso de indivduos num contexto forense ou de vnculo familiar. Consequentemente muita ateno tem sido dada para a padronizao desses novos mtodos em laboratrios forenses. Tcnicas similares tem sido usadas para teste de paternidade em casos legais. Uma aplicao potencial a anlise da sequncia dos nucleotdeos nos gens HLA para definir identidade imunolgica. Essa aplicao fornece uma oportunidade para se encontrar os melhores doadores. Uma outra aplicao seria estabelecer suscetibilidade a patologias autoimunes em indivduos com alteraes especficas nos genes HLA. Os locos de VNTR consistem em numerosas cpias de sequncias simples de DNA, em um intervalo de comprimento que varia de 9 a 14 pares de base (bp), alinhados de forma contnua. Estudos sobre populaes humanas tem revelado que o nmero de repeties sucessivas presentes em um determinado loco pode exibir uma grande variao de um indivduo para outro, dessa forma se estabelecem como marcadores genticos que so altamente informativos de acordo com o espcime biolgico. O uso de vrios locos VNTR independentes e hipervariveis fornecem informao muito importante condiderando uma fonte de espcime biolgico a ser identificado. A anlise por RFLP de locos de VNTR envolve a purificao do DNA de fludos corporais ou esfregaos de bipsias, seguida da digesto do DNA com a enzima de restrio (p. ex. Hae III). Os fragmentos de DNA resultantes so separados por eletroforese, utilizando gel de agarose; Os fragmentos separados so ento desnaturados e transferidos para uma membrana de nylon (Southern Blot). A membrana ento hibridizada com sondas marcadas isotopicamente ou por mtodos no-isotpicos (p. ex., enzimtico) especficas para o locos de VNTR de interesse. Os mtodos no-isotpicos so preferidos, pois no necessitam dos cuidados na manipulao que a conduta de segurana exige para os materiais radioativos. A enzima fosfatase alcalina muito utilizada na revelao, onde so utilizados substratos coloridos ou quimioluminescentes. O mtodo luminescente tem seus incovenientes, pois requer um sistema com produo contnua de luz para que o sinal possa ser coletado com o decorrer do tempo (para aumentar a sensibilidade) e se for necessrio, a exposio mltipla do filme. Os sistemas quimioluminescentes mais sensveis so aqueles que emitem luz continuamente e a reao enzimtica envolve a clivagem de substratos 1,2-dioxitanos estabilizados. Esses sistemas tem sido amplamente aplicados em pesquisas genticas. O sistema de deteco quimioluminescente pode substituir as sondas marcadas com 32P usadas nos sistemas de quantificaes de DNA e tipagem por RFLPs. 7 1

Tipos de Sondas utilizadas no RFLP

Para anlise de regies hipervariveis (VNTR) so utilizadas sondas moleculares complementares a estas sequncias repetitivas, o que possibilita observar as caractersticas de cada indivduo e suas relaes com os pais. No mtodo de RFLP, h sondas multilocais que hibridizam com vrios locos ao mesmo tempo, sendo analisadas vrias bandas de DNA, que correspondem aos alelos respectivos. Os testes com sondas unilocais utilizam a mesma metodologia, entretanto, identifica-se um loco polimrfico do DNA de cada vez, permitindo com simplicidade observar um alelo de origem materna e outro de origem paterna. O limite de deteco das sondas multilocais de 500 ng de DNA, as sondas unilocais apresentam limites muito menores onde quantidades em torno de 30 ng podem ser visualizadas, que permitem espcimes de at 1 L de sangue ou smem para anlise. Essa sensibilidade significa que embora as sondas multilocais fornecerem melhor distino individual as sondas unilocais so as mais utilizadas no contexto forense. Outra vantagem a possibilidade do uso das sondas unilocais em amostras misturadas.

PCR na identificao de indivduos

Uma alternativa que vem dominando as tcnicas moleculares para fins de identificao baseada na tcnica de amplificao do gene utilizando a reao em cadeia da polimerase (PCR). Esse procedimento baseia-se na amplificao especfica de VNTR, presentes em determinados alelos humanos, atravs da hibridizao de oligonucleotdeos (iniciadores ou primers) flanqueando a regio que contm a VNTR. Essa tcnica tem sido denominada Polimorfismo de Tamanho de Fragmento amplificado (AMP-FLP). Atualmente, estes locos altamente polimrficos demonstrados por PCR so os marcadores genticos mais informativos para a caracterizao do indivduo. A PCR permite um aumento da sensibilidade de um procedimento subanaltico para nveis analticos em um perodo de tempo relativamente curto. A tcnica permite o aumento da quantidade de DNA de tal forma que uma simples sequncia pode ser analisada, aps a PCR, em um simples procedimento sem a utilizao de material radioativo ou qualquer outro procedimento mais complexo. As vantagens em relao aos outros mtodos esto no aumento da sensibilidade, especificidade e a reduo no tempo de ensaio. Outra vantagem na utilizao da PCR que ela pode ser realizada com muito pouca quantidade de amostra (a tcnica de PCR pode detectar at 1 fentograma de DNA alvo) e em material fixado com formaldedo, parafinados e em peas de necrpsia ou manchas de sangue secas. Dentre os genes polimrficos utilizados para a caracterizao de indivduos, podemos citar a amplificao de minisatlites nos locos: Apo B (apolipoprotena B), D1S80, D17S30 e microsatlites SE33, D12S67, Y-27H39, vWF (von Willerbrand). Esses alelos podem ser amplificados de amostras contendo pouca quantidade de DNA, o que facilita a utilizao tanto para fins de identificao criminal como para testes de identificao de paternidade. Porm, nem todos os locos de minisatlites e microsatlites existentes podem ser utilizados na investigao de paternidade, sendo os mais adequados os que

