BAB II TINJAUAN PUSTAKA Untuk mencirikan dan mengidentifikasikan suatu spesies mikroorganisme tertentu, pertama-tama spesies tersebut harus

dapat dipisahkan dari

mikroorganisme lain, lalu ditumbuhkan menjadi biakan murni. Biakan murni adalah biakan yang selselnya berasal dari pembelahan tunggal. Sesungguhnya ada beberapa metode untuk memperoleh biakan murni dari suatu biakan campuran. Dua di antaranya yang paling sering digunakan ialah teknik cawan gores dan cawan tuang. Kedua metode ini didasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan organisme sehingga individu spesies dapat dipisahkan dari yang lain, dengan anggapan bahwa setiap koloni terpisah yang tampak pada cawan petri setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal (Hadioetomo, 1985). Mikroorganisme dibiakkan di laboratorium pada bahan nutrient yang disebut medium. Banyak sekali medium yang tersedia macamnya yang dipakai tergantung pada banyak faktor, salah satu diantaranya ialah macam

mikroorganisme yang akan ditumbuhkan. Untuk menumbuhkan bakteri biasanya dipakai nutrient agar. Sedangkan untuk menumbuhkan jamur medium yang dipakai biasanya PDA dan agar (Suriawirya, 2005). Sifat-sifat yang diperlukan pada koloni yang tumbuh dipermukaan medium adalah : a. Besar kecilnya koloni, sebagian koloni hanya serupa suatu titik, adapula yang melebar sampai menutup permukaan medium. b. Bentuk, ada sebagian koloni yang bulat ada yang memanjang ada yang tepinya rata, ada yang tidak rata. c. Kepekatan, ada koloni yang lunak seperti lendir, ada juga yang lunak seperti misalnya ialah mentega, ada juga yang keras dan kering. d. Warna, kebanyakan koloni-koloni bakteri tertentu itu berwarna keputihan atau kekuning-kuningan, akan tetapi ada juga koloni yang berwarna kemerahmerahan, jingga, biru, hijau, ungu, dan coklat (Dwidjoseputro, 1990).

Mikroba di alam mengambil peranan sangat penting dan terdapat dalam berbagai kondisi klimat, baik dingin, panas, basah, kering, ada udara, tidak ada udara, asin, tawar, asam, basa, bertekanan atau tidak ada tekanan, simbiosis dengan host atau parasit dengan host, dan lain sebagainya. Teknik isolasi yang tepat perlu dilakukan di lapangan dan dilaboratorium. Teknik yang tepat dan benar akan menjamin jenisjenis yang tepat dan kemudahan dalam memprediksi dan mengidentifikasi (Waluyo, 2008). Untuk menumbuhkan suatu biakan bakteri dalam media steril sejumlah sel-sel (inokulum) dipindahkan (diinokulasi) ke dalam media dengan perlakuan khusus untuk mempertahankan kemurnian dan biakan (Sutedjo, 1991). Setelah dipindahkan, biakan bakteri disimpan atau diinkubasi dalam suatu lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan mikroba tersebut. Pertumbuhan disini berarti pengembangan populasi sel-sel dari satu atau beberapa sel. Kumpulan dari sel-sel akan tampak dengan mata telanjang seperti sebagai suatu kekeruhan dalam media cair, atau sebagai populasi yang terpisah yang disebut koloni pada media padat. Bentuk pertumbuhan merupakan salah satu cara untuk membedakan spesies-spesies mikroba (Sutedjo, 1991). Seperti semua bentuk kehidupan lain, mikroba membutuhkan zat-zat hara dan lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan. Pertama-tama media harus mengandung senyawa-senyawa hara untuk pertumbuhan mikroba tersebut. Disamping media harus juga memberikan lingkungan yang cocok bagi pertumbuhan seperti pH, tekanan, osmotik, oksigen dan lain-lain. Pada umumnya semua media untuk pertumbuhan mikroba terdapat dalam dua bentuk yaitu media cair (broth media) dan media padat (solid media) (Sutedjo, 1991). Pada umumnya cara mengasingkan mikroba dari jenis anaerob dan aerob dapat dikatakan sama. Perbandingan yang utama, hanya terletak pada cara mendapatkan suasana lingkungan pertumbuhan yang diinginkan oleh masingmasing mikroba tersebut dan jenis pembenihan yang dibutuhkan untuk kesuburan pertumbuhannya. Jenis mikroba aerob dapat tumbuh dengan mudah pada suasana alam bebas. Dan mikorba anaerob membutuhkan suasana lingkungan bebas O2 dan kadar CO2 tinggi (5-10). Mengenai suhu pengerasan hampir tidak berbeda

