Anda di halaman 1dari 7

REKAYASA GENETIKA MIKROORGANISME PENGHASIL ENZIM LIPASE UNTUK PRODUK BAKERY ENZIM LIPASE Enzim lipase merupakan salah

satu enzim yang memiliki sisi aktif sehingga dapat menghidrolisis triasilgliserol menjadi asam lemak dan gliserol. Enzim lipase dapat digunakan untuk menghasilkan emulsifier, surfaktant, mentega, coklat tiruan, protease untuk membantu pengempukan daging, mencegah kekeruhan bir, naringinase untuk menghilangkan rasa pahit pada juice jeruk, glukosa oksidase untuk mencegah reaksi pencoklatan pada produk tepung telur dan lain-lain.

Sumber-sumber enzim lipase antara lain : bakteri (S. aureus), kapang (Aspergillus niger, Rhizopus arrhizus), tanaman yang menghasilkan trigliserida (kacang-kacangan), pancreas, susu. Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim lipase:

Suhu Suhu optimal lipase adalah 30-400C, aktivitas akan berkurang pada suhu dibawah 30 0C dan diatas 40 0C.

pH: Lipase memiliki pH optimal 8-9, beberapa golongan dapat bekerja pada pH 4,1-6,3 Konsentrasi substrat Jika konsentrasi substrat rendah maka semua substrat akan berikatan dengan enzim. Jika konsentrasi substrat naik maka akan lebih banyak enzim yang berikatan dengan substrat. Semakin tinggi konsentrasi substrat tidak akan meningkatkan kecepatan reaksi.

Konsentrasi enzim Kecepatan aktivitas enzim berbanding lurus dengan konsentrasi enzim.

Adanya aktivator Beberapa ion dan molekul mempunyai kemampuan menonaktifkan enzim.

Spesifisitas substrat Lipase akan bekerja degan baik jika enzim menemukan substrat yang sesuai dengan karakteristik dan kemampuannya.

Pelarut organik Pelarut organik digunakan untuk melarutkan lemak agar pada suhu kamar ada pada keadaan cair. Dalam menggunakan pelrut organik yang harus diperhatikan adalah jenis pelarutnya dan volume nya. Aplikasi enzim lipase untuk sintesis senyawa organik semakin banyak dikembangkan,

terutama karena reaksi menggunakan enzim lipase bersifat regioselektif dan enansioselektif. Aktifitas katalitik dan selektivitas enzim, tergantung dari struktur substrat, kondisi reaksi, jenis pelarut, dan penggunaan air dalam media.Contohnya biosintesis senyawa pentanol, hexanol & benzyl alkohol ester, serta biosintesis senyawa terpene ester menggunakan enzim lipase yang berasal dari Candida antartica dan Mucor miehei. ISOLASI ENZIM LIPASE DARI MIKROORGANISME Lipase merupakan biokatalis yang secara umum diperlukan untuk hidrolisis lemak, mono- dan di-gliserida yang akan menghasilkan asam lemak bebas dan gliserol (Suzuki et al., 1988; Kosugi et al., 1990) dan sebaliknya pada kondisi tertentu lipase juga mengkatalisis reaksi sintesis gliserida dari gliserol dan asam lemak (Suzuki et al., 1988; Hoq et al., 1985). Aplikasinya dapat dijumpai antara lain pada industri makanan dan minuman, deterjen, farmasi, agrokimia, dan oleokimia (Saxena et al., 1999; Yang & Xu, 2001). Penggunaan lipase dalam industri makanan memiliki keunggulan karena hidrolisis yang dikatalisis bersifat spesifik. Modifikasi oleh enzim lipase yang memiliki spesifisitas reaksi 1,3gliserida menghasilkan gliserida dengan produk utama diasilgliserol (DAG) dan produk samping monoasilgliserol (MAG) serta asam lemak bebas dan gliserol. Yasunaga et al. (2001) melaporkan bahwa minyak kaya DAG dapat berfungsi sebagai minyak sehat karena antara lain dapat mengurangi trigliserida (TG) dalam serum darah, mencegah akumulasi lemak dalam tubuh dan memperbaiki rasio kolesterol serum darah. Rekayasa genetika untuk memproduksi senyawa bernilai ekonomi tinggi telah banyak dikembangkan, terutama dalam industri makanan dan farmasi (Murooka & Imanaka, 1993; van Dijck, 1999). Pendekatan produksi lipase yang umum dilakukan dan telah berkembang ke tingkat komesialisasi adalah eksplorasi dan skrining strain kapang secara intensif yang diikuti dengan rekayasa genetika. Salah satu contoh adalah Lipolase. Lipase rekombinan yang diproduksi oleh Novo Nordisk ini, menggunakan gen lipase yang berasal dari Humicola yang kemudian diekspresikan di dalam sel inang baru yaitu Aspergillus oryzae (Hoq et al., 1985). Eksplorasi dan

