ESCUELA POLITCNICA DEL EJRCITO FACULTAD DE CIENCIAS APLICADAS INGENIERA EN BIOTECNOLOGA INFORME DE LABORATORIO

Integrantes: Renato Naranjo Alejandro Olmedo Jennifer Torres Practica N: 2 Fecha: 23/05/2012

Materia: Biologa Molecular I

Curso/Paralelo: Cuarto C

1. TEMA: Extraccin de ADN de hojas de Beta vulgaris var. (acelga)

2. OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GENERAL Extraer ADN de un organismo vegetal Beta vulgaris var. (acelga), siguiendo la tcnica respectiva y empleando los reactivos adecuados para comprender la funcin de cada uno de ellos y obtener ADN en calidad. 2.2 OBJETIVO ESPECFICOS Utilizar el procedimiento respectivo para poder extraer el ADN de un tejido vegetal, siguiendo minuciosamente sus pasos. Observar la accin del nitrgeno lquido al aplicarlo sobre la muestra vegetal. Comprender el mecanismo de accin en las clulas y tejidos de cada uno de los reactivos empleados.

3. MARCO TERICO INTRODUCCIN El ADN es un poli nucletido de doble cadena cuya misin es conservar la informacin gentica, especificando la secuencia de aminocidos de todas y cada una de las protenas. Constituye el otro tipo importante de poli nucletidos en la clula que acta en el proceso de expresin gentica y como intermediario entre el ADN y la maquinaria de sntesis de protenas (Radstrom et al. 2004). El conocimiento de la distribucin de la variabilidad gentica es de suma importancia para el desarrollo de estrategias de conservacin efectivas. Las tcnicas de biologa molecular y en particular el uso de marcadores moleculares permiten conocer, caracterizar y estimar la diversidad gentica y las relaciones entre grupos de inters (Tuckerb et al. 2003).

Uno de los principales inconvenientes tcnicos en el aislamiento y purificacin de ADN vegetal es la obtencin simultnea de fenoles, polisacridos, otros productos secundarios, as como la poca cantidad y calidad del ADN obtenido .Entre los protocolos de extraccin del ADN ms utilizados en diferentes especies se destaca el descrito por Dellaporta et al. (1983), en la cual menciona sobre la aplicacin de las diferentes tcnicas empleadas en Biologa Molecular para el anlisis del genoma, que depende en gran medida de la habilidad para extraer el ADN (Evenden et al. 2000). Para lo cual se realizan diversos mtodos de extraccin, dependiendo del tipo de tejido a emplear (Mortis & Hills, 1990). Uno de los problemas de trabajar con plantas es la composicin de la pared celular, la cual dificulta el acceso al interior para la extraccin de todo su contenido, incluyendo el ADN. Dicha pared se debe romper por accin mecnica, pulverizando el tejido con hielo seco o con nitrgeno lquido. En seguida se deben destruir las membranas celulares de manera que el ADN, acompaado de otros compuestos como protenas, enzimas, carbohidratos, etc, queden disponibles (Unicauca, 2005). Es por eso que para extraer el ADN primero es necesario romper las clulas y luego separar el ADN del resto de los componentes celulares como protenas y membranas lipdicas (Chile-cientfico, 2008).

4. MATERIALES Y MTODO 4.1 MATERIALES Hojas de acelga

Imagen 1: Hoja de Acelga 20 Mayo 2012, Olmedo Alejandro

Tubos Eppendorf

Morteros
Imagen 4:Tuboeppendorf con polvo de hoja congelada y DNA zolReagent 16 Mayo 2012, Olmedo Alejandro Imagen 2: Mortero con muestra de hoja congelada y pulverizada. 16 Mayo 2012, Olmedo Alejandro

Micropipetas

Centrfuga

Imagen 5: Micropipeta Imagen tomada de: http://ca.wikipedia.org/wiki/Fitxer:Micr opipeta_icona.png Fecha Actualizacin: 24 Enero 2012

Imagen 3: Centrfuga programable Imagen tomada de: http://www.testmark.com.mx/index.php ?main_page=product_info&products_id=16 Fecha Actualizacin: 20 Enero 2012

Puntas

Imagen 5: Puntas Micropipeta Imagen tomada de: http://www.medssofia.com/pipetas.html Fecha Actualizacin: 19 Febrero 2011

Reactivos: DNA zolReagent Tris EDTA (TE)

