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OBTENCIN DE ETANOL A PARTIR DE BANANO DE RECHAZO POR ACCIN DE Zymomonas mobilis.

JUAN FELIPE CANO PALACIO

CARLOS ANDRS NARANJO MERINO

Trabajo Dirigido de Grado presentado como requisito parcial para optar al ttulo de Ingeniero Qumico.

Director: MARTA CECILIA MEJA LAVERDE I.Q

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE MEDELLN FACULTAD NACIONAL DE MINAS

Medelln, 2002

NOTAS DE ACEPTACIN

Primer Jurado

_________________________________________________ _________________________________________________ _________________________________________________ _________________________________________________ _________________________________________________ _________________________________________________ _________________________________________________ _________________

Fecha ______________________________ Jurado _____________________________.

Segundo Jurado

_________________________________________________ _________________________________________________ _________________________________________________ _________________________________________________ _________________________________________________ _________________________________________________ _________________________________________________ _________________

Fecha ______________________________ Jurado _____________________________.

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DEDICATORIA

A nuestros Padres, por todo su apoyo

Juan Felipe y Carlos Andrs

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AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan sus agradecimientos: A MARTA CECILIA MEJA LAVERDE. I.Q. Profesora Asociada a la Universidad Nacional Sede Medelln y Directora del Trabajo de Grado. A OLGA INES MONTOYA C, Microbiologa. M.Sc. Directora del Laboratorio de Microbiologa de la Universidad Nacional Sede Medelln. A CARLOS GAVIRA. Tec.Qco. Encargado del Laboratorio de Alimentos Universidad Nacional Sede Medelln. AL CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOTECNOLOGICAS (CIBIOT) Universidad Pontificia Bolivariana Medelln.A todas aquellas personas que en una u otra forma colaboraron en la realizacin del presente trabajo.

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TABLA DE CONTENIDO Pg. LISTA DE TABLAS LISTA DE FIGURAS RESUMEN ABSTRACT INTRODUCCIN 1. MARCO TERICO 1.1 MATERIA PRIMA 1.1.1. El banano de rechazo como materia prima 1.1.2 Caractersticas del banano 1.1.3 Produccin de banano en Colombia 1.1.4 Generalidades sobre el almidn y el almidn de banano 1.2 TRATAMIENTO DE LA MATERIA PRIMA 1.2.1 Hidrlisis cida 1.2.2 Hidrlisis enzimtica 1.2.3 Resea bibliogrfica sobre hidrlisis de banano 1.3 FERMENTACIN 1.4 MICROORGANISMO 1.4.1 Antecedentes histricos 1.4.2 Taxonoma 1.4.3 Catabolismo 1.4.4 Efectos de ciertos parmetros fisicoqumicos sobre el crecimiento
v

viii x 1 2 2 4 4 5 6 10 14 15 15 16 17 21 22 22 23 24

y la produccin de etanol por Zymomonas mobilis 1.5 ASPECTOS TECNOLGICOS DE LA PRODUCCIN DE ETANOL por Zymomonas mobilis 1.5.1 Medio de cultivo 1.5.2 Ventajas y desventajas de la fermentacin batch y continua utilizando Zymomonas mobilis 1.6 ALCOHOL ETLICO 1.6.1 Generalidades 1.6.2 Aplicaciones del alcohol etlico 1.6.3 Formas comerciales de etanol 1.7 PROCESO FERMENTATIVO PARA LA PRODUCCIN DE ALCOHOL. PARMETROS QUE SE DEBEN TENER EN CUENTA 1.7.1 Descripcin del proceso general partiendo de una fuente de carbono, en este caso el hidrolizado 1.7.2 Revisin bibliogrfica sobre la produccin de alcohol 2. DESARROLLO EXPERIMENTAL 2.1 DESCRIPCIN DEL PROCESO DE HIDRLISIS 2.1.1 Caracterizacin de la materia prima 2.1.2 Hidrlisis 2.2 PROCESO FERMENTATIVO 2.2.1 Materiales y mtodos 2.2.2 Fermentacin 2.3 ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS

29 34 35 38 39 39 39 40 41 41 42 47 47 48 50 54 55 57 63

2.4 COMPARACIN CON LOS RESULTADOS REPORTADOS PARA Saccharomyces cerevisiae 66 3. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFA ANEXOS 69 72

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ANEXO 1. Determinacin de azcares totales ANEXO 2. Determinacin de azcares reductores ANEXO 3. Determinacin de contenido de almidn ANEXO 4. Determinacin de biomasa ANEXO 5. Fundamentos de los mtodos de determinacin de biomasa ANEXO 6. Determinacin de alcohol ANEXO 7. Coloracin de Gram

79 79 81 83 86 87 88

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LISTA DE TABLAS

TABLA 1. Clasificacin botnica del banano 2. Composicin en porcentaje de una banana verde 3. Composicin promedio de la harina de banano verde de rechazo (Urab) 4. Referencias bibliogrficas de diferentes composiciones qumicas de banano 5. Color de la cscara de banano en diferentes etapas de maduracin 6. Referencias bibliogrficas de diferentes hidrlisis de banano
7.

Pg. 7 7 8

9 10 19 24

Caractersticas fenotpicas del gnero Zymomonas

8. Parmetros cinticos en condiciones anaerbicas para la Zymomonas mobilis 9. Medios de mantenimiento, crecimiento y fermentacin para la Zymomonas mobilis 10. Referencias bibliogrficas de diferentes fermentaciones alcohlicas a partir de banano 11. Azcares reductores contenidos en la materia prima
viii

33

37

46 49

12. Determinacin de azcares totales 13. Hidrlisis cida con cido sulfrico 14. Hidrlisis Enzimtica 15. Mtodos de desinfeccin 16. Medio de fermentacin ptimo seleccionado 17. Determinacin de nutrientes en el jugo hidrolizado 18. Datos obtenidos en el proceso de fermentacin 19. Productividad y rendimientos de la fermentacin
20. Comparacin de Z.mobilis y S.cerevisiae en la produccin de alcohol

49 51 53 56 57 58 60 63 67

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LISTA DE FIGURAS FIGURAS 1. Procesos de obtencin de etanol 2. Arriero 3. Trabajo de seleccin en finca bananera 4. Cultivos de banano Zona de Urab 5. Cadena de Lavado y Empaque 6. Clster de banano 7. Sigatoka Negra 8. Fermentadores industriales
9.

Pg. 5 6 11 12 13 13 14 21 22 23 25 40 47

Zymomonas mobilis vista al microscopio

10. Zymomonas mobilis vista al microscopio II

11. Metabolismo de sacarosa, glucosa y fructosa en la Zymomonas mobilis

12. Ciclo del gas Carbnico producido por el Bioetanol 13. Diagrama de flujo

14. Jugo de banano diluido 15. Centrifugacin del jugo de banano 16. Hidrlisis cida del jugo de banano 17. Jugo de banano hidrolizado 18. Diagrama de flujo del proceso fermentativo 19. Fermentacin del jugo de banano hidrolizado 20. Cintica de la fermentacin de hidrolizado de banano verde por accin de Zymomonas mobilis 21. Microdestilacin del etanol

49 50 51 52 54 59

61 88

xi

RESUMEN

Se propone la utilizacin de banano verde de rechazo de la zona de Urab (Colombia) como un sustrato de bajo costo para la produccin de etanol por accin de Zymomonas mobilis La harina de banano se somete a hidrlisis cida y enzimtica de los almidones, escogindose la cida con un rendimiento del 67% en la conversin de almidones a glucosa, que es la fuente de carbono para el microorganismo. Del trabajo experimental se concluye que la Zymomonas mobilis NRRLB14022 produce 41.86 g/L de etanol en jugo de banano verde hidrolizado a partir de 100 g/L de glucosa inicial con adicin de pequeas cantidades de suplementos nutricionales y sin regulacin de pH. Obtenindose un rendimiento de 0.47 gramos de etanol por gramo de glucosa, lo que corresponde a un 95% de la productividad terica; mientras que la levadura Saccharomyces cerevisiae, reporta rendimientos de hasta un 90% de la productividad terica. Estos resultados sugieren que este jugo hidrolizado de banano verde puede ser usado como un sustrato de bajo costo para la produccin de etanol, disminuyendo la contaminacin causada por el banano de rechazo.

INTRODUCCIN

La crisis energtica que comenz en 1973 disminuy la oferta de petrleo e increment su precio en forma exorbitante. Esto oblig a los pases en desarrollo a reducir o retrasar importantes programas de desarrollo para poder adquirir el petrleo que necesitan para mantener la marcha de sus economas. Se plante la urgente necesidad de encontrar y desarrollar fuentes alternativas de energa, tales como otros combustibles fsiles (carbn, gas), energa nuclear o recursos energticos renovables. El carbn se encuentra en su mayora en los pases industrializados, constituyendo las reservas de Amrica Latina y Africa menos del uno por ciento del total mundial, por lo que resulta improbable que esta parte del Tercer Mundo pueda utilizar grandes cantidades de carbn. La alternativa nuclear resulta inconveniente; el riesgo de accidentes, la disposicin de desechos radiactivos, el terrorismo nuclear y la proliferacin de armas nucleares son peligrosos de por s, y hacen que esta forma de energa resulte demasiado costosa (Brown, et al. sin fecha). Ms an, la adquisicin de energa nuclear del mundo industrializado producira una mayor dependencia tecnolgica y econmica con respecto a los pases desarrollados. Una alternativa ms factible para el petrleo, el carbn y los reactores nucleares en los pases en desarrollo es la utilizacin directa e indirecta de la energa apartir de biomasa, que es renovable, abundante, descentralizada y no contaminante. Teniendo en cuenta que la tecnologa necesaria para el aprovechamiento de los recursos energticos renovables es simple y relativamente econmica, es importante desde un punto de vista estratgico que la planificacin energtica en los pases del Tercer Mundo, particularmente los del trpico hmedo, se oriente al desarrollo de la alternativa de combustibles renovables, ya que sta constituye una de las pocas oportunidades de alcanzar un desarrollo independiente de los pases industrializados. Con este fin, la planificacin energtica deber tambin estimular la conservacin de la energa, y

optimizar el uso de los subproductos y residuos orgnicos generados por las actividades econmicas y domsticas El etanol, tambin llamado alcohol etlico o simplemente alcohol, se fabrica mediante un proceso de sntesis a partir del etileno, o de fermentacin de sustancias amilceas y glucdicas. Actualmente, el uso del alcohol se ha ampliado de la destilacin de bebidas espirituosas al sector de las industrias qumica, farmacutica y de cosmticos. El etanol se produce biotecnologicamente a partir de la caa de azcar y el maz, pero tambin puede obtenerse de la yuca, la madera y otras sustancias. La caa de azcar slo necesita tratamiento fsico; la yuca requiere adems un tratamiento trmico y enzimtico, mientras que la madera requiere un tratamiento termocido y neutralizacin hidrolizada. La fermentacin se realiza con microorganismos los cuales segregan enzimas

especficas para la fragmentacin de las hexosas y otros azcares simples. La sustancia resultante se destila para producir el etanol puro quedando como residuo una forma de vino. Un microorganismo, Zymomonas mobilis, a despertado un gran inters en la comunidad biotecnologica del mundo por su alta velocidad de fermentacin. [Favela, 1993] Adems recientes trabajos con Zymomonas mobilis a partir de biomasa reportan excelentes resultados en la obtencin de etanol, con amplias ventajas sobre otros microorganismos; hacindola muy atractiva para su utilizacin a escala industrial. [Kondo,1996; Laplace, 1991; Doelle, 1990]. En el caso de nuestro trabajo se propone la obtencin de etanol a partir de la fermentacin de banano de rechazo (el cual es causa de un gran dao ecolgico en el pas) como sustrato, por la accin de Zymomonas mobilis. Se trata de un estudio a escala de laboratorio en proceso discontinuo. Durante la realizacin del trabajo se encontraron dificultades en encontrar el medio optimo de crecimiento, mantenimiento y fermentacin de la Zymomonas mobilis, ya que en el, manejo de la cepa con los medios de nutricin recomendados, la bacteria presentaba bajo crecimiento, se mora, o creca demasiado lento, adems de que en ocasiones se presentaron situaciones de estrs. Se requiri de un arduo trabajo en el laboratorio de Microbiologa de la Universidad y de mucha asesora de parte del encargado de este,
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debido a que la Zymomonas mobilis se contaminaba y mutaba fcilmente a pesar de los cuidados que se tenan.

1. MARCO TERICO En general con un apropiado pretratamiento varias formas de biomasa pueden servir como sustratos para una fermentacin alcohlica, por ejemplo remolacha, caa de azcar, cereales como trigo, maz, arroz, etc. El proceso global de obtencin de etanol a partir de biomasa puede dividirse en las siguientes etapas: [Llinares,1983; Glazer, 1995]. Pretratamiento de la materia prima. Hidrlisis o sacarificacin. Fermentacin. Separacin y purificacin de etanol.

Este esquema es solo general, ya que hay procesos en que la hidrlisis resulta innecesaria, por encontrarse los azucares ya libres, y otros, en que dicha hidrlisis tiene lugar simultneamente a la fermentacin. En la Fig. 1 se presenta un flujograma que describe la conversin de varios tipos de materia prima en alcohol.

1.1 MATERIA PRIMA Cualquier producto que posea en su estructura interna azcares o carbohidratos fcilmente transformables a azucares puede ser fermentado para la obtencin de etanol. El alcohol etlico puede elaborarse a partir de tres tipos de materias primas: Materiales azucarados: Donde los carbohidratos aparecen como azcares (remolacha, caa de azcar, melazas de caa y sorgo, etc).
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Cosechas de caa de azcar

Pretratamiento mecnico

Fermentacin

Destilacin y deshidratacin

Etanol anhidro

Azcares como sacarosa

Pretratamiento mecnico

Hidrlisis cida o enzimtica

Fermentacin

Destilacin y deshidratacin

Etanol anhidro

Almidones

Pretratamiento mecnico

Gelatinizacin

Hidrlisis enzimtica

Fermentacin

Destilacin y deshidratacin

Etanol anhidro

Hidrlisis cida

Hidrlisis cida

Celulosa

Pretratamiento mecnico

Pretratamiento qumico o biolgico

Hidrlisis enzimtica

Fermentacin

Destilacin y deshidratacin

Etanol anhidro

Hidrlisis y fermentacin simultneas

FIGURA 1. Procesos de obtencin de etanol Materiales amilceos: Incluye los cereales y algunos tubrculos en los cuales los carbohidratos aparecen como almidn e insulina. Entre estos figuran trigo, cebada, arroz, yuca, maz, centeno, etc. Materiales celulsicos: Comprende la madera y residuos de agricultura como cortezas y troncos de hortalizas.

1.1.1 El banano de rechazo como materia prima El banano es uno de los principales cultivos comestibles y produce una gran cantidad de alimento por rea plantada; as una plantacin bien administrada produce mas de 75000 Lb de fruta verde por rea, equivalente a 84000 Kg por ha. [Bowman, 1979].
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Debido a las exigencias cargadas al fruto de exportacin, en Colombia se rechazan en promedio el 20 % de la produccin anual (200.000 Ton/ao aprox.) convirtindose as en un problema de contaminacin ambiental en las regiones de produccin, tal es el caso de la regin del Urab antioqueo. Este banano gracias a su contenido de almidn y de azcares fermentables puede ser aprovechado para la produccin de etanol.

