Anda di halaman 1dari 16

ANALISA PROTEIN

A. Analisa Kualitatif Protein 1. Reaksi Xantoprotein Uji xantoprotein merupakan uji kualitatif pada protein yang digunakan untuk menunjukkan adanya gugus benzena (cincin fenil). Asam amino yang menunjukkan reaksi positif untuk uji ini adalah tyrosin, phenilalanin, dan tryptophan. Reaksi positif ada uji xantoprotein adalah munculnya gumpalan atau cincin warna kuning. Pada uji ini, digunakan larutan HNO3 yang berfungsi untuk memecah protein menjadi gugus benzena. Larutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati ke dalam larutan protein. Setelah dicampur terjadi endapan putih yang dapat berubah menjadi kuning apabila dipanaskan. Reaksi yang terjadi ialah nitrasi pada inti benzena yang terdapat pada molekul protein. Reaksi ini positif untuk protein yang mengandung tirosin, fenilalanin dan triptofan.

2. Reaksi Hopkins-Cole Larutan protein yang mengandung triptofan dapat direaksikan dengan pereaksi Hopkins-Cole yang mengandung asam glioksilat. Pereaksi ini dibuat dari asam oksalat dengan serbuk magnesium dalam air. Setelah dicampur dengan pereaksi Hopkins-Cole, asam sulfat dituangkan perlahan-lahan sehingga membentuk lapisan di bawah larutan protein. Beberapa saat kemudian akan terjadi cincin ungu pada batas antara kedua lapisan tersebut. Larutan albumin sebanyak 2 mL ditambahkan dengan 2 mL reagen HopkinsCole. Lalu, ditambahkan lagi dengan larutan asam sulfat pekat melalui sisi tabung sampai kira-kira 5 mL dan bila perlu putar perlahan-lahan. Warna yang terbentuk pada pertemuan kedua cairan diamati.kemudian Masing-masing 2 mL larutan tyrosin, phenilalanin, tripthopan, glisin dan sistein ditambahkan dengan 2 mL reagen HopkinsCole. Lalu, ditambahkan lagi dengan larutan asam sulfat pekat melalui sisi tabung sampai kira-kira 5 mL dan bila perlu putar perlahan-lahan. Warna yang terbentuk pada pertemuan kedua cairan diamati.

Reagen Hopkins-Cole mengandung asam glioksilat (HOO-CHO). Jika reagen tersebut ditambahkan dengan senyawa yang mengandung cincin indol dan ditambahkan dengan asam sulfat maka akan membentuk cincin ungu pada interfase kedua cairan tersebut.. Pada pengujian asam amino dengan uji Hopkins-Cole, larutan albumin ditambahkan dengan reagen Hopkins-Cole dan asam sulfat. Penambahan tersebut menyebabkan terbentuknya dua lapisan dan terbentuk cincin ungu pada bidang batas antara kedua lapisan tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa di dalam larutan albumin positif mengandung triptofan, karena triptofan merupakan satusatunya asam amino yang mengandung gugus indol. Cincin ungu yang terbentuk merupakan hasil kondensasi triptofan dengan gugus aldehida dari asam glioksilat dalam suasana asam sulfat.

3. Reaksi Millon Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Apabila pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna.

4. Reaksi Nitroprusida Pada asam amino sistein, selain terdapat gugus COOH ,gugus NH2 dan gugus R pada asam amino sistein juga terdapat SH bebas (gugus sulfidril) bila bereaksi dengan natrium nitroprusida dalam amonia berlebih menghasilkan kompleks berwarna merah. Beberapa protein yang memberikan hasil negatif terhadap uji ini, ternyata menjadi positif setelah dipanaskan sampai mengalami koagulasi atau denaturasi. Hal ini menunjukkan proses tersebut menghasilkan gugus SH bebas. Reaksi: [Fe3+(CN)3NC]2- + NH3 + RSH NH4+ + [Fe2+ (CN)5NOSR]2 Kompleks berwarna merah

Gugus sulfidril dalam larutan sistein akan bereaksi dengan natriumprusida dalam amonia berlebih membentuk kompleks berwarna merah. Pada pengujian ini penambahan natriumprusida dan amonia ke dalam larutan sistein menimbulkan warna
2

merah. Warna merah ini dihasilkan dari reaksi antara gugus SH dari sistein dengan natriumprusida dalam larutan amoniak. Hal ini menunjukkan uji positif terhadap reaksi nitroprusida.