Nitrgeno lquido

Imagen 6: Reactivo DNA ZolReagent Imagen tomada de: http://www.medssofia.com/DNAZOL. html Fecha Actualizacin: 19 Diciembre 2011

Imagen 7: Buffer Tris EDTA Imagen tomada de: http://www.medssofia.com/pipetas.html Fecha Actualizacin: 19 Febrero 2011

Cloroformo

Imagen 8: Nitrgeno lquido Imagen tomada de: http://es.wikipedia.org/wiki/Nitr%C 3%B3geno_l%C3%ADquido Fecha Actualizacin: 01 Febrero 2011

Imagen 9: Cloroformo Imagen tomada de: http://www.cosasquecontar.com/2010 /10/nuestro-amigo-elcloroformo/Fecha Actualizacin: 01 Febrero 2011

Etanol

Imagen 10: Alcohol Etlico Imagen tomada de: http://sciencechimie.blogspot.com/2010/12/ el-diablito.htmlFecha Actualizacin: 01 Febrero 2011

4.2 MTODOS

Homogenizacin de tejidos: Colocar la muestra de tejido vegetal en un mortero Posteriormente colocar nitrgeno lquido y macerar (tejido congelado) en morteros congelados. Colocar la muestra en un tubo eppendorf Aadir 1ml de DNAzol por 25-50mg de tejido Mezclar a fondo utilizando una pipeta Incubar por 5-10 minutos a temperatura ambiente mezclando por inversin o rotacin mecnica. Aadir 300 de cloroformo al 50% y lo mezclamos en un vortex.

Centrifugacin: Centrifugar por 10 minutos a 10 rpm a 4 C o TA Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo (remueve tejidos insolubles, RNA, exceso de polisacridos del homogenizado, aisla DNA del material extracelular o celular). Precipitacin: Precipitar con 0.5 ml etanol 100% por 1 ml de DNA zol usado. Mezclar por inversin y almacenar a temperatura ambiente por 1-3 minutos. Centrifugar a 4rpm por 1-2 minutos a TA o 4 C. Eliminamos el sobrenadante.

Lavado: Lavar el precipitado dos veces con 500 de etanol 75%. En cada lavado invertimos el tubo de 3-6 veces. Almacenar los tubos verticalmente por 30 segundos o 1 minuto para depositar ADN en el fondo, eliminamos el etanol.

 Suspensin: Secar el DNA a TA por 10-15 minutos. Colocamos 100 l Tris EDTA (TE).

5. RESULTADOS Y OBSERVACIONES:

Homogenizacin de Tejidos

1. Al introducir el nitrgeno liquido en la muestra (hojas de acelga) colocada en los morteros congelados, se procedi a macerar la muestra (foto1). Hasta obtener un polvillo de color amarilloverdoso. (Pea, 2012) Se utilizo el nitrgeno lquido ya que las hojas pueden volver a hidratarse, perdiendo en gran parte el contenido de ADN. (Michiels et al, 2003).

2. Al colocar el DNA zol en la muestra ya macerada de las hojas en los tubos Eppendorf , esta recupera su humedad y toma el color caracterstico de las hojas de acelga (verde intenso)(foto2). (Pea, 2012) 3. Al incubar la muestra manualmente y en el bortex por pocos minutos, se puede apreciar una respectiva homogenizacin de la muestra. Antes de la adicin del cloroformo (Naranjo, 2012). 4. Antes de proceder a la centrifugacin de la muestra. Adicionamos cloroformo ya que es un disolvente muy fuerte, el cual desnaturaliza todas las protenas y adems disuelve todos los lpidos, permitiendo que al momento de la centrifugacin pueda haber una buena separacin de las fases (Molinari, 2001).

Centrifugacin

1. Al realizar la respectiva centrifugacin de la muestra a 1000 rpm por 10 minutos, se obtuvo una muestra separada en dos fases (foto3). (Naranjo, 2012). 1 fase => sobrenadante 2 fase => pellet 2. Para continuar con la extraccin de DNA tomamos con una micropipeta el sobrenadante de la muestra y colocamos en otro tubo (foto4). Posteriormente desechamos el pellet ya que posee muchos excesos y tejidos insolubles. (Pea, 2012).