1.1.2 Caractersticas del banano Historia La historia del banano se remonta a relatos literarios antiguos de China, Grecia, Roma y pueblos de oriente; llegando a ser importante en la alimentacin de la poblacin. [Revista del Instituto colombiano de Normas Tcnicas, 1993] Los mercaderes portugueses en su paso por China hace ms de 500 aos, encontraron un sitio sembrado de Banano en la costa de Guinea y fueron los encargados de propagar el cultivo, respetando su nombre original Banano palabra de origen snscrito Fruta de los sabios , manjar de los dioses, bendicin de dios, fruta del paraso y muchas otras expresiones, importancia del banano en la FIGURA 2. Arriero alimentacin del hombre a travs de los tiempos. [Revista del Instituto colombiano de Normas Tcnicas. 1993] dan cuenta de la

Clasificacin botnica Banano (Musa sapientum)

Nombres

vulgares:

banano,

banana,

pltano

nuevo.

La

Clasificacin

botnica

comnmente aceptada, para el banano es la que figura en el sistema de Engler:

TABLA 1. Clasificacin Botnica del banano. [Fonseca, 1992] Divisin Subdivisin Clase Orden Familia Sub-familia Genero Espermatofitas Angiosperma Monocotiledneas Excitaminales Musceas Musoideas Musa

Composicin qumica Un banano pesa entre 100 y 200 gramos, contiene alrededor del 60% en pulpa comestible la cual es, por lo general de color blanco o marfil fuerte, ligeramente pastosa, de fcil digestin y valor nutritivo de primer orden. Est formado de agua, almidn, azcares, celulosa y pequeas cantidades de gomas, resinas, taninos, dextrinas, albuminoides y sustancias minerales. [Revista del Instituto colombiano de Normas Tcnicas, 1993]. En la Tabla 2 se presenta la composicin promedia en porcentaje para una banana verde de 100 g de peso. [Males, 1979; Botero, 1993]. TABLA 2. Composicin en porcentaje de una banana verde. Agua Almidn Azcares totales Celulosa Cenizas Sustancias Intermedias 69.00% 14.00% 14.00% 1.20% 0.76% 1.04%

La composicin promedio de la harina de banano verde de rechazo de la zona de Urab incluyendo su cscara es: [Bayona, 1989]. TABLA 3. Composicin promedio de la harina de banano verde de rechazo. (Urab) Componente % Humedad 13.7 Protenas 3.5 Grasa 0.5 Fibra 1.0 Carbohidratos 78.6

Para informacin mas detallada ver Tabla 4.

Cambios fsicos En general, el cambio del color del banano se debe a una reduccin en el contenido de clorofila, con escasa o ninguna formacin de carotenoides. El proceso de maduracin del banano ha sido clasificado en ocho etapas consecutivas, de acuerdo con el color de la cscara como se observa en la Tabla 5.

TABLA 4. Referencias bibliogrficas de diferentes composiciones qumicas de banano . Ref. Banano Componente Humedad Almidn Azcares totales Azcares reductor Azucares no reductor Carbohidratos totales Sacarosa Glucosa Fibra Protena Grasas Cenizas Taninos Celulosa Sustancias Intermedias 3 3 Maduro Harina 71 22 13.7 5 Verde fresco 75.8 13.78 5 Harina 18.4 58.67 46 Maduro 75.1 4 64 64 Verde Maduro 69.58 15 14 72.12 4 18.23 65 Verde fresco 74.4 12.83 11.64 2.81-7.24 4.85-6.52 20.5-21.5 9.3 6 2 0.3 0.76 0.02 1 2.5 5.2 0.245 1.069 0.3 0.765 0.23 7 9.3 0.594 1.788 0.964 0.417 1 0.85 1.17 0.43 1.06 20.6521.15 0.75 .5-2 .17-.5 .76-1.2 1.71-1.77 0.6 1.2 0.2 0.8 65 Maduro fresco 77.4 1.2-7 18.74 2.81-7.24 4.85-6.52 18-20 68 Maduro 74.8 1.2 21.2

78.6

20.25 14-15

0.1 0.76 1.2 2.4

1 3.5 0.5

0.43

* Datos dados en porcentaje (los datos no reportados corresponden a trazas de minerales)

TABLA 5. Color de la cscara de banano en diferentes etapas de maduracin. Etapa 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Color Cascara Verde Verde Verde con trazas amarillas Mas verde que amarillo Mas amarillo que verde Amarillo con una punta verde Todo amarillo Amarillo con manchas cafs Amarillo con muchas manchas cafs

La diferencia entre la etapa cero y uno es que en la cero el banano esta recin cortado; mientras que en la uno ya a sido expuesto a gas acetileno o etileno para maduracin. Mas informacin [Botero,et. al;1993].

1.1.3 Produccin de Banano en Colombia El cultivo agroindustrial de banano en Colombia con propsitos de exportacin data de 1890 con 120 ha en el Magdalena. El desarrollo bananero con fines de explotacin comenz propiamente en 1930 alcanzando en 1943 un rea sembrada de 28.467 ha. El nacimiento de la produccin de banano comercial en la regin de Urab, en el departamento de Antioqua, se dio gracias a ventajas comparativas de localizacin y calidad de los suelos con respecto a otras zonas productoras en Centroamrica, y el dinamismo en que se encontraba el mercado internacional, dieron un gran impulso al desarrollo de este cultivo en nuestro pas. En los 90s sobresalen, la ampliacin de la frontera bananera, incorporacin de nuevas tecnologas al proceso de produccin, y la llegada nuevamente a Urab de empresas multinacionales.

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En Colombia la produccin de banano para la exportacin, est concentrada en los municipios de Carepa, Chigorod, Apartad y Turbo, en el Urab antioqueo y de Cinaga, Aracataca, y El Retn en el departamento de Magdalena.

FIGURA 3. Trabajo de Seleccin en Finca Bananera Actualmente, se desarrolla en 42.500 ha sembradas con la variedad Cavendish principalmente; emplea a 22.000 personas en forma directa y 64.000 ms en forma indirecta; exporta cada ao alrededor de 80.000.000 de cajas, que representan ingresos al pas de US 430 millones, participando con aproximadamente el 30% del total de exportaciones agropecuarias y con ms del 3% en las exportaciones totales del pas. La calidad de la fruta colombiana y su sistema de comercializacin no slo ha llevado a que Colombia sea el tercer pas exportador de banano a nivel mundial, despus de Ecuador y Costa Rica, sino tambin, a que la participacin de las exportaciones se hayan mantenido en el mercado. Las exportaciones colombianas de banano en 2000 ascendieron a 91.9 millones de cajas de 18.14 kg por un valor de US 460.9 millones, presentando variaciones positivas del 16.18% y 11.30% en volumen y valor respecto al ao de 1999. El mercado hacia el cual se export la mayor cantidad de banano fue el europeo, a donde se enviaron 37 millones de cajas, que representan el 40.32% del total de exportaciones, seguido del norteamericano hacia donde se exportaron 32.7 millones de cajas. [www.augura.com.co].
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El banano de rechazo (Zona de Urab) Todos los pases exportadores de banano producen considerables cantidades de desperdicio debido a las exigencias de calidad. Para el banano de exportacin se han fijado normas de calidad inflexibles, acumuladas en algo ms de 14 defectos que castigan severamente la fruta.

FIGURA 4. Cultivos de Banano Zona de Urab. El banano es rechazado como producto exportable en tres puntos de la cadena de actividades que constituyen esta agroindustria. El primero de ellos es directamente en el campo, al avanzar las cuadrillas de corte cosechando la fruta y detectar racimos que por tener ms del 50% de las manos (bananos que conforman un racimo) no aprovechables son rechazados y picados. El segundo punto de control de calidad es en la empacadora donde la fruta se rechaza al no cumplir especificaciones de tamao, forma y aspecto, y por ltimo en el embarcadero. Durante el proceso de cosecha y empaque, significativos volmenes de banano verde son rechazados a diario llegndose a establecer cifras anuales que oscilan entre 200.000 a 250.000 toneladas ao en 29.586 ha cultivadas. [Augura, 2001]

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FIGURA 5. Cadena de Lavado y Empaque De acuerdo con la informacin suministrada por Fundauniban, el banano de rechazo tiene varios usos, de los cuales se pueden considerar como aprovechamiento un 50% (9% consumo animal, 1% consumo en la poblacin de Urab y 40% como comercio de frutas a otras ciudades del pas). El otro restante 50% que no se aprovecha se reparte de la siguiente forma: 10% perdidas de campo y el 40% se tira al ro o potreros desocupados.

Causas de rechazo Por regla general, las comercializadoras realizan inspecciones de calidad durante el tiempo de embalaje y embarque. Se trata de detectar los defectos y deficiencias que se cometen en la cosecha y proceso de empaque, que va en detrimento de la calidad.

FIGURA 6. Cluster (Manos) de banano.

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El nmero de defectos se establece por Cluster o manos que caben generalmente de 12 a 17 por caja con un peso que puede ser de 12 a 18 kg. Para la evaluacin se tienen grados para cada defecto tomando como punto de referencia una base del 100% por cada caja sin defecto. - Defectos de origen mecnico antes de la cosecha - Despus de la cosecha - En la empacadora - Fisiolgicos y Morfolgicos - Daos por clima - Patognicos - Por insectos - Otros: Residuo qumico, Pjaros, Murcilagos. FIGURA 7. Sigatoka Negra.

1.1.4 Generalidades sobre el almidn y el almidn de banano El almidn es un carbohidrato clasificado entre los polisacridos, que se almacena en las plantas con funciones nutritivas; presente en semillas, races y tubrculos. Es el principal constituyente de muchos alimentos y la mayor fuente de energa. La unidad fundamental del almidn es la glucosa y es el nico monosacrido obtenido de la hidrlisis total del polisacrido. El almidn se presenta en los tejidos vegetales en forma de grnulos, solo distinguibles con un microscopio normal; cuyo tamao y forma dependen de la especie vegetal de la cual provenga,. [Botero et. al., 1993] El almidn de banano presenta propiedades intermedias entre el almidn de maz y de papa. Los tamaos de los grnulos varan de 6 a 80 m y la mayora est en el intervalo de 20 a 60 m. Los intervalos de la temperatura de gelatinizacin son poco afectados por los diferentes grados de maduracin. Durante la maduracin el almidn es degradado rpidamente y los azcares sacarosa, glucosa y fructosa son acumulados; trazas de maltosa pueden estar presentes. Para mayor referencia. [Botero et. al, 1993; Taylor, 1993].

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1.2 TRATAMIENTO DE LA MATERIA PRIMA El almidn de banano no puede ser utilizado directamente por el microorganismo para la produccin de etanol, por lo cual se debe realizar un tratamiento para llevarlo hasta un sustrato asimilable, el cual pueda ser desdoblado por la Zymomonas mobilis (glucosa en este caso). La hidrlisis tiene como finalidad la transformacin de los polmeros de glucosa en azcares sencillos. [Llinares, et.al, 1983]. La hidrlisis de almidones para producir azcares, consiste en el rompimiento de los enlaces entre las molculas de glucosa, aadindose una molcula de agua por cada unidad de azcar. Contrariamente a las melazas, la celulosa y el almidn no pueden ser directamente metabolizados por microorganismos, por lo que la hidrlisis de estos productos previamente a su fermentacin es necesaria. De estudios anteriores se concluye que hay mejores resultados en la fermentacin cuando hay una previa hidrlisis del sustrato. [Favela, 1993]. Para mayor informacin. [Fennema,1993].

1.2.1 Hidrlisis cida El almidn puede retornarse a su forma monomrica original mediante la hidrlisis cida, en la cual los iones H+ actan como catalizadores de la siguiente reaccin: (C6H10O5)n + n H2O n C6H12O6

Industrialmente se utiliza cido clorhdrico o cido sulfrico como fuentes de H +; el primero produce mayores rendimientos. La extensin de la hidrlisis depende directamente de la temperatura, del tiempo de reaccin, de la concentracin del cido, de la concentracin de almidn en la lechada inicial (observndose que a concentraciones ms bajas de almidn se obtienen mayores rendimientos).
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La hidrlisis de almidn con cido sulfrico al 2% produce 97% de glucosa del cual un 88% puede ser aislada en forma cristalina. [Brautletch,1953] El producto final de la hidrlisis cida de almidn es glucosa en su mayor parte, pero puede presentar maltosa en pequeas proporciones. [Enyon,1928] Hay suficiente evidencia que demuestra que la velocidad de reaccin de la hidrlisis es de primer orden respecto a la concentracin del almidn. [Valencia,1989]. Durante la hidrlisis cida del almidn adems de presentarse la reaccin hasta glucosa, se presentan otros dos tipos de reacciones; por una parte se encuentra la produccin de gentobiosa por recombinacin de dos molculas de glucosa, cuya reaccin es reversible. Por otro lado despus que la glucosa se forma esta puede degradarse dando como resultado hidroximetilfurfural, el cual a su vez se puede descomponer para formar cido levulnico y cido frmico, o polimerizarse para formar sustancias de composicin desconocida. [Botero,et.al;1993]

1.2.2 Hidrlisis Enzimtica Lleva consigo un proceso de elaboracin de enzimas por microorganismos. Se distinguen dos tipos de sistemas enzimticos: los que actan sobre la celulosa y los que actan sobre el almidn. [Llinares,1983]. En la degradacin enzimtica del almidn estn involucrados dos tipos de enzimas: las primeras son enzimas que rompen los enlaces -(1,4) produciendo una disminucin en la viscosidad de la solucin de almidn y facilitando la accin de otras enzimas (dentro de este grupo pueden ser clasificadas las endoenzimas, que producen rompimiento al azar, y las exoenzimas, que actan desde el final de las cadenas), y el segundo tipo rompe enlaces -(1,6). El tratamiento de la amilosa o la amilopectina con -amilasa da como resultado una mezcla de maltosa, glucosa y panosa (si la reaccin continua por un largo perodo). La 16

amilasa retira unidades de maltosa del extremo no reductor de la cadena del almidn, hidrolizando los enlaces glicosdicos alternos.[Botero,1993] Estas referencias [Brautletch,1953; Enyon,1928], aunque son muy viejas no han sufrido ningn cambio significativo, debido a la simpleza del mtodo utilizado para la hidrlisis. 1.2.3 Resea bibliogrfica sobre hidrlisis de banano. En trabajos anteriores se reporta condiciones tales como: Hidrlisis de banano maduro (Cavendish) de 85 das de maduracin. Secado al sol a 50 OC, molido y tratado despus con cido sulfrico de 2 al 5%, con una presin entre 1.36 y 1.63 at durante 30 minutos de incubacin, relacin de cido a sustrato es de dos a uno (v/w). El jugo hidrolizado contiene 28% (w/v) de azcares reductores, del ms fue glucosa. Se realiza una fermentacin cual el 74% o 7 horas.

discontinua con S.diastaticus

obtenindose etanol al 6% (w/v), con un tiempo de fermentacin de [Pontiveros, et.al. 1980].