yaitu 37oC sesuai dengan suhu tubuh manusia, sedangkan waktu pengeraman untuk mikroba anaerob waktunya sedikit lebih lama (Pelczar,1986). Jika selsel mikroba tertangkap oleh media padat pada beberapa tempat yang terpisah, maka setiap sel atau kumpulan sel yang hidup akan berkembang menjadi suatu koloni yang terpisah, sehingga memudahkan pemisahan selanjutnya. Bila digunakan media cair, selsel mikroba sulit dipindahkan secara individu karena terlalu kecil dan tetap tinggal pada tempatnya. Akan tetapi bila selsel tersebut dipisahkan dengan cara pengenceran, kemudian dipindahkan pada media padat dan dibiarkan membentuk koloni, maka selsel tersebut selanjutnya dapat diisolasi dalam tabungtabung reaksi atau cawan petri yang terpisah (Sutedjo, 1991). Untuk mencegah terjadinya kontaminasi perlu dilakukan beberapa tindakan pencegahan. Pertamatama kita ambil agaragar yang telah cair dari penangas air, hapus bagian luar lap tabung dengan kain atau lap kertas. Jika hal ini tidak dilakukan maka air akan jatuh ke dalam cawan dan membawa kontaminasi. Selanjutnya jika membuka tutup kapas untuk menuangkan agar, lewatkan mulut tabung reaksi di atas api bunsen untuk membunuh mikroba yang terdapat pada permukaannya. Dalam menuangkan agar dari tabung kedalam cawan, angkat tutup cawan hanya pada satu sisi saja cukup seluas ruangan untuk melewatkan mulut tabung saja. Hal lain yang perlu diperhatikan adalah agar tabung tidak menggesek cawan atau penutupnya ketika menuangkan agar. Setelah menuangkan agar ke dalam cawan, segera letakkan tutup cawan ke tempat semula, angkat cawan dan miringkan perlahanlahan dari satu sisi ke sisi lain untuk menyebarkan agar ke seluruh bagian cawan hingga merata. Letakkan cawan di atas meja dan biarkan agar mengeras hingga sempurna (Sutedjo, 1991). Andaikan kita ingin mengisolasi biakan murni bakteri dari mulut kita, maka liur itu diinokulasikan sedikit saja pada medium yang cocok sedemikian rupa sehingga selsel mikroba tumbuh perpisahpisah pada medium tadi. Bahan yang diinokulasikan pada medium tersebut disebut inokulum. Dengan menginokulasikan medium agar nutrient dengan metode gores atau cawan tuang, selsel akan terpisah sendirisendiri. Setelah inkubasi, selsel mikroba individu

itu memperbanyak diri sedemikian cepatnya sehingga dalam waktu 18 atau 24 jam terbentuklah massa sel yang dapat terlihat dan dinamakan koloni. Koloni ini tampak oleh mata telanjang. Setiap koloni yang berlainan mewakili macam organisme yang berbedabeda. Setiap koloni merupakan biakan murni satu macam organisme. Jika dua sel mikroba pada inokulum asal terlalu berdekatan letaknya pada medium agar, maka koloni yang terbentuk dari masingmasing sel dapat bercampur dengan sesamanya atau paling tidak bersentuhan. Biasanya untuk koloni bakteri waktu yang digunakan untuk memperbanyak diri adalah 24 jam. Sedangkan jamur diperlukan waktu 48 jam untuk berkembang biak (Pelczar, 1986). Beberapa hal yang harus dilakukan sebelum melakukan pekerjaan isolasi dan identifikasi koloni mikroba dari bahan pemeriksaan yaitu : 1. Pengamatan bahan yang akan dikerjakan, apakah bahan tersebut masih baik atau prima. Karena jika tidak dilakukan pemeriksaan, ditakutkan hasil yang diperoleh tidak sesuai yang diharapkan. 2. Pengolahan bahan. Adakalanya bahan pemeriksaan yang diterima harus melalui pengolahan terlebih dahulu sebelum ditanamkan pada pembenihan. Pengolahan ini bertujuan untuk mendapatkan hasil isolasi yang baik dan tepat dengan cara yang mudah. Pengolahan tersebut diantaranya dapat berupa : a. Sentrifugasi. Apabila diperkirakan jumlah mikroba di dalam bahan tersebut sedikit. b. Pengenceran, apabila diperkirakan jumlah mikroba di dalam bahan tersebut terlalu banyak. c. Pemanasan, apabila yang ingin diasingkan dari bahan pemeriksaan yaitu kumankuman yang tahan terhadap pemanasan (mikrobamikroba yang memiliki spora, kecuali clastridium perfiringens) d. Penghancuran, apabila bahan pemeriksaan berupa bahan yang padat, sehingga diharapkan mikrobamikroba yang diinginkan keluar dari bahan (sisa makanan, jaringan tubuh, dan lainlain). Bahan yang telah di hancurkan dilarutkan dalam garam yang steril (Dwidjoseputro, 1990).

