Hematopoiese em serpentes (Ophidia) no incio do desenvolvimento ps-natal

Resumo A ocorrncia de hematopoiese foi Estudada em vrias partes da coluna e nas

costelas em quatro espcies de serpentes (Boa constrictor L., Elaphe guttata L., Lamprophis fulaginosus Boie., Bothrops jararaca Wied.) de incubao at 150 dias de desenvolvimento ps-natal. Espaos na medula so formados por condrlise com vrios prazos, dependendo da espcie estudada. Clulas da medula saem para a circulao geral de duas maneiras: atravs de migrao, atravs das clulas endoteliais que revestem as cavidades venosas ou pela ruptura das salincias. Erythroblasts esto presentes no lmen dos seios da medula, sugerindo sua maturao final ali. Diversas relaes do bao com o pncreas foram encontradas. Nenhum foco myelopoietic ocorre no bao, fgado e no rim de qualquer uma das espcies estudadas. Eritropoiese (ilhotas esparsas) foi observada no bao da Bothrops jararaca. Palavras-chave: Hematopoise, Medula ssea, Bao, Desenvolvimento, Serpentes, Ophidia.

Introduo
A diviso de hemcitos dentro do sistema circulatrio considerada a forma mais primitiva da hematopoiese e observada principalmente em invertebrados mais avanados, embora a proliferao que ocorre atravs da diviso do hemcitos prexistentes ou de um poo de clulas-tronco desconhecido (TAVASSOLI and Yoffey 1983). rgos Hematopoiticos com locais de hematopoiese do bao, intestino submucosa, rim e da medula ssea foram encontrados em vrias espcies de anfbios e, no entanto, a formao do sangue intravascular continua sendo citado como um local de eritropoiese. Em telesteos (carpa e peixe-zebra), tecido myelopoietic se desenvolve no rim (Al-Adhami e Kunz, 1977; 1981 Bielek; Cenini 1984; Lieschke et al. , 2001). Espcies de aves e anfbios fornecem bons modelos de animais para o estudo das origens embrionrias do sistema hematopoitico adulto. Curiosamente, o sistema embrionrio adulto e sistemas hematopoitico so gerados de forma independente em Xenopus (Uitz-ciau et al. 2000). Assim, clulas eritrides primitivas observadas nas ilhas de sangue do saco vitelino aviria ou ilhas de sangue ventral extra-embrionrio equivalente local mesodermal em anfbios so clulas transitrias do sangue presentes apenas nas fases embrionrias. Quando o processo de desenvolvimento embrionrio estabelecido, hematopoiese muda gradualmente para os rgos com qual associado na forma juvenil e adulto (Al Rombout al. 2005, Durand e Dzierzak 2005). De acordo com a Jordnia e Speidel (1929) e Zapata et al.(1981), os rpteis ocupam um nvel de transio importante entre anfbios e aves, em relao evoluo dos tecidos hematopoiticos, sendo o bao o principal rgo da eritropoiese em anfbios, enquanto, nas aves, a medula ssea o tecido exclusivo de formao do sangue do adulto. Em rpteis adultos, alguns autores consideram a medula ssea como o local

hematopoitico mais importante (Andrew 1965; Efrati et al. 1970; Taib Cazal-1973). Nos lagartos, granulopoiese um processo extravascular, ao passo que a eritropoiese ocorre no lmen dos seios venosos na medula ssea, mas tambm normalmente detectvel varivel grau de intensidade no bao, fgado e sangue perifricos. Os linfcitos so produzidos no bao, que tambm mantm granulopoiese varivel e atividade erythropoietica, e, o fgado desempenha um papel filial e compensadores para o tecido mielide (Zapata et al. 1981; Pienaar 1962). Na medula ssea de emys orbicularis L. (tartaruga) hematopoiese s foi observado em espcimes com um ano de idade (Vasse Beaupain e 1981). Entre os rpteis modernos, tartarugas viz. , lagartos, crocodilos e cobras, a hematologia dos representantes da ltima ordem mencionada a menos estudada, com as investigaes sobre os aspectos de desenvolvimento sendo especialmente escassos. Assim, seguindo nossos estudos iniciais da hematopoiese em serpentes adultas e a nossa descrio do mecanismo de sada das clulas sanguneas a partir do medula ssea para o sangue perifrico (Sano-Martins et al. 2002), examinamos esses processos em animais recm-nascidos. As formas iniciais da linha de celulas eritrocitria encontrada em diversas ocasies nas rplicas feitas a partir dos baos jovens, sexualmente maturo Bothrops jararaca nos levaram a estudar a possibilidade de atividade hematopoitica neste rgo. No h descries de hematopoiese em serpentes durante o desenvolvimento ps embrional disponveis na literatura.

