UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE CINCIAS EXATAS DEPARTAMENTO DE QUMICA

Fundamentos e Aplicaes de CLAE

Profa. Rosane Nora Castro nora@ufrrj.br

Julho de 2006

SUMRIO

1. Introduo..........................................................................................4
2.

Parmetros Cromatogrficos..........................................................6

3. Instrumentao.................................................................................8
4.

Fase Mvel......................................................................................13

5. Colunas e Fases Estacionrias........................................................18

6.

Modos de Separao.......................................................................22

7. Anlise Qualitativa..........................................................................27 8. Anlise Quantitativa........................................................................27 9. Aplicaes.........................................................................................34

10. Referncias Bibliogrficas...........................................................38

O QUE VOC VAI APRENDER NESTE CURSO

Definies da tcnica. Como comeou e como se desenvolveu a CLAE. O que e para que serve a CLAE. Aplicaes da tcnica. Descrio dos diversos mdulos que compem um sistema CLAE. Teoria das separaes. Avaliao da eficincia das colunas e dos sistemas cromatogrficos. Como evitar os erros crticos que podem comprometer a integridade do sistema.

1. INTRODUO HISTRICO
A cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao, que est fundamentada na migrao diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes 3

interaes entre duas fases imiscveis, a fase mvel (lquida ou gs) e a fase estacionria (slido ou lquido). A grande variedade de combinaes entre fases mveis e estacionrias torna-a uma tcnica extremamente verstil e de grande aplicao. Incio se deu com o botnico russo Mikhail Twsett 1903-1906- na separao dos pigmentos coloridos de extratos de folhas. Este provavelmente o motivo pelo qual esta tcnica conhecida como cromatografia (chrom cor e graphie- escrita), podendo levar a errnea idia de que esse processo seja dependente da cor. ter de petrleo Mistura de pigmentos

CaCO3

Pigmentos

separados

A principal diferena entre a cromatografia em fase lquida clssica e a cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE/HPLC) a utilizao de bombas que permitam a eluio da fase mvel atravs da fase estacionria que contenham micropartculas (10, 5 e 3m). A utilizao destas fases estacionrias, associadas ao desenvolvimento da instrumentao, levou esta tcnica a uma melhor eficincia em termos de resoluo, quantificao e deteco em menor tempo de anlise. Hoje a CLAE uma ferramenta que gera $1 bilho de dlares para indstria farmacutica e de biotecnologia. CLAE tem sido usada na pesquisa e desenvolvimento, preparo e controle de qualidade de matrias-primas e produtos. Tornou-se uma tcnica chave na descoberta, caracterizao, quantificao e preparo de biomolculas. CLAE tem limitaes para certas amostras ou situaes, como listado abaixo; contudo, substituio por mtodos alternativos pode freqentemente contornar o problema e ter resultados satisfatrios.

Possveis limitaes para CLAE Custo Complexidade Sensibilidade (para algumas substncias) Anlise em srie algumas vezes difcil

Substncias no detectveis adsorvidas irreversivelmente

Dificuldade de detectar substncias co-eludas.

Vantagens da CLAE sobre Tcnicas Tradicionais

Velocidade (minutos x horas)

Resoluo Sensibilidade (fentogramas - nanogramas)

Reprodutibilidade (+ 1%)

Recuperao Preciso Automao

2. PARMETROS CROMATOGRFICOS
Tempo de reteno (tR) Tempo morto (to ou tm) Fator de reteno (k) Fator de separao () Eficincia da coluna (N) Resoluo (RS)

a) Tempo de reteno (tr) - o tempo que o pico do analito demora em atingir o detector aps a injeo da amostra. b) Tempo morto (t0 ou tm) - o tempo em que uma substncia no-retida demora para alcanar o detector.

c) Fator de reteno (k) - Medida adimensional e fundamental da reteno em cromatografia lquida. Determina a quantidade de amostra que pode ser introduzida na coluna

k = tr - t0 t0

d) Fator de separao ( ) - Medida quantitativa da separao, ou seja, mede a seletividade da separao entre dois picos adjacentes. a relao entre seus fatores de reteno, sendo calculado da seguinte frmula:

k2 k1

Pode ser alterado por variaes na fase mvel e/ou estacionria, temperatura, pH e fora inica. e) Eficincia da coluna ou Nmeros de Pratos Tericos (N) - Mede a eficincia das condies cromatogrficas, atravs dos tempos de reteno obtidos e do alargamento dos picos.

N =16

tr

2 6

wb
2

N = 5,54

tr w1/2

A utilizao da largura do pico a meia altura (w1/2) mais simples, por no exigir a extrapolao das linhas tangentes ao ponto de inflexo, sendo tambm mais exata. f) Resoluo (Rs) - Mede a qualidade da separao. Leva em conta as larguras dos picos, alm de seus respectivos tempos de reteno. A resoluo entre dois picos dependente do fator de separao ( ), do n de pratos tericos (N) e do fator de reteno (k):

Rs = 1,18

t2 - t1 w1 + w2

3. INSTRUMENTAO
A instrumentao necessria para CLAE emprega pequenas colunas e uma fase mvel que bombeada sob altas presses, resultando em separaes com alta resoluo, eficincia e sensibilidade.

Figura 1: Componentes de um cromatgrafo com fase lquida ( bombas, coluna, injetor, detector e sistema de registro de dados). Atualmente, existem sistemas totalmente computadorizados, e o equipamento pode ser divido em mdulos que podem ser controlados individualmente ou por computador. Os softwares disponveis so capazes de detectar problemas de funcionamento e tambm a necessidade de troca de algumas peas. O desenvolvimento de colunas com fases estacionrias com partculas de menor dimetro, as quais ofereciam maior resistncia passagem da fase mvel, tornou necessria a utilizao de sistemas de bombeamento mais eficientes. As bombas analticas atuais operam em presses de no mximo 500 bar (7000psi), em fluxos de 0,01 10 ml/minutos, e so feitas de ao inoxidvel, safira, cermica, quartzo ou titnio (pistes), rubi (assentos das check valves) e teflon (selos) e outros polmeros.

