Informacin de la OMS para diagnstico de laboratorio del nuevo virusdelaInfluenzaA(H1N1)ensereshumanos

SeenfatizalarecomendacinquetodaslasmuestrasdeinfluenzatipoAnosubtificables seanenviadasdeinmediatoparaeldiagnsticoylacaracterizacinadicionalaunode loscincoCentrosColaboradoresdelaOMSparalagripe. 21demayodel2009 Estedocumentopresentainformacinsobrelosmediosdediagnsticodisponiblesala fechaindicadaparaelvirusdelainfluenzatipoAhumana(H1N1)A/California/4/2009y virussimilares.Lainformacinsobreeldiagnsticoseactualizarcundostase encuentredisponible. Muestras Lasmuestrasmsapropiadassegnlorecomendadoporlasinvestigacionesdela influenzaestacionalsonaquellasdeltractorespiratoriosuperior.Lasmuestrasdeben tomarsedelosorificiosnasalesprofundos(hisoponasal),nasofaringe(hisopo nasofarngeo),aspiradonasofarngeo,gargantaoaspiradobronquial.Todavanose sabequmuestraclnicaproporcionaelmejorrendimientoeneldiagnstico.La(s) persona(s)quetome(n)lamuestradebe(n)cumplirconlasprecaucionesapropiadasde tomademuestrasyaquepuede(n)exponerseasecrecionesrespiratoriasdelos pacientes.Hastaahora,noexisteningunainformacinsobreelvalordediagnsticode lasmuestrasnorespiratorias,porejemplo,muestrasdeheces.Muestrasdesuero agudoyconvalecientedebenusarseparaladeteccindelosttulosascendentesde anticuerpo. Pruebasdelaboratorio Diagnosticomolecular Losmediosdediagnosticomolecularsonactualmenteelmtodopreferidoparala influenzaA(H1N1)linajeporcino(swl)virus(A/California/4/2009yvirussimilares). Elusodeensayoscondiferentesgenesblancosesmsapropiadoparalaidentificacin deestevirus.Lossiguientesgenesblancossonimportantes:genmatrizdelaInfluenza detipoA;elgendelahemaglutininaespecficodelvirusdelaInfluenzaA(H1N1)swlyel gendelahemaglutininaespecficodelaInfluenzaestacionalAH1/H3yotrossubtipos.

Lossiguientesprotocolosestnactualmentedisponibles: PCRconvencionalespecficoparainfluenzatipoAyRTPCRentiemporeal(vase anexos1y2); RTPCRentiemporealdelosCDC(rRTPCR)paraladeteccinycaracterizacindela influenzatipoA(H1N1)(versin2009)1 ElanlisissecuencialdelproductodelPCRdelgenmatrizdelainfluenzatipoAusando loscebadoresdelosprotocolosdelaOMS(vaseanexo1)diferenciarentregenesM delinajeporcinoyvirusH1N1estacionales.Sinembargo,unanlisisadicionaldebeser realizadoparaconfirmarelorigendelvirus. Enestemomento,laspruebasdeRTPCRconvencionalestnsiendoevaluadas.Una actualizacinsepublicarcuandoestedisponible. Aislamientoytipificacindelvirusmediantelainhibicindehemaglutininaola inmunofluorescencia: Sepuedenutilizarlosprotocolosvigentesparaelaislamientodevirusdelainfluenza estacionalusandoclulasdeMDCKeinoculacin devirusenhuevosembrionados, aunquesusensibilidadestanpendientededeterminarse(vaseseccinde bioseguridadabajo). Loseritrocitosdepavos,pollos,conejillosdeindiasyhumanosseaglutinarnconel virusdelainfluenzaA(H1N1)swl.Losanticuerpospoliclonalesespecficosparael subtipoH1delosvirusdelainfluenzaestacionaldelkitdelaOMSnoreaccionarncon lapruebadeinhibicindehemaglutinacin(HAI)delvirusactualdelainfluenzaA (H1N1).LosresultadosobtenidosutilizandolosanticuerposmonoclonalesH1delkitde laOMSnodebetomarsecomocomprobacinconcluyenteyserecomiendarealizaruna verificacinadicional. Pruebasdeinmunofluorescenciarpida: Lasensibilidadyespecificidaddelaspruebasdeinmunofluorescenciarpidaenellugar deatencin,diseadasparaladeteccindirectadelosvirusdelainfluenzatipoAson actualmentedesconocidas.Unaactualizacinsepublicarcundoexistaevidencia disponible.Deberecalcarsequeestaspruebasnodiferenciarnlainfluenzaestacional deladelvirusdeinfluenzadetipoA(H1N1)swl.