Materiais e mtodo
Este estudo foi conduzido em amostras das seguintes espcies: Boa constrictor L (n = 16), Elaphe guttata L. (n = 4), Lamprophis fuliginosus Boie (n = 4) e Bothrops jararaca Wied. (N = 4). Todos os animais foram criados e mantidos em um terrrio e foram alimentados de acordo com as normas geralmente aceitas de cuidados de cobra. O estudo foi aprovado pelo Comit de Biotica Local. Aps serem resfriadas em um congelador, as serpentes foram anestesiadas por injeo intraperitoneal de sdio barbitrico (Morbital) em overdose. Os animais foram sacrificados quando eles tinham de 0, 7, 14, 21, 36, 50, 100 e 150 dias de idade. Para microscopia de luz, peas extirpadas da coluna e costelas e amostras de bao, fgado e rim foram fixados em Formol 10%, ou Bouin fixadores de Carnoy. Manchas de sangue, aps fixao em formol ou vapor de metanol, foram corados com corante de Wright, May- Grnwald-Giemsa ou pelo mtodo de Giemsa. Os cortes com parafina foram corados de acordo com o Goldner ou mtodo Movat. O procedimento com cido peridico-Schiff (PAS) para a visualizao de glicosaminoglicanos e glicognio tambm foi realizado. O mtodo com benzidina foi aplicado para demonstrar a presena de hemoglobina. Amostras contendo ossos foram descalcificados em EDTA 10% em temperatura ambiente. Para microscopia eletrnica, peas extirpadas da coluna vertebral e costelas de cobras de 7 dias de idade foram fixados em paraformaldedo 4% e glutaraldedo 2% em tampo fosfato 0,2 M, pH 7,3, por 4 h temperatura ambiente, ps-fixadas em 1% tetrxido de smio no mesmo tampo por 1 h, processado e

posteriormente incorporado em Incorporar 812. Cortes ultrafinos foram contrastados pelo citrato de chumbo e examinados por transmisso de microscopia eletrnica.

Resultados
Coluna A anatomia de duas vrtebras da Boa constrictor apresentada na figura 1 para orientao e para facilitar a compreenso da terminologia anatmica usada. As seguintes peas da coluna vertebral foram submetidas avaliao histolgica: vrtebra tronco anterior (Parte I), vrtebra tronco mdio (Parte II), a maior parte posterior da vrtebra (Parte III) vrtebra cloacal (Parte IV) e vrtebra caudal (Parte V). No estudo das espcies de serpente, o aumenta de tamanho da serpente foram acompanhados pelo aumento no volume das cavidades da medula aparecendo nos seguintes locais das vrtebras:

(1) Espinha neural (Fig. 1b). Geralmente, durante as primeiras semanas aps a incubao, apenas uma cavidade medular (ou raramente duas) foram vistas, aumentando para dois ou trs depois. Isso no era uma caracterstica especfica da espcie, mas dependia da amostra dada. (2) Desde os primeiros dias de desenvolvimento, medula com todos os tipos de clulas apareceram nas paredes do arco neural em os processos transversais da sua parte anterior, isto , o prezygapophysis localizao do conjunto capitular (Fig. 2) e postzygaphysis em sua parte inferior, ou seja, Zigapofisria a faceta articular da costela. Nenhum processo espinhal foi vistos junto da parte IV (vrtebra cloacal) na parte V (vrtebra caudal) e no estavam presentes Costales fveas na espinha neural do lymphapophysis. Nas partes perifricas da pleurapophysis e lymphapophysis das vrtebras anal, o volume das lacunas da medula aumentou gradualmente acompanhando o crescimento da serpente. Hypapophyses na vrtebra caudal final gradualmente desapareceu. As vrtebras adquiriu a forma dos anis caudal vertebral, inmeras lacunas medula apareceram simtrica ou assimtricamente em ambos os lados do anel. As cavidades no interior da medula hypapophyses freqentemente se comunicava com lacunas dos anis vertebral (Fig. 3).