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apresentam maior polimorfismo e maior grau de heterozigose. A anlise dos polimorfismos genticos tem sido utilizada como parmetro importante na rea mdica e tambm em anlises forenses.

Clculo da Frequncia dos Alelos

A frequncia dos alelos baseada na ocorrncia de todos os alelos para um dalo loco estudado dentro de mais ou menos 3% do tamanho do banco de dados, que se construiu. Em adio, pode-se escolher alelos com frequncia mnima de 2%.

Clculo estatstico
1. Probabilidade de Excluso A Probabilidade de Excluso (PE) definida como a probabilidade de excluir ao acaso, indivduos da populao dados os alelos da criana e da me. A informao gentica do suposto pai no considerada dentro da determinao da Probabilidade de Excluso. A Probabilidade de Excluso igual a frequncia de todos os homens da populao que no contm os alelos compartilhado obrigatoriamente do alelo do pai e da criana. A equao utilizada para determinar esta probabilidade : PE = (1-a)2 Onde, a = frequncia do alelo da criana herdado do seu pai biolgico (obrigatoriamente o alelo paterno). 2. ndice de Paternidade O ndice de Paternidade (PI) a razo de verossimilhana nas quais os testes apresentam duas probabilidades condicionais. A probabilidade do teste de paternidade supor que o suspeito pai o pai biolgico, comparado com a probabilidade de que ele no seja o pai biolgico. Se ambos os pais so heterozigotos, ento: PI = (0,5)x(0,5)/(0,5)x(fPa) ou PI = (0,5)/(fPa) Onde (fPa) a frequncia do alelo paterno. Padro de banda simples do suposto pai so tratadas como heterozigotos para o clculo de PI.

3. Probabilidade de Paternidade A Probabilidade de Paternidade (W) baseada sobre o Teorema de Bayes nas quais proporciona a determinao de posterior probabilidade para paternidade baseados nos resultados genticos dos testes da me, da criana e do suposto pai. Em ordem de determinao da Probabilidade de Paternidade, a suposio deve ser marcada (antes do teste) como uma prvia probabilidade de que o suposto pai seja o verdadeiro pai biolgico. A equao usada para o clculo da posterior probabilidade (W) da prvia probabilidade de 0,5 : W= _PI_ 7 3

PI + 1 PI = ndice de Paternidade.

Literatura recomendada Alford, L; Hammond, H. A.; Coto, I.; Caskey, C. T.; (1994). Rapid and Efficient Resolution of Parentage by Amplification of Short Tandem Repeats. Am. J. Hum. Genet. 55: 190-195. Arroyo, E.; Garca-Snchez, F.; Gmez-Reino, F.; Ruiz de la Cuesta, J. M.; Vicario, J. L.; (1994). Prenatal Exclusion of Paternity by PCR-FLP Analysis. J. Forensic Sciences 39 (2): 566-572. Boerwinkle, E.; Xiong, W.; Fourest, E.; Chan, L.; (1989). Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: Application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 212-216. Budowle, B.; Chakraborty, R.; Giusti, A. M.; Eisenberg, A. J.; Allen, R. C.; (1991). Analysis of the VNTR Locus D1S80 by the PCR Followed by High-Resolution PAGE. Am. J. Hum. Genet. 48: 137-144. Budowle, B.; Baechtel, F. S.; Comey, C. T.; Giusti, A. M.; Klevan, L.; (1995). Simple protocols for typing forensic biological evidence: Chemiluminescent detection for human DNA quantification and restriction fragment length polymorphism (RFLP) analyses and manual typing of polymerase chain reaction (PCR) amplified polymorphisms. Electrophoresis 16: 1559-1567. Decorte, R.; Cuppens, H.; Maynen, P.; Cassiman, J. J.; (1990). Rapid Detection of Hypervariable Regions by the Polymerase Chain Reaction Technique. DNA and Cell Biology 9 (6): 461-469. Horn, G. T.; Richards, B.; Kingler, K. W.; (1989). Amplification of the highly polymorphic VNTR segment by the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 17: 2140. Jeffreys, A. J.; Wilson, V.; Thein, S. L.; (1985). Hypervariable ' minisatellite' regions in human DNA. Nature 314 (7): 67-73. Silver, H.; (1989). Paternity Testing. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 25: 391-408.

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