http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/realtimeptpcr/en/index.html

Serologa SeesperaquelaspruebasdeHAIylasreaccionesdemicroneutralizacinempleandoel virusdelainfluenzaA(H1N1)swlpuedandetectarrespuestasdeanticuerposdespus delainfeccin. Interpretacindelosresultadosdelaboratorio PCR:Unamuestraseconsiderapositivasilosresultadosdelaspruebasusando dosdiferentesblancosdePCR(porejemplo,iniciadoresespecficosparagenMy genporcinodehemaglutininaH1)sonpositivosperoelPCRparavirushumano H1+H3esnegativo.SielPCRentiemporeal(RTPCR)parahemaglutinina mltiple(HA)(esdecir,H1,H3yH1delinajeporcino)daresultadospositivosen lamismamuestra,laposibilidaddecontaminacindePCRdebeser primeramenteexcluidaalrepetirelprocedimientodePCRusandoARNnuevo extradodelamuestraoriginaloARNextradodeotramuestra.Siserepitenlos resultadospositivosparalosblancosmltiplesdeHA,existeentoncesla posibilidaddecoinfeccin,quedebeconfirmarsemediantesecuenciacino cultivoviral.ElAnexo3muestraundiagramadeflujoparafacilitarla interpretacindelosresultadosdePCR. RTPCRentiemporealdelosCDC:Losresultadosdebeninterpretarsesegnlo descritoenelmanualdepruebasdeH1N1entiemporealdelosCDC.1 UnresultadodePCRnegativonopermitedescartarquelapersonapueda estarinfectadaporelvirusdelainfluenzaA(H1N1):Losresultadosdeben interpretarseconjuntamenteconlainformacinclnicayepidemiolgica disponible.LasmuestrasdelospacientescuyosresultadosdePCRson negativosperoparaquieneshayunaaltasospechadeinfeccinconH1N1deben investigarsemsafondoyseranalizadasporotrosmtodoscomoelcultivoo serologaviral,paradescartarinfeccinporinfluenzaA(H1N1)swl(vase diagramadeflujoenAnexo3). Serologa:Unincrementocudrupleenlosanticuerposneutralizantes especficosdelvirusdelainfluenzaA(H1N1)indicainfeccinrecienteconel virus. Secuenciacin:enestaetapa,lasecuenciacindealmenosunodelosblancos esesencialparalaconfirmacinporPCRconvencional. Aislamientodelvirus:Laidentificacinytipificacindelcultivodevirusde influenzapuedelevarseacaboporPCR,porlatcnicadelanticuerpo fluorescenteindirecto(IFA),lapruebausandoanticuerposmonoclonales

 Referenciaparalaconfirmacinycaracterizacinadicionales: Aloslaboratoriosquenocuentenconcapacidaddediagnsticodelvirusdelainfluenza Aselesrecomiendaenviarlasmuestrasrepresentativasdeloscasossospechososde influenzaA(H1N1),deacuerdoaladefinicindecasodelaOMS2,aunodelosCentros ColaboradoresdelaOMSparainfluenza(WHOCCs). LasmuestrasconresultadosdelaboratoriopositivasparainfluenzaAperono subtipificables(esdecir,negativasparainfluenzaA(H1)yA(H3));seconsiderancomono confirmadasdeacuerdoaloscriteriosdelaOMS)debenremitirseaunodelosWHOCCs paralaconfirmacin. Loslaboratoriosquenocuentenconcapacidaddeaislamientodelvirus(oqueno tenganelnivelnecesariodemedidasdebioseguridad)debenremitirlasmuestrasa cualquieradelosWHOCCs. EnadicinalosreglamentospertinentesdeIATA,sedebenseguirlasnormasordinarias dealmacenamiento,envasadoyenvodemuestrasdeinfluenza. Bioseguridad Eltrabajodelaboratorioconmuestrasclnicasdepacientesconsideradoscomocasos sospechososdeinfeccinporvirusdeinfluenzaA(H1N1)swlsedebenrealizar aplicandolasnormasyprocedimientosdeniveldebioseguridad2utilizandoelequipo deproteccinpersonalapropiado(PPE).Todamanipulacindemuestrasdebehacerse dentrodeunacabinadebioseguridadcertificada(BSC).VerManualdebioseguridaden ellaboratoriodelaOMS,3.ed.3 Actualmente,elaislamientoviralrequieremayoresmedidasdebioseguridad.Paralas recomendacionesespecficasver:Gestindelosriesgosbiolgicosenloslaboratorios dondesemanipulanmuestrashumanasquecontienenopuedencontenerelvirusdela gripeA(H1N1)queestcausandolasactualesepidemiasinternacionales.4

especficosdeNP,oelanlisisdeHAyelanlisisantignico(subtipificacin)por HAIusandoantisuerosdereferenciaseleccionados.