Centro Peas i-V desta regio da coluna vertebral foram examinadas. Durante o desenvolvimento das quatro espcies estudadas, este foi o local em que a medula ssea ocupou o maior volume. Diferenas inter-espcies consistiu na formao das cavidades da medula nesta parte da coluna sobre os diversos prazos, com o gasto dos condrcitos. Como as cobras cresceram, a bola do cndilo do centro penetrou-se

expandindo lacunas de medula, de sua parte central para a periferia. Osteoclastos desempenharam um papel neste processo (Fig. 4), dado o seu efeito direto sobre os condrcitos, estes osteoclastos deveriam ser chamados de "condroclastos". No 150 dia de desenvolvimento ps-natal, lacunas da medula rodeada por tecido sseo pode ser visto dentro do centro (Fig. 5). A formao das lacunas de medula ssea foi similar em todas as espcies estudadas, porm, na Boa constrictor, apareceram algumas medulas bem desenvolvidas nesta parte da coluna 50 dias mais cedo do que as outras espcies estudadas. A aparncia do centro das vrtebras caudal era completamente diferente. O centro das vrtebras caudais tinha uma forma oval ou triangular (Fig. 6) e foi preenchido com medula bem vascularizado do primeiro poucos dias de desenvolvimento.

Costelas O desenvolvimento da cavidade medular procederam da mesma forma, dentro da costela ligada a todas as partes da coluna (mas costelas no estavam presentes na parte posterior). A ponta da costela foi formada por cartilagem. Sua superfcie era coberta com fina camada de tecido conjuntivo fibroso. Uma parte relativamente pequena da costela transformou em um osso de parede fina rodeada por exosteum, onde os msculos ou tendes foram ligados. Nas espcies estudadas, a rea a partir do final da costela a um quarto do seu comprimento foi preenchido com condrcitos (Fig. 7) com um alto contedo de polissacardeos. Ilhotas Deficientemente vascularizadas apareceram inicialmente na regio, seguido por condrlise sem calcificao. Osteoclastos freqentemente desempenharam um papel neste processo de "criar" espao para as clulas hematopoiticas. A partir da menor parte da cabea da costela para a coluna, a parte interna foi preenchida com medula rica em suprimento sangneo da artria nutriente e drenada atravs da veia central (Fig. 8, VC). Nos captulos da costela, uma grande cavidade medular com uma cava central visivelmente alargada juntou-se a seios venosos e numerosas arterolas. A parte da cabea da costela foi altamente vascularizada, sendo a principal rea de vascularizao da costela, tanto centrpeta e centrfuga. Durante a formao da medula, a mais proeminente diferena entre espcies diz respeito taxa de aparecimento de focos hematopoiticos nas partes inferiores das costelas em que a substituio da cartilagem da medula ocorreu nas regies centrais, entre os dias 0 e 35 ps-natal na Boa e entre 35 e dia 50 nas espcies restantes estudadas. Egresso de clulas sangneas da medula ssea para o sangue perifrico.

