APUNTES DE ENZIMAS 2012

BIOQUMICA

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APUNTES DE ENZIMAS Y CINETICA ENZIMTICA 1. Introduccin Enzimas. La vida depende de la existencia de unos catalizadores muy potentes y altamente especficos denominados enzimas. De hecho, todos los pasos de todos los procesos metablicos estn catalizados por enzimas y la capacidad cataltica se considera, junto con la capacidad de autorreplicacin, una de las caractersticas fundamentales de la vida. Con la excepcin de un pequeo grupo de molculas de RNA cataltico (los ribozimas), todas las enzimas conocidas son protenas. El nombre de enzima ("en la levadura") no se emple hasta 1877, pero mucho antes ya se sospechaba que ciertos catalizadores biolgicos intervenan en muchos procesos. As en 1850, Louis Pasteur concluy que la fermentacin de azcar en alcohol por levaduras estaba catalizada por lo que llam fermentos, que l consideraba inseparable de las clulas de levadura vivas. En 1897, Bchner, consigui extraer las enzimas que catalizaban la fermentacin alcohlica de las clulas de levadura, terminando as con la teora vitalista. No obstante hubo que esperar hasta 1926, cuando Sumner consigui purificar y cristalizar por primera vez una enzima, la ureasa, para demostrar su naturaleza proteica. En la actualidad se conocen ms de 2000 enzimas diferentes, muchas de las cuales se han aislado en forma pura. Se utilizan potentes tcnicas de purificacin y secuenciacin, tcnicas de difraccin de rayos X, RMN, etc., para conocer su estructura, y tcnicas de mutagnesis dirigida para conocer ms sobre su funcionalidad y sus mecanismos de actuacin. 2. Las enzimas como catalizadores La funcin principal de las enzimas es actuar como catalizadores de las reacciones de los seres vivos; Las reacciones necesarias para la clula (digestin de alimentos, envo de seales, contracciones musculares) sencillamente no se daran en ausencia de catalizadores. La enzima a travs de su sitio activo proporciona el ambiente especfico para hacer energticamente ms favorables reacciones que en ausencia de catalizadora seran inviables. Aunque tiene ciertas peculiaridades (alta eficiencia, especificad, capacidad de regulacin,..) siguen los principios generales de la catlisis qumica. Todas las reacciones qumicas tienen lugar porque cierta fraccin de la poblacin de molculas reactantes poseen la suficiente energa como para alcanzar un estado activado, llamado estado de transicin, en el que es muy elevada la probabilidad de que se rompan o se establezcan enlaces para formar los productos. Este estado de transicin reside en la cima de la barrera energtica que separa los reactantes de los productos, como muestra la Figura 1. En ella se observa el diagrama de energa para una reaccin qumica, no catalizada y catalizada, donde la energa libre de activacin es la cantidad de energa necesaria para llevar todas las molculas de un mol de sustancia, a una temperatura determinada, al estado de transicin.

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Figura 1. Evolucin energtica de una reaccin qumica. Se observa la diferencia energtica entre los estados de transicin de las reacciones catalizada y no catalizada. Existen dos mtodos generales mediante los cuales puede acelerarse la velocidad de una reaccin qumica. Uno de ellos es la elevacin de la temperatura (ya que provoca un incremento en la velocidad de las molculas); el otro consiste en utilizar un catalizador. El catalizador se combina con los reactantes de modo transitorio activndolos, produciendo un estado de transicin de menor energa que en la reaccin no catalizada. Una vez formados los productos el catalizador queda libre, y puede ser de nuevo utilizado. La Tabla 1 muestra una comparacin de las energas de activacin para la descomposicin del perxido de hidrgeno, en ausencia o presencia de un catalizador. En ella se puede apreciar cmo el catalizador enzimtico baja an ms la barrera energtica que ha de superarse desde el nivel de reactivos para alcanzar el estado de transicin. Esta es una caracterstica comn de las enzimas. Su alto poder cataltico se debe en parte a su alta especificidad por los sustratos, la cul puede ser absoluta para un nico sustrato o relativa, cuando permite la reaccin de compuestos diferentes pero con una estructura similar.