skrining kapang yang berpotensi tinggi sebagai penghasil lipase merupakan tahapan penting dalam rekayasa genetika produksi lipase. Beberapa kapang diketahui mampu menghasilkan lipase yaitu Aspergillus niger, Mucor miehei, Monilia sitophila, Rhizopus delemar dan R. Javanicus (Onions et al., 1981; Yamane, 1987). Lipase yang berasal dari mikroba umumnya bersifat ekstraseluler. Isolasi gen yang menyandi protein lipase merupakan salah satu langkah awal produksi lipase dalam skala besar melalui rekayasa genetika. White et al. (1990) mengemukakan bahwa Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan metode deteksi yang tergolong mudah untuk mengetahui keberadaan gen target di dalam organisme uji. Pasangan primer heterologous yang dirancang berdasarkan daerah terkonservasi pada gen target dapat digunakan dalam PCR tersebut. Lipase merupakan enzim yang memiliki karakter spesifik tergantung organisme penghasilnya. Beberapa lipase yang dihasilkan organisme-organisme dalam satu genus juga memiliki karakter berbeda meskipun secara umum memiliki motif asam amino yang sama untuk tiap organisme. Motif asam amino ini berupa urutan asam amino Glisin-X-Serin-X-Glisin (G-XS-XG) yang juga merupakan sisi aktif dari enzim ini, dimana X dapat digantikan oleh Histidin, Leusin, atau Tirosin (Salomon, 2003). Pengaruh lingkungan kemungkinan turut memberikan peranan terhadap organisme penghasil lipase. Isolasi RNA kapang Isolasi RNA kapang menunjukkan kualitas dan kuantitas RNA hasil diisolasi dari ketiga jenis kapang penghasil lipase yang potensial yaitu R. oligosporus, A. corymbifera dan R. oryzae. Kunci keberhasilan untuk mendapatkan RNA kapang dengan kuantitas yang tinggi adalah umur pertumbuhan yang sekaligus menentukan jumlah miselium yang dipanen. Kapang yang dipanen untuk isolasi RNA umumnya mengandung sekitar 6 x 108 sel atau ekivalen dengan 1 1,5 gram biomassa miselium, yang menunjukkan bahwa metabolisme kapang sedang berada pada laju eksponensial. Kapang dengan dinding sel yang 80% terdiri dari polisakarida lebih mudah mengalami lisis sehingga jumlah RNA yang diperoleh sangat tinggi. RNA kapang yang diperoleh selanjutnya digunakan untuk sintesis cDNA. Miselium kapang dipanen menggunakan ose steril dan dicuci dengan akuades steril,kemudian digerus dalam mortar dengan menambahkan nitrogen cair hingga berbentuk serbuk beku. Ke dalam 2,5 g serbuk miselium beku ditambahkan 10 Ml bufer ekstraksi (Trizma Base 0,2 M, LiCl 0,3 M, EDTA 0,01 M, PVP MW 36,000 1%, tiourea 5 mM, aurintrikarboksilat