3.1 BOMBAS Existem dois tipos: bombas que produzem fluxo varivel a uma presso constante e as que produzem fluxo constante a uma presso varivel, sendo as ltimas as utilizadas em CLAE. Caractersticas:

Ser capaz de suportar altas presses; Ter grande intervalo de programao de fluxos; Ter reprodutibilidade de velocidade de fluxo; As partes que entram em contato com a amostra e/ou solvente devem ser inertes; Ser capaz de fazer eluio com gradiente; Ter rpida mudana de solvente; Ser fcil de desmontar e reparar. Pneumticas: O lquido deslocado mediante a presso exercida por um gs inerte alta presso.No so usadas em CLAE pq tem fluxo varivel e pulsao, mas so utilizadas para o empacotamento de colunas.

a) Bombas de presso constante

b) Bombas de fluxo constante Seringa: Funcionam como uma seringa, sendo o mbolo movido por um motor que possibilita o deslocamento do lquido a fluxo constante. As cmaras (seringas) possuem capacidade limitada de FM. Necessitam de recarga constante para chegar fluxo nominal. Recprocas: Representam 85% das bombas usadas em CLAE. Bombas de pisto ou diafragma. O funcionamento baseia-se em um ou mais pistes, movidos por motor eltrico, que empurra a fase mvel atravs do sistema (figura 2).

selos

pisto
Entrada da FM

Figura 2. Esquema de uma bomba recproca.

3.2. INJETORES o sistema que promove a introduo da amostra na coluna cromatogrfica, com grande preciso, exatido e eficincia. Atualmente, so utilizados injetores de vlvula de seis vias que acomoda a porta de injeo e a ala de amostragem (loop) onde se coloca a amostra lquida no sistema.

A ala de amostragem (loop) de tais vlvulas pode ser externa ou interna. As externas so tubulaes de volume preciso, as quais podem ser trocadas para que se permita a injeo de diferentes volumes de amostra.

Estas vlvulas possuem duas posies: LOAD a amostra injetada na ala de amostragem com uma seringa de ponta rombuda, sendo excesso descartado (entradas 1-2-5-6) e o INJECT abre a vlvula para que a fase mvel empurre amostra para a coluna (entradas 3-2-5-4) (Figura 3).

Figura 3: Posio de funcionamento do injetor vlvula

Figura 4: Injetor e Tipo Rheodyne 7125 - 6 vlvulas e 2 posies. Eficincia cromatogrfica obtida por retornar a vlvula na posio LOAD no fim da injeo (99% da amostra transferida) evitar disperso da banda causada por pequenas pores de amostras retidas na parede do tubo para dentro da coluna. So facilmente automatizveis, controlados por computadores. Esses injetores automatizados so denominados auto-injetores e apresentam sistema de suco, transferncia e lavagem da agulha automatizada. So capazes de injetar um grande nmero de amostras sem a presena do analista, alm de operaes como diluio,

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derivatizao ou adio de reagentes. A desvantagem no poder usar solventes volteis para diluio da amostra.

3.3. DETECTORES A funo do detector monitorar a presena de dos compostos vindo do eluente da coluna. A sada do detector um sinal eltrico que proporcional a alguma propriedade qumica ou fsica do soluto. Caractersticas: Alta seletividade, Alta sensibilidade, Estabilidade frente mudana de solvente e temperatura, Linearidade, Baixo limite de deteco, e No afetar a separao obtida na coluna. Os detectores para CLAE so classificados em duas categorias: os que detectam as propriedades tanto da FM como dos solutos (no seletivos) e os que apenas detectam propriedades inerentes do soluto (seletivos). Solues procuradas no desenvolvimento da deteco: - Medidas diferenciadas de propriedades gerais da FM e amostras. - Medida de uma propriedade da amostra no apresentada pela FM. - Deteco aps eliminao da FM. Detector ideal: Alta sensibilidade e baixo limite de deteco. Resposta rpida a todos os solutos. Baixo nvel sinal/rudo e baixo nvel de oscilao. Insensvel a mudanas na velocidade do fluxo. Resposta independente da FM. No destruio do soluto. Resposta linear com a quantidade de soluto. Segurana e convenincia para uso. Fcil de operar e manter. a) UV-Visvel: o detector mais utilizado. Princpio: absoro da luz ultravioleta ou visvel, por parte da amostra, quando nela passa radiao eletromagntica, seletivo para amostras que tem cromforos (ligaes mltiplas). Trs tipos: os fotmetros de comprimento de onda fixo tm aplicao restrita a molculas que absorvem no comprimento de onda em que eles trabalham; os espectrofotmetros - mais 11

versteis por terem comprimento de onda varivel ( = 190-600nm , atravs de lmpada de deutrio; e = 350-900 nm, lmpada de tungstnio); e os detectores por arranjo de fotodiodos (DAD)- fornecem espectros no UV-Vis do eluente da coluna em determinados intervalos de tempo. Permitem varredura da regio UV-Vis em uma nica corrida cromatogrfica, para medidas de pureza do pico e para anlise de amostras desconhecidas. b) Fluorescncia: Aplicao para substncias que tenham a propriedade de absorver a luz e, subseqentemente, emitem uma frao em um comprimento de onda maior (fluorescente) - emisso > excitao. Princpio: emisso de energia fluorescente por um soluto que foi excitado por radiao UV. Altamente seletivo, para molculas que fluorescem sistemas aromticos policclicos ou substncias com alto grau de conjugao. Altamente sensvel (10-12g) e seletivo quando comparado ao UV (absoro). Exemplos de aplicao: uso em anlise de amostras biolgicas, especialmente em anlise de traos, vitaminas ( E, B1 e B2), poluentes, alimentos (aflatoxinas), corantes e aminocidos derivatizados; reaes de derivatizao pr ou ps-coluna para tornar o analito fluorescente. c) ndice de Refrao: um detector no seletivo, sensvel a variaes de temperaturas, presso, fluxo e composio da fase mvel; segundo de maior uso em CLAE. Princpio: mede a diferena no ndice de refrao da fase mvel e do eluente vindo da coluna. considerado um detector universal, porm apresenta baixa sensibilidade (~10 -6g) e difcil de estabilizar, sendo inadequado para a eluio gradiente. Utilizado em anlises de amostras que no absorvem no UV e no fluorescem: polmeros, hidrocarbonetos saturados, aucares, etc. d) Eletroqumico: Altamente seletivo para solutos inicos, oxidveis ou redutveis, e apresentam alta sensibilidade e baixos limites de deteco. Princpio: baseia-se em interaes eletroqumicas teis deteco do analito por CLAE. Medem a condutncia do eluente (Detectores de Condutividade) ou a corrente associada oxidao ou reduo dos solutos (Amperomtrico).Os materiais de uso nos eletrodos so: pasta de carbono, carbono vitrificado, platina, ouro, mercrio e cdmio. Os eletrodos metlicos no so ideais para clulas de fluxo devido a oxidao na superfcie. Limitao ao uso porque requer que a FM seja eletricamente condutiva (adio de tampes salinos a fase mvel).Aplicaes: aminas (catecolaminas), fenis (poluentes), antioxidante (vitamina C em alimentos), carboidratos e glicoprotenas. e) Espectrometria de Massas: Interesse a partir de 1976. Detector universal, embora destrutivo, apresenta alta sensibilidade, fornece a massa molecular dos solutos e permite a elucidao estrutural destes. O uso de fase lquida vindo da coluna e um sistema de deteco 12