Hidrlisis cida, con cido sulfrico concentrado, llevando el pH del jugo de banano a un valor entre uno y dos, en una autoclave a una presin de 1 at y una temperatura de 65 0C por 15 minutos. La fermentacin fue realizada con S. cerevisiae. No se reportan resultados. [Morales, et. al. 1993]. Hidrlisis con cido sulfrico al 60% de banano maduro, se ajusta el pH del jugo entre uno y dos, a una presin de 15 at, durante dos horas. La fermentacin fue realizada con S. cerevisiae. Por trece kilos de banano maduro sin pelar se obtuvo un litro de alcohol al 84%. [Palacio,1982] El almidn de banano verde se convierte en azcar fermentable (hidrlisis) en una hora, a partir de una solucin con 25 partes de almidn y 75 partes de agua que contiene de tres a seis por ciento de cido sulfrico a una temperatura entre 135 y 140
0

C y una presin de 6 at durante 15 minutos. De 0.64% de azcares reductores

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iniciales se obtienen 9.9% de azcares reductores finales en base hmeda. [Valencia, et. al. 1987]. Se utiliza cido sulfrico al 2% para hidrolizar banano verde a una presin entre 2.5 a 3 at, llevando el jugo a un pH de 3.5, todo esto se realiza en un tiempo de una hora. Obtenindose un porcentaje de azcares invertidos finales de 18%. Se utiliza levadura prensada (S. cerevisiae) para realizar la fermentacin obtenindose un rendimiento de etanol de 7%. [Mndez, 1979]. Se realizan dos tipos de hidrlisis: Hidrlisis enzimtica, utilizando dos enzimas, la primera - amilasa bacterial (BAN), que lleva el almidn hasta dextrinas, en un tiempo entre una y dos horas; la segunda una mezcla de glucoamilasa y pululanasa (Dextrozyme) que lleva las dextrinas hasta glucosa, en un tiempo entre 24 y 72 horas. Obtenindose una eficiencia de hidrlisis del 40%. La hidrlisis cida con cido sulfrico al 2%, llevando el jugo a un pH de 3.5 a una presin entre 2.5 y 3 at durante una hora. No se reportan resultados para la hidrlisis cida. [Botero, et. al. 1993]. Para facilitar el manejo de banano como jugo se adiciona una enzima pectinoltica para romper la estructura de la pectina y facilitar la extraccin de lquido intracelular. Se utiliza la S. cerevisiae variedad ellipsoideus. Los porcentajes de alcohol obtenidos oscilan entre un 5.7 y 10%. [Garca, Gmez, 1996]. Tambin es posible obtener etanol a partir de pltano maduro (con cscara y sin cscara), las condiciones ptimas en las cuales se debe realizar el proceso de hidrlisis del almidn, son cinco minutos a una temperatura de 60 0C, utilizando una concentracin de enzima amiloglucosidasa de 200 ppm. El tiempo de fermentacin necesario para obtener la mayor produccin de etanol utilizando una concentracin de levadura fresca (Saccharomyces cerevisiae) al 5% (p/v) es de 15 horas a una temperatura de 30 0C. Obteniendo un porcentaje en volumen de 11.48% de etanol puro, y de 10.39% para el filtrado de pulpa ms cscara. [Valds, 2000]. La Tabla 6. Presenta un resumen de las referencias bibliogrficas de la hidrlisis.

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TABLA 6. Referencias bibliogrficas de diferentes hidrlisis de banano. Ref . Autor Materia Prima
Banano verde cienaguero

Pretratamiento Hidrlisis
Pulpa cida HCl ccial 37% Enzimtica Malta seca cida HCl ccial 37% Enzimtica Malta seca cida H2SO4 2% Enzimtica Malta germinada Enzimtica -amilasa dextrozyme cida H2SO4 60% cida H2SO4 concentrado

T(oC)
146 60 146 60 Coccin 65

Presin
55 psi Atmosfrica 55 psi Atmosfrica 0

pH
2 5.5 2.05 5.5 3.5

Tiempo
30 min. 60 min. 20 min. 60 min. 1a2h 6a8h

Cf

Observacin

64 MEZA, Julio UIS (1979)

Almidn de banano

41

MENDEZ, Jairo. Unal (1979)

Banano verde

Pulpa + Cscara

100g/L Relacin Lquido/Slido = 8.6 40.6 g/L Relacin Almidn/Malta = 1.27 130 g/L Relacin Lquido/Slido = 6.66 40.6 g/L Relacin Almidn/Malta = 2.5 147.3 g/L 150.1 g/L 2 g de malta/100g de muestra

BOTERO, Amed Unal (1993)

Banano verde

Harina

70 60 15 atm 121 15 psi

6 a 6.5 4.3 1a2 1a2

1.5 h 70 h 2h 15 min.

68.4 g/L 227g de harina = 133 g de almidn 0.75 g de enzima/kg de sustrato

46

PALACIO, Jorge UdeA (1982) 42 MORALES, Juan UdeA (1993)

Banano maduro Banano maduro

Pulpa + Cscara Pulpa + Cscara

Cf = Concentracin final de glucosa Cteo = Concentracin terica de glucosa

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Segn la bibliografa, la mayora trabaja la hidrlisis cida, debido a: Los buenos resultados que ha tenido esta hidrlisis en trabajos anteriores (bsqueda bibliogrfica). Los productos de reaccin, azcares, no inhiben el curso de sta, tal como ocurre en la hidrlisis enzimtica. Costo econmico relativamente bajo. Mayor velocidad que la hidrlisis enzimtica. No son necesarios pretratamientos costosos.

Aunque hay que tener en cuenta ciertos inconvenientes con esta hidrlisis al momento de realizarla tales como: La corrosin, debido al empleo de cidos a temperaturas elevadas. La necesidad de recuperar el cido para que el proceso resulte ms econmico. Se puede presentar una eventual degradacin de los azcares. Al operar a altas temperaturas se debe sobrepresionar el sistema para que contine en fase lquida. [Botero, et. al. 1993]. Es necesario neutralizar la solucin de azcares antes de la fermentacin. Es necesaria gran cantidad de energa para alcanzar las temperaturas adecuadas.

Comparacin de la hidrlisis cida y enzimtica La hidrlisis enzimtica tiene como desventaja que la conversin es relativamente incompleta ya que la dextrina residual y los almidones estn siempre presentes. Por medio de la va qumica, ms especficamente por hidrlisis cida, es posible alcanzar una conversin completa y una masa estril que no requiere control. [Valencia, et.al. 1987]. Se recomienda en la hidrlisis cida utilizar cido sulfrico por ser un reactivo menos corrosivo que el cido clorhdrico y adems por ser ms fcil y favorable su consecucin.

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1.3. FERMENTACIN Los procesos de produccin de alcohol pueden ser realizados por sntesis qumica o biolgica. La produccin por sntesis qumica se basa en la oxidacin del etileno bajo condiciones drsticas de presin y temperatura. La produccin de alcohol por va biolgica se ha utilizado desde hace miles de aos, entre los microorganismos productores de etanol se encuentran las levaduras.

FIGURA 8. Fermentadores Industriales La fermentacin es la transformacin de una sustancia orgnica en otra utilizable, es producida por microorganismos o enzimas que provocan reacciones de oxidacinreduccin, de las cuales el organismo productor deriva la energa suficiente para su metabolismo. Desde un punto de vista prctico las fermentaciones tienen su inters por el producto o productos finales que de ellas se derivan. Las fermentaciones pueden ser anaerbicas o aerbicas. Las fermentaciones ms comunes en la industria alimentaria son la del azcar, con formacin de alcohol etlico (producida por microorganismos tales como: las levaduras, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ovarum y en la actualidad se investiga la alta eficiencia de conversin de azucares en alcohol mostrada por la bacteria Zymomonas mobilis) en la elaboracin del vino y del pan; la del alcohol, con formacin de cido actico, en la elaboracin del vinagre (producida por el Acetobacter aceti, un tipo de bacterias capaces de producir cido actico por oxidacin de soluciones alcohlicas sobre
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las que viven), y la fermentacin lctica, en la obtencin de quesos y yogures. Las fermentaciones tienen gran importancia econmica. Su utilizacin por el hombre tiene races milenarias. En la actualidad la industria fermentativa se vale de tanques de fermentacin, en los que se realiza en condiciones controladas de temperatura (entre 27 a 35 0C), presin, pH (entre 4 y 5), concentracin de azcares (inferior al 22%) y concentracin de etanol (inferior al 14%) que permiten regular constantemente la entrada y salida de productos.

1.4. MICROORGANISMO El organismo escogido para trabajar la fermentacin alcohlica es la Zymomonas mobilis, debido a que se ha demostrado que en comparacin con las levaduras tradicionalmente utilizadas para la produccin de etanol, presenta rendimientos y velocidades de produccin de etanol superiores.

FIGURA 9. Zymomonas mobilis vista al microscopio. Ms informacin [Laplace 91, Doelle 90, Favela 93, Schgerl, K 2000]

1.4.1 Antecedentes Histricos Desde que fue aislada en 1912, la Zymomonas mobilis ha sido objeto de numerosos estudios, pero su eficiencia para la produccin de alcohol es conocida desde 1931, gracias a los estudios de Kluyver, Hoppenbrouwers. En 1934, Screder demostr que cuando la Zymomonas mobilis era cultivada en presencia de glucosa, 98% del sustrato era transformado en etanol y CO 2. A principios de los 50`s Gibbs y DeMoss demostraron que la bacteria metabolizaba su sustrato glucosa por la va Entner-Doudoroff (E-D). En los aos 60`s la bacteria fue utilizada a escala industrial para
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la produccin de pulque (bebida alcohlica mexicana), tambin se ha utilizado en procesos de produccin de etanol a nivel de laboratorio en pases como Australia, India, Japn, Estados Unidos y Canad. Algunos de estos procesos se encuentran patentados bajo el nombre de Sucrotech (US Patent 4797360) y Glucotech. [Doelle, 1990]

FIGURA 10. Zymomonas mobilis vista al microscopio II. La Zymomonas forman parte de la microbiota que est presente en el material de reserva de algunos vegetales tropicales. Algunas bacterias de este gnero se han aislado como contaminantes durante la produccin de cidra y cerveza.

1.4.2 Taxonoma Debido a su morfologa, y al hecho de metabolizar su sustrato por la va (E-D), la bacteria a sido clasificada dentro de la familia de las Pseudomonadaceae. Utilizando criterios taxonmicos, Swings y deLey propusieron una clasificacin que reagrupa a todas las cepas de Zymomonas en una especie (Zymomonas mobilis) y dos subespecies: Zymomonas mobilis mobilis y Zymomonas mobilis pomaceae. La mayora de las cepas pertenece a la subespecie mobilis. En la Tabla 7 se resume algunas caractersticas fenotipicas del genero Zymomonas

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TABLA 7. Caractersticas fenotipicas del genero Zymomonas.

1. Bastn gramnegativo de 1 a 1.4 m de ancho y de 2 a 6m de largo.

2. Inmvil o mvil debido a la presencia de 1 a 4 flagelos loftricos. 3. Arreglo celular pleomrfico (cadenas, rosetas, filamentos). 4. Ausencia de esporas, de cpsulas y de constituyentes de almacenamiento celular. 5. Catalasa positiva y Oxidasa negativa. 6. Anaerbico y microaeroflico. 7. La utilizacin de sacarosa es inducible y puede ir acompaada de formacin de levanas. 8. Las nicas fuentes de carbono que metaboliza son: Glucosa, Fructosa y Sacarosa. 9. Contenido de G + C de 47.5 a 49.5%.
10. Talla de gnoma 1.5 x 109 kdaltones, aproximadamente 1500 cistrones.

11. Bastn recto con borde redondeado u ovide encontrndose individualmente o en pares. 12. Gelatinasa negativa. La Zymomonas mobilis es una bacteria quimiorgantrofa, que presenta auxotrofa por el pantotenato de calcio, y la biotina. Cuando es cultivada en una mol de glucosa y fructosa, produce dos mol de etanol, dos moles de CO2 y algo de cido lctico. [Bergeys, 1984] El nitrgeno necesario para el crecimiento puede proporcionrsele por medio de sales minerales, aminocidos o peptidos. El azufre, magnesio y potasio son proporcionados en forma de sales. Los oligoelementos necesarios al metabolismo de la bacteria se encuentran en estado de trazas en las sales utilizadas para la preparacin del medio del cultivo. Los nitritos y nitratos no son asimilados por la bacteria. [Sreekumar, 1995] 1.4.3 Catabolismo Metabliza su sustrato por la va (E-D) En la Figura 11. Se muestra como la Zymomonas mobilis sintetiza la sacarosa, fructosa y glucosa por la ruta Entner-Doudoroff.
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FIGURA 11.Metabolismo de sacarosa, glucosa y fructosa en la Zymomonas mobilis [Glazer,et. al.,1995]

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Desde el punto de vista energtico ha sido considerada ineficiente para producir biomasa, ya que una sola molcula de ATP (Adenosin Tri-Fosfato) es producida por cada molcula de monosacrido metabolizada. Sin embargo, si se considera la produccin de etanol, es claro que la bacteria representa un sistema biolgico muy eficaz, debido a que posee tasas catablicas elevadas, utilizacin simultnea de glucosa y fructosa, tolerancia a altas concentraciones de etanol y de azcares, formacin de diferentes subproductos en funcin del tipo de sustrato carbonado utilizado, conversin elevada del sustrato en etanol y en CO2. En general: 1 mol Glucosa (1.58 1.93) moles Etanol + (1.7 1.9) moles CO2 + (0.02 0.2) moles Lactato + (0.011) moles Material celular Tambin se forman pequeas cantidades de acetaldehido, acetilmetilcarbinol y glicerina. El mecanismo aerbico parece estar limitado a la oxidacin en cido actico. [Bergey`s,1984]

Metabolismo de Glucosa La glucosa entra a la clula por medio de un mecanismo estereoespecfico de baja afinidad y alta velocidad de difusin facilitado por un sistema de transporte. La ruta E-D produce dos moles de NADH por cada mol de glucosa consumida. Las dos moles de piruvato producida por cada mol de glucosa son convertidas a dos moles de acetaldehdo. La reduccin de acetaldehido a etanol, la cual es catalizada por alcohol deshidrogenasa, estequeomtricamente regenera NAD+ (Nicotinamida, intermediario energtico de la cadena respiratoria, junto con NADH). [Glazer,et. al.,1995]

Metabolismo de Fructosa

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Zymomonas mobilis toma fructosa como glucosa por un sistema constitutivo de transporte por difusin facilitada. Cuando la glucosa es la fuente de carbono, la prdida de carbono por la formacin de producto es insignificante. Cuando la fructosa es la fuente de carbono el resultado es muy diferente. Experimentos usando la misma especie de Zymomonas, bajo condiciones similares de fermentacin batch muestra que la produccin de etanol a partir de glucosa es del 95% del terico y de fructosa nicamente del 90%. La produccin celular tambin disminuye, mostrando que el decrecimiento en la produccin de etanol no refleja una mayor utilizacin de la fructosa para el crecimiento celular. La mayor cantidad de productos de fermentacin batch a partir de fructosa con concentracin del 15% son en (g/L): Etanol 45, Dihidroxiacetona 4, Manitol 2.5, Glicerol 1.7. Sin embargo se sabe que la dihidroxiacetona y el acetaldehdo inhiben el crecimiento celular. [Glazer,et. al.,1995]

Metabolismo de Sacarosa Zymomonas mobilis produce la enzima Levansucrasa, la cual hidroliza sacarosa a glucosa y fructosa. Esta enzima ha sido detectada en los cultivos y en el interior de las clulas. En adicin a su actividad hidroltica la Levansucrasa posee actividad transfructosilante que permite la formacin de polmeros azucarados de alto peso molecular (>107 Dalton) llamados levanas, cuando Zymomonas mobilis crece en sacarosa. Adems tambin se forman cantidades de fructoligosacridos de bajo peso molecular. La formacin de levanas y oligmeros compite con la fermentacin de fructosa a etanol. Afortunadamente la formacin de levanas es ampliamente disminuida a altas temperaturas (37 C). [Glazer,et. al,1995] A partir de sacarosa la formacin de levanas y sorbitol provoca una disminucin de hasta un 20% en el rendimiento de produccin de etanol en comparacin con el obtenido con glucosa. [Favela, 1993]; aunque se ha encontrado que a partir de jugo de pia utilizando una especie de Zymomonas mobilis dada, el rendimiento de etanol fue de un 92.4% del

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terico y la productividad es de 2.81% (g/L h) utilizando como fuente de carbono la sacarosa presente en el jugo correspondiente a 125 (g/L). [Tanaka, 1999] Las especies mutantes y sus padres tienen similares velocidades de hidrlisis a partir de sacarosa pero las velocidades de produccin de levanas son ms altas para las mutantes. En la fermentacin de sacarosa, las mutantes exhiben una velocidad especfica de crecimiento suavizada comparada con la de sus padres (0.07 comparada con 0.1 h 1), sin embargo no es una diferencia altamente significante. [Ananthalakshmy, 1999]

Formacin de Sorbitol El Sorbitol es otro producto secundario que disminuye la produccin de etanol cuando la Zymomonas fermenta sacarosa en vez de glucosa como fuente de carbono. Este es el producto de una abundante enzima citoslica, glucosa-fructosa oxidoreductasa, la cual convierte glucosa a sorbitol usando glucosa como reductor. Cuando una mezcla de fructosa y glucosa es adicionada al medio de fermentacin, o cuando aparece en el medio como resultado de la hidrlisis de sacarosa, la Zymomonas mobilis convierte como mucho un 11% de las fuentes iniciales de carbono a sorbitol, la cual no puede ser usada como una fuente de carbono y simplemente es acumulada en el medio. [Glazer,et. al.,1995]

Estructura de la pared celular La pared celular de la Zymomonas mobilis es caracterstica de las bacterias gramnegativas, esta comprende una membrana externa, una membrana interna y la murena. La proporcin de cidos grasos insaturados es elevada; tambin se ha demostrado la presencia de hopanoides, cuya estructura es muy similar a la de los esteroles.

