Purificacin de quitinasas Como primer paso para la purificacin de las enzimas quitinolticas de BT var.

aizawai, se utiliz el sobrenadante obtenido por separacin de la biomasa con centrifugacin a 5000 rpm 10 min. a 4 C y posteriormente fue pasado a travs de una membrana estril de filtracin de 0.22 de porosidad (millipore, USA), con el fin de separar el debris celular y agregados indeseables. Para separar las protenas de ste caldo filtrado, se utiliz la modalidad de saltin out con la sal desecada de sulfato de amonio al 80% de saturacin, el cual es adicionado con agitacin continua a 4 C . Se considera que al incrementar la concentracin de sal, se pierde el agua

ordenada alrededor de las protenas, por lo que las zonas hidrofbicas de stas quedan expuestas, interactan entre s y se forman agregados proteicos que son separados por centrifugacin. Se obtuvo un precipitado que fue separado por centrifugacin (12 rpm, 20 min. 4 C); el sedimento se redispers en buffer Tris-HCl 20 mM pH 6.0 y transferido a una membrana de dilisis permeable a molculas de 10 kDa, dializando contra agua destilada estril, por 24 hrs. a 4 C con agitacin constante y suave. Se realizaron cuatro cambios. Se obtuvo una dispersin concentrada de protenas con actividad quitinoltica de 1.2 U/mg de protena. Melentev et al (1999) reportan 0.021 U/mg; Bhushan et al (1998) obtienen 1735 U/mg; Wei-Da et al (2002), 0.13 U/mg; Wen et al (2002) obtienen 20 U/mg. Estas variaciones se debe a que utilizan diferentes subespecies de Bacillus, as como las condiciones de cultivo y de crecimiento. Al extracto dializado se le realiz electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS al 12.5%, ste gel es tratado con los sustratos fluorognicos 4-MU(NAG)2 y 4-MU(NAG)3, en la figura (YE-YE) se observan dos bandas fluorescentes de diferente peso molecular. Una de ellas se detecta entre (---y---kDa) y la otra entre (---y---kDa). Con sta informacin, se continu con el proceso de purificacin de al menos dos protenas de inters.

Cromatografa de exclusin molecular: Para eliminar la mayor cantidad de sales presentes, la solucin concentrada de enzima fue transferida en una columna de vidrio (30 x 1 cm) empacada con sephadex G-25 previamente equilibrada con buffer Tris-HCl 20 mM pH 8.0; las protenas fueron eluidas con el mismo buffer a una velocidad de flujo de 0.7 ml/min. A todas las fracciones colectadas se les midi absorbencia a 280 nm y se les determin actividad quitinoltica. Se detect una zona de actividad en las fracciones 4-12 (pool-A) y (----) (pool-B) indicadas en las grficas (A) y (D), para cada caso y por separado, las fracciones se juntaron y se almacenaron a 4 C hasta su uso. Cromatografa de intercambio inico Q-sepharosa: A las muestras obtenidas en el pool-A, se les hizo pasar por una columna de intercambio aninico fuerte (25 x 1 cm) Q-sepharosa (sales cuaternarias de amonio) previamente equilibrada con buffer Tris HCl 20 mM pH 8.0. La muestra fue eluida a una velocidad de flujo de 1.0 ml/min., con un gradiente lineal de NaCl 0.0-200 mM en el mismo buffer. Como se puede apreciar en la grfica (B), la actividad quitinasa fue detectada en la regin de baja concentracin salina, lo que sugiere que la superficie de las protenas es ligeramente hidrofbica. Wen et al (2002), encontraron que la enzima de 36 kDa de Bacillus sp NCTU2, fue localizada en la regin de baja concentracin salina empleando una columna de interaccin hidrofbica (fenil-sepharosa). Las fracciones que corresponden a la zona de mayor actividad quitinoltica fueron analizadas en un gel de SDS-PAGE 12.5% y revelado por la tcnica de tincin con plata, se obtuvieron cinco bandas. Las fracciones con patrn electrofortico semejante fueron reunidas y conservadas a 4 C, para continuar con el proceso de separacin. Cromatografa de exclusin molecular G-75:

Las fracciones seleccionadas del paso anterior, se hicieron pasar a travs de una columna (30 x 1 cm) empacada con sephadex G-75. En los grficos (C) y (G) se puede apreciar que se obtuvo una regin de actividad quitinoltica en las fracciones (10-20) y (---a la--) respectivamente. Las fracciones fueron analizadas en gel de SDS-PAGE 12.5 % y revelados por la tcnica de tincin con plata. Las fracciones con patrn electrofortico semejante de una banda fueron reunidas y conservadas a 4 C, para iniciar el proceso de caracterizacin. Tablas de Purificacin de las enzimas quitinolticas: En las Tablas (XXX) y (XXX) se presenta un concentrado de los pasos de purificacin para el pool-A y pool-B. Para el primer caso, se obtuvo un porcentaje de recuperacin del 4.3 %, actividad especfica de 30.7 U/mg de protena y un factor de purificacin de 18 veces. Para el segundo caso, se obtuvo un porcentaje de recuperacin del 0.6 %, actividad especfica de 75.0 U/mg de protena y un factor de purificacin de 29 veces. No se puede establecer comparaciones en el proceso de purificacin de enzimas, ya que ste depende de varios factores, y entre otros, el mtodo de purificacin, el tipo de microorganismo, condiciones de produccin de enzimas. Araki et al (2001), utilizaron sulfato de amonio, DEAE-sepharosa, Sp-sepharosa y sephacryl-200 HR, para la purificacin de las quitinasas recombinantes ChiaA y ChiB de B. cereus y reportaron el porcentaje de recuperacin de 43 % y 42 %, actividad especfica de 7.5 U/mg y 56.4 U/mg de protena y un factor de purificacin de 55 y 40 veces, respectivamente. Por otro lado, Sakay et al (1998) identificaron tres endoquitinasas termolbiles (L,M y S), que purificadas por cromatografa de afinidad a quitina y cromatoenfoque, obtuvieron rendimientos de porcentaje de recuperacin del 2.2 %. 0.67 % y 1.1 %; actividad especfica de (consultar

artculo de composta) U/mg de protena y un factor de purificacin de 20, 18 y 24

veces, respectivamente.

Estimacin del peso molecular: El peso molecular de las enzimas fue determinado de acuerdo a la movilidad de las bandas en SDS-PAGE 12.5 % reveladas por la tincin con plata, utilizando una curva estandar con protenas de peso molecular conocido y el programa de computo de Kodak. En las figuras (SDS-PAGE-A y SDS-PAGE-B) se muestra el marcador de peso molecular y la banda obtenida en el ltimo paso de purificacin de las metodologas anteriormente descritas. El peso molecular estimado fue de 66 kDa y 38.6 kDa respectivamente; a la protena de alto peso molecular se le llam ChiA66, y a la de menor peso molecular se le nombr ChiB38.6. La enzima ChiA66 coincide con el reportado por Thiamthankul et al (2001) quienes por secuenciacin de nucletidos estimaron una masa molecular de 71 kDa y por SDS-PAGE determinaron que B. thuringiensis var. paquistan, presenta una enzima quitinoltica de 66 kDa y que por hidrlisis del extremo carboxilo terminal, se producen otras menores de 60, 47 y 32 kDa. Por otra parte, Barboza et al (2003), estimaron que la enzima quitinoltica de B. thuringiensis var. keniae tiene una masa molecular deducida por secuenciacin de nucletidos, de 74 kDa y por SDS-PAGE fue de 68 kDa. La enzima ChiB38.6 coincide con el reportado por Arora et al (2003) quienes estimaron por secuenciacin de nucletidos que la masa molecular de una quitinasa recombinante de B. thuringiensis var. alest es de 36 kDa.