Bioqumica e Biologia Molecular

Biologia Molecular
1 Semestre - 2009/2010 2 ano - Mestrado Integrado em Engenharia Biomdica Instituo Superior Tcnico

Baseado nas aulas e no livro The Cell, A Molecular Approach, Cooper & Hausman
Resumo por Ins Amorim

ndice
cidos Nucleicos ....................................................................................................................... 4 Replicao de DNA .................................................................................................................... 8 Reparao de DNA .................................................................................................................. 12 Recombinao de DNA............................................................................................................ 17 Transcrio de DNA................................................................................................................. 24 Regulao da Transcrio .................................................................................................... 29 Processamento de RNA ....................................................................................................... 36 Traduo de RNA .................................................................................................................... 40 Ciclo Celular ............................................................................................................................ 46 Laboratrio Restrio de plasmdeos.................................................................................... 54

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Biologia Molecular
A informao gentica de uma clula encontra-se armazenada no DNA, um cido nucleico, e expressa sob a forma de protenas. Para que essa informao seja passada de gerao em gerao necessrio que ocorra replicao e, para garantir a fidelidade desse processo e evitar mutaes, as clulas desenvolveram diversos mecanismos de reparao do DNA. A informao para a sntese de protenas contida no DNA encontra-se nos genes. Os genes so transcritos em RNA, outro cido nucleico, num processo denominado transcrio e que regulado por diversos mecanismos. Uma vez sintetizado o RNA correspondente ao gene que se quer expressar, este vai sofrer processamento (apenas nos organismos eucariotas) e dar origem a mRNA (RNA mensageiro). De seguida, d-se a sua traduo a sntese da protena. A traduo ocorre ao nvel dos ribossomas, molculas especializadas neste processo e constitudas por rRNA (RNA ribossomal) e protenas, e requer a interveno de RNA de transferncia tRNA, que transporta os aminocidos que vo constituir a protena final.

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cidos Nucleicos
cidos nucleicos so macromolculas (polmeros de nucletidos) onde armazenada a informao gentica de uma clula. Esto presentes em todos os seres vivos e podem surgir sob a forma de DNA (cido desoxirribonucleico) ou RNA (cido ribonucleico). O DNA actualmente a forma dominante de informao gentica , embora alguns organismos, como os retrovrus, utilizem apenas RNA. As unidades fundamentais dos cidos nucleicos, os nucletidos, so formadas por uma base azotada e um grupo fosfato ligados a uma pentose (ribose RNA ou desoxirribose DNA). A estrutura bsica de um nucletido compreende ento: Base azotada o Purinas: formadas por um anel duplo (penta-anel e hexa-anel) Adenina (A) Guanina (G) o Pirimidinas: formadas por um anel simples (hexa-anel) Citosina (C) Timina (T) exclusiva do DNA Uracilo (U) exclusiva do RNA Pentose acar de 5 carbonos o Ribose - RNA o Desoxirribose DNA (tem menos um grupo OH do que a ribose) Grupo fosfato responsvel pelo carcter cido das molculas. Tem um pKa1, pelo que em condies fisiolgicas (pH7) est sempre ionizado e com carga negativa.

Na formao de cada nucletido intervm reaces de condensao: base azotada liga-se ao carbono 1 da pentose, dando origem a nuclesidos. As bases azotadas tm a capacidade de rodar em torno do acar a que esto ligadas, podendo apresentar configurao syn ou anti, sendo a ltima a mais comum.

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Com a ligao de um grupo fosfato ao carbono 5 da pentose, forma-se um nucletido. Os nucletidos livres so tri-fosfatos - dNTP, perdendo dois grupos fosfato durante as reaces de polimerizao - passam a dNMP (ex: dAMP nucletido de adenina monofosfato). No caso do RNA temos NTP e NMP, respectivamente. A polimerizao de nucletidos, que d origem aos cidos nucleicos propriamente ditos, requer a formao de ligaes fosfodiesters entre o grupo hidroxilo do carbono 3 de um nucletido e o grupo fosfato do carbono 5 do nucletido seguinte. A cadeia polinucleotdica adquire assim uma direco, apresentando no terminal 5 um grupo fosfato e no terminal 3 um grupo hidrxido, e a sua sntese sempre feita na direco 5-3.