5. Reaksi Sakaguchi Pereaksi yang digunakan ialah naftol dan natriumhipobromit. Pada dasarnya reaksi ini memberikan hasil positif apabila ada gugus guanidin. Jadi arginin atau protein yang mengandung arginin dapat menghasilkan warna merah. Reaksi sakaguci dilakukan dengan menggunakan pereaksi nafol dan natrium hipobromit. Pada dasarnya reaksi ini dapat memberi hasil positif apabila ada gugus guanidin. Jadi, arginin atau protein yang mengandung arginin dapat menghasilkan warna merah (Lehninger, 1990).

B. Analisa Kuantitatif Protein 1. Metode Kjeldahl Metode Kjeldahl dikembangkan pada taun 1883 oleh pembuat bir bernama Johann Kjeldahl. Makanan didigesti dengan asam kuat sehingga melepaskan nitrogen yang dapat ditentukan kadarnya dengan teknik titrasi yang sesuai. Jumlah protein yang ada kemudian dihitung dari kadar nitrogen dalam sampel. Prinsip dasar yang sama masih digunakan hingga sekarang, walaupun dengan modifikasi untuk mempercepat proses dan mencapai pengukuran yang lebih akurat. Metode ini masih merupakan metode standart untuk penentuan kadar protein. Karena metode Kjeldahl tidak menghitung kadar protein secara langsung, diperlukan faktor konversi (F) untuk menghitung kadar protein total dan kadar nitrogen. Faktor konversi 6,25 (setara dengan 0,16 g nitrogen per gram protein) digunakan untuk banyak jenis makanan, namun angka ini hanya nilai rata-rata, tiap protein mempunyai faktor konversi yang berbeda tergantung komposisi asam aminonya. Metode Kjeldahl terdiri dari tiga langkah : digesti, netralisasi dan titrasi.

a. Digestion Sampel makanan yang akan dianalisis ditimbang dalam labu digesti dan didigesti dengan pemanasan dengan penambahan asam sulfat (sebagai oksidator yang dapat mendigesti makanan), natrium sulfat anhidrat (untuk mempercepat tercapainya titik didih) dan katalis sepert tembaga (Cu), selenium, titanium, atau merkurium (untuk mempercepat reaksi). Digesti mengubah nitrogen dalam makanan (selain yang dalam bentuk nitrat atau nitrit) menjadi amonia, sedangkan unsur oganik lain menjadi CO2 dan H2O. Gas amonia tidak dilepaskan ke dalam larutan asam karena berada dalam bentuk ion amonium (NH4+) yang terikat dengan ion sulfat (SO4 2-) sehingga yang berada dalam larutan adalah : N (makanan) (NH4)2SO4 (1).......................................(1)

b. Netralisasi Setelah proses digesti sempurna, labu digesti dihubungkan dengan labu penerima (recieving flask) melalui sebuah tabung. Larutan dalam labu digesti dibasakan dengan penambahan NaOH, yang mengubah amonium sulfat menjadi gas amonia : (NH4)2SO4 + 2 NaOH 2 NH3 + 2 H2O + Na2SO4 ..............................(2) Gas amonia yang terbentuk dilepaskan dari larutan dan berpindah keluar dari labu digesti masuk ke labu penerima, yang berisi asam borat berlebih. Rendahnya pH larutan di labu penerima mengubah gas amonia menjadi ion amonium serta mengubah asam borat menjadi ion borat: NH3 + H3BO3 NH4 + + H2BO3- ..............................................(3)

c. Titrasi Kandungan nitrogen diestimasi dengan titrasi ion amonium borat yang terbentuk dengan asam sulfat atau asam hidroklorida standar, menggunakan indikator yang sesuai untuk menentukan titik akhir titrasi. H2BO3- + H+ H3BO3 .....................(4) Kadar ion hidrogen (dalam mol) yang dibutuhkan untuk mencapai titik akhir titrasi setara dengan kadar nitrogen dalam sampel makanan (persamaan 3). Persamaan berikut dapat digunakan untuk menentukan kadar nitrogen dalam mg sampel menggunakan larutan HCl x M untuk titrasi.

