Anda di halaman 1dari 9

33

BAB 5 HASIL PENELITIAN

5.1 Peremajaan Streptococcus mutans Peremajaan S. mutans dari stok lama dilakukan dalam media padat TYC, yang terdiri dari tripton 15g/L, yeast extract 5g/L, L-cystine 0,2g/L, Na2SO3 0,1g/L, NaCl 1g/L, Na2HPO4 0,8g/L, Na2CO3 2g/L, CH3COONa 12g/L, Sukrosa 50g/L, dan Agar 12g/L (Stoppelaar, 1967). S. mutans yang ditanam pada media agar yang mengandung sukrosa mempunyai karakteristik sebagai berikut, yaitu ukuran koloni 0,5-1 mm, berwarna putih, permukaan koloni kasar, melekat erat pada agar, di sekitar koloni dibasahi produk polimer glukan. S. mutans ini termasuk anaerob fakultatif tetapi tumbuh optimum pada kondisi anaerob (Rahardjo dan Kriswandini, 2004). Pertumbuhan sel S. mutans dalam media padat TYC tampak setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC dalam candle jar, seperti tampak pada Gambar 5.1.

Gambar 5.1 Pertumbuhan S.mutans dalam media TYC. 33

34

5.2 Pertumbuhan Streptococcus mutans dalam Media BHIB Pertumbuhan S. mutans dalam media cair BHIB dilakukan dengan memasukkan koloni tunggal S. mutans dari media padat TYC ke dalam media cair BHIB 10ml. Media cair BHIB dibuat dengan melarutkan BHIB 37g/l dalam

akuades. Kultur S. mutans diinkubasi pada 37oC selama 24 jam dalam candle jar. Pertumbuhan sel S. mutans dalam media BHIB dicirikan dengan warna putih kekuningan, yang sebagian besar menempel di dasar erlenmeyer. S. mutans tumbuh sangat baik dalam media BHIB pada keadaan anaerob (Nolte, 1982). Bakteri S. mutans apabila ditanam pada medium yang diperkaya seperti pada Brain Heart Infusion Broth (BHIB) berbentuk coccus dengan formasi rantai panjang (Clark, 1924). Pertumbuhan S. mutans pada media BHIB seperti tampak pada Gambar 5.2.

Gambar 5.2 Pertumbuhan S. mutans dalam media BHIB. (a) Pertumbuhan S. mutans pada media BHIB (b) Pertumbuhan S. mutans pada dasar tabung erlenmeyer.

35

5.3 Pertumbuhan Biofilm Streptococcus mutans dalam Media BHIBS Biofilm S. mutans tumbuh menempel pada slide glass setelah diinkubasi selama 24 jam. Biofilm S. mutans yang menempel pada slide glass berwarna putih kekuningan. Komposisi biofilm terdiri dari mikroorganisme, produk tambahan ekstraseluler, polisakarida sebagai bahan pelekat yaitu glukan, dan air (Watnick, et al., 1999).

Gambar 5.3 Pertumbuhan biofilm S. mutans dalam media BHIBS. (a) Pertumbuhan biofilm S. mutans dalam media BHIBS (b) Skematik pertumbuhan biofilm S. mutans dalam media BHIBS.

5.4 Lisis Biofilm Streptococcus mutans Lisis biofilm S. mutans dilakukan menggunakan metode ultrasonikasi dengan kekuatan 7 x 30s, 40Hz (Cury, et al., 2007) dalam bufer TEM (10mM TrisHCl [pH 6,8], 1mM EDTA, 5mg MgSO4) (Welin, et al., 2004). Pada awalnya, lisis dikerjakan dengan menggunakan kekuatan 10 x 1s, 40Hz (Welin, 2004). Tetapi, setelah dilakukan analisis protein terhadap crude protein hasil lisis hanya ditemukan sebuah pita protein yang sangat tipis. Sehingga lisis terhadap biofilm

36

dengan kekuatan tersebut dianggap belum mampu memecah secara keseluruhan komponen penyususn biofilm yang lebih kompak setelah diinkubsi 24 jam. Selanjutnya lisis dilakukan dengan kekuatan 40Hz selama 7 x 30s. Dengan pertimbangan bahwa biofilm setelah diinkubasi selama 24 jam memiliki struktur yang lebih kompak dibandingkan jika biofilm diinkubasi selama 2 jam (Cury, et al., 2007) . Kekompakan struktur biofilm berbanding lurus dengan lama inkubasi biofilm (Donlan, 2002). Inkubasi terhadap biofilm selama 24 jam bertujuan untuk mendapatkan massa biofilm yang lebih banyak. Lisis dianggap berhasil setelah beberapa pita protein terlihat pada hasil analisis menggunakan SDS-PAGE 12%. selama

37

5.5 Analisis Profil Protein Biofilm S. mutans dengan SDS-PAGE 12% Hasil analisis profil protein biofilm S. mutans dengan variasi pengenceran seperti tampak pada Gambar 5.4.