Tabla1.Descomposicin enzimtica del agua oxigenada. Comparacin de las energas de activacin para la descomposicin del perxido de hidrgeno, en ausencia o presencia de un catalizador La especificidad de las enzimas es muy importante para los seres vivos. Cada clula contiene varios cientos de miles de compuestos diferentes, y existen muchas combinaciones posibles entre las reacciones qumicas que estos compuestos pueden experimentar. Las enzimas cuidan de que tengan lugar, de manera especfica, aquellas reacciones que son esenciales e indispensables para que la clula viva.

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Los catalizadores intervienen en la reaccin pero no en su balance pues no aparecen como productos iniciales ni finales de modo que no alteran el incremento de energa libre y por tanto la termodinmica de la reaccin.

La constante de velocidad aplicando la teora del estado de transicin como veremos puede expresarse como

siendo K la constante de Boltzmann y h la de Planck. Hay una relacin inversa entre la constante de velocidad y la energa de activacin. Adems de la especificidad y la alta eficiencia, otras dos caractersticas que diferencian a las enzimas de los catalizadores qumicos, son que las enzimas pueden saturarse por sustrato y tienen capacidad para regular su actividad. 3. Nomenclatura y clasificacin de las enzimas Muchas enzimas han sido designadas aadiendo el sufijo -asa al nombre del sustrato, es decir, la molcula sobre la cual ejerce su actividad cataltica. Por ejemplo la ureasa cataliza la hidrlisis de la urea, y la arginasa cataliza la hidrlisis de la arginina (a urea y ornitina). Otras enzimas han recibido su nombre en funcin del tipo de reaccin que catalizan; as la Gliceraldehdo-3Pdeshidrogenasa cataliza la oxidacin del la Gliceraldehdo-3P. Incluso algunas se conocen de hace mucho tiempo y mantienen su nombre, sin dar informacin alguna del sustrato o la reaccin que catalizan (tripsina). No obstante existe una clasificacin sistemtica de las enzimas que las divide en 6 grandes grupos, cada uno de los cuales se divide a su vez en subclases: 1: Oxido-reductasas (reacciones de oxido-reduccin) 2: Transferasas (transfieren grupos funcionales) 3: Hidrolasas (reacciones de hidrlisis), 4: Liasas (reacciones de adicin a los dobles enlaces) 5: Isomerasas (reacciones de isomerizacin) 6: Ligasas (formacin de enlaces con consumo de ATP).

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A cada enzima se le asigna un nmero con cuatro componentes. Los tres primeros indican la clase, subclase y sub-subclase, respectivamente, y el ltimo es un nmero de orden. As, por ejemplo, la enzima alcohol deshidrogenasa, que cataliza la oxidacin de etanol a acetaldehdo, y por lo tanto pertenece al grupo 1, se designa como EC 1.1.1.1. La Tabla 2 muestra la clasificacin internacional de las enzimas en los seis grupos antes citados.

Tabla 2. Clasificacin internacional de enzimas. 4. Cofactores enzimticos La actividad de algunas enzimas depende solamente de su estructura como protena, mientras que otras necesitan, adems, uno o ms componentes no proteicos, llamados cofactores. El cofactor puede ser un ion metlico o bien una molcula orgnica, llamada coenzima, aunque algunos enzimas necesitan de ambos. El cofactor puede estar fuertemente unido a la protena (suele ser el in metlico, aunque puede igualmente ser un coenzima) y recibe entonces el nombre de grupo prosttico, o dbilmente unido, por lo que en realidad acta como un sustrato especfico de la enzima (co-sustrato; suele ser una molcula orgnica, coenzima). La Tabla 3 muestra una relacin de iones metlicos que actan como cofactores de enzimas. La Tabla 4 muestra algunos de los coenzimas ms habituales en la catlisis enzimtica. Tabla 3.Iones metlicos como cofactores.

Tabla 4. Algunos coenzimas mayoritarios en catlisis enzimtica.