Em 1928, Fredrick Giffith descobre um factor gentico nas bactrias e, em 1952, Rosalind Franklin obtm a primeira imagem de raio-X do DNA. Finalmente em 1953, com base nos resultados de experincias anteriores, James Watson e Francis Crick apresentam, na Universidade de Cambridge, o modelo de dupla hlice para o DNA. Segundo este modelo, a molcula de DNA composta por duas cadeias polinucleotdicas, que se dispem em sentidos inversos, designando-se, por isso, antiparalelas. No esqueleto da cadeia distinguimos duas cadeias laterais e degraus centrais: as bandas laterais so formadas por molculas do grupo fosfato alternadas com pentoses e unidas por ligaes fosfodiesters; os degraus centrais so pares de bases ligados por pontes de hidrognio. A especificidade das ligaes hidrognio entre as purinas e pirimidinas a chamada complementaridade de bases: a adenina liga-se timina por uma ligao dupla (A = T) e a guanina liga-se citosina atravs de Pgina | 5

uma ligao mais forte, uma ligao tripla (G C) - a quantidade de adenina e timina, e de guanina e citosina numa clula sensivelmente a mesma (Regra de Chargaff). O DNA de dupla-hlice (dsDNA double-stranded DNA) adquire, geralmente, a forma - uma dupla hlice de mo direita com aproximadamente 10 pares de bases (3.4 cada par) por volta, ou seja, tem um passo de 34 ; 20 de dimetro e uma rotao de 36 entre os resduos. De um ponto de vista vertical, a distncia entre as cadeias de DNA pode ser pequena minor groove, ou grande major groove.

J o RNA apresenta uma estrutura em cadeia simples e est presente em 3 formas: RNA mensageiro (mRNA): cadeia de nucletidos que transporta a informao para a sntese de protenas aos ribossomas; RNA de transferncia (tRNA): transfere os aminocidos para os ribossomas; RNA ribossmico (rRNA): entra na constituio dos ribossomas. Nos seres procariontes, o DNA encontra-se no hialoplasma e um molcula circular. J nas clulas eucariticas, 99% do material gentico est no ncleo e apresenta-se sob a forma de cromatina - filamentos de DNA associados a protenas, as histonas. Tipo de cadeia
DNA Dupla hlice.

Pentose
Desoxirriobose

Bases Azotadas
Adenina (A) Guanina (G) Citosina (C) Timina (T) Adenina (A) Guanina (G) Citosina (C) Uracilo (U)

Localizao
Principalmente no ncleo. Forma-se no ncleo e migra para o citoplasma.

Quantidade
Constante para todas as clulas da mesma espcie. Varivel de clula para clula e com a actividade celular.

RNA

Simples, por vezes dobrada.

Ribose

Uma vez que o DNA se encontra sob a forma de uma dupla hlice, a sua estrutura pode ser modificada por factores externos, como a temperatura ou acidez do meio. Pgina | 6

O aquecimento do material gentico enfraquece e quebra as ligaes hidrognio entre bases complementares, levando desnaturao do DNA. A quantificao deste processo pode fazerse atravs da medio da absorvncia a 260 nm (pico de absoro das bases azotadas), verificando-se que quanto maior for o valor medido maior a desnaturao da cadeia em cadeia simples, as bases outrora viradas para o interior da molcula esto mais sujeitas radiao, absorvendo-a em maior quantidade. Registando os valores de absorvncia medida que se aumenta a temperatura do meio verifica-se que estes vo aumentando, o que indica que a elevao da temperatura actua como agente desnaturante. Representando graficamente a Abs em funo de T obtm-se as curvas de melting, nas quais se distingue um ponto de inflexo. Este ponto corresponde temperatura qual 50% da cadeia dupla de DNA se encontra desnaturada e designa-se temperatura de melting (TM), ou de fuso. Esta temperatura depende directamente do contedo de citosina e guanina da molcula, pois quanto maior for o contedo CG maior o nmero de ligaes triplas. Como estas ligaes so mais fortes, para que sejam quebradas e ocorra desnaturao necessria uma temperatura mais elevada, pelo que a um maior contedo CG corresponde uma maior TM. Aps a desnaturao, se a temperatura diminuir h hibridao do DNA, ou seja, restabelecemse as ligaes hidrognio entre as bases complementares e volta a formar-se uma cadeia dupla. As molculas de RNA so cadeias simples no lineares que apresentam estrutura secundria, como ganchos e hlices, pelo que pode ocorrer desnaturao do RNA. Cada molcula possui uma curva de melting diferente, em funo do seu tipo de estrutura secundria, que pode no estar associada a nenhum ponto de inflexo, pelo que no se define temperatura de melting para o RNA.