1 mM, dan 2-Merkaptoetanol 2%). Campuran dikocok kuat, ditambahkan 1 volume campuran fenol:kloroform: isoamilalkohol (25:24:1), divorteks 330 detik, kemudian disentrifus pada kecepatan 15.000 rpm, suhu 4C selama 15 menit. Supernatan diekstraksi sekali lagi menggunakan kloroform : isoamilalkohol (24:1) sebanyak 1 volume dilanjutkan dengan sentrifus kembali pada kecepatan, suhu dan waktu yang sama. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung sentrifus baru, kemudian ditambahkan 1/30 volume Na asetat 3,3 M pH 5,2 dan 1/10 volume etanol absolut. Setelah campuran diinkubasi dalam es selama 30 menit, RNA diendapkan melalui sentrifugasi (15.000 rpm, 4C, 25 menit). Endapan RNA dicuci menggunakan etanol 70% dingin dilanjutkan dengan sentrifugasi (8000 rpm, 4C, 25 menit). Endapan RNA dilarutkan dengan DEPCdH2O. RNA dipisahkan dari DNA dengan menambahkan LiCl 8 M ke dalam larutan RNA hingga konsentrasi akhir 2 M. Campuran didiamkan selama 4-16 jam pada suhu 4C, kemudian disentrifus 13.000 rpm, 4C, 20 menit). Endapan RNA dibilas menggunakan etanol dingin 70%, dilanjutkan dengan sentrifugasi (5000 rpm, 4C, 5 menit). Endapan RNA dilarutkan menggunakan 50-100L DEPC-dH2O. RNA yang diperoleh diuji kualitas dan kuantitasnya menggunakan elektroforesis pada gel agarosa 0,8% dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 260 dan 280 nm. Di samping itu prosedur isolasi RNA yang dikembangkan dari gabungan metode Chang et. al. (1993) dan Liu et. al. (1998) untuk mengatasi kandungan senyawa polisakarida yang tinggi nampaknya sangat efektif untuk isolasi RNA dari kapang. Kapang dengan dinding sel yang 80% terdiri dari polisakarida lebih mudah mengalami lisis sehingga jumlah RNA yang diperoleh sangat tinggi. RNA kapang yang diperoleh selanjutnya digunakan untuk sintesis cDNA. Amplifikasi fragmen gen LIPASE Untuk mengetahui secara pasti panjang dan susunan nukleotida fragmen produk RTPCR tersebut, dilakukan isolasi dan pemurnian fragmen dari gel, kloning dan isolasi plasmid rekombinan, dilanjutkan dengan sekuensing. Prinsip kerja program ini adalah membandingkan pixel gambar masingmasing sampel dengan menggunakan marka DNA sebagai standar konsentrasi. Baik secara visual maupun secara kuantitatif nampak hasil RT-PCR tertinggi. Semakin tinggi spesifisitas primer, maka semakin tinggi produk RT-PCR yang Dihasilkan. Produksi lipase oleh kapang pada umumnya dipengaruhi kondisi lingkunganmenghasilkan lipase ekstraseluler sebagai biokatalis untuk mencerna lemak. Dipilih untuk kloning ke dalam E. Coli

dilanjutkan dengan analisis DNA untuk mengkonfirmasi kebenaran produk RTPCR sebagai fragmen gen LIPASE. Isolasi dan analisis fragmen DNA Ac_LIP4 hasil RT-PCR Koloni putih hasil transformasi E. Coli XL1Blue menggunakan fragmen DNA produk RT-PCR asal A. Corymbifera (Ac_LIP4) dianalisis untuk memastikan ada tidaknya sisipan fragmen DNA produk RT-PCR terklon, dengan teknik PCR koloni menggunakan primer LIP4F/R. Isolasi plasmid kemudian dilakukan untuk mendapatkan plasmid yang telah tersisipi fragmen Ac_LIP4. Sekuensing DNA yang dilanjutkan dengan analisis BLAST VecScreen untuk menghilangkan kontaminasi sekuen DNA yang berasal dari vektornya. Dengan demikian dapat dipastikan bahwa fragmen tersebut adalah fragmen gen LIPASE. APLIKASI ENZIM LIPASE DALAM INDUSTRI BAKERY Dalam bidang pangan, nutrisi dan nilai sensoris serta sifat fisik dari lemak dan minyak banyak dipengaruhi oleh beberapa faktor, seperti posisi asam lemak dalam rantai gliserol, panjang rantai asam lemak, dan derajat tidak jenuh (degree unsaturation). Lipase memungkinkan modifikasi dari sifat lemak dengan menubah lokasi dari rantai asam lemak pada gliserida dan mengganti satu atau lebih asam lemak dengan satu asam lemak yang baru. Lipase digunakan untuk meningkatkan atau mengembangkan flavouring agent pada produk bakery (Gunasekaran and Das, 2004). Lipase juga digunakan sebagaio pengganti dari emulsifier dan untuk memperbaiki rheologi adonan untuk memproduksi remah-remah dan tekstur yang lebih lembut pada roti. Beberapa lipase digunakan pada cakes untuk mengganti emulsifier atau memperkuat adonan untuk memproduksi cake yang berangin dengan tekstur yang lembut, yang disebut Fatula. Lipase juga bekerja untuk membebaskan beberapa lemak pada tepung yang diikat oleh protein. Dengan melepaskan lemak-lemak tersebut dan memecahnya dari ikatannya, lemak-lemat tersebut bebas untuk digunakan pada roti dengan baik (Rigik, 2009). Enzim lipase memodifikasi lemak alami dari tepung, jadi lipase dapat berfungsi sebagai emulsifier dan mengurangi penambahan emuilsifier tanpa mengurangi kualitas produk bakery (Michaelides, 2007).