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El complejo enzima-cofactor catalticamente activo recibe el nombre de holoenzima. Cuando se separa el cofactor, la protena restante, que por s misma es inactiva catalticamente, se designa con el nombre de apoenzima. HOLOENZIMA = APOENZIMA + COFACTOR

En las enzimas el cofactor puede actuar como centro cataltico primario, grupo puente para reunir el sustrato y la enzima agente estabilizante de la actividad enzimtica (conformacin). Por su parte cada uno de los coenzimas catalogados suele contener en su estructura, alguna vitamina (sustancias orgnicas que, en cantidades mnimas, son vitales para el funcionamiento de todas las clulas, y deben figurar en la dieta de algunas especies) o molcula derivada de ella. Los coenzimas actan por lo general como transportadores intermedios de tomos especficos o de electrones. 5. Modelos de actuacin de las enzimas Las enzimas son catalizadores extraordinarios, consiguen enormes aumentos de la velocidad de la reaccin y son altamente selectivos. Como consiguen un descenso tan espectacular de las energas de activacin?. Para explicar la actividad cataltica de las enzimas, se ha propuesto un mecanismo general, en dos etapas:

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En la primera etapa, la enzima (E) se une a la molcula de sustrato (S), para formar el complejo enzima-sustrato (ES). En una segunda etapa, el complejo se fragmenta dando lugar al producto (P) y a la enzima (E), que vuelve a estar disponible para reaccionar con otra molcula de sustrato. Por lo general, la molcula de enzima es mucho mayor que la del sustrato por lo que slo una pequea parte de la enzima est implicada en la formacin del complejo; esta regin que interacciona con el sustrato y en la que tiene lugar la reaccin, se denomina sitio activo de la enzima. El sitio activo es una regin tridimensional de la enzima con una distribucin de los grupos nica para posibilitar la unin a su sustrato especfico. Dichos grupos del enzima no tienen por qu ser necesariamente consecutivos en la secuencia de la protena y reciben el nombre de centros catalticos. En la figura podemos ver los centros catalticos (Arg-145, Glu-270, tyr-248) y el cofactor (Zn) que conforman el sitio activo de la enzima carboxipeptidasa, implicada en la hidrlisis del extremo C terminal de las protenas.

Figura 2. Sitio activo de la carboxipeptidasa

El modelo ms conocido sobre el mecanismo de reaccin de las enzimas es el de Fischer, quien propuso que la molcula de sustrato se adapta al centro activo de la enzima del mismo modo que lo hara una llave al encajar en una cerradura, es decir, que tienen una relacin estructural complementaria (Figura 3). No obstante, esta hiptesis tiene ciertas limitaciones: si el centro activo posee una estructura prediseada para el sustrato, en caso de que sea reversible el proceso dicho debera estar perfectamente diseado para que tambin encaje el producto de la reaccin. De la misma forma, la teora de la llave-cerradura tampoco explica bien el fenmeno de la inhibicin enzimtica.

Figura 3. Modelos de accin enzimtica. A) Modelo llave-cerradura de Fischer. B) . Modelo de ajuste inducido de Koshland.

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Otra hiptesis ms aceptada actualmente es la del enzima flexible o de ajuste inducido (modelo de Koshland), que sugiere que el sitio activo no necesita ser una cavidad geomtricamente rgida y preexistente, sino que dicho sitio activo debe tener una disposicin espacial, precisa y especfica, de ciertos grupos de la enzima que en presencia del sustrato se adaptan a su estructura cuando interaccionan con l (Figura 3 B). Independientemente del modelo, una vez formado el complejo enzima sustrato, mediante un mecanismo de distorsin, se activan los enlaces que hay que romper y se aproximan los grupos que hay que enlazar, favoreciendo la formacin del producto resultante de la reaccin catalizada y quedando la enzima libre para comenzar de nuevo el proceso cataltico. La Figura 4 muestra el caso de una enzima (hexoquinasa) que nos sirve para ilustrar el modelo de Koshland, en ella se puede ver como en el sitio activo posee una conformacin inicial que se modifica al interaccionar con el sustrato y formal el complejo [ES].

Figura 4. Modelo de ajuste inducido de Koshland. Hexokinasa. 6. Enzimas no protecas: ribozimas y deoxiribozimas Hasta hace poco se supona que todas las reacciones de catlisis bioqumica se llevaba a cabo por protenas, pero en 1983 Altman y sus colaboradores descubrieron que la parte proteca de la ribonucleasa P por si sola no era activa, mientras que el supuesto cofactor de ARN de esta enzima si poda por si solo catalizar la reaccin. El complejo ARN-proteco ribonucleasa P fragmenta los precursores de los ARNt para producir ARNt funcionales. Se comprob que la parte ribonucleica del complejo (en presencia de Magnesio) no solo era capaz de fragmentar la molcula, sino que adems obedeca a la cintica de Michaelis-Menten. Despus de estos primeros ejemplos se han descrito un gran nmero de ARN con propiedades catalticas, como la actividad peptidil transferasa que cataliza la formacin del enlace peptdico durante la sntesis de pptidos en los ribosomas parece que recae en la parte no proteca de la subunidad 50S. Esto aunque en principio pareci sorprendene no lo es tanto. El hecho de que el ARN posea capacidad de autorreplicacin y catlisis confirma el papel primordial de estas molculas en la evolucin. La vida podra haberse basado en el ARN antes de la aparicin de las protenas y el ADN. Muy recientemente (1994). Se ha descrito una desoxirribozoma. Una molcula de ADN monocatenario con Histidina como cofactor, capaz de hidrolizar el ADN.