em fase gasosa operando em alto vcuo que so incompatveis, necessita de utilizao de uma interface. Vrias so as interfaces disponveis, bem como os mtodos de ionizao e os analisadores de massa. - Existem dois principais problemas: - enriquecimento da amostra remoo seletiva da FM. - CLAE permite separao de solutos com alto PM e/ou alta polaridade, tais substncias tendo presses de vapores negligenciveis no podem ser ionizadas pelas tcnicas tradicionais de EM. f) Ressonncia Magntica Nuclear: Combina o poder de separao por CLAE s

informaes estruturais obtidas por RMN. No um detector de uso rotineiro, devido dificuldade encontrada em sua hifenao CLAE. O desenvolvimento de interfaces adequadas tem sido investigado, de modo a contornar os problemas em relao ao tempo necessrio para a aquisio de dados e a supresso dos sinais do solvente. 4- FASE MVEL - A fase mvel armazena em reservatrios de vidro ou teflon.

Figura 5: Reservatrio para fase mvel em CLAE - Os solventes utilizados devem ser de alta pureza (grau espectroscpico). - A fase mvel pode ser constituda por uma ou mais solues aquosas de sais, ou um ou mais solvente orgnico. Pode-se tambm ter uma mistura entre um solvente orgnico com uma soluo de sal. - A fase mvel bombeada pelo sistema CLAE para que ocorra o arraste da amostra pelo sistema, interagindo com a amostra durante a separao. . - Deve-se verificar antes a miscibilidade entre os solventes, quando se trabalha com mais de um solvente de fase mvel. 13

a) Caractersticas dos solventes: pureza; viscosidade e polaridade. alto grau de pureza ou fcil purificao. dissolver a amostra sem decompor. no decompor ou dissolver a fase estacionria. ter baixa viscosidade. ser compatvel com o detector usado. ter polaridade adequada para permitir separao conveniente. A fora do solvente a soma de trs tipos de interao intermolecular: disperso, orientao e ligao de hidrognio. - Uma fase mvel mais forte resulta em um menor tempo de reteno. - Solventes polares so mais fortes para a fase normal. - Solventes no polares ou orgnicos so mais fortes para fase reversa. a) b) Preparo da Fase Mvel: - A fase mvel filtrada com filtros de 0.2 a 0.45 mm de porosidade - Degaseificao da fase mvel aumenta a reprodutibilidade e a estabilidade do detector. - Solues tampo so necessrias para manter o pH, para limitar a atividade biolgica ou controlar as interaes cido-base. c) Escolha da Fase mvel: diferentes solventes so usados para fase normal e fase reversa. - A fase mvel a ser escolhida deve em primeiro lugar separar a amostra, e mais: No alterar a coluna e suas caractersticas; Ser compatvel com o detector; Dissolver a amostra; Permitir a recuperao da amostra, se desejada; Ser de alta pureza; No ser txica; Ter baixa viscosidade

d) Propriedades de alguns solventes utilizados em CLAE Solvente Hexano Cicloexano Isooctano CCl4 Trietilamina Tolueno Benzeno Polaridade 0.06 0.04 0.1 1.6 1.8 2.4 3.0 IR(25C) 1.375 1.427 1.389 1.461 1.400 1.496 1.501 Limite (UV)* nm 200 205 210 265 235 285 280 Viscosidade 0.30 0.90 0.47 0.90 0.38 0.53 0.60 14

CHCl2 3.4 1.421 233 THF 4.2 1.407 215 AcOEt 4.3 1.370 255 IPA 4.3 1.377 205 CHCl3 4.3 1.443 245 EtOH 5.2 1.361 210 Acetona 5.4 1.359 330 AcCN 6.2 1.344 200 AcOH 6.2 1.370 251 MeOH 6.6 1.326 210 H2 O 9.0 1.330 190 * Comprimento de onda mnimo dos solventes mais usados em CLAE 4.1. Solventes para Fase Reversa:

0.41 0.40 0.43 1.9 0.51 1.20 0.30 0.34 1.10 0.54 0.81

Em fase reversa, a fase mvel tem polaridade maior que a fase estacionria. A gua o mais comum lquido polar, portanto o solvente mais utilizado para fase reversa. Para se mudar a reteno do soluto, necessrio utilizar um modificador orgnico. Os modificadores mais comuns so o metanol, a acetonitrila e o tetrahidrofurano (THF).

4.2. Solventes para Fase Normal: Em fase normal, a polaridade da fase mvel e menor que a da fase estacionria. Em fase normal, utilizam-se misturas de um solvente no polar e um ou mais solventes polares (modificadores). A composio isocrtica composta de hidrocarboneto, 10-50% de hidrocarboneto clorado e 1-5% de lcool. As fases mvel e estacionria ficam em competio pelo soluto.

4.3. Solventes para Cromatografia de ons: Utiliza um tampo aquoso num pH adequado carga da amostra. Para cidos, o pH deve ser maior que 5; Para bases, o pH deve ser menor que 5.

medida que a concentrao do tampo aumenta, a fora do solvente aumenta e a reteno diminui. Neste caso, para se mudar a reteno e a seletividade, adiciona-se um solvente orgnico, sendo o metanol o mais utilizado 15

4.4 . Separao Isocrtica x Gradiente - A eluio isocrtica normalmente preferida gradiente devido a uma srie de desvantagens atribudas ao uso de gradiente, tais como: 1. o equipamento para uso de gradiente mais complexo, 2. no pode ser usado com alguns detectores, 3. desenvolvimento e otimizao mais complexo, 4. o tempo de anlise prejudicado pelo tempo necessrio para o reequilbrio da coluna e normalmente tem problema de linha de base, 5. no possvel aplic-las a todos os tipos de FE, e a comibanao FM-FE deve ser cuidadosamente selecionada, e 6. a transferncia de mtodos complicada, pois as diferenas de equipamentos podem afetar a separao. Apesar dos problemas com a eluio gradiente, muitas separaes somente so possveis com o uso de gradiente. A programao isocrtica de fase mvel pode no resolver todas as separaes, pois algumas amostras so muito complexas e podem ter uma resoluo pobre de picos que saem rapidamente ou alargamento de bandas e encaudamento de picos tardios. Em eluio com gradiente, a fora da fase mvel aumenta com a mudana da composio do solvente em funo do tempo. A bomba deve ser capaz de combinar um solvente fraco com um forte sob o controle de um programa de gradiente Os solutos permanecem retidos no comeo da coluna at que a fase mvel se torne suficiente para fazer com que cada soluta comece a se mover.