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http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/interim_guidance/en/index.html http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/WHO_CDS_CSR_LYO_2004_11/en/ 4 http://www.who.int/entity/csr/resources/publications/swineflu/Laboratorybioriskmanagement_es.pdf

Pruebadelosalgoritmos ElmtodogeneraldeladeteccindevirusdelainfluenzaporPCRRTdebeconsiderarse enelcontextodelasituacinnacional,porejemplo,cuntasmuestraspueden procesarse(producto),elblancoutilizadoparalasecuenciadelgenporPCRRT,ysise utilizalacomprobacinconcurrenteosecuencialdeM,NPygenesdeHAporPCRRT. Buenasprcticasdelaboratorio Losprotocolosestndarparatodoslosprocedimientosdebenexistiryserrevisados regularmente.Esfundamentalasegurarsequelosreactivosrecomendadosseuseny manejenadecuadamenteyaquelasreaccionessoncomplejasyproblemasinclusoslo conunreactivopuedentenerefectossignificativossobrelosresultadosobtenidos. Validacin Todoslosprotocolosdebenservalidadosencadaunodeloslaboratoriosparaevaluar quesuespecificidadysensibilidadalusarlosmismoscontrolesencadarondasean adecuadas. Aseguramientodelacalidad Losprotocolosdeaseguramientodelacalidadybuenasprcticasdelaboratoriodeben existir.LaparticipacinenlosejerciciosdeevaluacindelosCentrosNacionalesde Influenza(Proyectodeevaluacinexternadelacalidad)esaltamenterecomendada paraconfirmarqueloslaboratoriosestnalcanzandounniveladecuadodesensibilidad yespecificidadensuspruebas. Capacitacindelpersonal Lafamiliaridaddelpersonalconlosprotocolosyexperienciaenlainterpretacin correctadelosresultadossonpiedrasangularesparalaejecucinexitosadelaspruebas diagnsticas. Instalacionesyreasdemanejo Debenexistirinstalacionesadecuadasparaelmanejodemuestrasyreactivos (incluyendocadenasdefro)conunaseparacinapropiadaparalasdiferentesetapasde RTPCRafindeprevenirlacontaminacincruzada.Lasinstalacionesyelequipodeben cumplirconelniveldebioseguridadapropiado.ElRTPCRdeberealizarseenunespacio separadodelusadoparalastcnicasdeaislamientodevirus.

Equipo Elequipodeequipodebeusarseymantenersedeacuerdoalasrecomendacionesdel fabricante. Anexo1:AnlisisdeRTPCRconvencionaldelgenmatrizdelosvirusdeInfluenza detipoA ProtocoloConvencionaldeRTPCR5 Acontinuacinsepresentanlosprotocolosycebadores(oprimers)dePCR convencionalyelectroforesisengeldeproductosparadetectarvirusdeinfluenzatipoA enmuestrasdesereshumanos.Estosprotocoloshandemostradoserampliamente efectivosparalaidentificacindelvirusdeinfluenzadetipoAcuandoselesutilizacon losreactivosycebadoresindicados.Serecomiendaqueloslaboratoriosquetengan dudassobrelaidentificacindelosvirusactualmentecirculantescontactaraunodelos LaboratoriosdeReferenciaH5delaOMS6oaunodeWHOCCsparalainfluenza7afin derecibirayudaparalaidentificacindeloscebadoresptimosparasuuso Materialesrequeridos QIAampViralRNAMiniKit(QIAGEN,Cat#52904.Otroskitsdeextraccinpueden serusadosdespusdehabersidosujetosaunaevaluacinapropiada). OneStepRTPCRKit(QIAGEN,,Cat#210212) InhibidordeRNase20U/lAppliedBiosystems,Cat#N8080119 Aguadestilada(libredeRNase) Ethanol(96100%) Microcentrfuga(ajustablehasta13000rpm) Pipetasajustables(10,20,200,and100l Puntasparapipetaestriles(libresdeRNase)conbarreradeaerosol Vortex Tubosparamicrocentrfuga0.2,1.5ml Termociclador(equipodePCR) Conjuntodecebadores Controlpositivo(estepuedesolicitarsealWHOCCenlosCDCdeAtlanta,EEUU)