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Cintica enzimtica.
Los principios generales de la cintica de las reacciones qumicas son aplicables a las reacciones catalizadas por las enzimas, en los seres vivos. No obstante, stas muestran (adems del fenmeno de la especificidad, antes comentado) un rasgo caracterstico que no se observa en los catalizadores no enzimticos, se trata de la saturacin por el sustrato, entendida en trminos de ocupacin de los centros activos de todas las molculas de enzima. Estudiar el efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad de una enzima no es sencillo, si pensamos que lgicamente la concentracin del sustrato disminuye segn avanza la reaccin. Una simplificacin en los experimentos cinticos consiste en medir la velocidad inicial (Vo). Si el tiempo es suficientemente corto la disminucin de sustrato ser mnima y sta podr considerarse, por tanto, casi constante. La Figura 1 muestra el efecto de distintas concentraciones de sustrato sobre la velocidad inicial de la reaccin catalizada por un enzima.

Figura 1.Cintica enzimtica. Modelo de Michaelis-Menten. Este comportamiento es caracterstico de la mayora de las enzimas y fue estudiado por Michaelis y Menten en 1913. En la cintica enzimtica de la Figura 1 se distinguen tres fases: Para una concentracin baja de sustrato, la velocidad de la reaccin es directamente proporcional a la concentracin del sustrato (relacin lineal), la cintica es de primer orden. Para una concentracin alta de sustrato, la velocidad de la reaccin se hace prcticamente constante e independiente de la concentracin de sustrato, la cintica se considera de orden cero. Para concentraciones de sustrato intermedias la velocidad del proceso deja de ser lineal, y a esta zona se la denomina de cintica mixta. La velocidad de una reaccin catalizada (V) nos indica la cantidad de sustrato consumido, o producto formado, por unidad de tiempo. En el Sistema Internacional se designa por U (unidad

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de actividad enzimtica) y corresponde a los moles de sustrato consumidos en 1 min, o bien a los moles de producto formado en 1 min. U = mol S/min = mol P/min La curva que expresa la relacin entre la concentracin de sustrato y la velocidad inicial tiene la misma forma para la mayora de las enzimas; se trata de una hiprbola rectangular, cuya expresin algebraica viene dada por la ecuacin de Michaelis-Menten, donde muestra la relacin entre la velocidad inicial (Vo) y la concentracin de sustrato, S.

Los trminos Vmax (velocidad mxima) y Km (constante de Michaelis) son dos parmetros cinticos caractersticos de cada enzima, que pueden determinarse experimentalmente. La velocidad mxima (Vmax) se obtiene cuando la velocidad de reaccin se hace independiente de la concentracin de sustrato, cuando esto ocurre la velocidad alcanza un valor mximo. Este valor depende de la cantidad de enzima que tengamos. La constante de Michaelis (Km) nos indica la concentracin de sustrato a la cul la velocidad de reaccin es la mitad de la velocidad mxima. Este parmetro es independiente de la concentracin de enzima, y es caracterstico de cada enzima segn el sustrato utilizado (si tiene varios). La Km tambin indica la afinidad que posee la enzima por el sustrato, siendo sta mayor, cuanto menor es la Km. Cuanto menor sea la Km menor ser la cantidad de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad mxima, por lo que mayor ser la afinidad del enzima hacia ese sustrato. A partir de la ecuacin de Michaelis-Menten podemos explicar matemticamente las tres fases de la curva de la figura 1. As: A baja [S], es decir si Km >>> [S], el trmino Km+[S] podemos aproximarlo a la Km, quedando un expresin del tipo: V = k [S] Esta es una cintica de primer orden, que se caracteriza por una variacin lineal de la V respecto al tiempo, como tiene lugar en la primera fase. A altas [S], es decir, Km<<<<[S], despreciaramos Km frente a [S], con lo que V = Vmax (que sera constante); la cintica es de orden cero y se habra alcanzado la saturacin por sustrato, como ocurre en la fase final.