4.4a. O desenvolvimento de uma separao com gradiente: Otimizao sistemtica pode ser feita como na separao isocrtica. Vale a pena seguir estes passos: 1. Selecione as condies iniciais. O primeiro gradiente deve usualmente ser amplo (5-100%), 2. Ajuste a faixa do gradiente para minimizar o tempo de anlise. Elimine os tempos vazios no incio e fim do gradiente. 16

3. Otimize a separao. Aumente N, aumentando o tamanho da coluna e/ou diminuindo o tamanho da partcula e o fluxo. 4. Avalie o melhor modo de reequilibrar a coluna. O volume morto s vezes calculado multiplicando-se o t0 pelo fluxo. Conhecer o volume morto da coluna importante para poder calcular quanto de FM deve ser usado para equilibrar a coluna. Em eluio gradiente a fora da FM aumenta durante a separao cromatogrfica, o que significa dizer que o k decresce enquanto o pico migra na coluna. A faixa de gradiente refere-se diferena entre os percentuais final e inicial do solvente forte. Gradientes exploratrios so usualmente feitos com amplas faixas de gradientes, 5 a 100% do solvente forte. A escolha da FE um item importante em eluio isocrtico. Recomenda-se que eluio no modo reverso seja preferida. Um gradiente em brando sempre deve ser feito para observar a compatibilidade dos solventes com a deteco escolhida e para observar a presena de artefatos e tambm de material retido no topo da coluna por uso de fases mveis mais fracas que as do gradiente escolhido. Snyder e Dolan desenvolveram uma metodologia para o uso de gradientes de ampla faixa para servir de guia no desenvolvimento de mtodos por CLAE. Para isso, algumas condies bsicas so recomendadas: O uso de colunas C8 ou C18 de 15 x 4,6mm, gradiente de 5 a 100% de acetonitrila com um tempo de gradiente de 60 minutos e fluxo de 2,0 ml/min. Deve ser observado se a amostra no muito hidroflica (muitos picos perto do t0) ou se muito hidrofbica, ou seja, se eluio em fase reversa no aconselhvel. 5. COLUNAS e FASES ESTACIONRIAS - Local onde ocorre a separao dos componentes da amostra. - Tubo de material inerte (ao, inox, vidro) - Dimetro interno uniforme, capaz de resistir a presso e paredes finamente polidas. - Comprimento - varia de 10 a 50 cm (exceto excluso que pode usar colunas maiores ou vrias colunas em srie). - Capacidade determinada pelo comprimento, d.i e recheio. 17

- Colunas retilneas para no perderem a eficincia. - Uso de pr-colunas (4 mm)- conservao da coluna Avanos: - uniformidade no tamanho das partculas. - obteno de micropartculas (3 ou 5 m) - melhor eficincia nos processos qumicos de preparao das fases quimicamente ligadas. - desenvolvimento de processos eficientes de enchimentos. a) Seleo da coluna A polaridade da fase estacionria deve ser similar polaridade da amostra para fase reversa, e diferente da amostra para fase normal. Os fabricantes de colunas fornecem indicaes teis para a escolha da fase estacionria adequada para uma aplicao especfica. A capacidade da coluna aumenta com o aumento do dimetro; contudo, colunas mais estreitas so mais eficientes e consomem menos fase mvel. Dimetros menores das partculas do empacotamento produzem eficincias mais altas.

b) Vida til de uma coluna Geralmente uma coluna C-8 ou C-18 durar mais que uma coluna de cadeia mais curta ou mais polar. Empacotamento polimrico estvel contra ataque qumico e, portanto, pode durar mais. Evitar o choque mecnico. . Guardar as tampas da coluna e recoloc-las sempre que a coluna no estiver sendo usada. Manter a coluna molhada (preenchida) com o solvente recomendado para estocagem.

Intervalo: 8,0 < pH < 2,5 c) Manuteno da Coluna 18

Uma pr-coluna deve ser colocada entre o injetor e a coluna analtica.

- Deve conter o mesmo material de empacotamento da coluna. - Retm componentes da amostra ou da fase mvel que de outra forma se acumulariam na cabea da coluna analtica. - Deve ser substituda quando contaminada, ou quando a presso aumentar muito. Cuidado com precipitao da fase mvel. Nunca deixar a fase mvel, que contm tampo ou reagentes inicos na coluna por mais de um dia sem uso. Amostras sujas podem gerar problemas. Filtrar sempre a amostra e o solvente.

d) Classificao quanto ao tipo de coluna e quantidade de amostra

CLAE Analtica

CLAE Preparativa

1mg

10mg

100mg

1g

Kg

Micropeparativa: 10 a 100mg Preparativa: 0,1 a 100g Macropreparativa: 0,1 Kg Escala analtica anlises quali- e quantitativas em pequenas escalas. Colunas de baixa capacidade e alta resoluo. Colunas com dimetro interno 2 -5 mm e comprimento de 10 -30 cm. Escala semipreparativa colunas comercializadas com o mesmo empacotamento das analticas (partculas de 5 a 10 m ) para manter eficincia, j que suportam carga at 20 vezes superior as da coluna analtica. Colunas com d.i. > 6 mm . Escala preparativa compromisso bsico relao balanceada entre resoluo, capacidade e tempo, sendo os dois ltimos sacrificados. Colunas com d.i. ~ 5 m e fluxo de at 0,5 L/min. Condies de sobrecarga ponto no qual o valor de k (fator capacidade) decresce de 10% e a quantidade de amostra a ser injetada depende basicamente do fator seletividade, fator separao ( ) na separao cromatogrfica.

Condies de sobrecarga deve ser determinado experimentalmente para cada separao cromatogrfica. 5.1. CROMATOGRAFIA ANALTICA

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 Separao de uma mistura em um suporte cromatogrfico de maneira a determinar a composio da soluo. Propsito caracterizao e determinao do nmero de componentes presentes, identificao e quantificao. Uso de pequenas quantidades de amostra, necessita de detector sensvel.

Objetivos de uma separao analtica alcanada pela otimizao: - empacotamento da coluna. - configurao da coluna (l, d.i, ) - condies de eluio. Fatores que afetam uma separao: - fatores qumicos seletividade () e capacidade (k) - fator fsico eficincia ou n0 de pratos tericos (N).