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Replicao de DNA
Durante a diviso celular necessrio copiar o material gentico para que toda a informao possa ser transferida da clula-me para a clula-filha sem erros. A clula cria cpias do seu prprio DNA atravs de um processo de replicao semi-conservativa no qual 50% do DNA da clula-filha pertenceu anteriormente clula-me cria-se uma nova cadeia com base numa cadeia-molde original. Para que ocorra replicao necessrio que o DNA se encontre na forma de cadeia simples. Existem 3 enzimas responsveis por esta tarefa (helicases, SSB e girases) que, embora no participem directamente no processo de replicao, so auxiliares de replicao. A replicao tem incio em zonas especficas, denominadas origem de replicao (Ori). Nos procariotas existe apenas uma destas regies, contrariamente ao que acontece nos eucariotas, que apresentam vrias origens de replicao. As regies Ori so ricas em timina e adenina a natureza desta ligaes mais fraca que as de guanina e citosina o que facilita a abertura da cadeia dupla, e so reconhecidas por um par de enzimas, as helicases. Cada helicase envolve uma cadeia simples do DNA e move-se num dado sentido, quebrando as pontes de hidrognio entre bases complementares. Essa quebra bidireccional - existem duas foras de replicao para cada origem de replicao, e requer consumo de ATP. Quando j se encontra em cadeia simples o DNA tem tendncia a voltar a estabelecer uma cadeia dulpa, uma vez que esta a sua forma mais estvel. Para impedir esse processo existe um conjunto de protenas, as SSB (single-stranded DNA-binding proteins), que actuam estabilizando a cadeia simples. H medida que ocorre a separao do DNA um outro tipo de enzimas, as DNA-girases ou topoisomerases, vo distorcendo a cadeia para que esta no se enrole em si prpria e dificulte ou impea o processo de replicao.

Uma vez separada em cadeia simples a molcula de DNA pode finalmente ser replicada. Os dNTPs existentes na clula vo sendo mobilizados e inseridos sequencialmente na cadeia (respeitando a complementaridade de bases) libertando um pirofosfato (dois fosfatos), por aco das DNA polimerases. Estas enzimas actuam apenas no sentido 5-3 e so incapazes de Pgina | 8

colocar os primeiros nucletidos, pelo que no do incio replicao. Para isso existem as RNA polimeraes, ou primases. As RNA polimerases comeam o processo de replicao adicionando alguns NTPs cadeia de DNA e formam os chamados primers, ou iniciadores, constitudos por cerca de 3 a 10 nucletidos de RNA. Uma vez sintetizados estes pedaos de RNA a DNA polimerase III (pol III) continua a replicao no sentido 5-3, agora j utilizando dNTPs.