Dimana vs dan vb adalah volume titrasi sampel dan blanko, 14 g adalah berat molekul untuk nitrogen N. Penetapan blanko biasanya dilakukan pada saat yang sama dengan sampel untuk memperhitungkan nitrogen residual yang dapat mempengaruhi hasil analisis. Setelah kadar nitrogen ditentukan, dikonversi menjadi kadar proteind dengan faktor konversi yang sesuai : % Protein = F x %N

Keuntungan metode Kjeldahl : Metode Kjeldahl digunakan secara luas di seluruh dunia dan masih merupakan metode standar dibanding metode lain. Sifatnya yang universal, presisi tinggi dan reprodusibilitas baik membuat metode ini banyak digunakan untuk penetapan kadar protein.

Kerugian metode Kjeldahl : Metode ini tidak memberikan pengukuran protein sesungguhnya, karena tidak semua nitrogen dalam makanan bersumber dari protein. Protein yang berbeda memerlukan faktor koreksi yang berbeda karena susunan residu asam amino yang berbeda. Penggunaan asam sulfat pada suhu tinggi berbahaya, demikian juga beberapa katalis. Teknik ini membutuhkan waktu lama.

2. Metode Titrasi Formol Larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH) lalu ditambahkan formalin akan membentuk dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol ini berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi antara asam dengan basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah fenoftalein akhir titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang dalam 30 detik.

3. Metode Spektroskopi Visible Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun.. selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak (visible). Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 C) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu. Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memilii warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible. Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil. Salah satu contohnya adalah pada analisa kadar protein terlarut (soluble protein). Protein terlarut dalam larutan tidak memiliki warna. Oleh karena itu, larutan ini harus dibuat berwarna agar dapat dianalisa. Reagent yang biasa digunakan adalah reagent Folin.

4.

Metode Spektrofotometri UV Asam amino penyusun protein diantaranya adalah triptofan, tirosin dan fenilalanin yang mempunyai gugus aromatik. Triptofan mempunyai absorbsi maksimum pada 280 nm, sedang untuk tirosin mempunyai absorbsi maksimum pada 278 nm. Fenilalanin menyerap sinar kurang kuat dan pada panjang gelombang lebih pendek. Absorpsi sinar pada 280 nm dapat digunakan untuk estimasi konsentrasi protein dalam larutan. Supaya hasilnya lebih teliti perlu dikoreksi kemungkinan adanya asam nukleat dengan pengukuran absorpsi pada 260 nm. Pengukuran pada 260 nm untuk melihat kemungkinan kontaminasi oleh asam nukleat. Rasio absorpsi 280/260 menentukan faktor koreksi yang ada dalam suatu tabel. Pengukuran langsung pada 280nm. Tryptophan dan tyrosine mengabsorbsi kuat cahaya uv pada 280 nm. Kandungan tryptophan dan tyrosine berbagai protein umumnya konstan sehingga serapan larutan protein pada 280 nm dapat digunakan untuk menentukan kadarnya. Keuntungan metode ini : Sederhana untuk dilakukan, non-destruktif, tidak dibutuhkan reagen khusus, sensitif terhadap protein dengan konsentrasi rendah.. Kerugian metode ini : Asam nukleat juga mengabsorbi kuat pada 280 nm dan sehingga mengganggu pengukuran protein jika ada dalam kadar yang bermakna. Namun demikian, metode ini telah berkembang untuk mengatasi masalah ini, antara lain : dengan pengukuran serapan pada dua panjang gelombang yang berbeda. Sebagian besar teknik UV-visible memerlukan larutan yang encer dan jernih, serta tidak mengandung senyawa kontaminan yang dapat mengabsorpsi atau memantulkan cahaya pada panjang gelombang di mana protein akan dianalisis. Karena diperlukan larutan jernih, maka makanan harus mengalami sejumlah tahap preparasi sampel sebelum dianalisis, seperti homogenisasi, ekstraksi pelarut, sentrifugasi, filtrasi, dsb. yang dapat menyita waktu dan tenaga. Selain itu, kadang-kadang sulit untuk secara kuantitatif mengekstraksi protein dari jenis makanan tertentu, terutama bila makanan tersebut telah mengalami proses dimana protein menjadi agregat atau terikat secara kovalen dengan senyawa lain. Kelemahan lain adalah, serapan tergantung pada jenis protein (karena protein yang berbeda mempunyai sekuens/urutan asam amino yang berbeda pula).