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Aspectos genticos Con el objetivo de aumentar el nmero de azcares fermentables por la bacteria, muchos grupos de investigacin se han dedicado a la bsqueda de vectores de clonacin. Se ha sugerido que el gene que codifica para una de las dos alcoholdeshidrogenasas se encuentra a nivel plasmdico. Se ha encontrado que las especies madres siempre forman clulas elongadas (clulas anguila), que a altas temperaturas resultan en un obstculo para el fermentador; pero las especies mutantes son pequeos bastones que mantienen una alta eficiencia y viabilidad. [Sreekumar, 1999]

1.4.4

Efectos de ciertos parmetros fisicoqumicos sobre el crecimiento y la

produccin de etanol por Z. mobilis

Efecto del sustrato

Algunas cepas de Z. Mobilis pueden crecer en medios con concentraciones muy elevadas de azcares. La mayora de las cepas crecen en presencia de 200 g/L de glucosa. La produccin de 85 g/L de etanol a partir de 460 g/L de sacarosa fue reportada [Favela,1993]. El aumento de la concentracin inicial de azcares tiene un efecto mas importante sobre los parmetros relacionados con el crecimiento que sobre aquellos relacionados con la produccin de alcohol. La Z. Mobilis tiene alta osmotolerancia a la glucosa, pero baja tolerancia a la sal. Ninguna especie puede crecer en NaCl al 2%, sin embargo muchas levaduras pueden tolerar altas concentraciones de sal.

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Un estudio para la optimizacin de los componentes del medio para la produccin de etanol usando Zymomonas mobilis [Sreekumar, 1999] muestra que: La biomasa producida muestra una tendencia parablica a concentraciones de glucosa crecientes, el crecimiento de biomasa ocurre nicamente cuando niveles apropiados de extracto de levadura estn presentes, por otra parte los altos niveles de fuente de carbono no producen una fraccin constante de la biomasa esperada. El extracto de levadura requerido para la mxima utilizacin de la glucosa fue absolutamente evidente, as que muy altas concentraciones de azcar conducen siempre a altos niveles de azcar no utilizados, sin tener en cuenta la concentracin de extracto de levadura. Sin embargo, a bajas concentraciones de azcar en el medio, el extracto de levadura muestra una fuerte interaccin en la utilizacin de la fuente de carbono. Un incremento en la concentracin de sulfato de amonio ((NH 4)2SO4, componente del medio de cultivo) genera un incremento en la produccin de etanol. Unicamente los niveles ptimos de glucosa y extracto de levadura dan el mximo rendimiento. El extracto de levadura y la concentracin del inculo contribuyen a aumentar la produccin de etanol, pero este rendimiento es comparativamente menor que el de extracto de levadura y glucosa juntos. No se observan variaciones significantes con la fuente de fosfato (KH2PO4) y nitrgeno ((NH4)2SO4), resultando en un insignificante papel para el fosfato y comparativamente menos apreciable para el sulfato de amonio, ya que las clulas pueden utilizar el nitrgeno disponible del extracto de levadura. El exceso de nitrgeno podra conducir a mayor concentracin de biomasa pero menor produccin de etanol. En principio se encontr que en vez del sulfato de amonio en el medio de cultivo se observa que la rea (0.5 (g/L)) fue un mejor componente de este, ya que conduce a mejores rendimientos en la produccin de etanol. [Sreekumar, 1995]
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El pantotenato de calcio se encontr como una vitamina esencial para la produccin de etanol, aunque es muchas veces reemplazado por extracto de levadura o peptona (5 g/L). [Sreekumar, 1995]

Efecto de la Temperatura

Aunque la Zymomonas mobilis es capaz de crecer en un intervalo de temperaturas de 25 a 40 oC, su temperatura ptima de crecimiento se sita entre 30 y 35 oC. A temperaturas superiores a 30 oC, los rendimientos en etanol y en biomasa se ven afectados, ms que los parmetros especficos. A altas temperaturas la concentracin de fosfolpidos en Zymomonas mobilis disminuye, lo que causa la prdida de integridad de la membrana celular; tambin la fluidez disminuye proporcionalmente a la concentracin de cidos grasos insaturados. El aumento de temperatura induce a la acumulacin del etanol en el interior de las clulas, lo que amplifica su efecto inhibidor. Durante el cultivo de Zymomonas mobilis a 40 oC, la adicin de Mg2+ al medio de cultivo mejora en un 100 % el rendimiento de produccin de etanol. [Favela,1993] Se sugiere el uso de especies mutantes de Zymomonas mobilis que sean termotolerantes, ya que las altas temperaturas de fermentacin podran reducir significativamente los costos de destilacin y enfriamiento, especialmente en los pases tropicales. [Sreekumar, 1999]

Efecto del Etanol

El inters de producir el etanol a concentraciones elevadas ha provocado muchos estudios sobre el efecto inhibidor de este sobre los microorganismos que lo producen. El etanol tiene un efecto muy importante sobre la composicin de la membrana celular. Estudios realizados sobre el efecto del etanol adicionado al medio de cultivo y del producido por Zymomonas mobilis mostraron que en ambos casos, su efecto inhibidor es
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ms importante sobre el crecimiento que sobre su produccin [Favela,1993], mientras que el efecto de inhibicin se hace ms intenso cuando hay un ascenso en la concentracin de etanol. [Daugulius, et.al.1997] Los resultados obtenidos sobre el efecto inhibidor del etanol adicionado al medio de cultivo no deben tomarse en cuenta de una manera cuantitativa, pues no se considera ni la adaptacin progresiva de las clulas al etanol producido ni el choque al que son sometidas las clulas al adicionar el etanol. [Favela,1993]

Efecto del pH

La Zymomonas mobilis puede crecer en una amplia gama de valores de pH (3.0 a 7.0). Tradicionalmente, valores de pH de 5.0 a 6.5 se han usado para estudiar el metabolismo de Zymomonas mobilis, pero el hecho de que la bacteria pueda crecer a pH inferiores a 5.0 la hacen interesante desde el punto de vista biotecnolgico. En efecto, los riesgos de contaminacin pueden ser reducidos considerablemente. [Favela,1993] El uso de un fermentador de pH controlado podra reducir significativamente el periodo de fermentacin a 16 o 20 horas (De un tiempo total de 60 horas aprox.). [Sreekumar, 1999]

Efecto del Oxgeno

Aunque Zymomonas mobilis puede crecer en aerobiosis, el oxgeno tiene un efecto negativo sobre la produccin de alcohol. Este induce la formacin de subproductos de la fermentacin (acetato, acetaldehido y lactato). Aparentemente el efecto inhibidor del oxgeno est ligado a la concentracin de sustrato. Para concentraciones de sustrato bajas el crecimiento y el rendimiento en biomasa son independientes de la presencia de oxgeno. Por el contrario, en presencia de concentraciones elevadas en azcares, los parmetros relacionados con el crecimiento disminuyen en presencia de oxgeno. [Favela,1993]

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Otros efectos

[McLellan,et al.,1999] Encontraron experimentalmente un cambio peridico en la morfologa, especficamente la formacin de clulas filiformes; esta variacin fue valorada en una escala de uno a diez para la que 1 corresponde a clulas diminutas, 3 a clulas de longitud normal y 10 a poblaciones de clulas extremadamente elongadas (5 a 20 veces de la longitud normal para la forma unicelular). Los resultados morfolgicos son importantes por dos razones: Provee un soporte adicional experimental para la hiptesis de que la inhibicin

es causada por una respuesta retrasada al STRESS en el medio, la cual en algunos casos es la velocidad de cambio positiva en la concentracin de etanol. Indica la naturaleza fisiolgica de la respuesta, es decir la formacin de clulas filamentosas o elongadas en respuesta a medios de estrs. La Tabla 8 reporta los parmetros cinticos para la Zymomonas mobilis en condiciones anaerbicas. TABLA 8. Parmetros cinticos en condiciones anaerbicas para la Zymomonas mobilis Parmetro de modelo max (h-1) Yx/s (g.g-1) Yp/s (g.g-1) Qp (g.g-1.h-1) Donde: Laplace,1991 0.34 0.03 0.36 1.85

max: Velocidad especifica de crecimiento mximo. Yx/s: Rendimiento de produccin de biomasa. (g clulas producidas/g sustrato usado). Yp/s: Rendimiento de produccin de etanol. (g etanol producido/g sustrato usado). Qp: Promedio de la productividad especifica del etanol. (g etanol/g clula por h)
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1.5 ASPECTOS TECNOLGICOS DE LA PRODUCCIN DE ETANOL POR Zymomonas mobilis La Zymomonas mobilis es un organismo que: Exhibe altas velocidades metablicas. Reduce tiempos de fermentacin. Prcticamente elimina problemas de infeccin. No requiere esterilizacin de medios o sustratos. Exhibe una baja masa celular, as hay menor generacin de calor. Elimina inoculaciones repetidas, reciclando o centrifugando. Mejora la productividad de etanol por unidad de alimento. presentan una eficiencia de conversin entre un 96-98% de

Estudios realizados

biomasa, y una concentracin de etanol del 12% (v/v). [Doelle, 1990]. Conocer la cantidad de biomasa en un sistema y su comportamiento en el tiempo es fundamental en cualquier trabajo de biotecnologa. Esta variable puede ser tomada como parmetro de control en el fermentador, ms an, teniendo en cuenta que su tasa de crecimiento depende del tipo de microorganismo, la edad del cultivo, el medio de crecimiento, y parmetros fisicoqumicos tales como, temperatura, pH, oxgeno disuelto, entre otros. En forma general, se puede definir la tasa de crecimiento como el incremento de la biomasa con el tiempo. El problema bsico de su medida est en la seleccin de un parmetro disponible que sea proporcional a la cantidad de biomasa. Tradicionalmente el crecimiento se mide mediante la turbidez como parmetro de poblacin promedio, el cual es proporcional al peso seco. Las propiedades de una poblacin microbiana, representan valores medios sobre la poblacin. Estas propiedades son distribuidas de acuerdo al microorganismo como ente individual, a su estado en el ciclo celular, al igual que a su metabolismo y proceso de crecimiento. Slo bajo condiciones apropiadas, se consigue una curva con este tipo de distribucin.
34

Dentro de las tcnicas disponibles para medir la tasa de crecimiento figuran las tcnicas de enumeracin, o mtodos que pueden ser evaluados por compatibilidad con la bioqumica, metabolismo y ciclo celular del microorganismo de inters. Adems las caractersticas del microorganismo requeridas para la produccin a gran escala de alcohol son: Capacidad de metabolizar varios sustratos. Tasas de crecimiento y de produccin de etanol elevadas. Mxima eficiencia para la conversin del sustrato. Tolerancia a altas concentraciones de sustrato y de etanol. Tolerancia a altas temperaturas.

Esta informacin fue obtenida de [Favela, 1993]; para una mayor informacin de la Z. mobilis referirse a [Bergey`s,1984; Etanol cap. 11; Kondo, 1996; Laplace,1991; Doelle, 1990], ms artculos publicados en la Web.

1.5.1 MEDIO DE CULTIVO Las exigencias nutricionales de un microorganismo se derivan preferentemente de las sustancias que intervienen en las sntesis de la clula. Los sustratos se eligen de acuerdo con las necesidades recogidas en la bibliografa como correspondientes a cada especie o los microorganismos afines. Por lo general se recurre a la siguiente combinacin bsica de medios nutricionales: Fuente de N inorgnico para microorganismos autotrfos y N orgnico para aquellos que son heterotrfos. La energa consumida en la sntesis intracelular de protena depende de la estructura de las protenas extracelulares. Segn esto, el consumo de energa es mnimo si se aportan aminocidos directamente. Las fuentes de N ms importantes son: peptonas, polipptidos, aminocido y soluciones nutricias naturales (agua de levadura, jugo de cerveza). Fuente de C (glucosa, sacarosa y fructosa).
35

Sales minerales, poseen con frecuencia una accin especfica sobre el metabolismo de los microorganismos. As, el azufre, magnesio y fsforo son necesarios para la sntesis de sustancias proticas, mientras que el potasio es necesario para la constitucin del protoplasma. Vitaminas, actan estimulando el crecimiento, y son menos efectivas como fuente de energa. En particular deben mencionarse aqu aquellas vitaminas que desarrollan la funcin de coenzima. Ejemplos son: La riboflavina, cido nicotnico, tiamina, nicotinamida, cido pantotnico, piridoxina, biotina y complejo B12.

Las exigencias nutricias cuantitativas de los diversos microorganismos son diferentes y dependen de: La composicin global del sustrato. La proporcin carbono/nitrgeno. El espectro enzimtico de la especie. La clase y proporcin de sustancias estimulantes y del crecimiento y de factores rectores fisiolgicos. [Kunz,1986] En la Tabla 9, se reportan los medios de mantenimiento, crecimiento y fermentacin para la Zymomonas mobilis.

36

TABLA 9. Medios tenimientoiimiento,ferm n de man ,crec entac para

GLUCOSA (g/L) Daugulis, 1999 Chen, 1991 Sreekumar, 1999 Tanaka, 1999 Sreekumar, 1995 Ananthalakshmy, 1999 Hobley, 1994 Stanley, 1997 M.m F. 100 100 120.4 125 (sacarosa) 100-300 20 150 (sacarosa) 100 100 EXTRACTO DE LEVADURA (g/L) 19 5 6.5 10 5 10 10 5 5 (NH)4SO4 (g/L) 1.9 1 0.96 1 1 0 0 1.5 0

Z.mob ilis.
KH2PO4 (g/L) 1.9 2.5 0.02 1 2 2 2 5 0 MgSO4.7H2O (g/L) 0.95 0.5 0.5 0.5 0.5 0 0 1 0 pH 5 4.6 - 5 5.5 5.5 5.5 6 6 6 5.2 T(0C) OBSERVACIONES 30 32 30 30 30 30 30 30 30 T. C:18 h T.C: 18 h Ag. 100 rpm T.C: 16 -24 h C.c: Log 10 8.4 T.C: 18 h Ag. 200 rpm T.f: 72 h C.c: 0.01 (g/L)

Kondo, 1996

M.m C.