A replicao d-se em simultneo nas duas cadeias do DNA. No entanto, enquanto na cadeia 3-5 (leading strand) ocorre replicao contnua no sentido da abertura da cadeia, isto , a pol III actua sem interrupes no sentido 5-3, na cadeia 5-3 (lagging strand) d-se replicao descontnua. Como a polimerase s actua no sentido 5-3 e est acoplada a um complexo que se movimenta na direco da abertura da cadeia dupla, o nico modo de fazer com que a enzima v nessa direco sintetizar a lagging strand por partes.1 Os fragmentos descontnuos so chamados fragmentos de Okasaki e esto associados, cada um, a um novo primer. Quando a polimerase chega ao final de um destes fragmentos e encontra o fragmento anterior, dissocia-se da cadeia e a replicao desse pedao termina. medida de ocorre a replicao, a polimerase I (pol I) percorre as cadeias formadas em busca de erros de sntese, corrigindo-os, e de primers, substituindo-os pelos nucletidos de DNA correctos. Tem, por isso, actividade de exonuclease hidrolisa DNA ou RNA nos sentidos 5-3 ou 3-5, para alm de actividade de polimerase adiciona novos nucletidos. Tambm as DNA polimerases III actuam como exonucleases. No entanto, enquanto as DNA polimerases I so capazes de reconhecer e corrigir erros de insero de nucletidos em qualquer ponto da cadeia e em qualquer sentido, as pol III apenas detectam erros nos ltimos nucletidos adicionados correco in loco, e no sentido 5-3.

A separao da cadeia original de DNA d origem a duas cadeias complementares, uma 5-3 (leading strand) e outra 3-5 (lagging strand). No sentido da abertura da cadeia pelas helicases a replicao contnua da cadeia 3-5 d-se no sentido 5-3, pois as cadeias complementares so anti-paralelas. J a replicao da cadeia 5-3 se fosse por replicao contnua dar-se-ia no sentido oposto, ou seja, no sentido 3-5. Como a polimerase III no actua neste sentido a replicao da lagging strand tem que ser descontnua.

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Como a pol I no consegue estabelecer a ligao entre os nucletidos que substitui e os que se encontram nas extremidades dos fragmentos de Okazaki, formam-se lacunas entre o grupo fosfato de um nucletido e o carbono 3' do outro. Essas falhas so posteriormente corrigidas pelas DNA ligases atravs do estabelecimento de uma ligao covalente.

Como as DNA polimerases apenas estendem os primers na direco 5-3 so incapazes de copiar a extremidade 5 (onde ocorre replicao descontnua) de cromossomas lineares, pelo que se torna necessria a interveno de mecanismos especializados nesta tarefa. Existem ento projeces de nucletidos na extremidade 3, os chamados telmeros, que no so mais do que sequncias repetidas de nucletidos nos terminais dos cromossomas. Estas sequncias so replicadas custa de enzimas, as telomerases, que catalisam a sntese dos telmeros mesmo na ausncia da DNA polimerase. As telomerases so transcriptases reversas, ou seja, sintetizam DNA a partir de um molde de RNA, e cada telomerase tem um molde complementar da sequncia do telmero. As telomerases ligam-se ento ao telmero e prolongam-no, sintetizando uma cadeia simples de DNA a partir do RNA complementar. Findo este processo, a telomerase desconecta-se e a replicao de mais uma poro da cadeia de DNA pode dar-se por replicao descontnua convencional. Forma-se um novo telmero que pode ser prolongado de novo. A maioria das clulas somticas no tem nveis de telomerases suficientemente altos para manter o comprimento dos seus telmeros por um nmero indefinido de divises celulares. Deste modo, medida que a clula envelhece verifica-se o desaparecimento progressivo dos telmeros e o encurtamento dos cromossomas, o que pode levar morte ou senescncia celular. Algumas patologias humanas, como o envelhecimento precoce, tm vindo a ser associadas a mutaes nas telomerases. Por outro lado, verifica-se que clulas cancergenas apresentam nveis anormalmente altos destas enzimas, o que lhes permite dividirem-se indefinidamente. O problema da existncia e replicao dos telmeros no se pe nos organismos procariotas pois estes tm um cromossoma circular. Neste caso, no existe nenhuma ponta solta e, portanto, todo o DNA replicado sem problemas.