5. Metode Lowry Metode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret. Dalam metode ini terlibat 2 reaksi. Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdatphosphotungstat (phosphomolybdotungstate), menghasilkan heteropolymolybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri. Kekuatan warna biru terutama bergantung pada kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya. Keuntungan metode Lowry adalah lebih sensitif (100 kali) daripada metode Biuret sehingga memerlukan sampel protein yang lebih sedikit. Batas deteksinya berkisar pada konsentrasi 0.01 mg/mL. Namun metode Lowry lebih banyak interferensinya akibat kesensitifannya. Beberapa zat yang bisa mengganggu penetapan kadar protein dengan metode Lowry ini, diantaranya buffer, asam nuklet, gula atau karbohidrat, deterjen, gliserol, Tricine, EDTA, Tris, senyawa-senyawa kalium, sulfhidril, disulfida, fenolat, asam urat, guanin, xanthine, magnesium, dan kalsium. Interferensi agen-agen ini dapat diminimalkan dengan menghilangkan interferens tersebut. Sangat dianjurkan untuk menggunakan blanko untuk mengkoreksi absorbansi. Interferensi yang disebabkan oleh deterjen, sukrosa dan EDTA dapat dieliminasi dengan penambahan SDS atau melakukan preparasi sampel dengan pengendapan protein (Lowry dkk 1951). Metode Lowry-Folin hanya dapat mengukur molekul peptida pendek dan tidak dapat mengukur molekul peptida panjang (Alexander dan Griffiths, 1992). Prinsip kerja metode Lowry adalah reduksi Cu2+ (reagen Lowry B) menjadi Cu+ oleh tirosin, triptofan, dan sistein yang terdapat dalam protein. Ion Cu+ bersama dengan fosfotungstat dan fosfomolibdat (reagen Lowry E) membentuk warna biru, sehingga dapat menyerap cahaya (Lowry dkk 1951).

ANALISA KARBOHIDRAT 1. Analisis Kadar Gula Pereduksi dan Gula Total Gula pereduksi yaitu monosakarida dan disakarida kecuali sukrosa dapat ditunjukkan dengan pereaksi Fehling atau Benedict menghasilkan endapan merah bata (Cu2O). selain pereaksi Benedict dan Fehling, gula pereduksi juga bereaksi positif dengan pereaksi Tollens (Apriyanto et al 1989). Penentuan gula pereduksi selama ini dilakukan dengan metode pengukuran konvensional seperti metode osmometri, polarimetri, dan refraktrometri maupun berdasarkan reaksi gugus fungsional dari senyawa sakarida tersebut (seperti metode Luff-Schoorl, Seliwanoff, Nelson-Somogyi dan lain-lain). Hasil analisisnya adalah kadar gula pereduksi total dan tidak dapat menentukan gula pereduksi secara individual. Untuk menganalisis kadar masingmasing dari gula pereduksi penyusun madu dapat dilakukan dengan menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCTK). Metode ini mempunyai beberapa keuntungan antara lain dapat digunakan pada senyawa dengan bobot molekul besar dan dapat dipakai untuk senyawa yang tidak tahan panas (Gritter et al 1991 dalam Swantara 1995). Penentuan kadar glukosa dilakukan dengan cara menganalisis sampel melalui pendekatan proksimat. Terdapat beberapa jenis metode yang dapat dilakukan untuk menentukan kadar gula dalam suatu sampel. Salah satu metode yang paling mudah pelaksanaannya dan tidak memerlukan biaya mahal adalah metode Luff Schoorl. Metode Luff Schoorl merupakan metode yang digunakan untuk menentukan kandungan gula dalam sampel. Metode ini didasarkan pada pengurangan ion tembaga (II) di media alkaline oleh gula dan kemudian kembali menjadi sisa tembaga. Ion tembaga (II) yang diperoleh dari tembaga (II) sulfat dengan sodium karbonat di sisa alkaline pH 9,3-9,4 dapat ditetapkan dengan metode ini. Pembentukan (II)-hidroksin dalam alkaline dimaksudkan untuk menghindari asam sitrun dengan penambahan