100 120

3 3

0 0

0 0

0 0

6.5 6.5

30 30

A.g: 200 rpm C.c:1.6x109 (cel/ml) Inyeccin de N2 Enriquecido con triptona, 10 (g/L) y NaCl, 9 (g/L) A.g 100 rpm Inyeccin de N2 T.C: 48 h A.g: 100 rpm T.f: 24 h Enriquecido con polipeptona, 2 (g/L) y glicerol, 3 (g/L) Enriquecido con triptona, 10 (g/L),MgSO4, 8 (g/L) y Solucin salina, 100 ml T.f: 16 h

Thordsen, 1993 Kim, 1992 Carey, 1983

100 100 10

5 2.5 5

1 1 0

0 0 5

1 1 0

5 5

30 30 30

Hellendoorn, 1999

M.m 10 C. 100 Abreviaturas: M.m: Medio de mantenimiento

5 10

0 0 1 1 T.C: Tiempo de crecimiento 37

2 0.5

6.8 4 6.8 30 C.c: Concentracin celular

C: Medio de crecimiento F: Medio de fermentacin

T.f : Tiempo de fermentacin Ag: Agitacin

38

1.5.2 Ventajas y desventajas de la fermentacin Batch y Continua utilizando Zymomonas mobilis

Fermentacin Batch utilizando Zymomonas mobilis Generalmente los carbohidratos polimericos son prehidrolizados con enzimas apropiadas y el hidrolizado es usado para la fermentacin tanto en Batch como en continuo. La mezcla de cultivos de diferentes especies etanologenicas (productoras de etanol) puede ser usada en la fermentacin para obtener una productividad mejorada. La fermentacin Batch es un proceso el cual se puede realizar a escala de laboratorio con mayor facilidad en el control de las variables sin la necesidad de esperar a que se llegue a un estado de equilibrio (lo contrario a lo que ocurre en una fermentacin continua). El desarrollo de sistemas para una rpida fermentacin batch conlleva dos problemas, la baja concentracin celular y el efecto inhibitorio del etanol. Estos inconvenientes haran totalmente antieconmicos dichos procesos. [Chen, 1991]

Fermentacin Continua utilizando Zymomonas mobilis Una desventaja asociada con la fermentacin continua de Zymomonas mobilis es la incidencia de un comportamiento oscilatorio en el cual biomasa, producto y sustrato ciclan bajo ciertas condiciones. [McLellan,et al. 1999] La productividad de etanol decrece por periodos de tiempo durante oscilaciones, conduciendo a altos niveles de sustrato residual (que se traducen en perdidas en la produccin). Los resultados reportados por McLellan, et.al, confirman la incidencia del comportamiento oscilatorio a concentraciones combinadas del sustrato y bajas velocidades de dilucin.

39

Las clulas de Zymomonas mobilis son incapaces de responder instantneamente a cambios en su medio, se ha postulado que existe un retraso en el tiempo en que la clula experimenta un cambio y el de su repuesta metablica.

1.6 ALCOHOL ETLICO

1.6.1 Generalidades Desde la antigedad se conocan las bebidas alcohlicas, y as lo consignan escritos antiguos, la primera noticia que se tiene de la existencia de alcohol data del siglo XII; Nicols Teodoro De Saussure (1808) obtuvo alcohol completamente libre de agua y en 1845 Berthelot lo obtuvo por sntesis. El alcohol etlico (C2H5OH) es un compuesto ternario de carbono (52.15%), oxgeno (34.73%), hidrogeno (13.12%). Funde a 117.3 0C y su punto de ebullicin es de 78.35 0C a 760 mm Hg. A 15 0C tiene una densidad relativa de 0.7943. Es un lquido incoloro de olor aromtico, reaccin neutra, sabor ardiente y altamente higroscpico.

1.6.2 Aplicaciones del alcohol etlico Sus aplicaciones son innumerables y van desde las bebidas fermentadas para consumo humano, hasta su utilizacin industrial como solvente o materia prima para la elaboracin de otros productos qumicos. El alcohol se utiliza para producir bebidas fermentadas tales como: vinos, aguardiente, vodka, ron, brandy, etc. Como solvente se utiliza en gran cantidad de procesos por ejemplo: disolucin de la nitrocelulosa, disolvente de colorantes en las industrias alimenticias y textil; disolvente de: resinas; jabn, aceites, ceras, etc.; por oxidacin en la fabricacin de cido actico, vinagre, acetaldehdo. En la Figura 11 se muestra el ciclo de transformacin del bioetanol a CO 2 cuando es utilizado como combustible.

40

FIGURA 12. Ciclo del gas Carbnico producido por el Bioetanol. El alcohol etlico se puede mezclar con la gasolina, para mejorarle ciertas propiedades como carburante. Se recomienda una mezcla en proporcin del 10 al 25%, ya que se logra un ndice de octano entre 70 y 75, mayor que el de la gasolina. Las mezclas de alcohol gasolina permiten aumentar la compresin en el motor, dan un funcionamiento ms regular, su recalentamiento es menor y por tanto se puede utilizar a un mayor nmero de revoluciones. [Mendez,1979]

1.6.3 Formas comerciales de etanol El alcohol etlico se presenta en el mercado bajo las siguientes formas: Alcohol Neutro: (96-97 0GL) este alcohol se utiliza en la preparacin de licores y vinos de baja graduacin, en clinicas y hospitales. Alcoholes Desnaturalizados: (90 0GL) son aquellos en los cuales se ha mezclado el etanol con alguna sustancia extraa que lo hace impropio para el consumo humano. Se emplean en usos industriales como fabricacin de cloruro de etilo, sustancias colorantes, etc. Alcohol Deshidratado, Absoluto o Carburante: (99.6-99.8 0GL), utilizado en laboratorios y en mayor escala como carburante, mezclado con la gasolina.

41

Alcohol Slido: utilizado por comodidad para reemplazar el alcohol combustible en los viajes (en forma de pastillas). [Mendez,1979; Pereira,1986; Glazer,1995].

1.7

PROCESO

FERMENTATIVO

PARA

LA

PRODUCIN

DE

ALCOHOL.

PARAMETROS QUE SE DEBEN TENER EN CUENTA.

1.7.1 Descripcin del proceso general partiendo de una fuente de carbono, en este caso el hidrolizado.

Pretratamiento de Materia Prima El pretratamiento tiene como objetivo transformar la biomasa utilizada cuando esta es poco asequible a la transformacin o a la hidrlisis. El tratamiento previo en el caso del banano verde se lleva a cabo en las siguientes etapas.

Cortado Se realiza en forma longitudinal, en pedazos de espesor pequeo, para que haya mayor rea de contacto para el secado en horno.

Secado Se debe alcanzar un bajo porcentaje de humedad para disminuir la posibilidad de ataque de microorganismos, esto se hace no a muy altas temperaturas para evitar la degradacin (caramelizacin) del sustrato.

42

Molienda Con el propsito de adecuar la partcula para permitir una mayor superficie de reaccin y disminuir el tamao de las fibras, se puede hacer en una picadora o en un molino de atriccin de disco domstico.

Reaccin (Hidrlisis cida) Un intervalo de pH recomendado para hidrlisis cida con cido sulfrico es de 1.0 a 2.0. Un pH de 3.0 garantiza que a medida que avanza la reaccin el pH se mantenga dentro de los lmites encontrados debido a que por efecto de la evaporacin del agua la concentracin del cido puede ir aumentando. Se realiza a una temperatura de 90 OC en un bao Mara.

Fermentacin Para este caso, el jugo o pur diluido (harina de banano ya hidrolizada) se filtra, se le adicionan los micronutrientes (sulfato de amonio y de magnesio, extracto de levadura, fosfato de potasio) y se ajusta el pH; este sustrato se esteriliza y luego se inocula con Zymomonas mobilis, en una cantidad conocida de microorganismo. La Zymomonas mobilis es capaz de transformar los azucares en este caso glucosa en etanol. Para un proceso en fermentacin batch con este microorganismo se deben controlar parmetros tales como pH (5.0 6.0, preferiblemente 5.5), Temperatura (30 0C) , concentracin de etanol y concentracin de azucares.

1.7.2 Revisin bibliogrfica sobre la produccin de alcohol

El consumo de glucosa en un tiempo de 18 horas por parte de la Zymomonas mobilis en cultivo puro utilizando 100 ml/L de inoculo a 300C indic que es mejor utilizar un medio con micronutrientes. [Laplace, et.al.1991].

43

S. cerevisiae y la Z. mobilis son dos microorganismos, usualmente usados para fermentar glucosa. Han obtenido mejor rendimiento y velocidades de conversin que muchos otros microorganismos tales como Pichia stipitis, Candida shehatae. [Laplace, et.al.1991].

La S. cerevisiae no se ve afectada apreciablemente por la velocidad de transferencia de oxgeno (VTO) probada en un intervalo de 0.0-3.5 (mmol / L h) bajo esas condiciones el intervalo de rendimiento de etanol va desde 0.41 a 0.45 g/g glucosa y la productividad especfica de etanol es de alrededor de 0.70 g/g glucosa h. [Laplace, et.al.1991].

La Z. mobilis da los ms altos rendimientos fermentativos bajo estrictas condiciones anaerobias (medio continuamente inyectado con nitrgeno): bajo esas condiciones el rendimiento de etanol fue de 0.43 g/g glucosa y la productividad especifica de etanol es en promedio 2.3 g/g glucosa.h. Concluyendo que la Z. mobilis posee un rendimiento mucho ms alto que el de la S. cerevisiae. [Laplace, et.al.1991].

A partir de jugo de pia la S. cerevisiae var. Sake tiene una produccin de etanol mxima de 89% de la produccin terica, la productividad fue de 1.44g/L.h, cuando se us S. cerevisiae CM1 la mxima produccin de etanol fue 2.22g/L.h y la produccin de etanol terica fue de 77%. Al comparar estos resultados con la produccin de etanol con Z. mobilis ATCC 10988, esta produjo del jugo de pia un 92.4% de la produccin de etanol terica y la productividad fue de 2.81 g/L.h [Tanaka, 1999].

La fermentacin Batch de hidrolizado de almidn de Cassava (Yuca) por clulas inmovilizadas Z. mobilis muestra una concentracin mxima de etanol de 59 g/L y una productividad de 3.57 g/L.h. La concentracin final obtenida con clulas libres fue de 66 g/L con una productividad de 2.75 g/L.h, se reporta que las clulas inmovilizadas son estables por siete ciclos (etapas completas de fermentacin). [Gunasekaran et.al, 2001]

Chay, et al. reportan que las mejores especies para la produccin de etanol de jugos sacarificados son las cepas de Z. mobilis y S.diastaticus. [Gunasekaran et.al, 2001]
44

Toran y Diaz et al. Investigaron el efecto de la hidrlisis cida y enzimtica de los sustratos en la produccin de etanol por Z. mobilis ZM4 y ZM4F, obteniendo una productividad de etanol de 4.8 g/g.h con Z. mobilis creciendo en jugo de alcachofa Jerusaln, el cual fue ms alto que el reportado para la levadura Kluyveromyces marxianus por Duvnjek et al., ellos observaron que el jugo de alcachofa Jerusaln fue fermentado sin la adicin de nutrientes. [Gunasekaran et.al, 2001]

Lawford et al. demostraron que el licor de maz es un sustrato barato para la produccin de etanol por Z. mobilis ZP4[Gunasekaran et.al, 2001]

Torres y Baratti, investigaron la fermentacin del almidn hidrolizado de cereales por Z. mobilis, reportaron que en una fermentacin Batch, concentraciones de azcar de 223g/L pueden ser fermentadas para producir 105g/L en 70 horas. El porcentaje terico de produccin fue del 92%.[Gunasekaran et.al, 2001]

Bring y Meyer, reportan que en una fermentacin continua usando un cultivo mixto de Z.mobilis y S.cerevisiae, se obtiene una produccin de 54.3 g/L de etanol despus de 3 das, con una productividad de 70.7 g/L.h, una concentracin final de 49.5 g/L y una produccin de 0.5 g de etanol/g de sustrato, lo que corresponde a una produccin terica de 98% y conversin del 99% del sustrato. [Gunasekaran et.al, 2001]

Una produccin continua de etanol del jugo de alcachofa Jerusaln, usando ZM4F de Z.mobilis fue estudiada por Allais et al. sus resultados muestran una productividad volumtrica de 67.2 g/L.h con una concentracin final de etanol de 42 g/L de 100 g/L de azcares iniciales[Gunasekaran et.al, 2001]

Doelle describe un proceso de produccin continua de etanol de un hidrolizado de almidn este proceso hace uso de la Z.mobilis en una fermentacin de una etapa, el autor dice que la calidad del hidrolizado de almidn no es crucial para que suceda la fermentacin, y reporta una eficiencia de conversin del 92%. [Gunasekaran et.al, 2001].

45

De estas referencias bibliogrficas se pueden sacar las mejores condiciones de temperatura, presin, pH para diferentes fermentaciones con Z. mobilis. Tambien se puede observar el trabajo de fermentacin por accin de Z. mobilis sobre diferentes sustratos reales (pia, alcachofa, licor de maz, etc).y su comportamiento hacia ellos con buenos rendimientos en la produccin de etanol. En la Tabla 10, se resumen algunas referencias sobre fermentacin alcohlica a partir de banano, utilizando como microorganismo la S. cerevisiae.

46

TABLA 10. Referencias bibliogrficas de diferentes fermentaciones alcohlicas a partir de banano. Ref 23 Materia Prima Banano maduro Pretratamiento Hidrlisis Microorganismo Pulpa Ninguna S.cerevisiae var.ellipsoideus Cantidad 5ml/100ml de sustrato Poblacin E10 T(oC) 33 pH 5.2 Tiempo Rf * 48h 85.8 Observaciones

41 42 46 64

Banano verde Banano maduro Banano maduro Banano verde

Pulpa + cascara Enzimtica (malta) Pulpa + cascara Pulpa + cascara Pulpa Acida (H2SO4) Acida (H2SO4) Acida (HCl) Enzimtica (malta) Almidn de banano Acida (HCl) Enzimtica (malta)

S.cerevisiae (levadura prensada) S.cerevisiae S.cerevisiae S.cerevisiae (levadura prensada) S.cerevisiae (levadura prensada) S.cerevisiae (levadura prensada) S.cerevisiae (levadura prensada)

2 g/L

25-30 30

3.5 3.54.5 3.54.5 5 4.5 4.75 4.5

2a3 das

Concentracin de etanol = 3.9%p/v Vol. Fermentacin = 2.5 litros Anaerobia 72 r.p.m. 83.0 5 g de malta/litro de muestra Anaerobio Recipiente oscuro Adicin de micronutrientes 81.8 Concentracin de azcar con evaporacin a 50oC 82.0 83.0 82.0

1g/100 ml 0.1g / g de azcar 0.1g / g de azcar 0.1g / g de azcar 0.1g / g de azcar

33-37 26 26 26 26

72 h 60 h 72 h 60 h

* Rf: Porcentaje del rendimiento terico.

47

2. DESARROLLO EXPERIMENTAL

2.1 DESCRIPCIN DEL PROCESO DE HIDRLISIS.

Cortado
Longitudinal

Secado
0-64 h 40 0C 64-76 h 60 0C

Molienda

Reaccin
H2SO4, pH 1-2 T= 90 0C P= 1 at t= 45 min

FIGURA 13. Diagrama de flujo. El banano utilizado, es del tipo banano Urab exportacin (rechazo), en su primera etapa de maduracin. El cual fue comprado en la plaza central Mayorista de Medelln Antioquia.
48

Los bananos se cortan en tajadas longitudinales, incluyendo cscara, luego se colocan en un horno de secado con circulacin de aire. Se deja a una temperatura de 40 OC durante 64 horas liberndose as gran parte de la humedad y evitando la caramelizacin. Entre las 64 y 76 horas se aumenta la temperatura a 60 OC dando como resultado un material con una humedad aproximada de 13%. Luego este material se muele (Lab. de micotoxinas, UNAL), obtenindose harina de granulometra de 1 mm de dimetro aproximadamente.

2.1.1

Caracterizacin de la materia prima.

En la caracterizacin de la materia prima, o sea la harina de banano verde, se determina el contenido de almidn, azcares reductores, azucares totales y porcentaje de humedad, con el fin de conocer las condiciones iniciales de trabajo.