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El tramo intermedio, en el que la [S] Km correspondiente a una cintica de orden mixto y se ajusta a la ecuacin de Michaelis. En muchos casos es de vital importancia conocer estos parmetros cinticos. En principio, podran obtenerse de forma poco rigurosa a partir de la curva de Michaelis-Menten, para lo cual sera preciso primero obtener el valor de la Vmax y despus, teniendo en cuenta que la Km es la concentracin a la cual la velocidad es la mitad de la velocidad mxima, podramos obtener su valor. Pero existen mtodos grficos ms fiables que facilitan el clculo preciso de la Km y la Vmax. Los clculos se hacen en base a transformaciones matemticas de la ecuacin de Michaelis; una de las expresiones ms utilizadas es la representacin de Lineweaver-Burk (Figura 2). En esta forma de clculo se representa 1/V frente a 1/S, esto es la inversa de la velocidad frente a la inversa de la concentracin (de ah que tambin la representacin sea conocida como de dobles inversos), as se obtiene una recta cuya interseccin con el eje X es 1/Km y con el eje Y es 1/Vmax, siendo la pendiente Km/Vmax. De esta forma, y una vez hecha la representacin, podemos extrapolar el valor de X para Y=0, o el de Y, cuando X=0, y obtener haciendo el inverso de los valores (y teniendo en cuenta el signo) el valor de Km y Vmax.

Figura 2. Cintica enzimtica. Representacin de LineweaverBurk.

La obtencin de la Km y la Vmax de una enzima, es importante no slo porque son parmetros que la identifican, sino tambin por motivos que, en ocasiones, pueden ser de vital importancia. Por ejemplo, algunos tipos de leucemia (enfermedad en la que los glbulos blancos proliferan anormalmente) pueden evitarse por la administracin de una enzima, la Asparraginasa, que cataliza la reaccin de hidrlisis de la asparragina (Asn) a cido asprtico (Asp). Asparragina + H2O cido asprtico + NH+4

Este descubrimiento condujo a la conclusin de que la Asn presente en la sangre es un principio nutritivo para el crecimiento de los linfocitos malignos; el problema apareci cuando se utilizaron distintas fuentes de asparraginasa, descubrindose que no todas eran eficientes. Al final se encontr la razn. Estas enzimas, de diferentes fuentes (animal, vegetal o microbiana), tenan diferente Km respecto a la Asn. Como la [Asn] en la sangre es muy baja, slo aquellas enzimas con el valor de Km muy bajo (una mayor afinidad por el sustrato) seran capaces de provocar la 11

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hidrlisis de la Asn. As, se comprob al obtener los parmetros que la enzima que presentaba menor Km para la Asn era la de una bacteria (E. coli), y fue la que se utiliz para controlar la enfermedad. 2. Inhibicin enzimtica Existen sustancias que pueden impedir que la enzima desarrolle su actividad cataltica, ralentizando o paralizando la reaccin enzimtica. A estas sustancias se las denomina inhibidores enzimticos. Teniendo en cuenta que las reacciones qumicas en la clula estn catalizadas por enzimas, es fcil intuir el papel de muchos inhibidores enzimticos que actan como frmacos, antibiticos o conservantes; otros pueden ser txicos, potentes venenos. Por ejemplo, la aspirina (acetilsalicilato) es un analgsico que inhibe la enzima que cataliza el primer paso en la sntesis de prostaglandinas, implicadas en la produccin del dolor. Se conocen dos tipos principales de inhibicin: la reversible y a la irreversible. La primera implica una unin no covalente del inhibidor y, por lo tanto, siempre puede revertirse. En la inhibicin irreversible, el inhibidor se une al enzima de forma covalente y permanente. Inhibicin reversible: los distintos modelos de inhibicin reversible implican la unin no covalente del inhibidor con la enzima, pero difieren en los mecanismos por medio de los cuales reducen la actividad enzimtica y en la forma en que afectan a la cintica de la reaccin. Entre ellos estn la inhibicin competitiva (acompetitiva) y la no competitiva. El inhibidor competitivo, es una sustancia similar en estructura al sustrato, con quien compite por el sitio activo de la enzima.