O lanamento de clulas sangneas matura no sangue perifrico ocorre de duas maneiras: (1) lentamente, no qual as clulas sanguneas individuais passam para os seios venosos atravs do endotlio, alinhando-se (Fig. 9), ou (2) de forma rpida, na qual as clulas derramam-se no lmen do seio onde so levadas com o fluxo sanguneo. Eritrides e outros tipos de clulas do sangue (Granulcitos heterfilos,

trombcitos) podem entrar no lmen dos seios venosos, usando o tipo lento de transio, apertando-se atravs do endotlio (Fig. 9), Considerando que, no "mecanismo rpido" (Fig. 10), constituda por a ruptura das salincias endotelial provavelmente sob o impacto da maturao de elementos morphotic, mielcitos sempre dominam os eritroblastos. Eritroblastos (Fig. 11) so agrupados em pequenas salincias, mas mais freqentemente podem ser vistos como aglomerados de clulas ou em clulas individuais no lmen dos seios da medula. Por outro lado clulas mielides imaturas esto apenas presentes ocasionalmente na luz dos seios venosos. Em muitas observaes de lminas submetidas histoqumica, reaes de benzidina para indicar a presena de hemoglobina e para permitir a discriminao de clulas eritrocticas no encontraram formas de clula intermediria da linha celular eritroctica ou do parnquima da medula ou entre salincias. Por outro lado, diversas formas de eritroblastos em vrios estgios de desenvolvimento pode ser encontrado dentro dos seios da medula (Fig. 11) e no sangue perifrico. Os numerosos eritroblastos presentes em seios venosos entraram na circulao geral, mas em um nmero limitado, como indicado pelo seu percentual com relao a eritrcitos maturos. Nas espcies estudadas, o nmero de clulas imaturas da linhagem eritroctica presentes na circulao geral diminuiu gradualmente entre os dias 0 e 150 do desenvolvimento ps-natal: Boa constrictor, de 4,5% para 0,9%; Elaphe guttata, 3,9% para 1,2%; fuliginosus Lamprophis, 4,3% para 0,1%; Bothrops jararaca, 7,0% a 0,6%. Isto levou concluso de que a maturao final de clulas pertencentes a esta linhagem de clulas ocorreu principalmente no sangue perifrico. Esse fenmeno causa a linhagem de clulas granulocticas um grau mnimo. Anlise dos dados recolhidos nos esfregaos feitos a partir do sangue perifrico mostrou que, entre os dias 0 e 50 de desenvolvimento ps-parto, a proporo de glbulos imaturos foi maior do que em cobras com 150 dias de desenvolvimento. Contagens realizadas em esfregaos de sangue perifrico das serpentes estudadas confirmaram que entre os dias 0 e 50 de desenvolvimento, a porcentagem de clulas sanguneas imaturas, especialmente linhagem de clulas eritrides, aumentou. Elevado nmero de eritroblastos e reticulcitos na medula de seios venosos indicam que o fluxo de sangue diminuiu, resultantes desses elementos que esto sendo levados a uma taxa reduzida. Brnemark (1968) o descreveu como fluxo sanguneo lento, enquanto Doan (1921) demonstrou que, em pombos famintos, que possuem uma vasta cadeia de seios venosos, parte da cadeia est desligada. Com base nessas informaes, sugerimos que, no caso dos seios venosos de serpentes, as que contenham eritrcitos maduros podem ser temporariamente fechada. Bao Em todas as espcies estudadas entre 0 e 150 dias de idade, o bao foi um rgo ativo na linfopoiese (Fig. 12). Ns tambm no encontramos evidncias de sua participao no mielopoiese.