Determinacin de Almidn de la Harina El mtodo utilizado para este anlisis es el propuesto por Marta Quicazn. (Ver Anexo 3). Para la harina de banano. El porcentaje reportado fue de 30% (base hmeda)

Determinacin de azcares reductores de la materia prima Se realizan dos ensayos con diferentes cantidades de harina y se hacen por triplicado, el ensayo 1 corresponde a la muestra 1,2 y 3; el ensayo 2 corresponde a la muestra 4,5 y 6. Los resultados se pueden apreciar en la Tabla 11. Para determinar azcares reductores se sigue el mtodo de Miller (Anexo 2).

49

TABLA 11. Azcares reductores contenidos en la materia prima Muestra 1 2 3 4 5 6 Absorbancia 0.295 0.270 0.275 0.283 0.278 0.287 Azcares Reductores (ppm) 283.6 258.6 263.6 271.6 266.6 275.6 % (g azcar/100 g muestra) 9.51 8.67 8.84 9.05 8.89 9.19

Determinacin de azcares totales Realizada segn el mtodo utilizado en el laboratorio de alimentos de la Universidad Nacional Sede Medelln. (Anexo 1). Los resultados se reportan en la Tabla 12. TABLA 12. Determinacin de azcares totales Volumen Final (ml) 66 69 Absorbancia 0.758 0.706 Azcares Reductores (ppm) 746.6 694.6 % (g azcar/ 100 g muestra) 8.2 8.0

Los azcares totales corresponden a una cantidad menor que los reductores iniciales, por lo que se piensa que el cido tuvo un efecto destructor sobre los azucares.

FIGURA 14. Jugo de banano diluido 2.1.2 Hidrlisis

50

Se trabajan tanto la hidrlisis cida como la enzimtica sustentado en lo reportado en la bibliografa y buscando la que presente los mejores resultados.

FIGURA 15. Centrifugacin del jugo de banano Hidrlisis cida Se realizan preensayos con dos reactivos: cido clorhdrico y cido sulfrico. En la

hidrlisis con cido clorhdrico se encuentra que el contenido de azcares luego de la hidrlisis es menor que el reportado para la harina sola, por lo cual se concluye que este tiene un efecto destructor de los azcares. Adems el cido clorhdrico es de mayor costo y ms difcil consecucin. En la hidrlisis con cido sulfrico se realiza una determinacin de las mejores condiciones de reaccin debido a las incongruencias presentadas en la bibliografa. Con la asesora del profesor Aicardo Prez (Universidad Nacional) el cual ha tenido experiencia en trabajos de hidrlisis anteriores, y por medio de varios ensayos a distintas condiciones se llega a establecer el siguiente mtodo: Se diluyen aproximadamente 6 g de harina de banano verde en 100 ml de agua destilada, se lica y se filtra, se toma una alcuota de 25 ml y se diluyen a 50 ml, de esta se toman cuatro alcuotas de 10 ml a las que se le adiciona cido sulfrico hasta obtener un pH entre 1 y 2, despus se llevan a un bao Mara a una temperatura de 90 oC y presin

51

atmosfrica. El jugo ya hidrolizado se lleva a un pH igual a 5.4 con NaOH. Los resultados de la hidrlisis cida con cido sulfrico se presentan en la Tabla 13.

FIGURA 16. Hidrlisis Acida del jugo de banano TABLA 13. Hidrlisis cida con cido sulfrico Muestra Tiempo Hidrlisis 1 2 3 4 (min.) 15 30 45 60 Vol. Final (ml) 50 54 62 68 0.521 0.754 0.716 0.634 Absorbancia Azcares red. (ppm) 509.6 742.6 704.6 622.6 % (g azcar/ 100 g harina inicial) 16.99 26.73 29.12 28.22

Luego de la hidrlisis se hace una determinacin del porcentaje de almidn que hay presente y para el hidrolizado de harina es de 2.78% (en la muestra 4); concluyendo de esta manera que se convierte un 93% de los almidones presentes inicialmente.

52

FIGURA 17. Jugo de banano hidrolizado Hidrlisis Enzimtica La enzima facilitada por Cervunin S.A, la cual es una enzima dextrizante de alto peso molecular (de 400 a 500 u.m.a.), no se conoce su caracterizacin debido a que hace parte del know-How de la empresa, al no conocer esta caracterizacin no sabemos cual es la verdadera potencialidad de hidrlisis, o sea hasta que punto llega a degradar los almidones, si realmente llega a glucosa o a otro producto diferente. Se sospecha que es -amilasa. Esta se agrega al sustrato en ebullicin o maceracin Se seleccionan como condiciones las recomendadas por Botero en su trabajo de hidrlisis enzimtica: Volumen de agua 867 ml y peso de harina 227 g (las cuales obtuvieron los mejores resultados para la obtencin de glucosa), [Botero, 1993]. Se prepara un jugo clarificado (47 g de harina + 200 ml de agua destilada); se procede a hacer la gelatinizacin en un bao Mara a 80 OC durante 5 minutos teniendo el jugo a un pH entre 6 y 6.5, despus de tener la suspensin gelatinizada se enfra hasta 70 OC, luego de la cual se le agrega una solucin preparada (agua destilada 20 ml + Enzima 0.015 g/g almidn). Se sacan 4 alicuotas de 50 ml, las cuales se colocan en el bao Mara a 70 OC. Al final de la experiencia se realiza anlisis de azucares reductores a distintos tiempos. Los resultados para esta hidrlisis se presentan en la Tabla 14.

53

TABLA 14. Hidrlisis Enzimtica Muestra 1 2 3 4 Tiempo (horas) 1 1.5 2 2.5 Porcentaje Azcares reductores % 8.46 9.12 12.09 10.81

Al analizar estos resultados se observa que no se presento hidrlisis de almidones, ya que los porcentajes corresponden a los porcentajes de azcares reductores de la muestra inicial. Por lo tanto se escoge la hidrlisis cida en vez de la enzimtica, por tener mejores resultados.

Seleccin del mtodo entre hidrlisis cida con cido sulfrico y enzimtica con y amilasa Se escoge la hidrlisis cida con cido sulfrico como el mejor mtodo de hidrlisis, debido a que: Se tiene a disposicin todos los equipos de laboratorio necesarios para realizar la hidrlisis cida.
-

Las enzimas necesarias para realizar la hidrlisis enzimticas ( y amilasa)son costosas y difciles de conseguir (deben ser importadas). El mtodo de la hidrlisis enzimtica es ms riguroso que el de hidrlisis cida, debido a las condiciones de asepsia, mantenimiento de la enzima a bajas temperaturas (40C). El tiempo de hidrlisis es menor en hidrlisis cida que enzimtica. La hidrlisis enzimtica reporta malos resultados, ya que la tasa de conversin de almidn a azcares reductores es baja. (la hidrlisis enzimtica si tiene buenos resultados segn la bibliografa consultada, pero contando con todos los medios apropiados, enzimas, para su realizacin).

2.2. PROCESO FERMENTATIVO

54

En la Figura 18 se observan las etapas del proceso fermentativo.

Neutralizacin del hidrolizado

Llevar a pH= 5

Enriquecimiento Esterilizacin
del medio

Inoculacin

Fermentacin
t= 60 h T= 30 0C pH= 5

FIGURA 18. Diagrama de flujo del proceso fermentativo

2.2.1 Materiales y mtodos

55

Equipo El equipo utilizado para la fermentacin fue el siguiente: Reactor batch: Baln de vidrio de dos bocas de 500 ml, al cual se le adapta un sistema de venoclisis (previamente esterilizado) para la toma de muestra y el escape de CO2. Este reactor se introduce en un tanque (Bao Mara), el cual se coloca sobre una plancha de agitacin con calentamiento adecuando la temperatura para el proceso fermentativo (30 oC) a 100 r.p.m - Autoclave: Consolidate. Stills & Sterilized. Boston. Modelo 16D36 - Incubadora: Cenco. Con control de temperatura - pHmetro: (PHC-2201), BiottCo Ltd, Tokyo. - Vidriera: Pipetas, Erlenmeyer, Beaker, Cajas de Petri, Tubos de ensayo.
- Equipos de microbiologa: Microscopio, Asas, Estiletes, Mechero, Portaobjetos.

Esterilizacin y Desinfeccin La finalidad de la esterilizacin es eliminar todos los microorganismos o evitar su posterior reproduccin. Generalmente se esterilizan los equipos implicados con el proceso (reactor, herramientas, utensilios) y el medio. La esterilizacin generalmente se realiza con vapor y se logra que las levaduras y los hongos similares mueran a temperaturas y presiones altas ( >100 oC y >15 Lb). [Brock] TABLA 15. Mtodos de desinfeccin
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Vidriera

Solucin jabonosa antibacterial, agua caliente. Autoclave

Reactor

Solucin jabonosa antibacterial, agua caliente. Hipoclorito de Sodio.

Area de trabajo

Solucin jabonosa antibacterial, Hipoclorito de Sodio.

Microorganismo Se utiliza Zymomonas mobilis NRRLB14022, cedido por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) la cual se encontraba liofilizada, por lo que tuvo que ser rehidratada de acuerdo al medio de rehidratacin recomendado por USDA; el medio de rehidratacin est compuesto por (g/L): Glucosa 20, Extracto de levadura 10, y Peptona 5. Se dejo en una incubadora a una temperatura de 30 0C, por un tiempo de 48 horas. Se selecciona este microorganismo debido a que en comparacin con otros, como la Saccharomyces cerevisiae, la Zymomonas tiene una mayor velocidad de produccin de alcohol, adems de muchas otras ventajas, como mayor tolerancia a la concentracin de alcohol, entre otras ya mencionadas anteriormente. Luego de rehidratar la Zymomonas mobilis, esta se siembra en un medio de mantenimiento compuesto de glucosa, extracto de levadura y agar. Despues de 24 horas y a una temperatura de 30 0C, se realiza una coloracin por medio del mtodo de Gram (Anexo 7), con el fin de visualizar en el microscopio las caractersticas de la bacteria; se realiza la prueba de la Catalasa y la oxidasa, dando como resultado que la bacteria es un bacilo gram negativo, de Catalasa positiva y Oxidasa negativa, y con el tamao reportado en la bibliografa.

Medio de cultivo
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Despus de realizar muchos ensayos se encuentra que el medio ptimo de crecimiento y fermentacin es el propuesto por [Sreekumar, 1999] con la siguiente composicin: TABLA 16. Medio de fermentacin ptimo seleccionado Glucosa (g/L) Sulfato de Amonio (NH4)2SO4 (g/L) Fosfato Dihidrogenado de potasio KH2PO4 (g/L) Extracto de Levadura (g/L) Sulfato de Magnesio Heptahidratado MgSO4.7H2O (g/L) 120.4 0.96 0.02 6.5 0.5

En este medio se observa un buen crecimiento, mientras que en los medios propuestos por [Kondo, 1996] y [Bergey`s,1984] no dieron los resultados esperados para esta cepa de Zymomonas mobilis.

Mtodos de Anlisis La concentracin de azcares se determina por el mtodo del cido dinitrosaliclico (DNS) (Ver Anexo 2). La concentracin de almidn se determina por el mtodo de Marta Quicazn (UNAL) (Ver Anexo 3). Los azcares totales por el mtodo de cido clorhdrico (UNAL) (Ver Anexo 1). El etanol por el mtodo de ndice de refraccin (UNAL) (Ver Anexo 6).

2.2.2 Fermentacin Preparacin del medio de fermentacin Se realiza un anlisis de nutrientes del jugo de harina de banano ya hidrolizado para determinar si es necesario adicionar los nutrientes bsicos para una buena fermentacin exigidos por la Zymomonas mobilis. Determinacin de Nutrientes en el jugo hidrolizado

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La concentracin inicial de azcares en el jugo hidrolizado fue de 90 g/L, el anlisis de los micronutrientes fue realizado en el laboratorio de Ingeniera Sanitaria de la Universidad Nacional, Sede Medelln. Los resultados fueron los siguientes: TABLA 17. Determinacin de nutrientes en el jugo hidrolizado Dureza clcica, CaCO3 Nitrgeno amoniacal NH3 como N Fsforo total, P 40.0 mg/L 7.2 mg/L 7.64 mg/L

Debido a que estas cantidades son muy pequeas, comparadas con las requeridas por el medio nutricio, se adicionaron las cantidades recomendadas por [Sreekumar,1999]. Ver Tabla 16.

Esterilizacin Se esteriliza el jugo hidrolizado enriquecido en autoclave a 15 psi, 121oC durante 15 minutos. Esta causa evaporacin y por tanto incrementa la concentracion de azucares a 100.37 g/L.

Inoculacin El objetivo de la etapa de inoculacin es conseguir un medio donde los microorganismos estn en condiciones ptimas de crecimiento. Su cantidad debe ser tal que al inocular en el fermentador se logre una adecuada capacidad de asimilacin de sustrato. Para evitar la fase Lag y adems evitar choques osmticos debido a los gradientes de concentracin entre el medio fermentativo y el medio de inoculacin, se necesitan relaciones entre el volumen del inculo y el volumen del medio fermentativo entre el 5 10 % en volumen. Se debe utilizar el mismo sustrato en el medio de inoculacin ya que

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favorece la sntesis de bioenzimas necesarias para el consumo del sustrato del medio fermentativo. La temperatura del inoculo debe ser la misma del medio fermentativo para evitar choques trmicos; la temperatura del proceso es de 30 oC que corresponde a la temperatura optima de crecimiento de Z. mobilis. [Kondo, 1996] Con respecto a la cantidad de bacteria en el inculo los autores estudiados recomiendan que se obtiene un mayor rendimiento en la produccin de etanol con concentraciones iniciales alrededor de 0.2 g/L de Z. mobilis en el inculo. [Laplace, 1991]

FIGURA 19. Fermentacin del jugo de banano hidrolizado. Seguimiento del proceso (Datos obtenidos) Se toman muestras peridicamente para determinar consumo de azcares reductores, produccin de etanol; concentracin de microorganismo y pH, el cual se mantuvo constante en un intervalo de 5.2 a 5.5. La fermentacin termin cuando la concentracin de etanol se mantuvo constante con el tiempo y cesa la produccin de CO2. La Tabla 18 reporta los datos obtenidos y la Figura 20 muestra la cintica de la fermentacin.

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TABLA 18. Datos obtenidos en el proceso de fermentacin Tiempo Concentracin (h) 1 6 11 14 17 20 26 29 32 35 38 42 46 65 de Azcar (g/L) 100.37 99.63 98.88 98.88 97.68 95.58 64.43 52.75 39.42 28.34 18.30 14.71 11.71 10.50 Concentracin de Alcohol (ml/L) 5.98 5.98 5.98 7.69 8.55 11.11 18.80 25.64 27.35 44.44 46.15 48.72 50.43 52.99 Concentracin de Alcohol (g/L) 4.73 4.73 4.73 6.08 6.75 8.78 14.85 20.26 21.61 35.11 36.46 38.49 39.84 41.86 Concentracin de Biomasa (g/L) 0.74 0.68 0.92 1.16 0.91 0.98 1.81 2.25 2.71 3.44 3.59 3.69 4.09 3.83

Las muestras del mosto fermentado se centrifugaron con el fin de separar la biomasa para el posterior anlisis.

61

Cintica de la Ferm entacin

100.00

80.00

Azucares (g/L)

Alcohol (g/L)

Biomasa (x1E-5)

Concentracin (g/L)

60.00

40.00

20.00

0.00 0 10 20 30 Tiempo (horas) 40 50 60 70

FIGURA 20. Cintica de la fermentacin de hidrolizado de banano verde por accin de Zymomonas mobilis.