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 importante referir que a replicao do DNA mitocondrial feita por enzimas especficas e que as enzimas mencionadas anteriormente, nomeadamente as polimerases, so responsveis pelo processo de replicao em E.coli. Nos mamferos intervm outros complexos, como exemplificado na imagem seguinte:

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Reparao de DNA
Alteraes no DNA so de grande importncia visto esta molcula guardar uma cpia permanente do genoma da clula. Se uma alterao no for corrigida antes da replicao ento vai ser perpetuada para todas as geraes seguintes. Apesar de a replicao ser muito fivel podem verificar-se algumas modificaes do DNA no final deste processo devido insero de bases incorrectas. E no s nesta fase da vida clula, mas em todas as fases do ciclo celular, podem ocorrer alteraes na sequncia e estrutura do DNA, espontneas ou induzidas por diversos factores externos como qumicos e radiao. Alteraes ao nvel da molcula de DNA podem impedir os processos de replicao e transcrio, bem como aumentar a frequncia de mutaes. Para manter a integridade dos seus genomas as clulas desenvolveram mecanismos de reparao que actuam no sentido de reverter reaces qumicas responsveis pela alterao do DNA e/ou substituir bases incorrectas ou danificadas. As alteraes espontneas dos nucletidos manifestam-se de duas formas principais: deaminao (remoo de um grupo amina de uma base) e depurinao (remoo da base purina de um nucletido). Pode ainda ocorrer metilao (adio de grupos metilo) que embora seja um processo normal nos nucletidos se se der de forma incontrolada prejudicial. A deaminao ocorre principalmente nos nucletidos de citosina e adenina e o resultado da substituio, na base, de um grupo amina (NH2) por um tomo de oxignio. A deaminao da adenina d origem a hipoxantina, uma base modificada, e da alterao da citosina resulta uracilo pelo que esta base, considerada exclusiva do RNA, pode surgir em DNA danificado.

Durante a replicao de uma regio que sofreu deaminao vai formar-se uma cadeia mutada e outra cadeia intacta pois apenas uma das cadeias originais est modificada. Na deaminao da citosina, por exemplo, um dos moldes ter um nucletido de uracilo pelo que a cadeia complementar ir apresentar uma adenina no local de guanina - ocorre uma mutao. A outra cadeia molde, como tem um nucletido de guanina que complementar da citosina, vai manter-se inalterada.

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Na depurinao h remoo total da base de um nucletido, por clivagem da ligao entre essa base e a desoxirribose. No local do nucletido fica apenas a base associada ao grupo fosfato e designa-se esse local por local AP - local apurnico ou apirimidnico.

semelhana do que acontece na deaminao, a replicao de uma regio danificada vai dar origem a uma cadeia mutada e outra cadeia intacta. S que neste caso, a cadeia mutada tem um nucletido a menos no local em que ocorre depurinao pois no apresenta nenhuma base que permita a ligao de uma base complementar. Esta mutao pode ter consequncias gravssimas para a clula, visto que se ocorrer numa regio codificante pode modificar completamente a protena resultante.

Das alteraes induzidas por radiao ou qumicos, podemos destacar a formao de dmeros de timina e de aductos de DNA, e a alquilao. A exposio radiao UV induz a formao de ligaes entre timinas de nucletidos adjacentes, dando origem a um dmero de timina. As duas bases de timina ligam-se entre si formando um anel de ciclobutano e deixam de estabelecer ligaes com as adeninas da cadeia complementar (ligao T-T mais forte que a ligao A-T). Consequentemente h distoro da estrutura das cadeias de DNA, o que pode bloquear a transcrio ou replicao. A reparao directa dos dmeros de timina d-se atravs de fotoreactivao. Nesta reaco, inversa dimerizao, utilizada energia da luz visvel para quebrar o anel de ciclobutano e permitir que as timinas se liguem de novo s adeninas complementares. Apesar de as bactrias utilizarem este processo muito frequentemente os mamferos e, nomeadamente, os seres humanos no so capazes de corrigir os dmeros de timina directamente, estando por isso mais sujeitos aos efeitos novios da radiao UV. Pgina | 13

Muitos agentes qumicos so agentes alquilantes, isto , so agentes reactivos que transferem grupos metilo ou etilo para bases do DNA, modificando-as quimicamente. A alquilao da guanina em particular d origem a O6-metilguanina, uma base complementar da timina em vez da citosina, pelo que a cadeia complementar desta molcula vir alterada. Este tipo de alterao do DNA pode ser reparada directamente por aco de enzimas (O6 metilguanina metiltransferase) que transferem o grupo metilo, adicionado posio O6 da guanina, por um resduo de cistena presente no stio activo da enzima.