No entanto, na Bothrops jararaca, a evidncia de atividades eritropoieticas (pequenos focos de eritropoiese) foi vista. Na Boa constrictor, desde os primeiros dias ps-natal, a polpa branca era claramente visvel, com as caractersticas de um tecido nodular linfide rodeado por um perilymphoid zona fibrosa, contra a polpa vermelha. Nas demais espcies, o bao apresentou a infiltrao difusa de linfcitos similar a um cu estrelado, por causa da presena de um reduzido nmero de macrfagos dispersos na luz do citoplasma entre as densas embalagens de linfoblastos e linfcitos. O momento da migrao de linfcitos para dentro da circulao era difcil de capturar, especialmente naquelas espcies com o bao com uma estrutura irregular (sem uma distino clara entre a polpa branca e vermelha). Este processo, no entanto, apresentado na fig. 12, que provavelmente consiste na ruptura local abaixo do endotlio dos seios esplnicos e a liberao de linfcitos maturos da zona marginal para a circulao perifrica; linfcitos so visveis entre as hemcias em dois vasos. Ns observamos diferenas fundamentais na relao do bao com o pncreas. Na Boa constrictor e fuliginosus Lamprophis, estes dois rgos esto claramente separados um do outro. Durante a fase de crescimento inicial (0-50 dias), apesar da proximidade um do outro, um septo substancial do tecido conjuntivo (Figs. 13, 14) os separa. Na Elaphe guttata, no entanto, o bao est intimamente ligado com o pncreas e est localizado no pncreas (anatomicamente) e, histologicamente, o tecido esplnico pode ser visto penetrando profundamente no pncreas. A fronteira entre estes dois rgos aparece como um delicado tecido conjuntivo (Figs. 15, 16), que s vezes difuso. Fgado e Rim Em todas as espcies estudadas, a anlise das seces do rim e do fgado no revelaram nenhuma atividade hematopoitica perceptvel nesses rgos, independentemente da idade dos animais.

A anlise ultraestrutural A microscopia eletrnica revelou eritroblastos nicos espremendo seu caminho atravs do endotlio durante a passagem "lenta" de clulas do sangue no seio venoso (fig. 17). Vrios tipos de clulas do sangue foram registrados no seio (cf. 11, 18). Discusso Ns completamos nossa descrio anterior da hematopoiese em serpentes maturas (Sano-Martins et al. 2002), estudando o processo de espcimes a partir do momento da incubao. Ns usamos Boa constrictor L., Elaphe guttata L., Bothrops jararaca Wied. e fuliginosus Lamprophis, a fim de detectar se existem diferenas importantes neste processo, aps o processo de hematopoiese no apenas durante o crescimento, mas tambm entre espcies pertencentes a famlias diferentes. Uma diferena importante diz respeito taxa de desenvolvimento de focos hematopoiticos. Na Boa, este processo ocorre mais rapidamente atravs do desaparecimento de condrcitos que "fazem a sala" para lacunas de medula ssea. Esse fenmeno visto, nomeadamente nas costelas e centro da espinha. Nota-se que o aparecimento de cavidades da medula ssea em serpentes se assemelha ao mesmo processo descrito nos embries humanos.

No espao deixado vago pelo recuo da cartilagem, um tecido conjuntivo frouxo que se desenvolve dentro de angiognese e hematopoiese pode prosseguir (Charbord et al. 1996). Uma diferena importante ocorre na localizao e no grau de desenvolvimento entre os focos hematopoticos nas partes I-IV da coluna e da parte V (vrtebras caudais). Nas quatro primeiras partes da coluna, focos hematopoticos so restritos aos seus processos, enquanto que nas vrtebras caudais enquanto as lacunas da medula so numerosas em ambos os lados da espinha neural. Do ponto de vista fisiolgico, Esta localizao pode ser vista como altamente justificvel, pois esta parte o principal local de retorno do sangue venoso para o corao, sangue enriquecido com novos elementos morficos. A nomenclatura utilizada aqui, relativo estrutura das vrtebras foi adotado a partir de Gomes e Puorto (1993), que, no entanto no do nenhuma descrio das vrtebras caudais no final da cauda. Portanto, essas vrtebras, aps consultas com especialistas que trabalham com esqueletos de cobras contemporneas e fsseis (Szyndlar Rage e 2003), so referidos como anel caudal da vrtebra, devido reduo de todos os processos tpicos de vrtebras localizadas em partes altas da coluna vertebral. Nossas observaes sobre a nova linha de clulas eritrocitrias indicam a nossa falha em rastrear todo o processo de maturao, particularmente dos polychromatophils, ortochromatic eritroblastos e reticulcitos. Estas clulas esto ausentes na medula ssea das serpentes, apesar de aparecerem em propores significativas nos seios venosos e no sangue perifrico. Isso pode ser explicado, por um lado, pela maior demanda do corpo para eritrcitos durante o crescimento da serpente por seu reduzido tempo de maturao e, por outro lado, pelo endotlio mais delicado dos seios da medula ssea, um endotlio mais suscetvel ruptura por vis a targo uma fora exercida por uma proliferao de clulas da medula. Um estudo mais adicional deste fenmeno necessrio. Nosso objetivo imediato no foi descrever a citomorfologia do bao entre as espcies estudadas, mas apenas verificar a presena de ilhotas hematopoiticas. Alm disso, Tanaka e Hirahara (1995) e Tanaka (1998) forneceram uma descrio detalhada da estrutura do bao, baseada em observaes em luz e microscopia eletrnica de transmisso em Pantherophis climacophora, os autores afirmam que o bao est localizado na cabea do pncreas e separado por uma cpsula fibrosa (Tanaka e Hirahara , 1995). Nesta espcie, no h penetrao recproca dos rgos como encontramos em fulaginosus Lamprophis. No entanto, Scatizi (1931) descreveu uma relao similar anatmica do bao e pncreas (adjacncia entre bao e pncreas, com a penetrao recproca parcial destes rgos) Tropidonotus natrix. Alm disso, a penetrao mtua do bao e do pncreas tambm foi descrita por Frye (1991) no leite de cobra Lampropeltis t. triangulum e nas serpentes copperhead Agkistrodon c. contortrix. No ltimo, o ndulo pancretico, est profundamente enraizado no parnquima esplnico. Esta estrutura tem sido descrita como um espleno-pncreas. Este fenmeno difcil de explicar dadas as diferentes funes fisiolgicas desses rgos e pode ser vista como uma caracterstica mais primitiva.