Protocol provided by Virology Division, Centre for Health Protection, Hong Kong SAR, China (WHO H5 Reference Laboratory). 6 http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/referencelabs/en/ 7 http://www.who.int/csr/disease/influenza/collabcentres/en/

Cebadores Gen:M VirusInfluenzaA Secuenciasdecebadores M30F2/08: 5`ATGAGYCTTYTAACCGAGGTCGAAACG3` M264R3/08: 5`TGGACAAANCGTCTACGCTGCAG3` Tamaoesperadodelproducto244bp(referencia:NIID8) Procedimiento 1. ExtraerARNviraldelamuestraclnicaconelMiniKitQIAampViralRNAokitde extraccinequivalente,deacuerdoalasinstruccionesdelfabricante. 2. RealiceelRTPCRdeunaetapa. Sacarlosreactivosdesualmacn,djelosdescongelaratemperatura ambiente.Unavezdescongelados,mantngalosenhielo. Prepararlamezclamaestra(operadaenhielo) Agregarlosiguienteauntuboparacentrfugaymezclarlobien agitndoloparaarribayparabajo10veces,(Nota:Afindeevitar diferenciaslocalizadasenlaconcentracindesales,esmuyimportante mezclarlassolucionesantesdesuuso). ReaccinsinsolucinQ Aguadestilada(sinRNasa)9.5l Amortiguador5xQIAGENRTPCR5.0l MezcladedNTP1.0l Cebadorsentido(+)(10M)1.5l Cebadorantisentido()(10M)1.5l Mezclaenzimtica1.0l InhibidordelaRNasa(20U/l)0.5l Volumentotal20.0l/prueba Distribuir20ldelamezclamaestraencadatubodereaccindePCR.Aadir5lde RNAdelamuestraalamezclamaestra.Paralasreaccionesdecontrol,usar5 lde aguadestiladalibredeRNaseparacontrolnegativoy5ldelosRNAviralesadecuados paracontrolpositivo.Programareltermocicladordeacuerdoalascondicionesde termociclado.IniciarelprogramadeRTPCRmientraslostubosdePCRseencuentren anenelhielo.Esperarhastaqueeltermocicladorhayaalcanzadolos50C.Luego colocarlostubosdePCReneltermociclador.
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Primers designed by Laboratory at National Institute of Infectious Diseases (NIID), Tokyo, Japan (WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza)

CondicionesdecicladodelatemperaturaparaPCR Transcripcininversa30min,50C ActivacindelaPCRinicial15min,95C Cicladoentresetapas Desnaturalizacin30seg,94C Templado30seg,50C Extensin1min,72C Nmerodeciclos45 Extensinfinal10min,72C Mantener4C 3.ElectroforesisengeldeagarosadeproductosdeRTPCR Prepararelgeldeagarosa,cargarlosproductosdePCRyelmarcadordepeso molecular,ejecutardeacuerdoconlosprotocolosestndar.Visualizarlapresenciadel marcadorconluzultravioleta. Materialesrequeridos Bandejaparageldeagarosaycmaradeelectroforesis Suministroelctricoyelectrodos CajadeluzUV(302nm) CmaraypelculaPolaroidocomputadoraconectadaalacmara Pipetasajustables Geldeagarosaal2%en1TAE Amortiguador1TAE Bromurodeetidio(10mg/ml) 6xSolucinamortiguadoraconcargadegel(GLB) Procedimiento A)Fundirungeldeagarosa: I. Colocarunabandejaparafundicindelgeldentrodeunabaseparafundicinde gel.Inserteunpeineynivelelabase. II. Prepararagarosaal2%pesando4gdepolvodeagarosaydisulvalaen200ml1 amortiguadorTAE.Disuelvaelagarcalentndoloenhornodemicroondas. III. Enfriarelagarderretidohastaaproximadamente60C,yluegoagregue10lde bromurodeetidio. IV. Verterlaagarosaderretidaenunabandejaparafundicindegel. V. Dejarqueelgelsesolidifiqueatemperaturaambiente. VI. Retirarelpeinedelmarco.