Precipitacin

1. Para obtener la precipitacin del sobrenadante se adiciono etanol al 100%, y se procedi a la inversin por 3 minutos. (Pea, 2012). 2. La muestra obtenida se somete a centrifugacin a 4000 rpm en 2 minutos. En este momento ya se pueden apreciar pequeas Aglomeraciones de DNA (foto5) a manera de hebras muy finas. (Pea, 2012).

Lavado

Suspensin

3. Eliminamos el sobrenadante. Quedando en el fondo del tubo estas pequeas aglomeraciones de un color blanco caracterstico. (Pea, 2012). 1. Al realizar el respectivo lavado con etanol al 95% e invirtiendo los tubos que contienen la muestra de DNA. Se logro apreciar el DNA de la muestra con ms claridad pero en menores proporciones en las paredes del tubo Eppendorf, luego de realizar la respectiva eliminacin del etanol. (Olmedo, 2012). 2. Se utiliza etanol al 95 % ya que nos ayuda a obtener una muestra ms limpia. Pero se pierde un poco de DNA de la muestra. (Sarabia, 2005). 1. En esta parte de la prctica se adiciono el Buffer TE al DNA de la muestra. Para que proceda la respectiva suspensin (foto6). Posteriormente se lo agita en el bortex. (Pea, 2012). 2. Se almaceno la muestra por una semana.

Foto1: Mortero con muestra de hoja congelada y pulverizada. 16 Mayo 2021, Olmedo Alejandro

Foto2: Homogenizacin de la muestra. Adicin del DNA zol. 16 Mayo 2021, Olmedo Alejandro

Foto3: Muestra Centrifugada. Obtencin del sobrenadante y pellet 16 Mayo 2021, Olmedo Alejandro

Foto4: Extraccin del sobrenadante 16 Mayo 2021, Olmedo Alejandro

Foto5: Precipitacin del DNA. 16 Mayo 2021, Olmedo Alejandro

Foto6: DNA de la muestra adicionado Buffer TE para su respectiva suspensin 16 Mayo 2021, Olmedo Alejandro

6. DISCUSIN En la prctica realizada se pudo evidenciar resultados esperados, ya que en primer lugar al colocar el nitrgeno lquido la muestra se congela inmediatamente al contacto con el mismo y se procedi a la trituracin del tejido para romper la pared y membranas celulares sin que ocurra daos en las clulas; se realiz de una manera rpida para que la muestra no se oxide, y tom la coloracin verde amarillento, si la muestra se hubiera oxidado hubiera tomado una coloracin verde oscura. Luego de colocar la muestra en el tubo eppendorf, se coloc el DNA ZolReagent el cual contiene un detergente de origen no fenlico (no txico) derivado de la guanidina que hidroliz el RNA y es selectivo con el DNA. Despus se coloc el cloroformo el cual desnaturaliz protenas y removi lpidos. As, luego de centrifugar se observaron tres fases, de las cuales la fase superior nos servira. Luego al agregar el etanol con pureza del 100%, despus de hacer varias inversiones se pudo observar unas pequeas fibras pegadas al

tubo eppendorf, ya que el etanol cumple la funcin de precipitar los cidos nucleicos. Luego de centrifugar nuevamente, eliminar la fase superior, manteniendo el pellet y lavando con etanol al 95% se pudo apreciar que las fibras pequeas seguan pegadas al tubo por lo que todo iba correctamente en el proceso y finalmente se dej agregando una sustancia buffer de Tris EDTA, la cual se encarga de quelar iones de magnesio que son cofactores de enzimas nucleasas, inhibiendo su actividad en conjunto con el mantenimiento del pH alcalino, manteniendo la molcula de DNA intacta hasta el posterior uso de la misma en distintas tcnicas moleculares, en nuestro caso, iremos a cuantificar el mismo.

7. CONCLUSIONES El etanol al 100% nos permite precipitar la muestra, mientras que el etanol al 75% que utilizamos durante esta prctica nos permite jugar con los OH para de esta manera obtener una muestra ms limpia aunque se pierda un poco de DNA. Durante el proceso de lavado de la muestra obtenida, debemos ser cuidadosos para de esta manera no perderla. Uno de los problemas al trabajar con plantas es la composicin de la pared celular, la cual dificulta el acceso al interior para la extraccin de todo su contenido, incluyendo el ADN. Dicha pared se debe romper por accin mecnica, pulverizando el tejido con hielo seco o con nitrgeno liquido. Despus de haber realizado la centrifugacin el sobrenadante que obtuvimos es mucho ms claro. Para la extraccin del ADN en una forma correcta se debe usar todos los reactivos con una cantidad adecuada de la misma para que se produzca los efectos deseados con el detergente que hidroliza el ARN, el cloroformo que desnaturaliza protenas y el TE que evita que enzimas nucleasas acten sobre nuestro ADN