Daftar Pustaka Chang, S., J. Puryear & J. Cairney (1993). A simple and efficient method for isolating RNA from pine trees. Plant Mol. Biol. Rep., 11, 98 100. Gunasekaran, V and Debabrata Das. 2004. Lipase Fermentation : Progress and Prospects. Indian Journal of Biotechnology Vol 4, October 2005, pp 437 445 Hoq, M. M, T. Yamane, S. Shimizu, T. Funada, & S. Ishida. 1985. Continous hydrolysis of olive oil by lipase in microporous hydrophobic membrane bioreactor.J. Am.Oil Chem.Soc. Kosugi Y., H. Tanaka & N. Tomizuka. 1990. Continuous hydrolysis of oil by immobilized lipase in a countercurrent reactor. Biotechnol. & Bioengin., 36 (6), 617-622 Liu, J.J., C.J Goh, C.S Loh, Liu P. & E.C. Pua (1998). A method for isolation of total RNA from fruit tissues of banana. Plant Mol. Biol. Rep., 16, 1-6. Michaelides, J. 2007. Emulsifiers. http://www.gftc.ca/articles/2007/baker08.cfm Murooka, Y. & T. Imanaka (1993). Recombinant Microbes for Industrial and Agricultural Applications. New York, Marcel Deker Pub. 896 pp. Onions, A.H.S., D. Allsopp & H.O.W. Eggins (1981). Smiths Introduction to Industrial Mycology. 7Th Rigik, E. 2009. Enzymes 101. http://baking-management.com/ingredients/enzymes-101/ Salomon, S. (2003). A Secreted Lipase as a Virulence Factor of Fusarium graminearum.Hamburg, Dept Molecular Phytopatology & Genetics. Univ. of Hamburg. 19 p Saxena, R.K., et al. 2000. Microbial lipases Curr.Sci. otential biocatalysis for the future industry.

Suzuki, T., Y. Mushiga, T. Yamane & S. Shimizu. 1998. Mass production of lipase by fedbatch culture of Pseudomonas Fluorescens. Appl. Microbiol. Technol.,27,417-422. Van Dijck, P.W.M. (1999). Chymosin and Phytase. Made by genetic engineering (No. 10 in a series of articles to promote a better understanding of the use of genetic engineering). J. Biotechnol., 67,77-80. White, T. J., T. Burns, S. Lee & J. Taylor. (1990). Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In M. A. Innis, D. H. Gefland, J. J. Sninsky & T. J. White (eds). Yamane, T. (1987). Enzyme technology for the lipids industry : An Engineering overview. In Applewhite, T. H. (ed.). Proceeding of World Conference on Biotechnology for the Fats and Oils Industry. AOAC Champaign. p.17-22. ondon, Edwards Arnold British. P.140-142.

Yasunaga, K., Y. Katsuragi & T. Yasukawa (2001). Nutritiolal characteristics of diacylglycerol.In: 2001 PIPOC International Palm Oil Congress. p. 149155.