Muitos agentes carcinognicos danificam o DNA pela introduo de grandes grupos aos nucletidos, os aductos de DNA, que alteram a configurao normal das cadeias e, por vezes, at da prpria molcula de DNA.

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Nem todas as alteraes do DNA podem ser reparadas directamente, como acontece com os dmeros de timina e a alquilao, pelo que as clulas tm mecanismos que permitem reparar vrios tipos de danos. Os mecanismos mais importantes, tanto em procariotas como em eucariotas, so os mtodos de reparao por exciso - exciso de base, exciso de nucletido e mismatch repair. Estes mecanismos reconhecem a zona danificada e eliminam a base ou nucletido alterados permitindo depois a sntese de uma nova cadeia de DNA a partir da cadeia complementar intacta. A reparao por exciso de base permite corrigir problemas em bases individuais, quer estas tenham sido danificadas por oxidao ou ionizao quer sejam o resultado de deaminao ou depurinao. Neste processo de reparao a base danificada reconhecida e por aco de enzimas especficas clivada a ligao entre a pentose e a base, formando-se um local AP. Este local posteriormente reconhecido por uma AP endonuclease que quebra a ligao fosfodiester entre o fosfato do local AP e a pentose do nucletido adjacente, deixando um nick (interrupo) na cadeia. O que resta do nucletido a ser reparado ento removido e, por aco da DNA polimerase e DNA ligase, adicionada uma nova base.

A reparao por exciso de nucletidos corrige dmeros de timina e aductos de ADN atravs da remoo de uma poro da cadeia de DNA que contm a leso. Em E.coli existe um sistema, o sistema Uvr, constitudo por 3 protenas (UvrA, UvrB e UvrC) que actua neste sentido. A zona danificada reconhecida por uma protena (UvrA) e outras protenas, as nucleases, clivam ligaes fosdiesters na extremidade 3 e 5 da leso (UvrB e UvrC, respectivamente). Por aco de helicases, so quebradas as pontes hidrognio entre as bases complementares e removido um oligonucletido (com cerca de 12 a 13 bases) que contm a regio alterada. DNA polimerase I e ligases actuam, de seguida, no sentido de sintetizar correctamente o pedao da cadeia excisado.

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O sistema mismatch repair reconhece e corrige bases no complementares adicionadas nova cadeia de DNA durante o decorrer da replicao. Em E.coli esse sistema, designado sistema MUT, formado por um conjunto de 3 protenas (MutS, MutL e MutH) que reconhecem a cadeia-filha por esta ainda no estar metilada (a metilao ocorre nos resduos de adenina de sequncias GATC). MutS reconhece a base alterada e forma um complexo com as restantes protenas. De seguida, a MutH, uma endonuclease, cliva a nova cadeia (ainda no metilada) no local da sequncia GATC e a MutS e MutL, juntamente com uma helicase e uma endonuclease, removem a cadeia de DNA entre o local de clivagem e a base mal colocada. Posteriormente, polimerases e ligases procedem sntese do DNA em falta.

Existem diversas polimerases, tanto nos procariotas como nos eucariotas, que podem participar na replicao ou na reparao do DNA. Na tabela seguinte sumarizam-se algumas caractersticas de certas polimerases de eucariotas: Enzima Pol
(tem actividade da RNA primase inicia a replicao do DNA)

Localizao Ncleo Ncleo Ncleo Ncleo Ncleo Mitocndria

Funo Replicao de DNA Replicao de DNA Replicao de DNA Reparao de DNA Reparao de DNA Replicao de DNA mitocondrial

Pol
(substitui a pol para continuar a replicao e tambm tem actividade correctora)

Pol
(similar a pol , existe em leveduras)