kompleksierungsmittel. Hasilnya, ion tembaga (II) akan larut menjadi tembaga (I) iodide berkurang dan juga oksidasi iod menjadi yodium. Hasil akhirnya didapatkan yodium dari hasil titrasi dengan sodium hidroksida (Anonim 2010). Pengukuran karbohidrat yang merupakan gula pereduksi dengan metode Luff Schoorl ini didasarkan pada reaksi sebagai berikut :

Karbohidrat kompleks gula sederhana (gula pereduksi) Gula pereduksi + 2 Cu2+ Cu2O(s) 2 Cu2+(kelebihan) + 4 I- 2 CuI2 2 CuI- + I2 I2 + 2 S2O32- 2 I- + S4O6 Monosakarida akan mereduksikan CuO dalam larutan Luff menjadi Cu2O. Kelebihan CuO akan direduksikan dengan KI berlebih, sehingga dilepaskan I2. I2 yang dibebaskan tersebut dititrasi dengan larutan Na2S2O3. Pada dasarnya prinsip metode analisa yang digunakan adalah Iodometri karena kita akan menganalisa I2 yang bebas untuk dijadikan dasar penetapan kadar. Dimana proses iodometri adalah proses titrasi terhadap iodium (I2) bebas dalam larutan. Apabila terdapat zat oksidator kuat (misal H2SO4) dalam larutannya yang bersifat netral atau sedikit asam penambahan ion iodida berlebih akan membuat zat oksidator tersebut tereduksi dan membebaskan I2 yang setara jumlahnya dengan dengan banyaknya oksidator (Winarno 2007). I2 bebas ini selanjutnya akan dititrasi dengan larutan standar Na2S2O3 sehinga I2 akan membentuk kompleks iod-amilum yang tidak larut dalam air. Oleh karena itu, jika dalam suatu titrasi membutuhkan indikator amilum, maka penambahan amilum sebelum titik ekivalen. Metode Luff Schoorl ini baik digunakan untuk menentukan kadar karbohidrat yang berukuran sedang. Dalam penelitian M.Verhaart dinyatakan bahwa metode Luff Schoorl merupakan metode tebaik untuk mengukur kadar karbohidrat dengan tingkat kesalahan sebesar 10%. Pada metode Luff Schoorl terdapat dua cara pengukuran yaitu dengan penentuan Cu tereduksi dengan I2 dan menggunakan prosedur Lae-Eynon (Anonim 2009). Metode Luff Schoorl mempunyai kelemahan yang terutama disebabkan oleh komposisi yang konstan. Hal ini diketahui dari penelitian A.M Maiden yang menjelaskan bahwa hasil pengukuran yang diperoleh dibedakan oleh pebuatan reagen yang berbeda. 2. Analisis Jenis-jenis Gula Karbohidrat dengan zat tertentu akn menghasilkan warna tertentu yg dapat dgunakanuntuk analisis kualitatif. Beberapa reaksi yg lebih spesifik dpt membedakan golongankarbohidrat. Banyak cara untuk mengetahui atau mengidentifikasi karbohidrat dalam suatu bahan alam, diantaranya adalah sebagai berikut:

10

a. Uji Molisch Pereaksi Molish harus selalu dibuat segar. Pereaksi ini dibuat dari -naftol dengan etanol.Karbohidrat oleh asam sulfat pekat akan terhidrolisis menjadi monosakarida dan selanjutnya monosakarida mengalami dehidrasi oleh asam sulfat pekat menjadi furfural atau hidroksimetil furfural. Furfural dengan -naftol akan berkondensasi membentuk senyawa kompleks yang berwarna ungu. Apabila pemberian asam sulfat pada larutan karbohidrat yang telahdiberi naftol melalui dinding gelas dengan hati-hati maka warna ungu yang terbentuk berupa cincin pada batas antara larutan karbohidrat dengan asam sulfat. KH (pentose) + H2SO4pekat ->furfural ->+ -naftol -> warna ungu KH (heksosa) + H2SO4pekat -> HM-furfural -> + -naftol -> warna ungu Kedua macam reaksi diatas berlaku umum, baik untuk aldosa (CHO) maupun karbohidratkelompok ketosa (C=O). b. Uji Benedict Pereaksi ini berupa larutan yang mengandung kuprisulfat, natrium karbonat, dan natriumsitrat. Glukosa dapat mereduksi ion Cu2+ dari kuprisulfat menjadi ion Cu+ yang kemudian mengendap sebagai CuO. Adanya natrium karbonat dan natrium sitrat membuat pereduksi. Benedict bersifat basa lemah. Endapan yang terbentuk dapat berwarna hijau, kuning, atau merah bata. Reaksi: R-COH + CuO -> Cu2O (s) + R-COOH c. Uji Barfoed Larutan Barfoed merupakan campuran kupriasetat dan asam asetat. Larutan ini akan bereaksidengan gula pereduksi sehingga dihasilkan endapan Tembaga (II) Oksida. Dalam suasana asam, gula pereduksi yang termasuk disakarida memberikan reaksi yang sangat lambatdengan larutan Barfoed sehingga tidak memberikan endapan merah kecuali pada waktu percobaan yang diperlama. Uji ini untuk menunjukkan gula pereduksi monosakarida. KH + camp CuSO4dan CH3COOH Cu2Oendapan merah bata d. Uji Seliwanoff Peristiwa dehidrasi monosakarida ketosa menjadi furfural lebih cepat dibandingkan dehidrasimonosakarida aldosa. Hal ini dikarenakan aldosa sebelum mengalami dehidrasi lebih dahuluakan mengalami transformasi ketosa. Dengan demikian aldosa akan bereaksi negatif pada ujisilwanoff. Pada pengujian ini

11

furfural yang terbentuk dari dehidrasi tersebut dapat bereaksidenga resorsinol membentuk senyawa kompleks berwarna merah. KH (ketosa) + H2SO4 -> furfural -> + resorsinol -> warna merah. KH (aldosa) + H2SO4 -> furfural -> + resorsinol -> negatif

e. Uji Tauber Pentosa dalam asam asetat pekat jika dipanaskan berubah menjadi furfural uyang kemudiandengan benzidin mengadakan kondensasi membentuk zat yang berwarna merah anggur.Heksosa tidak memberikan warna merah. Reaksi ini posotifuntuk aldopentosa dan negatif untuk ketopentosa. f. Uji Fenilhidrazin Semua karbohidrat yang mempunyai gugus aldehid atau keton bebas akan membentuk osazon bila dipanaskan bersama fenilhidrazin berlebih. Osazon yang terjadi mempunyai bentuk kristal dan titik lebur yang khas bagi mesing-masing karbohidrat. Hal ini sangat penting untuk mengidentifikasi karbohidrat dan merupakan salah satu cara membedakan beberapa monosakarida. g. Uji Iodium Karbohidrat dengan golongan polisakarida akan memberikan reaksi dengan larutan iodiumdan memberikan warna yang spesifik bergantung pada jenis karbohidratnya. Analisa denganiodin akn berwarna biru, amilo[ektin dengan iodin