200 kDa 116,3 kDa 97,4 kDa 66,3 kDa 55,4 kDa

36,5 kDa 31 kDa 21,5 kDa 14,4 kDa 6,0 kDa

S1

S2

S3

Gambar 5.4 Profil protein biofilm S. mutans. M: Marker protein, S: Sampel protein biofilm S. mutans (S1: pengenceran 2x; S2: tanpa pengenceran; S3: pengenceran 1x)

Menurut Rantam 2003, penentuan berat molekul (BM) protein dilakukan dengan menghitung nilai Rf (Retardation factor) dari masing-masing pita (band) dengan rumus seperti di bawah. Jarak pergerakan protein dari tempat awal Jarak pergerakan warna dari tempat awal

Rf =

38

Selanjutnya dicari nilai Rf dari marker, kemudian dibuat kurva standar. Data untuk pembuatan kurva standar seperti tampak pada Tabel 5.1. Tabel 5.1 Data pembuatan kurva standar penentuan BM protein. BM marker 200.0 116.3 97.4 66.3 55.4 36.5 31.0 21.5 14.4 6.0 Migrasi protein marker 0,5 9,75 11,25 20 22,5 34,25 39,25 50 52 54 RF (X) 0,01 0,17 0,20 0,36 0,41 0,62 0,71 0,91 0,94 0,98 Log BM (Y) 2,301 2,066 1,988 1,822 1,744 1,562 1,491 1,332 1,158 0,984

Gambar 5.5 Kurva standar penentuan BM protein.

Berat molekul protein sampel ditentukan dengan cara mengkonversi data nilai Rf sampel pada persamaan Y = 0,359X2 1,422X + 2,294. Dengan X nilai Rf, sedang Y adalah nilai logaritma berat molekul protein. Nilai Rf sampel seperti tampak pada Tabel 5.2.

39

Tabel 5.2 Nilai Rf sampel dari gel SDS-PAGE 12%. Pita ke1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Migrasi protein sampel 0,6 1 2 4 11 15 20 24 25,5 30 31 39 43 46 50 53 54 RF protein sampel (X) 0,01 0,02 0,03 0,07 0,20 0,27 0,36 0,43 0,46 0,54 0,56 0,71 0,78 0,83 0,91 0,96 0,98

Dari perhitungan berat molekul protein masing-masing pita sampel pada lampiran 2, maka diketahui berat molekul masing-masing pita protein dari sampel biofilm S. mutans adalah: 181, 176, 172, 154, 108, 90, 70, 58, 53, 43, 41, 28, 22, 19, 16, 14, dan 13 kDa. 5.6 Analisis Protein Antigenik Biofilm S. mutans dengan Western blot Analisis protein antigenik biofilm S. mutans dilakukan dengan metode Western blot, menggunakan sampel saliva dari individu karies (sIgA rendah) dan non karies gigi (sIgA tinggi). Proses analisis protein menghabiskan waktu sekitar 7 jam, dengan rincian proses sebagai berikut: proses transfer protein pada membran nitrocellulose 2,5 jam; inkubasi dengan antibodi primer (saliva) 2 jam; inkubasi

213 kDa

40

dengan antibodi sekunder (antihuman IgA) 1 jam; inkubasi dengan SA-HARP selama 1 jam; dan inkubasi dengan substrat TMB 15 menit. Sampel saliva yang memiliki sIgA rendah (sampel 1,2,3, dan 4) menunjukkan pita protein yang lebih tipis dibandingkan dengan sampel yang memiliki sIgA tinggi (sampel 5,6,7, dan 8). Data hasil analisis protein antigenik seperti tampak pada Gambar 5.7.

Gambar 5.6 Hasil analisis protein antigenik biofilm S. mutans. (Sampel 1, 2, 3, dan 4: sIgA rendah; Sampel 5, 6, 7, dan 8: sIgA tinggi).

Penentuan berat molekul protein antigenik dilakukan dengan cara membandingkan pita protein hasil Western blot dengan profil protein hasil SDSPAGE 12% dan marker protein yang digunakan pada proses Western blot. Pita protein hasil analisis Western blot yang merupakan protein antigenik biofilm

41

S. mutans sebagai biomarker risiko karies gigi sebanyak 4 buah, dengan berat molekul 108, 43, 41, dan 28 kDa.

Beri Nilai