VII. Colocarlabandejadentrodelacmaradeelectroforesisconlasfosasdelladode losctodos. VIII. Llenarlacmaraamortiguadoracon1TAEaunnivelquepuedacubrirlaparte superiordelgel. B)Cargadelasmuestras: I. Agregar5ldeGLBdePCR. II. Cargarelmarcadordepesomolecularenlafosadelgeldeagarosa. III. Pipetear15ldelproductodePCR/GLBenelgel. IV. Cerrarlatapadelacmarayconecteloselectrodos.Correrelgela100Vdurante 3035min. V. VisualizarlapresenciadebandasdemarcadoresyproductosdePCRconluzUV. VI. Documentarlaimagendelgelconunafotografa. Interpretacindelosresultados EltamaodelosproductosdePCRobtenidosdebecompararseconeltamaoesperado delosproductos.Silapruebaseejecutasinuncontrolpositivo,losproductosdebenser confirmadosmediantesecuenciacinycomparacinconlassecuenciasdisponibles. Anexo2:AnlisisdeRTPCRentiemporealdelamatrizdelosvirusdeInfluenzade tipoA LaRTPCRentiemporealpresentadiferentesdesafosencomparacinconlaRTPCR convencional.AdemsdelasconsideracionessobreRTPCRdescritasenelAnexo1,las consideracionesespecficasparaRTPCRentiemporealincluyen: Garantizarqueseusenymanipulencorrectamentelosequipos,elsoftwareylos reactivosparafluorescenciaadecuados. Garantizarlacapacitacinadecuadadelpersonalparalainterpretacindelos resultados(esesenciallaexperienciaparareconocerlosverdaderospositivos, interpretacindeloscontroles/valorCtyfluorescenciaaberrante,etc.). Parahacerdeterminacionescuantitativas,esesenciallavalidacinenellaboratorio ylaoptimizacindelasreacciones. Haypocaprobabilidaddecontaminacincuandosedescartanlasreacciones despusderealizarlaspruebas.Sinembargo,muchoslaboratorioshacenanlisis postreaccinadicionales(porej.,polimorfismodelongituddefragmentosde restriccinusandogeles,secuenciacin)quepuedenreintroducirlacontaminacin.

ProtocolodeRTPCRentiemporeal9 ExtraerelARNviraldelespcimenclnicosegnsedescribeenelAnexo1:Anlisisde RTPCRconvencional Materialesrequeridos TranscripcinInversa AmortiguadorI10XPCRcon15mMMgCl(AppliedBiosystems) Hexmeroaleatorio50M(AppliedBiosystems) TranscriptasaInversadeMuLV50U/l(AppliedBiosystems) InhibidordelaRNasa20U/l(AppliedBiosystems) PCRentiemporeal KitLightCyclerFastStartDNAMasterHybProbes(Roche) Cebadoresymezcladesondas:Agregarigualvolumendelossiguientescomponentes paraprepararloscebadoresylamezcladesondasparaH5ygenM Cebadoresysondas VirusdeinfluenzatipoA Secuenciadecebadores FLUAM1F:5'AAGACCAATCCTGTCACCTCTGA3'(10mol/l) FLUAM2F:5'CATTGGGATCTTGCACTTGATATT3'(10mol/l) FLUAM1R:5'CAAAGCGTCTACGCTGCAGTCC3'(10mol/l) FLUAM2R:5'AAACCGTATTTAAGGCGACGATAA3'(10mol/l) FLUA1P:5'(FAM)TTTGTGTTCACGCTCACCGT(TAMRA)3'(5mol/l) FLUA2P:5'(FAM)TGGATTCTTGATCGTCTTTTCTTCAAATGCA(TAMRA)3'(5mol/l) Elcebadoractivoylamezcladesondassepreparamezclandolos6reactivosen volmenesiguales.