Inkubasi merupakan suatu teknik perlakuan bagi mikroorganisme yang telah diinokulasikan pada media (padat atau cair), kemudian disimpan pada suhu tertentu untuk melihat pertumbuhannya. Bila suhu inkubasi tidak sesuai dengan yang diperlukan, biasanya mikroorganisme tidak dapat tumbuh dengan baik. Media inkubasi digolongkan menjadi 2 jenis yaitu pada lemari biasa atau suhu kamar dan dalam inkubasi yang dapat diatur suhunya (Pelczar, 1986). A. Teknik penanaman Teknik penanaman dari suspensi Teknik penanaman ini merupakan lanjutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi dengan tujuan isolasi (untuk mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir. 1. Spread plate (agar tabur ulas) Teknik ini memerlukan agar yang belum padat dengan menyebarkan suspensi bakteri dipermukaan agar diperoleh kultur murni. 2. Pour plate ( agar tuang) Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (> 45oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri kedalam cawan petri. Lalu kemudan dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebakan selsel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar cair (dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh di dalam agar yang tidak terlalu banyak mengandung oksigen (Waluyo, 2008). Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml untuk spread plate dan 1ml pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbukan dipermukaannya saja, sedangkan pour plate menumbuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak daripada spread plate.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan 4.4.1 Tabel pengamatan koloni mikroba No 1 Gambar Na1 a. Sp1 Form = circular Margin = entire Elevation = convex Warna = kuning keruh b. Sp2 Form = punctiform Margin = undulate (wavy) Elevation = flat Warna = kuning keruh c. Sp3 Form = spindle Margin = undulate Elevation = flat Warna = putih transparan 2 Na2 a. Sp1 Form = punctiform Margin = entire Elevation = flat Warna = putih kekuningan Keterangan

b. Sp2 Form = circular Margin = erose (serrated) Elevation = convex Warna = putih kekuningan 3 PDA1 (bakteri pengkontaminan)

PDA2 (bakteri pengkontaminan)

4.2 Pembahasan Pada hasil pengamatan setelah mikroba diinkubasi, diperoleh hasil pada Na1 terdapat 3 spesies dengan karakteristik pada spesies 1 yaitu formnya circular, marginnya entire, elevationnya convex dan berwarna kuning keruh. Pada spesies 2 karakteristik bakteri di dalamnya yaitu formnya punctiform, marginnya undulate (wavy), elevationnya flat dan berwarna kuning keruh. Pada spesies 3 karakteristik bakteri di dalamnya yaitu formnya spindle, marginnya undulate, elevationnya flat dan berwarna putih transparan. Pada hasil pengamatan pada Na3 hanya terdapat 2 spesies, dengan karakteristik pada spesies 1 yaitu: formnya punctiform, marginnya entire,