COMPONENTES DA COLUNA E A QUALIDADE DA CROMATOGRAFIA

Coluna

Material Empacotamento

Configurao

Natureza Partcula Superfcie

Tamanho Partcula

Comprimento

Dimetro

Material

FATORES QUMICOS

FATORES FSICOS N TEMPO DE VIDA EFICINCIA VELOCIDADE 20

,
RESOLUO

VELOCIDADES DE FLUXO NA COLUNA Coluna (d.i) 2mm 3mm 4mm 8mm 10mm 5.2. CUIDADOS E USO COM COLUNAS Reprodutibilidade e eficincia na CLAE se devem em grande parte a estabilidade e cuidados com a COLUNA. Prticas usuais de conservao, embora consumam tempo, garantem um maior tempo de uso das colunas. Colunas de slica costumam perder resoluo com o tempo. Preparo da amostra Fluxo (mL/min) 0,5 a 2 2 2a3 4 a 10 10 a 20

- amostra deve ser totalmente dissolvida. - compatibilidade da FM com a FE. - amostra deve ser dissolvida na FM (incompatibilidade entre amostra eluente causa alargamento da banda). - partculas insolveis devem ser filtradas. - evitar solvente que cause mudana qumica. - estocar amostra em condies ideais. - preparar amostra diariamente. Uso de pr-coluna

- recomendada para proteger coluna. - colocado aps sistema de injeo. - de mesma dimenses que a coluna, porm com partculas mais grosseiras. - atua como filtro de linha. - fazer troca com freqncia.

- no deve causar alargamento de banda.

6. MODOS DE SEPARAO A classificao da cromatografia em fase lquida de acordo com a fase estacionria levou a uma grande variedade de tipos. A primeira grande diviso foi a cromatografia de adsoro e cromatografia de partio, referindo-se s fases estacionrias slida e lquida, respectivamente. No caso das fases estacionrias serem lquidas, estas podem estar simplesmente adsorvidas sobre um suporte slido ou imobilizado sobre ele. O grande desenvolvimento 21

conseguido a partir das fases lquidas quimicamente ligadas fez com que estas sejam majoritariamente usadas em CLAE analtico. A separao de uma mistura por CLAE se d por uma ou mais interaes entre o soluto, a fase estacionria e a fase mvel, as quais podem ser ligaes de hidrognio, interaes eletrostticas e hidrofbicas ou foras de van der Waals, entre outras. A escolha do modo mais adequado separao de um soluto baseado em sua natureza, peso molecular, polaridade e carter inico. Os modos de separao podem ser classificados de acordo com a natureza destas interaes. So eles: cromatografia em fase normal, em fase reversa por troca inica e por excluso.

Cromatografia em fase normal - A slica gel a matria-prima mais importante das fases estacionrias da cromatografia lquida. um polmero composto por tomos tetradricos de silcio conectados entre si por tomos de oxignio (ligaes siloxano, Si-O-Si), tendo grupos silanis (Si-OH) de diferentes tipos (Figura 6).

Figura 6: Superfcie da slica com os grupos silanis - As caractersticas mais importantes que regulam a eficincia cromatogrfica da slica, so: tamanho mdio de partcula, formato da partcula, rea superficial especfica, tamanho do poro, pH, nmero de grupos silanis e a presena de ons metlicos.

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- Slicas com grande nmero de silanis livres so mais cidas que as slicas com grupos hidroxilados. - A slica gel utilizada como fase estacionria em cromatografia no modo normal, no sendo recomendado seu uso com fases mveis aquosas. A presena de pequenas quantidades de gua altera o comportamento cromatogrfico de tais colunas, causando sua desativao e afetando profundamente a reprodutibilidade das anlises. - Colunas de slica no podem ser usadas em pH 8, pois ela comea a se tornar solvel. - Na cromatografia no modo normal, a fase estacionria mais polar do que a fase mvel. Os solventes utilizados so normalmente, uma mistura de solventes orgnicos (hexano, diclorometano, acetato de etila, ter, etc) sem a adio de gua. - As fases estacionrias so adsorventes orgnicos (slica, alumina) ou fases polares quimicamente ligadas (ciano, diol, amino). - Embora molculas inicas ou ionizveis possam ser separadas por cromatografia em fase normal, a aplicao majoritria tem sido para molculas neutras. - As molculas hidrofbicas (menos polares) so eludas primeiro, enquanto as hidroflicas (mais polares) so mais retidas. - O solvente para eluio no modo normal selecionado escolhendo-se um solvente fraco e misturando-se com um solvente forte para conseguir a fora desejada. - O uso de slicas quimicamente modificado em eluio no modo normal tem sido preferido, uma vez que elas oferecem stios especficos de interao com o soluto, alm de oferecer uma superfcie mais homognea quando comparada com a slica gel, que tem uma variedade de grupos silanis de diferentes polaridades. - As fases quimicamente ligadas so as fases estacionrias mais utilizadas. A superfcie da slica pode ser modificada por reaes dos grupos silanis com um lcool, produzindo alcoxisilano; por halogenao dos grupos silanis e posterior reao com um nuclefio ; e por reao com organosilanos, levando a formao de ligaes siloxano.

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Figura 7: Fases quimicamente ligadas

- Na preparao de fase quimicamente ligada existem alguns grupos silanis que no reagem devido ao impedimento estrico. Assim, os grupos silanis restantes podem interagir com grupos bsicos e/ou polares, e resultar em formao de caldas nos picos. Esse problema pode ser minimizado fazendo a desativao desses grupos usando reagentes de silanizao pequenos, como o trimetilclorosilano. Este processo chamado capeamento (end capping). Cromatografia em fase reversa - A fase mvel mais polar que a fase estacionria. A cromatografia em fase reversa a mais usada na CLAE, uma vez que permite a separao de uma grande variedade de solutos e o uso de fases mveis aquosas.