Protocol provided by Virology Division, Centre for Health Protection, Hong Kong SAR, China, WHO H5 Reference Laboratory

Procedimiento 1.RealizarRTutilizandolosreactivosquesemuestranenlasiguientetablaylas instrucciones13alcalcedelatabla. Reactivo Volumen(l)porreaccin Amortiguador10xPCRIcon15mmol/lMgCl2 2 Extra25mmol/lMgCl2 2.8 2.5mmol/ldNTPs 8 Hemmeroaleatorio50M 1 InhibidordelaARNasa20U/l 1 TranscriptasaInversa50U/l 1 ARNextrado 4.2 I. AgitarenVortexycentrifugareltuboconlamezclabrevemente(aprox.3seg.) II. Mantenereltuboatemperaturaambientedurante10minutosyluegoincubara 42Cporlomenosdurante15minutos III. Incubareltuboa95Cdurante5minutosyluegoenfriarenhielo. 2.RealizarPCRentiemporeal I. PrepararlamezcladereaccinHotStartpipeteandosuavemente60lde SondasdeHibridacinparaMezcladeReaccinLCFastStart(frascoampolla 1b)enelLCEnzimaFastStart(frascoampolla1a). II. Paracadamuestradepruebaycontrolespositivosynegativos,prepararla mezcladelreactivoconcebadoresymezcladesondasdeacuerdoconlo siguiente Mezclamaestra: Reactivo Volumen(l) H2OgradoPCR 7.6 MgCl2(25mmol/l) 2.4 Cebadoresymezclaparasondas 3 MezclaparareaccinHotStart 2 Volumentotal 15 Cadareaccin: Mezclamaestra 15 ADNc: 5

CondicionesdecicladodelatemperaturadePCR Temperatura(C) Tiempo No.deciclos (minuto:segundo) 95 10:00 1 95 0:10 }50 56 0:15 72 0:10 40 0:30 1 ProtocolodeRTPCRentiemporeal10 ExtraerelARNviraldelespcimenclnicocomosedescribeenAnlisisdeRTPCR convencional Materialesrequeridos QIAGENQuantiTect,EquipodeSondaparaRTPCR(#204443): o 2xQuantiTect,MezclaMaestradeSondadeRTPCR o QuantiTect,MezclaRT o AguasinRNasa InhibidordelaARNasa Cebadores SondaTaqManMGB Equipo:SistemadeDeteccindePCRentiemporealChromo4(BioRad); LingtCycler2(Roche)oLingtCycler480(Roche) PCRentiemporeal LaPCRentiemporealserealizamedianteRTPCRdeunsolopasousandounasonda TaqMan Cebadoresysondas: Gen:TipoA(M) Secuenciasdecebadores MP3967For 5'CCMAGGTCGAAACGTAYGTTCTCTCTATC3'(10mol/l) MP183153Rev 5'TGACAGRATYGGTCTTGTCTTTAGCCAYTCCA3'(10mol/l)
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Protocol provided by National Institute of Infectious Diseases (NIID), Center for Influenza Virus Research, Tokyo, Japan (WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza).

Secuenciadesondas MP9675ProbeAs 5'(FAM)ATYTCGGCTTTGAGGGGGCCTG(MGB)3'(5pmol/l) MezcladeReaccin Reactivo Volumen(l) MezclaMaestraparaSondadeRTPCR2xQuantiTect 12.5 CebadorDirecto(10M) 1.5 CebadorInverso(10M) 1.5 SondaTaqManMGB(5pmol/l) 0.5 MezclaQuantiTect 0.25 AguasinRNasa 3.75 Total 20 Procedimiento 1) Distribuir20ldelamezcladereaccinencadaplacadereaccinparaRT PCR. 2) Agregar5lARNdemuestraalamezcladereaccin.Parareaccionesde control,usar5ldeaguadestiladaparacontrolnegativo,y5ldeARNvirales positivosadecuadosparacontrolpositivo. 3) Programareltermocicladordeacuerdoconelprogramaquesedescribea continuacin. 4) IniciarelprogramadeRTPCRentiemporealmientrasquelasplacasde reaccinparaRTPCRtodavaestnenhielo. 5) Esperarhastaqueeltermocicladorhayaalcanzado50C.Luego,colocarlas placasdereaccinparaRTPCReneltermociclador. CondicionesdecicladodetemperaturadeRTPCR:SistemadedeteccindePCR Chromo4Realtime(BioRad) Temperatura(C) Tiempo No.deciclos (minuto:segundo) 50 30:00 1 95 15:00 1 94 0:15 }45 56 1:00

CondicionesdecicladodetemperaturadeRTPCR:LingtCycler2(Roche)oLingtCycler 480(Roche) Temperatura(C) Tiempo No.deciclos (minuto:segundo) 50 30:00 1 95 15:00 1 94 0:15 o (ramprate1.2 C/seg) }45 56 1:00 (ramprate1.2oC/seg) Recopilacindedatos Anexo3:AlgoritmodepruebaporPCReinterpretacinderesultados