Como consecuencia, aunque la velocidad mxima no se altera, para alcanzarla sera necesario poner ms cantidad de sustrato en el medio de reaccin, lo que se refleja, en la correspondiente curva de Michaelis, como un aparente aumento de la Km (la enzima en presencia del inhibidor perdera afinidad por el sustrato). La representacin de dobles inversos (Figura 3) permite observar claramente este tipo de inhibicin. As cuando se realizan distintos estudios a varias concentraciones de inhibidor, obtenemos, mediante la representacin de dobles inversos, distintas rectas que se cortan en el mismo punto (para X=0), indicando que la Vmax no se altera, pero la Km (y por lo tanto la afinidad) aparentemente s, pues existen varios puntos de corte para y=0, por lo tanto aparentemente varias Km, que adems van aumentando con la concentracin del Inhibidor. Figura 3. Inhibicin competitiva. Clculo de parmetros cinticos mediante la representacin de dobles inversos.

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La eficacia de un inhibidor competitivo depende de su concentracin respecto a la del sustrato. Si hay un exceso de inhibidor ste bloquear los centros activos de las molculas de enzima, resultando una inhibicin total. No obstante, el proceso es reversible si se procura exceso de sustrato, que desplazara totalmente al inhibidor. El inhibidor no competitivo puede combinarse tanto con la enzima libre como con el complejo enzima-sustrato, sin afectar al sitio activo de la enzima. Al no unirse el inhibidor al sitio activo, no se afecta la afinidad de la enzima por el sustrato y en este caso la Km no se altera y la Vmax disminuye, como puede observarse en la representacin de dobles inversos (Figura 4), el punto de corte de las rectas ahora esta sobre el eje X, (cuando y=0), mientras que hay distintos punto de corte con el eje Y, como se aprecia la Vmax disminuye con el inhibidor.

Figura 4. Inhibicin no competitiva. Clculo de parmetros cinticos mediante la representacin de dobles inversos.

El inhibidor acompetitivo reacciona con la enzima en un punto distinto al centro activo, pero slo en el caso de que sta est unida al sustrato formando el complejo ES; de esta forma impide que la enzima desarrolle su actividad cataltica.

Figura 5. Inhibicin acompetitiva. Clculo de parmetros cinticos mediante la representacin de dobles inversos.

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Tanto la Vmax como la Km se alteran en la misma proporcin, esto se manifiesta en la representacin de dobles inversos como rectas paralelas y por lo tanto con la misma pendiente (Figura 5). Se observa cmo se produce, una disminucin de la Vmax y curiosamente, tambin, una disminucin aparente de la Km. En la inhibicin irreversible, el inhibidor se une covalentemente a la enzima y la inactiva de manera irreversible. Casi todos los inhibidores irreversibles son sustancias txicas naturales o sintticas.

Se trata de sustancias que reaccionan con algn grupo funcional importante para la catlisis, bloquendolo e impidiendo que la enzima desarrolle su actividad. En muchos casos la interaccin se produce a travs del sitio activo, impidiendo de manera irreversible que el sustrato ocupe su lugar; tal es el caso del gas Sarn, que inhibe irreversiblemente la acetilcolinesterasa, enzimas implicadas en la transmisin del impulso nervioso, al competir con su sustarato, la acetilcolina (un neurotransmisor) y la inhalacin del gas causa parlisis rpida de las funciones vitales. En la inhibicin irreversible, cuando el inhibidor afecta al sitio activo se observara una situacin similar a la inhibicin competitiva, una disminucin de la Vmax y un aumento aparente de la Km, si bien el proceso sera completamente irreversible por sustrato, incapaz ste de desplazar al inhibidor del sitio activo. La inhibicin enzimtica por modificacin covalente constituye adems una importante forma de regulacin metablica, como veremos en prximos apartados. 3. Reacciones multisustrato En este captulo hemos estudiado reacciones catalizadas enzimticamente en las que interviene un solo sustrato que se transforma en porducto, se trata un mecanismo relativamente simple que podra ajustarse a reacciones catalizadas por algunas enzimas (isomerasas, hidrolasas, algunas liasas) pero es importante tener en cuenta que la gran mayora de las reacciones son multisustrato y suelen dar varios productos. Cuando una enzima une dos o ms sustratos y libera mltiples productos, el orden de los pasos para a ser una caracterstica importante del mecanismo de reaccin. Hay distintos mecanismos que explican este tipo de reacciones, veamos varios casos en los que se utilicen dos sustratos S1 y S2 y se obtengan dos productos P1 y P2. a) Unin ordenada de los sustratos: en este caso un sustrato debe unirse antes de que el segundo sustrato pueda unirse a la enzima. E + S1 [ES1] S2 [ES1S2] E + P1 + P2