 semelhana da maioria dos estudos sobre rpteis, os nossos resultados apontam para a medula como o mais importante tecido hematopoitico nas quatro espcies de serpentes estudadas. No entanto, em um deles (Bothrops jararaca), o bao tambm participa da eritropoiese. Alm disso, em rpteis primitivos como solare Phrynosoma, o bao o principal rgo de formao do sangue (Jordan e Speidel 1929), enquanto em alguns lagartos e tartarugas, eritropoiese tem sido descrita tanto em bao como em medula ssea (Vasse Beaupain e 1981; Pienaar, 1962). Durante a evoluo dos tecidos hematopoiticos em animais vertebrados, rpteis ocupam uma posio intermediria entre os anfbios, no qual o bao o principal stio de linfcitos e eritropoiese, e aves, em que a eritropoiese confinado a medula ssea e dos gnglios linfticos que aparecem como rgos independentes (Tischendorf 1985). Assim, podemos razoavelmente sugerir que, A este respeito, os rpteis podem apresentar maior variabilidade entre as diferentes famlias, ou mesmo entre as espcies, que est presente em outros vertebrados. O desenvolvimento pr-natal de serpentes tem sido descrita e dividida em 37 etapas (Zehr, 1962). No entanto, ao nosso conhecimento, nenhuma ateno tem sido dada ao desenvolvimento de hematopoiese. Portanto, em nossos estudos futuros sobre o desenvolvimento da hematopoiese durante a embriognese e em nossas investigaes sobre a ultra-estrutura das clulas de orgos hematopoiticas, no incio ps-natal, ns daremos ateno especial para a maturao de vrias clulas hematopoiticas a fim de esclarecer o problema intra e extravascular eritropoiese em algumas espcies de serpentes.

Legendas Fig.17. A medula ssea de Boa constrictor. Seces Ultrafinas atravs do seio venoso (sv).Tipo "Slow", tipo de transio de um eritroblastos (Erb) da medula ssea (Bm) atravs do endotlio (endot) para o lmen da cavidade. 10.000 Fig.18. A medula ssea da Boa constrictor. Seces Ultrafinas atravs de fragmento de medula ssea (BM) e tipo seio venoso (sv). A presena de eritroblastos (erb) e de reticulcitos (RET) no lmen da medula ssea (clulas sangneas vermelhas (rbc), endotlio (endot) do tipo seio venoso). 10.000