- A fase mvel mais comumente utilizada a mistura de acetonitrila/gua, ou metanol,

tetraidrofurano/ gua. - O princpio da reteno em fase reversa a hidrofbica. A separao se deve principalmente a interao entre a parte no-polar do soluto e a fase estacionria, isto , repulso desta parte do soluto pela fase mvel aquosa. - As fases estacionrias apolares quimicamente ligadas mais utilizada em CLAE so as octadecilsilano (C18) e as fases de octilsilano (C8). Fases quimicamente ligadas podem atuar pelos dois modos de separao: Fase Normal : Ciano, amino, diol Fase Reversa: C18, C8, C4, fenil Resumindo: 24

ASPECTO Polaridade do recheio Polaridade da fase mvel Ordem de eluio Efeito de aumento da polaridade da FM

FASE NORMAL ALTA BAIXA Menos polar primeiro Diminui K - reteno (fator capacidade)

FASE REVERSA BAIXA ALTA Mais polar primeiro Aumenta K

Cromatografia de Troca Inica - Mtodo de escolha para anlise de ons inorgnicos e, s vezes, tambm o preferido para anlise de pequenos ons orgnicos. - A reteno em troca inica se d por atrao eletrosttica entre os ons na fase mvel e os ons de carga oposta na fase estacionria. - As fases estacionrias so referidas como resinas trocadoras de ons e so classificadas como aninicas ou catinicas ( fortes ou fracas). As aninicas fortes tm usualmente um on amnio quaternrio imobilizado, enquanto a catinica forte tem um cido sulfnico, sendo ionizados na faixa completa de pH. - As resinas catinicas so feitas de materiais peliculares e atualmente so de slica ou de polmeros porosos. - A reteno em troca inica determinada pelo pH da fase mvel. Fora inica, temperatura e a natureza dos ons de tampo so tambm um fator importante. a) Para troca catinica: X+ + R- K+ b) Para troca aninica: X- + R+Cl - CATINICA Fraca ---COO-Na+ (cido carboxlico) Forte ---- SO3-Na+ (cido sulfnico) X+ R- + K+ X-R+ + ClANINICA ---HN+(R)2Cl(Amina 1a / 2a / 3a) -----N+(R)3Cl(Amina 4a)

25

Cromatografia de Excluso - A resoluo cromatogrfica determinada pela reteno em decorrncia do tamanho efetivo das molculas da amostra em soluo. - A separao por excluso requer que o tamanho das molculas que o tamanho da fase estacionria seja adequadamente selecionado de acordo com o tamanho das molculas que se pretende separar. As molculas pequenas devem penetrar nos poros, enquanto as molculas grandes devem ser excludas de todos os poros da fase estacionria. - A escolha do solvente em cromatografia de excluso requer somente que o soluto seja solvel no mesmo e que este tenha baixa viscosidade, alm da compatibilidade com o soluto e a fase estacionria. - As fases estacionrias que podem ser usadas em cromatografia de excluso so slica gel, slica derivatizada ou polmeros rgidos. Rigidez da fase estacionria: 1. materiais fracos (gis de polidextrano Sephadex), poliamidas (BIO-Gel P) e poliagaroses (Sepharose e BIO-Gel A). 2. materiais semi-rgidos presses na ordem de 100 a 150 bar; materiais em microesferas de copolmeros podem usar solues aquosas e no aquosas. 3. materiais rgidos resistem qual quer presso e so constitudos de partculas de slica porosa ou vidro poroso. Devido rigidez pode-se obter separaes rpidas com fluxo alto de fase mvel. 7. ANLISE QUALITATIVA CLAE, GPC E IC so tcnicas de separao e NO identificao! Atravs de CLAE realiza-se uma anlise qualitativa pelos seguintes mtodos: 1. Comparao de tempos ou volumes de reteno da amostra com o tempo ou volume de reteno do pico de um padro. As condies da anlise tm que ser mantidas iguais. Isso NO confirma a identidade de uma substncia. 2. Envenenamento da amostra: adio amostra, de um padro da substncia suspeita e observao do aumento na altura/rea do pico em questo. No uma tcnica de identificao! 3. Um detector tipo arranjo de fotodiodo, junto com tempo de reteno, ajuda na identificao de substncias j conhecidas ou suspeitas de estarem presentes na amostra. 3. Para uma identificao com > 95% certeza s vale a coleta do pico j separado e sua anlise subseqente por IR, UV, RMN, Massa, etc. 26

4. Para um pico especfico, ajuda comparar a relao de respostas que ele mostra em dois detectores diferentes ou a dois comprimentos de onda diferentes, que s confirma a pureza de um pico. Junto com isto pode-se separar a substncia em dos solventes qumicos diferentes (tipo de coluna e fase mvel em termos de ).

8. ANLISE QUANTITATIVA 8.1. VALIDAO DE MTODOS ANALTICOS um processo que fornece uma evidncia documentada de que mtodo confivel ao que se aplica. Consiste em uma srie de procedimentos que visam assegurar credibilidade s medidas obtidas. A validao de um mtodo uma etapa muito importante e necessria para que o mtodo desenvolvido possa ser utilizado. O esquema 1 mostra as etapas envolvidas no processo de desenvolvimento, validao e utilizao de um mtodo analtico. O desenvolvimento de um mtodo analtico envolve o estabelecimento do procedimento de extrao e das condies cromatogrficos e a realizao de alguns estudos preliminares quanto seletividade, sensibilidade e linearidade. Seleo do mtodo (literatura, novo) Desenvolvimento do mtodo escolhido VALIDAO DO MTODO Seletividade Calibrao e linearidade Preciso

Exatido Recuperao Sensibilidade e limite de deteco

Robustez UTILIZAO DO MTODO 27

Esquema 1. Desenvolvimento, validao e utilizao de um mtodo analtico Antes de iniciar a validao de um mtodo deve-se ter resposta para as seguintes questes: Quais parmetros de validao devem ser avaliados? Quais procedimentos sero utilizados para avaliar estes parmetros? Quais os critrios de aceitao de cada parmetro? - Quantificao comparvel a CG. - Envolve processo todo de anlise da reunio da amostra at a interpretao do resultado final. - A concentrao do componente desejado na amostra importante. - Anlise de mltiplos componentes mais difcil para desenvolver do que para um nico componente. - Para determinaes em nveis baixo, rudo e oscilao causada por contaminao de solvente, flutuaes na temperatura ou variaes no fluxo podem causar diminuio da preciso. - A pureza dos padres mais importante na CL do que na CG desde que a resposta do detector para as amostras pode variar drasticamente, particularmente com UV. -Termos importantes: Exatido, Preciso, Linearidade, Seletividade, Recuperao, Sensibilidade, Robustez.