elevationnya flat, dan berwarna putih kekuningan. Pada spesies 2 karakteristik di dalamnya yaitu formnya circular, marginnya erose, elevationnya convex dan berwarna putih kekuningan. Hasil pengamatan pada PDA1 dan PDA2 tidak didapat pertumbuhan jamur melainkan terdapat bakteri pengkontaminan. Pada percobaan isolasi dan morfologi koloni bakteri yang pertamatama dilakukan adalah pengenceran. Pengenceran dilakukan apabila jumlah mikroba disampel tersebut diperkirakan terlalu banyak jumlahnya. Pengenceran berfungsi untuk mengurangi jumlah mikroba yang ada pada sampel. Pada praktikum kali ini menggunakan NaCl 0,9% pada saat pengenceran. Hal ini dilakukan karena NaCl 0,9% atau garam bersifat isotonis. Isotonis merupakan suatu keadaan dimana konsentrasi cairan dalam sel dan di luar sel sama dengan keadaan isotonis, sehingga bakteri yang dikembangkan tidak terganggu. Bakteri yang diisolasi juga tidak akan kekurangan atau kelebihan cairan dalam sel karena sudah bersifat isotonis. Faktorfaktor kesalahan yang mungkin dapat terjadi selama praktikum adalah : a. Kesalahan personal/praktikan, seperti kurang teliti dalam menjaga dan memperhatikan kebersihan. b. Kebersihan alat, mungkin pada saat pemasangan blue tip, ujung blue tip tersentuh tangan sehingga tidak steril lagi. c. Terlalu banyak bicara sehingga mikroba dari dalam mulut dapat masuk ke dalam cawan. Metode yang digunakan dalam percobaan ini adalah metode agar tuang yang menggunakan NA (natrium agar) dan PDA (Potato Dextrose Agar) yang belum padat untuk dituang ke cawan petri yang dituang bersama suspensi bakteri. Cara homogenkannya yaitu dengan metode menggoyangkan cawan membentuk angka 8. Hal ini bertujuan agar selsel bakteri terhomogen secara menyeluruh, tidak hanya pada permukaan, melainkan selselnya terendam agar, metode angka 8 ini perlu dilakukan secara hatihati pula sehingga mikroorganisme tumbuh dimana saja pada cawan petri.

Percobaan kali ini menggunakan sampel media hidup berupa kue lapis dan juga NA dan PDA. Pertamatama kue talam ditimbang seberat 1 gr, dengan menggunakan neraca analitik, kemudian kue yang sudah ditimbang tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang sebelumnya sedah mengandung NaCl 0,9 %, lalu tabung reaksi ditutup dengan alumunium foil. Sampel kue tersebut dimasukkan ke dalam NaCl di belakang lampu bunsen agar tidak terjadi kontaminasi. Setelah itu di tutup kembali tabung reaksi dengan alumunium foil kemudian divorteks untuk menghomogenkan sampel dengan NaCl 0,9%. Kemudian diambil NaCl 1 ml dengan mikropipet 0,5 ml dan di tuang ke dalam cawan petri, masukkan juga larutan Na hingga menutupi dasar cawan. Homogenkan larutan tersebut dengan menggoyangkan cawan petri membentuk angka 8. Beri kertas label lalu diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37oC. Pada Na2 ambil larutan dari pengenceran 1 lalu dimasukkan dari sampel ke dalam NaCl 0,9% kemudian divorteks. Dimasukkan hasil pengenceran 2 kedalam cawan petri sebanyak 1 ml yang dilakukan dibelakang bunsen. Namun sebelum cairan dimasukkan panaskan dahulu cawan petri agar mikroba yang ada pada cawan tersebut mati. Dituang Na kedalam cawan petri hingga menutupi permukaan dasarnya. Dipanaskan lagi cawan petri dengan bunsen agar tetap steril. Homogenkan juga cawan petri dengan menggoyangkannya membentuk angka 8. Ditandai dengan kertas label kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Untuk sampel PDA yang diambil dari PDA yang dibekukan di dalam cawan petri dan dikerjakan di belakang lampu bunsen juga. Diusapkan tangan ke kepala yang berketombe dan disentuhkan pada cawan petri yang telah berisi PDA. Dipanaskan cawan petri di bunsen untuk mensterilkannya kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC di dalam inkubator. Pada percobaan kali ini terdapat perlakuanperlakuan khusus yang dilakukan agar tidak terjadi kontaminasi dari mikroba lain. Misalnya ketika tangan dibasuh alkohol terlebih dahulu sebelum melakukan percobaan agar bakteribakteri yang menempel pada tangan kita mati, sehingga tidak mengkontaminan isolasi mikroba. Dan pada saat kita melakukan percobaan cawan petri diletakkan

dibelakang bunsen agar bakteri dari hembusan nafas kita terbakar dan tidak masuk ke cawan petri.