8. CUESTIONARIO

1. Cul es la funcin que cumple el DNA zolReagent? Reactivo preparado para aislar el ADN en un solo paso. Contiene un detergente, derivado de la guanidina, que hidroliza al ARN y es selectivo para la obtrencin de ADN a partir de lisados celulares. Los disolventes orgnicos de este reactivo son no fenlicos, obviando la toxicidad del mismo (Chomeczynski et al, 1997). El DNAzol Reagent es un reactivo muy completo y no txico (Traverso, 2005). Existen tres versiones del reactivo con funciones especficas: DNAzol para usos con tejidos, clulas y muestras lquidas

DNAzol ES especfico para DNA de plantas DNAzol BD especfico para DNA genmico o viral de sangre

2. Con qu otros reactivos se puede realizar extraccin de DNA? y describa brevemente un protocolo. Se puede utilizar Tris-HCL pH8 que alcaliniza el medio dndole mayor estabilidad al DNA, adems, emulcifica las grasas y permite separar el DNA de las protenas al degradarlas con fenol. Se aumenta EDTA para quelar los iones de magnesio y NaCl para estabilizar el ADN evitando as su degradacin. Se agrega el detergente CTAB para eliminar las grasas y destruir las membranas celulares. Se necesita de un buffer PVP para remover los polifenoles al formar puentes de hidrgenos con ellos y separndolas con centrifugacin. (Traverso, 2005). 3. Por qu es importante mantener a temperatura ambiente el DNA zolReagent? El reactivo DNA zol se mantiene estable entre 15 y 30 C, lmites que representan la temperatura ambiente promedio, por lo que si se mantiene a una temperatura que est bajo o que exceda estos lmites el reactivo se volver inestable y ya no funcionar eficientemente. Esto se debe a que el DNAzol es estable a temperatura ambiente, pero se activa con un cambio de ella (Traverso, 2005).

9. BIBLIOGRAFA ATIENZAR. F, EVENDEN. A, JHA. A, SAVVA. D, DEPLEDGE. M. 2000. Optimized RAPD analysis gener ates high qualitygenomic ADN profiles at high annealing temperature .Biotechniques; Cap 28: 52-54. DELLAPORTA, S., J. WOOD y J. HICKS. (1983). A plant minipreparation: Version II . Plant Molecular Biology Report Cap 1. 19-20. HILLS DM, MORTIZ C. 1990, Molecular Systematics. Sinauer Associates, INC Publishers. Sunderland, Massachu- setts. USA.; 238 p. MICHIELS A, ENDEA V, TUCKERB M, LIESBET V, LAEREA A. (2003). Extraction of high-quality genomic DNA from latex- containing plants. Analytical Biochemistry. USA; Cap 1, 85-89. MOLINARI, H. y M. CROCHEMORE. (2001). Genome DNA EXtraccion from Passiflora ssp. For PCR-RAPD analyses. Bras. Frutic. Cap 23: 447-450. CHOMCZYNSKI P., KAROL MACKEY, ROMAN DREWS Y WILLIAM WILFINGER . DNAzol: A Reagent for the Rapid Isolation of Genomic DNA. Molecular Research Center, Cincinnati. 1997

RADSTROM, P. et al. (2004) Pre-PCR processing: Strategies to samples . Mol. Biotechnol. Cap 26, 133 46.

generate PCR-compatible

SARABIA, JUAN. Comparacin de Tcnicas de Extraccin De ADN en Pinus Teocote Schiede Ex Schlechtendal. Universidad de Chapingo. Mxico. 2005 TRAVERSO GUTIRREZ, JOS. Caracterizacin Gnica, Protenica y Funcional de Tiorredoxinas de guisante (Pisum sativum).Universidad de Granada. 2005

Artculo en revista:

ROGERS, S y BENDISH, A.J. (1988), Extraccion Of Dna From Plant Tissues. Plant Molecular Biology Manual. A6:1-10. Kluwer Academic Publishers, Belgium.