12

akan berwarna merah violet, glikogendengan iodin akan berwarna merah cokelat, begitu juga dengan dekstrin. KH (poilisakarida) + Iod (I2) -> warna spesifik (biru kehitaman)

13

h. Uji Fermentasi Dalam ragi terdapat enzim-enzim yang dapat mencerna amilum sampai menjadi CO2 dan H2O, juga terdapat enzim sukrosa (invertase) maupun fruktokinase. Oleh karena amilum,glukosa, fruktosa, maltosa, dan sukrosa dapat diragikan. Dalam ragi tidak terdapat laktosa,maka laktosa tidak dapat dipecahkan. Hal ini dapat digunakan untuk membedakan apakahgula dalam urin glukosa atau fruktosa. Enzim ragi pada umumnya baik bekerja padatemperatur 37o C 40o C.

3. Anaisis Kadar Pati Pati merupakan molekul polisakarida yang terdiri dari amilosa dan amilopektin dimana kedua unsure penyusun pati ini merupakan rantai dari molekul glukosa dan apabila dihidrolisa menghasilkan glukosa dan amilosa. Dengan larutan iodium amilosa akan berwarna biru, sedangkan amilopektin akan berwarna violet. Pada umumnya pati tidak terdapat dalam keadaan murni, tetapi tercampur dengan zat-zat lain. Oleh karenanya didalam analisa kimia kadar pati, zat-zat lain itu harus dipisahkan agar analisanya sempurna. Pinsip analisanya yaitu hidrolisa pati oleh asam atau enzim sehingga diperoleh kadar pati. Kadar pati dalam sample sama dengan 0,9 kali kadar gula reduksi dalam sample (Fardiaz, 1989). Analisa penetapan pati dengan menggunakan metode Nelson-Somogi. Prinsip kerja metode Nelson-Somogi yaitu tereduksinya jumlah endapan kuprooksida yang bereaksi dengan arsenomolibdat yang tereduksi menjadi molybdine blue dan warna biru diukur absorbansinya. Reagen Nelson berfungsi sebagai oksidator antara kuprooksida yang bereaksi dengan gula reduksi membentuk endapan merah bata. Pada penentuan kadar pati terlebih dahulu dilakukan perparasi sample, hal ini dimaksudkan untuk mendapatkan sample yang benar-benar murni. Perlakuan pertama adalah dengan mengambil 2 gram sample (kentang) lalu ditambahkan aquadest untuk melarutkan sample. Lalu distirer selama 1 jam yang berfungsi untuk menghomogenkan larutan dan memisahkan larutan dari komponen selain karbohidrat. Kemudian disaring dan diambil filtratnya atau padatannya dan dicuci dengan aquadest untuk mempermudah ekstraksi pati dari bahan. Residu yang dihasilkan dicuci dengan eter untuk menghilangkan lipida dan klorofil yang terkandung dalam bahan. Setelah itu residu dicuci lagi dengan etanol 10% untuk melarutkan lemak yang masih terkandung
14

dalam sample dan untuk mencegah terjadinya hidrolisa gula oleh enzim. Hasil residu yang diperoleh kemudian dipindahkan secara kuantitatif dari kertas saring ke dalam Erlenmeyer, setelah itu dicuci dengan aquadest dan ditambahkan 25% HCl untuk menghidrolisa pati dan memecah residu menjadi amilosa dan amilopektin. Lalu panaskan pada pemanas balik yang berfungsi untuk menghidrolisa pati sehingga volumenya tetap selama 2,5 jam. Setelah itu didinginkan, kemudian dinetralkan dengan NaOH 45% pada pH 7 untuk mengembalikan pH larutan akibat pengaruh asam pada hidrolisa pati. Hasil yang diperoleh kemudian diencerkan hingga volume 500 ml, lalu disaring dan diambil filtratnya sebagai sampel. Filtrate sample dimasukkan ke dalam tabung dengan junlah yang berbeda-beda (25l, 50l dan 75l) serta blanko yang berisi aquadest, ditambahkan reagen Nelson, setelah itu dipanaskan dalam air mendidih selama 20 menit. Reagen Nelson berfungsi sebagai katalisator yang mereduksi kuprioksida menjadi koprooksida karena adanya gula reduksi yang berwarna merah bata. Jumlah endapan kuprooksida eqivalen dengan julah gula reduksi yang ada. Kemudian larutan ditambahkan Arsenomolybdat yang akan bereaksi dengan kuprooksida membentuk molybdine pada panjang gelombang 540 nm yang dapat menyerap optimum.