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b) Unin aleatoria de los sustratos: en este caso cualquiera de los dos sustratos puede ser el primero en unirse a la enzima. c) Mecanismo ping-pong: en este caso primero se une un sustrato, se libera el primer producto, y a continuacin se une el segundo sustrato para as liberar el segundo producto.

4. Regulacin enzimtica Una caracterstica que diferencia las enzimas de los catalizadores qumicos convencionales es su capacidad para regular su propia actividad. Una enzima puede ser ms o menos activa gracias a la existencia de distintos niveles de regulacin: Nivel de sntesis: implica una regulacin gentica, en este caso se trata de protenas inducibles que se sintetizan cuando las requiere el organismo, este tipo de regulacin se estudiar en el Tema 11. Nivel de actividad: que las molculas de enzima existentes estn ms o menos activas. Puede llevarse a cabo por factores extrnsecos a la enzima. Dicha regulacin puede venir dada por una variacin en la concentracin celular del sustrato o de inhibidor, como se ha indicado en apartados anteriores, o bien, por cambios de temperatura o de pH, en este caso se debe a que las enzimas poseen un pH ptimo y una temperatura ptima de trabajo. pH ptimo

Efecto del pH Figura 6: Ejemplo del efecto del pH o la T sobre la actividad enzimtica La variacin del pH o la T afectan a la actividad enzimtica, en algunos casos, como los de la figura los efectos pueden ser bastante drsticos, mientras que en otros casos el rango de T o pH optimo puede ser mayor, sin que afecten a la actividad. No obstante, suele ocurrir que una vez superado el ptimo se produzca una desnaturalizacin irreversible de la enzima Tambin ocurre que la regulacin puede ser provocada por factores intrnsecos a la propia enzima; en este caso se habla de enzimas reguladoras, enzimas que por su 15

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propia naturaleza tienen mecanismos especiales de regulacin. Estn especializadas en regularse respondiendo de forma muy sensible a seales externas. En la clula las enzimas operan en grupo, en rutas constituidas por varios pasos enzimticos. En cada ruta hay al menos una enzima reguladora que determina la velocidad de toda la ruta. La modulacin de las enzimas reguladoras ocurre mediante diferentes mecanismos: Enzimas alostricas. Funcionan mediante la unin reversible no covalente de compuestos regulatorios llamados moduladores. El modulador puede ser una activador (modulacin positiva) que acelere el proceso, o un inhibidor (modulador negativo). Este modulador puede se el propio sustrato de la reaccin (alosterismo homotrpico) o una otra sustancia (alsoterismos heterotrpico). Normalmente se trata de enzimas multimricas, de tal forma que la entrada del primer sustrato facilita (acelera) la entra del siguiente, y normalmente ocurre que el sito activo y el regulatorio se encuentran en distintas subunidades. En esos casos la cintica que presenta la enzima es distinta a la clsica de Michaelis-Menten, apareciendo una sigmoide como muestra la siguiente figura:

Figura 7: Enzima alostrica Enzimas interconvertibles. Se trata de enzimas reguladoras en las que el proceso de control de la actividad se realiza gracias a una modificacin covalente reversible, en el que estn implicadas tambin otras enzimas que se encargan de hacer la modificacin, en base a la concentracin celular de determinados metabolitos. Un ejemplo, claro es el caso de la enzima piruvato deshidrogenasa, que se estudiar en profundidad en el Tema 14, y que su regulacin implica, entre otros factores, la fosforilacin /defosforilacin de la enzima. De tal forma que cuando la enzima es fofosforilada pierde su actividad y cuando se defosforila recupera su actividad.

Tambin son posibles, la regulacin enzimtica mediante protenas reguladoras que se unen a la enzima, o la regulacin por eliminacin proteoltica de pequeos segmentos peptdicos, aunque en este caso el proceso es irreversible.

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