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Rendimientos

Hidrlisis Rendimiento de hidrlisis = (Azcar despus de hidrlisis Azcar antes de hidrlisis) Almidn Inicial A partir de 30 g de almidn se obtienen 21 g de azcares reductores, con un rendimiento del 70%. x 100

Fermentacin alcohlica. A partir de 100 g/L de azcares reductores iniciales, la Zymomonas mobilis utiliza 90 g/L (un 90%) de los cuales se obtienen 41.86 g/L de etanol, con un rendimiento de 0.47 gramos de etanol por gramo de glucosa a las 65 horas, lo que corresponde a un 95% del rendimiento terico. Rendimiento Real = [ ] de alcohol [ ] de azucares Rendimiento Terico = 0.5 g de etanol / g de glucosa Productividad Real = [ ] de alcohol (g/L) [ ] de azucares (g/L) x tiempo (h) Donde: [ ] = concentracin A partir de estas ecuaciones y de los datos de la Tabla 18, se obtiene la Tabla 19. x 100 x 100

63

TABLA 19. Productividad y Rendimientos de la fermentacin. Tiempo (h) 1 6 11 14 17 20 26 29 32 35 38 42 46 65 Rendimiento Real Productividad % Rendimiento terico =(Rendimiento Real /Rendimiento terico) x 100 10.73 10.73 10.73 13.80 15.33 19.93 33.73 45.99 49.06 79.73 82.80 87.39 90.46 95.06

(g etanol/g glucosa) Real (g/g.h) x10 -3 0.05 0.05 0.05 0.07 0.08 0.10 0.17 0.23 0.24 0.39 0.41 0.43 0.44 0.47 5.0 8.3 4.5 5.0 4.7 5.0 6.5 7.9 7.5 11.1 10.8 10.2 9.6 7.2

2.3 ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS

Los mtodos estandarizados para determinacin de almidn, azucares reductores, alcohol y cantidad de biomasa, son buenos pero presentan el exigencia de equipos especializados como refractmetro y reactivos muy costosos La elaboracin de la harina de banano no present ningn inconveniente, debido a que se encontr el equipo necesario y se obtuvo una humedad optima (13%), gracias a la cual no se present contaminacin por microorganismos. Al diluir la harina se presentan problemas debido a la alta viscosidad, lo que impide una buena agitacin, lo cual hace que el rgimen de agitacin no sea igual para todos los ensayos y su variacin pudo afectar los resultados finales (en la concentracin de azucares del jugo) ya que no hay reproducibilidad. inconveniente de: polarmetro, espectrofotmetro,

64

La filtracin del jugo requiere gran cantidad de tiempo y no se cont con un equipo especializado para realizarlo (filtroprensa o filtracin al vaco tipo Oliver) y la forma como se llevo a cabo permiti adems de la contaminacin (polvo de la centrifuga, manipulacin con la mano y equipos contaminados), la perdida de material, lo cual influye en los resultados. Los resultados presentados por la bibliografa de los diferentes tipos de hidrlisis, tanto la enzimtica como la cida, presentan grandes incoherencias en las condiciones de presin, temperatura, tiempo, concentracin de cidos y enzimas; y rendimientos de conversin a azucares reductores. Lo que causo problemas en la seleccin del mtodo optimo a seguir. Para la hidrlisis enzimtica, no se cont con las enzimas apropiadas. Los ensayos de esta hidrlisis se desarrollaron por una enzima donada por Cervunin, la cual se sospechaba que era y amilasa (ms no se tuvo la caracterizacin de esta por hacer parte del know-how de la empresa), sin obtenerse ningn resultado en la realizacin de la hidrlisis. La hidrlisis cida se realiz con H2S04, debido a que no se obtuvo ningn resultado con HCl. Adems, no se cont con ningn equipo especializado para la realizacin de la hidrlisis que evitara perdidas del jugo por evaporacin y que controlara el pH de este. El jugo hidrolizado tambin tuvo que filtrarse (formacin de sustancia gomosa), pero este ya no present problema alguno (filtracin al vaco simple). En el desarrollo del trabajo, la hidrlisis cida presenta resultados reproducibles (se realiz varias veces obtenindose resultados similares), el contenido de azucares se triplico. Ver Tabla 13. El encontrar el medio optimo de crecimiento, mantenimiento y fermentacin de la Zymomonas mobilis, trajo muchas dificultades y retrasos en el trabajo. Ya que, o no creca, o se mora, o creca demasiado lento, o se estresaba. Se requiri de un arduo trabajo en el laboratorio de Microbiologa de la Universidad y de mucha asesora de parte del encargado de este, debido a que la Zymomonas mobilis se contaminaba muy fcil a pesar de los cuidados que se tenan, tambin mutaba muy fcil

65

(crecimiento pleomrfico, lo cual baja la eficiencia del microorganismo en la fermentacin), al hacer los repiques para la renovacin de la cepa. Se recomienda para un buen manejo de la cepa, una persona especializada en este campo, que le dedique el tiempo necesario para obtener buenos resultados. La inexperiencia en la escogencia, preparacin (esterilizacin), del reactor y en el sistema de la toma de muestras y escape de CO2, trajo retrasos de tiempo. De acuerdo a la Tabla 19, se observa que el rendimiento obtenido es un poco mayor al rendimiento alcanzado en otras fermentaciones alcohlicas reportadas por la bibliografa (a nivel de laboratorio) el cual no excede el 90 a 95% del valor terico. La Figura 20, muestra el progreso en el tiempo de la produccin de etanol. La velocidad de produccin de etanol en la fase temprana del cultivo utilizando jugo de banano hidrolizado es relativamente lenta, pero se incrementa rpidamente despus de las 24 horas. La fermentacin se complet despus de las 46 horas. La concentracin final de etanol fue de 41.86 g/L. Est figura tambin muestra el cambio en la concentracin residual de glucosa, y se observa que a partir de las 46 horas la concentracin de glucosa permanece constante sin agotarse totalmente (10.50 g/L). En la misma figura, se observa una semejanza entre la curva de concentracin de etanol y la curva de biomasa, observndose que el punto de mxima concentracin de etanol coincide con el de mxima concentracin de biomasa, esto puede deberse a que el microorganismo no presenta retardo en eliminar el etanol que produce La produccin de etanol en cultivo Batch, usando jugo de banano verde hidrolizado es de 0.47 gramos de etanol por gramo de glucosa, lo que corresponde a un 95% de la productividad terica. La mxima productividad se presenta entre las 35 y 38 horas (0.0111 g/g.h). Ver Tabla 19.

66

El crecimiento del microorganismo presenta una curva tpica (Figura 20); se monitorea el crecimiento celular de la Zymomonas mobilis, observndose que la fase de adaptacin se da en las primeras 20 horas, despus de las cuales comienza la fase exponencial de crecimiento la cual se da hasta las 36 horas, de hay en adelante se aprecia una fase de desaceleracin del crecimiento a las 65 horas. A las 46 horas se observa el mximo crecimiento de la Zymomonas mobilis equivalente a 4.09g/L de clulas. A partir de este momento el microorganismo empieza a disminuir hasta llegar a 3.83 en las 65 horas (Figura 20)

2.4 COMPARACIN CON LOS RESULTADOS REPORTADOS CON Saccharomyces

cerevisiae

Las fermentaciones industriales para la produccin de alcohol son desarrolladas casi exclusivamente por levaduras (Saccharomyces cerevisiae), la bacteria Zymomonas mobilis es un organismo potencialmente til para la produccin comercial de alcohol, el cual puede fermentar glucosa, fructosa y sacarosa. Comparando la Z.mobilis con la S.cerevisiae en la produccin de alcohol, la Zymomonas mobilis tiene mayor velocidad de produccin, an cuando ambos organismos son similares en otras facciones (ver Tabla 20) Al comparar los resultado obtenidos en este trabajo, con la Tabla 20, se crea la duda de cmo fue calculada la velocidad de productividad de etanol (son 50 veces mas altos)y la velocidad de productividad volumtrica de etanol por este autor, ya que no se presenta informacin experimental de cmo se obtuvieron los datos expuestos en la Tabla 20. TABLA 20. Comparacin de Z.mobilis y S.cerevisiae en la produccin de alcohol. [Glick, 1994] Productores de alcohol Conversin etanol (%) Velocidad de Velocidad de Intervalo para de etanol volumtrica produccin de Temperatura la optima (oC)

de azcar a productividad productividad pH

67

(g/g.h)a Z.mobilis S.cerevisiae

a

de (g/L.h) a 200 29

etanol de etanol 3.5-7.5 2-6.5 25-30 30-38

La

96 96

5.67 0.67

La velocidad de productividad de etanol es medida bajo condiciones de fermentacin batch. La

velocidad de productividad volumtrica de etanol fue medida durante un cultivo continuo. misma tolerancia de azcar (>40%).

produccin de las dos cepas tuvieron la misma mxima concentracin de etanol (12%) y poseen la

Muchos de los experimentos realizados sobre las Z.mobilis se han concentrado en expandir los sustratos que esta puede utilizar, por ejemplo codificacin de genes de enzimas que pueden hidrolizar lactosa, almidn , celulosa, xilosa y celubiosa, han sido introducidos en las Zymomonas. [Glick, 1994]. Muchos investigadores estn confiados que algn da estas Z.mobilis codificadas con genes puedan ser usadas para convertir materiales de desecho en alcohol sin previo tratamiento de este. [Glick, 1994] La Zymomonas mobilis presenta algunas ventajas sobre las levadura (Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cereviseae)para la produccin de etanol, a partir de un medio con concentraciones elevadas de glucosa, son: Velocidades especificas de consumo de sustrato y de produccin de etanol elevados. Mayor productividad volumtrica de etanol. Rendimiento de etanol superior y el de biomasa inferior. No necesita aporte de oxigeno. Mayores posibilidades de manipulacin gentica. Alta tolerancia al etanol y a las altas temperaturas. Bajos niveles de productos tales como cidos y glicerol. Caractersticas apropiadas de floculacin y sedimentacin que facilitan el reciclo.

La desventaja principal de la Z. mobilis frente a la S.cerevisiae, es que se requiere un manejo microbiologico mas exigente; y otra es que la S.cerevisiae es mas fcil de conseguir (supermercados, tiendas).

68

En los trabajos de fermentacin de banano por accin de S.cerevisiae (Tabla 10), se observa que la fermentacin se da entre 48 y 60 horas, en este trabajo con Z.mobilis, la fermentacin prcticamente se completa a las 36 horas. Los porcentajes de rendimiento terico para S.cerevisiae oscilan entre 80 y 90%, mientras que con Z.mobilis se obtuvo un 95% del rendimiento terico.

3. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

69

Al realizar la parte experimental de este trabajo se pudo obtener alcohol mediante un proceso de fermentacin a partir de banano de rechazo, previa hidrlisis por accin de Zymomonas mobilis. La importancia de este trabajo, es que se realizo a partir de un sustrato real (Banano de rechazo) y no a partir de un sustrato sinttico (Glucosa, extracto de levadura, peptona, sales minerales, etc), como lo hacen en muchos estudios consultados en la bibliografa (muchos de estos estudios trabaja con sustratos sintticos). En la elaboracin de harina a partir de banano verde, se logr mantener uniformidad en las muestras a analizar, evitando maduracin del fruto y eventuales focos de contaminacin. Se recomienda la hidrlisis cida con cido sulfrico gracias a: la fcil consecucin y bajo costo del cido, que se lleva a cabo a presin atmosfrica, tiempo de desarrollo corto, y buena conversin de almidn a azcares reductores; aunque la temperatura de la hidrlisis cida es alta (90oC) no difiere mucho de la de hidrlisis enzimtica (70
o

C). (al realizar la hidrlisis cida se observa que hay una conversin a glucosa del

93% de los almidones presentes en la harina de banano, triplicndose los azcares iniciales). El rendimiento de esta hidrlisis es de 0.67 g de glucosa/g de almidn inicial.

Los resultados de la fermentacin obtenidos en este estudio sugieren que el jugo de banano verde hidrolizado contiene cantidades adecuadas de fuente de carbono las cuales son esenciales para el crecimiento satisfactorio y produccin de etanol por parte de Zymomonas mobilis. No solo se realizo una corrida de la fermentacin, se hicieron varios preensayos de esta, los cuales arrojaron resultados muy parecidos. La dificultad de estas corridas era la falta de equipos y reactivos de laboratorio, espacio en los laboratorios. Se obtuvo rendimiento de 0.47g de etanol/g glucosa (lo que corresponde a un 95% del rendimiento terico); con una concentracin final aproximada de etanol al 5.3%(v/v)

70

4.19%(p/v) en un tiempo de 38 a 46 horas contando la fase de latencia. Despus de que la Z.mobilis ha pasado su perodo de latencia, la fermentacin se efecta en 20 a 24 horas aproximadamente. El pH en la fermentacin alcohlica (Batch) no tiene un cambio significativo permaneciendo en el intervalo requerido, por lo tanto no es necesario un control de este. Se recomienda buscar un mtodo ptimo de filtracin, para evitar las excesivas prdidas de material. Para disminuir la fase de latencia del microorganismo hay que adaptarlo con el fin de que se acostumbre al sustrato antes de la fermentacin para obtener mejores resultados Se sugiere calentar el jugo antes de la hidrlisis a 50oC durante 15 minutos para lograr una mejor solubilizacin de los almidones. La productividad de la fermentacin con Z.mobilis, puede ser mejorada realizando barridos con nitrgeno al reactor, ya que se dan mejores condiciones de anaerobiosis. Trabajar con clulas inmovilizadas permitira realizar una fermentacin continua, la cual tiene una mayor eficiencia que la fermentacin Batch (segn la bibliografa). Ver la posibilidad de conseguir una cepa mejorada de Zymomonas mobilis, la cual sea ms resistente y ms eficiente (mejor comportamiento cintico). Conseguir equipos especializados para la filtracin, hidrlisis y fermentacin, los cuales permitan un manejo ms aceptable de ascepcia y eviten prdidas de material excesiva, lo cual lleva a una mayor eficiencia del proceso. Estudiar con el propsito de optimizar los mtodos de hidrlisis cida y enzimtica, en busca de obtener mejores rendimientos y menor perdida de material (sustrato).

71

Se recomienda un estudio especializado en el manejo gentico y microbiolgico de la Zymomonas mobilis, con el fin de aprovechar los avances en este campo, en el que se realizan: simultneamente hidrlisis y fermentacin por accin de esta bacteria modificada genticamente, mayor tolerancia a concentraciones altas de sustrato y producto, altas temperaturas, capacidad de desdoblar celulosa, lignocelulosa, xilosa, etc. Estudiar con le propsito de optimizar los mtodos de concentracin y purificacin de alcohol obtenido.

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ANEXOS

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ANEXO 1. DETERMINACIN DE AZCARES TOTALES Segn el mtodo utilizado en el Lab. de alimentos de la universidad, se toman aproximadamente 6 g de harina se diluye en agua destilada y se llevan a un baln de 100 ml, de ac se toma una alcuota de 10 ml y se le adicionan 10 ml de HCl (6 N), se calienta al bao Mara a 70 oC durante un tiempo de 15 min. El jugo hidrolizado se lleva aun pH igual a 5.4 con NaOH para despus analizar por el mtodo del cido 3,5 dinitrosaliclico. Los azcares totales corresponden los azcares obtenidos despus de realizado este proceso menos los azcares iniciales en la harina

ANEXO 2. DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES

Mtodo: Usando el cido dinitrosaliclico [Miller, 1959]

Fundamento El cido 3,5-dinitrosaliclico se reduce a cido 3-amino-5-nitrosaliclico mientras los grupos aldehdos se oxidan a grupos carboxlicos. La principal ventaja de este cido en la determinacin de azcares reductores, se encuentra en la gran conveniencia que tiene comparada con la mayora de las otras pruebas para azcares, en las cuales generalmente se deben realizar un gran nmero de pruebas. Procedimiento

Preparacin del reactivo de Summer

80

Este se prepara conteniendo 1% de cido 3,5-dinitrosaliclico, 0.2% de fenol, 0.05% de bisulfito de sodio y 1% de hidrxido de sodio, con los porcentajes en peso por volumen. Se pesan cantidades exactas de los reactivos y se disuelven todos los slidos en la solucin que contiene 1% de hidrxido de sodio. Este reactivo debe guardarse a baja temperatura.