4. Analisis Kadar Dekstrin Dekstrin adalah karbohidrat yang dibentuk selama hidrolisis pati menajdi gula oleh panas, asam dan atau enzim. Maltosa, sukrosa dan laktosa adalah disakarida yang memiliki rumus empiris sama (C12H22O11) tetapi berbeda dalam struktur. Dekstrin dan pati memiliki rumus umum yang sama , [Cx(H2O)y)]n- (y = x 1), yang mana unit glukosa bersatu dengan yang lainnya membentuk rantai (polisakarida) tetapi dektrin memiliki ukuran lebih kecil dan kurang kompleks dibandingkan pati. Dektrin larut dalam air tetapi dapat diendapkan dengan alkohol. Dektrin memiliki sifat seperti pati. Beberapa dekstrin bereaksi denngan iodin memberikan warna biru dan larut dalam alkohol 25% (disebut amilodekstrin) sedang yang lainnya berwarna coklatkemerahan dan larut dalam alkohol 55% (disebut eritrodekstrin) dan yang lainnya tidak membentuk warna dengan iodin serta larut dalam alkohol 70 (disebut akhrodekstrin), yang juga diidentifikasi sebagai desktrosa ekuivalen (DE) . DE yang tinggi menunjukkan adanya depolimerisasi pati yang besar. Maltodekstrin adalah produk dengan DE rendah.
15

Kadar dekstrin dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer UV. Analisis ini didasarkan pada kenyataa bahwa dekstrin dapat larut dalam air dingin, dan antara dekstrin yang larut tersebut dengan larutan iod membentuk ikatan dekstrin-iod yang bewarna merah atau coklat-ungu. Absorbansinya dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm (Armelia, 1990). Untuk membuat kurva standar dekstrin, sebanyak 0,1 g dekstrin murni ditimbang dan diencerkan dengan air sapai volume 100 ml sambil diaduk dengan pengaduk magnetik selama 15 menit. Larutan tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 15 menit. Larutan yang jernih dipipet ke dalam tabung reaksi, masing-masing sebanyak 0,1,2,3,4,5, dan 6 ml, selanjutnya masing-masing diencerkan dengan air hingga volumenya 10 ml. Masing-masing tabung dibubuhi larutan iod 0,2 % (0,2 g I2 + 2,0 KI + 100 ml air) sebanyak 1,2 ml, kemudian dicari absorbansi maksimumnya dengan spektrofotometer UV Vis. Pada percobaan ini diperoleh

absorbansi maksimum pada panjang gelombang 550 nm. Selanjutnya dibuat kurva standar yang menyatakan hubungan antara konsentrasi dekstrin standar(absisa) terhadap absorbansi (ordinat). Pada penetapa dekstrin, mula-mula ditimbang 3 sampel yang telah dihomogenkan dan dimasukkan ke dalam gelas piala 100 ml. Kemudian ditambah 75 ml air, diaduk dengan magnetik stirer selama 15 menit. Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke dalam labu ukur 100 ml, sedangkan endapan dalam tabung sentrifugai ditambah 25 ml air, diaduk dengan spatula, dan disentrifugasi kembali. Supernatan dipipet dan dpindahkan ke dalam labu ukur yang sama seperti tersebut di atas hingga volumenya mencapai 100 ml. Setelah dicampur dengan baik, sebanyak 10 ml filtrat dibubuhi 0,2 ml larutan ion dan absorbansinya dibaca pada panjang gelombang 550 nm dengan spektrofotometer UV Vis. Selanjutnya persen dekstrin dalam sampel ditetapkan dengan memanfaatkan kurva standar dekstrin.

16