Exatido a relao entre o valor encontrado pelo mtodo e o valor aceito como verdadeiro ou de referncia, sendo calculada pela seguinte frmula: Concentrao obtida Exatido = ______________________ x 100% Concentrao terica A exatido pode ser determinada de vrias formas: Anlise de uma amostra certificada e sua comparao com o valor medido. Comparao com resultados obtidos por intermdio da utilizao de um mtodo j existente e de exatido conhecida. Baseando-se na preparao de uma soluo de concentrao conhecida, por intermdio da adio de uma determinada quantidade de amostra matriz. Preciso a habilidade do mtodo de reproduzir o mesmo resultado, embora no necessariamente o correto, sempre que o procedimento executado. A avaliao da preciso subdividida em trs etapas:

28

a) Reprodutibilidade confundido com preciso. Medida da habilidade de um mtodo para dar o mesmo resultado quando diferentes operadores em diferentes lugares usando diferentes equipamentos realizam a anlise. Este valor que importante no desenvolvimento de padres de mtodos de anlise. b) Repetibilidade - mede o grau de variao de uma srie de replicatas de injeo em um curto intervalo de tempo, ou seja, em uma mesma seqncia, nas condies originais do mtodo. A preciso de um mtodo por intermdio do desvio-padro e/ou do coeficiente de variao das medidas obtidas. Seletividade a habilidade de um mtodo de separar, da substncia de interesse, componentes da amostra que sero visveis no detector. Assegura que o sinal medido no influenciado por substncias interferentes. A seletividade determinada analisando-se diversas amostras da matriz ( n 6), para que se investigue a possvel presena de substncias que interfiram ou se sobreponham ao sinal da substncia de interesse. Linearidade a capacidade de um mtodo analtico gerar resultados proporcionais concentrao da substncia em questo, dentro de uma faixa analtica especificada, sendo possvel relacionar a resposta do detector concentrao. avaliada por intermdio de medidas da amostra em diversas concentraes, ou seja, da construo de curvas de calibrao. Sua determinao normalmente realizada por intermdio da anlise de amostras extradas da matriz apropriada em, no mnimo, cinco concentraes diferentes. Recomenda-se a anlise das amostras em replicata (n> 2). Recuperao avalia a eficincia do mtodo de tratamento da amostra. Sua porcentagem calculada pela seguinte frmula: Valor obtido Recuperao (%) = _______________ x 100% Valor adicionado A porcentagem de recuperao determinada por intermdio da comparao de anlises em quintuplicata de trs concentraes, de amostra extradas com solues-padro no extradas, as quais representam 100% de recuperao. Sensibilidade a habilidade de um mtodo distinguir, com determinado nvel de confiana, duas concentraes prximas. A avaliao da sensibilidade compreende a determinao dos limites de quantificao e deteco. Limite de quantificao definido como a menor concentrao da substncia que pode ser medida com uma preciso especificada, dentro do critrio de aceitao do mtodo. Limite de deteco definido como a menor concentrao da substncia que produz uma resposta maior do que trs vezes o rudo. Robustez a habilidade do mtodo em fornecer resultados inalterados quando sujeito a pequenas mudanas com diferentes analistas, variaes no pH e/ou concentrao da fase mvel, alteraes na performance da coluna, temperatura do ambiente, etc.

29

Do ponto de vista operacional o processo de quantificao pode ser dividido em 5 partes, onde cada etapa diretamente dependente da outra: a) Amostragem Separao cromatogrfica Medida fsica (medida de rea) Converso do sinal em composio (clculo) Anlise estatstica. Amostragem e preparo da amostra trs categorias para fontes de erro: tomada

de amostra representativa; estocagem e pr-tratamento. b) Separao cromatogrfica processo separao pode conduzir inmeros erros. Decomposio e degradao. Sobreposio de picos e caldas. Gradiente de eluio tambm causam picos espordicos devido desoro de picos. Tcnica de injeo crtica (grande volume morto no injetor deve causar calda e sobreposio pico). c) Medida fsica deteco e amplificao etapas importantes na quantificao. Importantes especificaes dos detectores: sensibilidade , linearidade e especificidade. Tcnicas: altura pico; altura x largura meia-altura; triangulao; planimetria (rea traada pelo planmetro); corte e pesagem; integrador disco; integrador digital e computadores. d) Converso do sinal em composio a calibrao pode ser feito utilizando-se quatro mtodos principais: 1. Normalizao rea (com ou sem fator de resposta) - presume que todos componentes da amostra foram eludos e foram detectadas.

%X = Ax
Na

x 100

2. Padro Externo o mtodo mais utilizado, sendo apropriado para amostras que
no necessitem de um pr-tratamento.Consiste na construo de uma curva de calibrao, a partir de solues-padro com concentraes conhecidas. Deve-se utilizar padres com concentraes similares s esperadas nas amostras, sendo as anlises feitas na matriz, de modo a assegurar a exatido das medidas. Comparao direta da rea ou altura do pico da amostra desconhecida com injeo direta de amostra padro. Requer perfeito controle de injeo injetar sempre mesmo volume. O fator resposta (FR) a mdia dos valores obtidos e o coeficiente angular da reta.

30

Figura 8: Curva de calibrao com o padronizao externa. Exemplo: Determinao de glicose em bebida. O contedo esperado na faixa de 5g.l-1 Uma soluo padro de 6g.l-1 preparada. Ela d uma rea de pico de 5400. A amostra d uma rea de pico de 3600. Fator de calibrao: FC = 6 = 1,11 x 10-3 5400 Contedo = rea do pico x FC = 3600 x 1,11 x 10-3 = 4g.l-1 3. Padro Interno envolve a adio de um padro a cada amostra a ser analisada. o mtodo de escolha para amostras que requerem muita manipulao. Requerimentos: - completamente resolvido; deve estar ausente da amostra; deve ser semelhante em concentrao e resposta; deve ser quimicamente inerte e deve ser purssimo e disponvel. Para ambos amostra e soluo padro um outro componente que no est presente na a mostra, adicionado em igual proporo. Exemplo: Aqui isto foi feito com 10g.l-1 de frutose, com reas de pico = glicose na amostra 3600; glicose no padro 5400, frutose em ambas solues 6300. Agora uma razo da quantidade obtida por comparao com a razo do sinal: FC = RAZO DA QUANTIDADE PADRO = 6 X 6300 = 0,6 razo do sinal do padro 10 x 5400 0,86 = 0,7