Preparacin de la sal de Rochelle Se prepara con una concentracin de 40% porcentaje en volumen. (tartrato de sodio).

Construccin de la curva patrn Se parte de una solucin patrn de glucosa con una concentracin de 1 mg/ml. Se establece una escala estndar de 0 a 1 mg/ml tomando volmenes de 0,5,7,10,17,20,25 ml de la solucin patrn y completando a 25 ml con agua destilada en balones volumtricos. Se toman alicuotas de 3 ml de cada una de las soluciones de la escala estndar, se llevan a tubos de ensayo con 3 ml de agua destilada y 3 ml de reactivo de Summer. Se agita y se lleva a bao Mara durante 15 minutos, se retiran y se le agrega a cada tubo 1 ml de la sal de Rochelle, se dejan enfriar a temperatura ambiente. Se llevan las soluciones al espectrofotmetro para realizar las curvas de absorbancia a una longitud de onda de 575 nm; utilizando la solucin con concentracin de 0 mg/ml de glucosa como blanco. Con los datos obtenidos se construye una grfica Absorbancia vs. Concentracin, la cual debe ser una lnea recta con un coeficiente de correlacin que no debe ser menor de 0.99. La ecuacin para relacionar absorbancia contra concentracin con un coeficiente de correlacin de 0.9909 es:

81

C= ( A 0.0114 )/ 0.001 Donde: C: Concentracin de azcares reductores (mg/ml) A: Absorbancia obtenida

Para la etapa de fermentacin, se realiza otra curva de calibracin, debido a que se cont con un espectrofotmetro diferente. La ecuacin para relacionar absorbancia contra concentracin con un coeficiente de correlacin de 0.9998 es: C= ( A + 0.0002 )/ 0.6677 Donde: C: Concentracin de azcares reductores (mg/ml) A: Absorbancia obtenida

ANEXO 3. DETERMINACIN DE CONTENIDO DE ALMIDN

Fundamento Se fundamenta en la hidrlisis que ejerce el cido clorhdrico sobre el almidn, produciendo glucosa, sustancia pticamente activa. Este producto se evala polarimtricamente y su contenido se corrige descontando los azucares que contenga el alimento, los cuales son extrados con agua y tratados con cido. [Quicazn, 1992] Equipo Balanza analtica. Agitador magntico. Polarmetro. Bao Mara.

82

Balones volumtricos. Embudos.

Reactivos Acido Clorhdrico al 1.128%. Acetato de Zinc al 21.9% Ferrocianuro de Potasio al 1.6%

Procedimiento Se toma 2.5 g de muestra seca a 60 0C en un volumtrico de 100. Se adicionan 50 ml de HCl y se coloca al bao Mara a ebullicin con agitacin durante 15 min. Se enfra rpidamente y se le adicionan 20 ml de agua destilada, 5 ml de solucin de acetato de zinc y de solucin de ferrocianuro; se completa el volumen con agua destilada y se filtra. Para este filtrado se lee el ngulo de rotacin en el polarmetro utilizando un tubo de 200 mm. Tratamiento del blanco : En un volumtrico de 100 ml se toma 5 g de muestra. Se le adiciona 40 ml de agua para suspender la muestra y luego otros 5 ml para enjuagar las paredes del volumtrico. Se le adicionan 5 ml de acetato de zinc y solucin de ferrocianuro de potasio, se completa el volumen con agua destilada y se filtra. Se toma una alcuota de 50 ml de filtrado en un volumtrico de 100 ml, se le adicionan 2 ml de HCl al 37%. Se calienta con agitacin al bao Mara durante 15 min. Se enfra, se completa a volumen y determinamos el ngulo de rotacin.

Clculos % Almidn = [( B- C) x V x 100] / ( 2 x D x F x M) Donde: %A: contenido de almidn en la muestra, en porcentaje.

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D: Rotacin especfica para cada alimento (180 para este caso) B: ngulo de rotacin total. C: ngulo de rotacin del blanco. V: Volumen total. M: Peso en gramos de la muestra. F: Factor de equivalencia entre alimento fresco y alimento seco a 60 0C.

ANEXO 4. DETERMINACIN DE BIOMASA Para conocer el crecimiento del microorganismo en el medio de cultivo se realiz esta determinacin en el Laboratorio de Control Microbiolgico y Fsico Qumico de los Alimentos del Colegio Mayor de Antioquia. Se anexa el correspondiente informe.

LACMA LABORATORIO DE CONTROL MICROBIOLOGICO Y FSICO QUMICO DE LOS ALIMENTOS CONTROL: 041-02 UNIVERSIDAD NACIONAL - MEDELLN Microorganismo en medio de cultivo. 27-06-2002. 27-06-2002. Curva de crecimiento. Carlos Naranjo. 200 ml aprox. Frasco de vidrio estril con tapa rosca plstica.

EMPRESA: PRODUCTO A ANALIZAR: FECHA DE RECOLECCION: FECHA DE ANLISIS: ANALISIS SOLICITADO: MUESTRA TOMADA POR: CANTIDAD: EMPAQUE:

ANALISIS ORGANOLPTICO ASPECTO Lquido no translucido, turbio. COLOR Amarillo mbar OLOR Propio. CURVA DE CRECIMIENTO DE LA BACTERIA Zymomonas mobilis PROCEDIMIENTO: El proceso se inicia realizando una suspensin en dilucin 1:9 de la bacteria rehidratada en un medio de cultivo lquido que contiene sales de fosfato y glucosa, siendo ste t 0
84

(tiempo = 0 horas), t1 (tiempo = 6 horas), t2 (tiempo = 12 horas), t3 (tiempo = 24 horas) y t4 (tiempo = 36 horas). Para la elaboracin de la curva de crecimiento se utilizaron 3 mtodos diferentes: determinacin de biomasa, recuento directo de clulas en cmara de Neubauer y turbidimetra (D.O). DETERMINACIN DEL PORCENTAJE BIOMASA: se obtiene peso constante mediante evaporacin del agua a 103C. El resultado se obtiene por diferencia de peso expresado en porcentaje. Se aplica la tcnica a un blanco equivalente al medio de cultivo, as como a alcuotas de t0, t2 y t3. Resultados: Blanco = 8.36% t0 = 8.66% t2 = 8.85% t3 = 10.80% Se resta el blanco a t0, t2 y t3 para obtener el porcentaje de la masa celular: t0 = 8.66% 8.36% = 0.3% de biomasa t2 = 8.85% - 8.36% = 0.49% de biomasa t3 = 10.8% - 8.36% = 2.44% de biomasa RECUENTO DIRECTO DE CLULAS EN CMARA DE NEUBAUER: se realiza conteo de clulas en el retculo central de la cmara que posee 25 cuadrados, con un rea de 1 mm2, profundidad de 0.1 mm, volumen de llenado de 0.01 ml. El resultado se obtiene multiplicando el nmero de clulas contadas por un factor de conversin. Se aplica la tcnica a t0, t1 , t2, t3 y t4 . Resultados: t0 = 9.7 x 105 clulas/ ml t1 = 10.6 x 105 clulas/ ml t2 = 10.7 x 105 clulas/ ml t3 = 51.3 x 105 clulas/ ml t4 = 77.5 x 105 clulas/ ml TURBIDIMETRIA: se realiza lectura en espectrofotmetro a una longitud de onda de 578 nanmetros (nm), en absorbancia (Densidad ptica) a t0, t3 y t4., frente a blanco de agua destilada. Cada una de las alcuotas se someten a centrifugacin a 3000 RPM por 5 minutos, para obtener un pellet de las clulas y luego ser lavadas y resuspendidas en solucin salina isotnica estril para realizar la medicin en el espectrofotmetro. La absorbancia obtenida es confrontada con la escala de Mac Farland, cuyas concentraciones fueron medidas a la mismas condiciones de las alcuotas (absorbancia y longitud de onda). Resultados: t0 = 0.019 D.O.

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t3 = 0.060 D.O. t4 = 0.088 D.O. CONTROL: 041-02 Patrn de Mac - Farland: Tubo 1: 0.025 D.O. equivalente a una concentracin de 3 x 108 cl./ ml Tubo 2: 0.031 D.O. equivalente a una concentracin de 6 x 108 cl. / ml Tubo 3: 0.047 D.O. equivalente a una concentracin de 9 x 108 cl. / ml Tubo 4: 0.062 D.O. equivalente a una concentracin de 12 x 108 cl. / ml Tubo 5: 0.089 D.O. equivalente a una concentracin de 15 x 108 cl. / ml Tubo 6: 0.099 D.O. equivalente a una concentracin de 18 x 108 cl. / ml Tubo 7: 0.112 D.O. equivalente a una concentracin de 21 x 108 cl. / ml Tubo 8: 0.128 D.O. equivalente a una concentracin de 24 x 108 cl / ml Tubo 9: 0.161 D.O. equivalente a una concentracin de 27 x 108 cl. / ml Tubo 10: 0.175 D.O. equivalente a una concentracin de 30 x 108 cl. / ml Correlacionando los resultados con el patrn de Mac Farland se determina que el t3 = 12 horas presenta una concentracin aproximada a 12 x 10 8 clulas / mililitro y t4 = 24 horas presenta una concentracin aproximada a 15 x 108 clulas / mililitro. CONCLUSIN Los resultados obtenidos en las 3 tcnicas aplicadas: determinacin del porcentaje de biomasa, recuento de clulas en cmara y turbidimetra para la elaboracin de la curva de crecimiento de Zymomonas mobilis indican que la fase de latencia o adaptacin se realiza en las primeras 12 horas, para continuar con la fase logartmica o exponencial entre las 24 horas y las 36 horas. SUGERENCIAS Realizar curva de crecimiento de Zymomonas mobilis determinando las 4 fases: latencia o adaptacin, logartmica o exponencial, estacionaria y declinacin o muerte Margarita Gutirrez Buritic Bacteriloga CMA Especialista en Ciencia y Tecnologa de Alimentos Jefa LACMA Medelln, junio 19 de 2002 ANEXO 5. FUNDAMENTOS DE LOS METODOS DE DETERMINACION DE BIOMASA

El crecimiento de una poblacin microbiana se mide siguiendo los cambios en el numero de clulas o el peso de la biomasa celular, de acuerdo a los siguientes mtodos: [Madigan, 1997]

86

Contaje total de clulas El nmero de clulas de una poblacin puede medirse directamente al microscopio. Se puede realizar en muestras lquidas, las que requieren cmaras especiales de Contaje. En ellas la superficie del porta lleva marcada una rejilla, encima de cada cuadrado de la rejilla se coloca un volumen conocido de muestra. El nmero de clulas por unidad de rea de la rejilla se cuenta directamente en el microscopio, lo que nos da un nmero de clulas por unidad de volumen. Convertir este valor a nmero de clulas por mililitro de suspencin se hace fcilmente: el valor obtenido por un valor de conversin. El contaje microscpico directo es una manera rpida de estimar el nmero de clulas microbianas. Sin embargo tiene una serie de limitaciones: (1) las clulas muertas no se distinguen de las vivas. (2) las clulas pequeas son difciles de ver al microscopio y algunas de ellas probablemente no se cuentan. (3) se requiere tiempo y habilidad para conseguir precisin por este mtodo. (4) se requiere de un microscopio de contraste de fases cuando la muestra no este teida. (5) este mtodo no es bueno para una suspensin de clulas poco densa. En el caso de bacterias si la suspensin tiene menos de 106 clulas/ml se vern pocas clulas en campo del microscopio. Estas muestras diluidas pueden, sin embargo contarse, si previamente se concentran por centrifugacin en un pequeo volumen.

Medidas de masa celular y turbidez En algunos casos, es necesario estimar la masa de clulas presente en el cultivo ms que el nmero de clulas. Sin embargo, debido a que la masa celular es proporcional al nmero se puede utilizar la determinacin de un parmetro para estimar el otro. Se puede medir la masa celular neta por centrifugacin de un volumen conocido y simplemente pesar el precipitado. El procedimiento habitual es determinar el peso seco despus de secar las muestras durante una noche a 90-110oC. La masa seca de las clulas bacterianas es aproximadamente entre el 10 y el 20% de la masa hmeda.

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Un mtodo ms rpido y til, para obtener una estimacin del nmero de clulas o biomasa, consiste en la utilizacin de medidas de turbidez. Una suspensin celular aparece turbia porque las clulas dispersan la luz que atraviesa la suspensin. La turbidez puede medirse con un espectrofotmetro en unidades de densidad ptica (DO). Para organismos unicelulares, las unidades fotomtricas DO son proporcionales (dentro de ciertos limites) a la masa celular y tambin al nmero de clulas. Por lo tanto las medidas de turbidez pueden utilizarse como un sustituto para otros mtodos de contaje. Sin embargo y antes de utilizar la turbidez, hay que realizar una curva estndar que relacione las medidas directas (peso seco) con las indirectas de turbidez. Tales curvas contienen datos para masa celular, permitiendo la estimacin de este parmetro a partir de una sola medida de turbidez.

ANEXO 6. DETERMINACIN DE ALCOHOL.

Mtodo A.O.A.C 920.58: Por volumen desde refraccin Tomar 5 ml de muestra y hacer una microdestilacin (equipo especial: microdestilador); destilar por lo menos 2 ml. Si hay formacin de espuma, esto se puede prevenir por la adicin de un antiespumante. Se determina por inmersin en el refractmetro por lectura del ndice de refraccin del destilado obtenido, y encuentre el correspondiente porcentaje de alcohol a partir de la curva de calibracin.

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FIGURA 21. Microdestilacin del etanol. Construccin de la curva de calibracin Partir de una solucin de etanol al 99.9% y preparar diluciones as: 1/10, 1/8, 1/6, 1/4. Mezclar bien, luego leer en el refractmetro el ndice de refraccin. Realizar la curva Indice de refraccin vs. Concentracin. Ecuacin obtenida de la curva de calibracin C = (I 1.3338) / 0.117 Donde: C = Concentracin de alcohol. I = Indice de refraccin.

ANEXO 7. COLORACIN DE GRAM. El bacterilogo dans Christian Gram descubri en 1884 un mtodo de coloracin el cual ha dividido las bacterias en dos grupos. negativas. El de las gram positivas y el de las gram La tcnica est basada en la capacidad de las bacterias para retener el

colorante cristal violeta durante la decoloracin con alcohol acetona. Las bacterias gram negativas son decoloradas por el alcohol acetona, perdiendo el color prpura del cristal violeta. Las bacterias gram positivas no se decoloran y retienen el color violeta. Despus de la decoloracin se utiliza safranina, que es un colorante de contraste de color rojo; dicho colorante da un color rojo claro a las clulas decoloradas.

Procedimiento para fijar muestra. Coloque la muestra de cultivo en el portaobjetos utilizando para ello un asa estril. Extienda la gota sobre el porta objetos formando una pelcula fina.

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Seque la preparacin pasndola varias veces sobre la llama de un mechero.

Tincin de la muestra. Coloque los porta objetos en un puente de coloracin. Cubra el extendido con cristal violeta, djelo actuar durante un minuto. Lave el exceso de colorante con agua Cubra el extendido con lugol, durante un minuto Lave con agua Recolore con alcohol acetona, durante 20 a 30 segundos aproximadamente Lave con agua. Cubra el extendido con safranina, djelo actuar durante un minuto. Lave con agua, seque y observe al microscopio.

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