RAZO DA QUANTIDADE DE AMOSTRA = RAZO DO SINAL X FC = 3600 X 0,7= 0,4

6300 CONTEDO = QUANTIDADE PADRO INTERNO X RAZO QUANTIDADE DE AMOSTRA Contedo = 10 x 0,4 = 4g. l-1 4. Adio de padro o mtodo utilizado nos casos em que no possvel a obteno da matriz sem a presena do composto de interesse. Consiste na adio de diferentes concentraes do analito matriz, que j contm uma quantidade desconhecida do mesmo. Aqui isto foi feito pela adio de 5g. l-1 de glicose. As reas do pico so 3600 para amostra sozinha e 8100 para amostra fortificada. CONTEDO = ADIO X SINAL AMOSTRA S = 5 X 3600 sinal da diferena 8100 - 3600 = 4 g.L-1

e) Anlise Estatstica interpretao dos dados. Erros: Determinados sistmicos, cujas causas podem ser determinadas (diferentes respostas entre componentes, detector no-linear; erros de clculos ou calibrao; sobreposio picos, etc) Indeterminados inerentes ao mtodo, variveis no controlveis (flutuaes temperatura; medidas de volumes, etc.). Podem ser reduzidos, mas nunca eliminados. O mtodo de padro externo o mais simples e somente pode ser usado para problemas analticos simples. A injeo deve ser realizada com boa reprodutibilidade; assim recomendado que o mtodo de loop completamente preenchido seja usado. Como resultado, o loop deve ser preenchido com 5x o volume da amostra (ex: 100l de amostra para o loop de 20l). 31

 Gradiente de eluio pode ser fonte de erros, assim o mtodo isocrtico deve ser usado quando possvel. necessrio manter o fluxo (para determinao da rea do pico) ou composio da fase mvel (para determinao altura pico) constantes. Amostra deve ser dissolvida na FM. Se o solvente da amostra e FM. no so idnticos, ento a anlise pode ser menos exata; tambm possvel que a resposta do detector seja dependente do solvente da amostra. Anlise quantitativa estritamente dependente das condies da coluna, no podendo dar sobrecarga e detector operar na faixa linear.Experimentos devem ser feitos para checar esses pontos. Exatido deve ser aumentada por condicionar a coluna. Picos assimtricos devem ser evitados. A rea de um pico proporcional a quantidade de um composto injetado. Um grfico de calibrao pode ser derivado de reas de picos obtidos para vrias solues de concentrao precisamente conhecidas e uma comparao pico-rea pode ser feita para determinar a concentrao de uma amostra desconhecida.

9.

APLICAES

32

A) Alimentos

Adoante

Coluna: Inertisil NH2 (250x 4.6mm x 5mm) Fluxo: 1 mL/min Isocrtico: 1%H3PO4:Metanol (60:40) Detector: UV 210 nm Volume de amostra: 1mL
Amostra:

1- Aspartame (0,125 mg/mL) 2- Esteviosdeo (0,125mg/mL) 3- c. Glicirzico (0,125 mg/mL) 4- o-sulfobenzimida (0,125 mg/mL)

B) Anlise de Acar Coluna: Inertisil NH2 (250x 4.6mm x 5mm) Fluxo: 1 mL/min Isocrtica: Acetonitrila:gua (75:25) Temperatura: 40C Detector: IR Volume de amostra: 3L Amostra: 1- frutose 2-glicose 3- sacarose 4- maltose

1 2

C) Contedo de bebidas energticas

Coluna:Chromolith: RP-18e, 50-4.6mm Fase A: Acetonitrile Mvel: B: 0,01M Tampo fosfato pH 5,0 Gradiente Time/min %A %B 0,0 3 97 2,5 3 97 2,6 8 92 5 8 92 Fluxo: 4 mL/min Detector: UV 227 nm Temperatura ambiente Volume injeo:10 L Amostra: 1) Acesulfame - K 23 g/mL 2) Sacarina 29 g/mL 3) cido Benzoico 13 g/mL 4) cido Srbico 14 g/mL 5) Cafena 47 g/mL 6) Aspartame 100 g/mL

33

2,3

4, min 6

C) Anlise de Tocoferol - Margarina

Estruturas:
O O O S N K O Acesulfame_ K O Sacarina O NH S O cido benzico COOH NH H2N COOH Aspartame Coluna: Chromolith Performance RP-18e, 1004.6mm O O OH

H3C

O O OH cido Srbico H3C O N N CH3 Cafena

CH3 N N

5 6

Fase A: Acetonitrile Mvel: B: 20 mM Phosphate buffer pH 4,5 Gradiente Time/min %A %B 0,0 20 80 3,0 60 40 Fluxo: 4 mL/min Detector: UV 230 nm Temp. 22 C Inj.Volume:10 L Amostra:1. cido Ascorbio 100 g/mL 2. cido 4-hidroxibenzoico 100 g/mL 7 3. cido Benzoico 100 g/mL 4. cido Sorbico 150 g/mL 5. 4-hidroxibenzoate metila 100 g/mL 6. 4-hidroxibenzoate etila 150 g/mL 7. 4-hidroxibenzoate propila 100 g/mL

2 D) Anlise de conservantes 1

34 0, 1, 3,

OH O HO OH HO cido ascrbico O OCH3 HO 4-hidroxibenzoato de metila HO HO O

O OH

O OH cido srbico

cido benzico

O OCH2CH3 HO 4-hidroxibenzoato de etila

O OCH2CH2CH3

4-hidroxibenzoato de propila

4 3 2
Coluna:Chromolith Performance RP-18e, 100-4,6mm

Fase mvel: Metanol / gua ( 95/5 v/v) Fluxo: 4 mL/min Detector: UV 280 nm Temperatura: T.A. E) Anlise de tocoferol - margarina 1 Inj.Volume: 5 L Amostra: 1. Tocopherol 0,38 mg/mL 2. Tocopherol 0,30 mg/mL 3. Tocopherol 0,19 mg/mL 4. - Tocopherol Acetato 0,25 mg/mL

35 0 2,5 5,0 min

CH3 O HO

CH3

CH3 CH3 HO O

CH3

CH3

(CH2CH2CH2CH)3 CH3 _ Tocoferol CH3

(CH2CH2CH2CH)3 CH3 _ ocoferol

CH3 H3C HO CH3 O

CH3

CH3 CH3 H3C H3C2OC O

CH3

CH3

(CH2CH2CH2CH)3 CH3 CH3

(CH2CH2CH2CH)3 CH3

_ Tocoferol

Acetato de _Tocoferol

10. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS JONHSON, E.L. e STEVENSON, R. Basic Liquid Chromatography, 2a ed. Varian, Palo Alto, 1978. SNYDER, L.R. e KIRKLAND, J.J. Introduction to Modern Liquid Chromatography , 2a Ed.; Wiley & Sons, NY, 1979. MEYER, Veronika R.; Practical High-Performance Liquid Chromatography, 2aEd., Jonh Wiley & Sons, NY, 1996 HAMILTON, R. J. e SWELL, P.A. Introduction to High Performance Liquid Chromatography, Chapmam e Hall, 1982. 36

37