Pol Pol Pol

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Recombinao de DNA
O genoma de um organismo tem uma enorme plasticidade, facto para o qual contribui a recombinao gentica - troca de material gentico. Podem distinguir-se 2 tipos de recombinao: Recombinao homloga: entre sequncias de DNA semelhantes - homlogas; o Site-specific: requer homologia localizada e pode ser considerada um subgrupo da recombinao homloga; Recombinao no homloga ou heterloga: entre sequncias de DNA no homlogas; o Transposo: elementos genticos (transposes) movem-se ao longo do genoma, sendo inseridos e/ou retirados de diferentes locais. Do ponto de vista biolgico, a recombinao tm diversos papis importantes, dos quais podemos destacar: Gerar novas combinaes de genes/alelos. Ex: crossing-over da meiose; Gerar novos genes. Ex: rearranjo de imunoglobulinas; Integrar elementos de DNA especficos. Ex: virs; Reparar DNA. Relativamente utilidade prtica deste fenmeno, em biologia molecular utiliza-se recombinao para, por exemplo, mapear genes em cromossomas e criar clulas e organismos transgnicos. A recombinao homloga requer extensa homologia gentica, ou seja, necessrio que haja uma extensa complementaridade entre os nucletidos de 2 cadeias de cromossomas diferentes, ou mesmo de zonas do mesmo cromossoma que estejam repetidas ou invertidas. Usualmente a recombinao envolve a quebra de duas molculas de DNA na mesma regio, onde as sequncias so muito semelhantes, e a juno de um DNA ao outro, o que resulta num processo de "cross-over". Neste tipo de recombinao o local de troca pode estar localizado em qualquer zona da regio homloga e no implica a alterao do arranjo dos genes nos cromossomas. O processo mediado por enzimas e pode dar-se segundo dois modelos: Recombinao por copy choice d-se durante a replicao, quando duas cadeias de DNA prximas e homlogas esto a ser replicadas simultaneamente e, a dada altura, trocam de cadeia molde; Recombinao por breakage and rejoining no se d durante o decorrer da replicao e requer que as duas cadeias de DNA homlogas sofram um nick no mesmo local. A partir desses nicks, uma das cadeias de cada molcula parcialmente separada e emparelha com a cadeia da outra molcula que lhe complementar. Em ambos os casos, h o cruzamento de duas cadeias de DNA e a formao de heteroduplexes, regies da molcula de DNA formadas por cadeias de origens diferentes. zona de cruzamento d-se o nome de juno de Holliday e da sua resoluo pode resultar uma recombinao com ou sem alterao de genes.

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Aps a formao da juno de Holliday, que pode migrar ao longo da cadeia, as duas molculas rodam em torno do seu ponto de ligao. Dependo do sentido dessa rotao, as cadeias cruzam em direces diferentes e o produto final deste processo pode resultar em heteroduplexes recombinantes ou no recombinantes. Para separar as duas molculas ento necessrio cortar as cadeias cruzadas ao nvel da juno. Se o corte for horizontal (imagem esquerda) ento, aps a ligao das cadeias obtm-se molculas iguais s originais heteroduplexes no-recombinantes. Por outro lado, se o corte for vertical (imagem direita) verifica-se a recombinao propriamente dita, pois s neste caso h alterao na composio da cadeia as molculas resultantes so heteroduplexes recombinantes.

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Tomemos como exemplo as seguintes sequncia A, B e as suas sequncias complementares a,b, respectivamente: A: AATCGGTCTT a: TTAGCCAGAA B: CTGACCC b: GACTGGG

As molculas de DNA originais, que so iguais entre si, tm a seguinte sequncia de nucletidos: (1) AATCGGTCTTCTGACCC TTAGCCAGAAGACTGGG (2) AATCGGTCTTCTGACCC TTAGCCAGAAGACTGGG

Aps um corte horizontal, obtivemos molculas de DNA com sequncia AB e ab, iguais s molculas originais. Logo, embora tenha ocorrido troca de informao no se verificou recombinao porque no houve alterao dos genes. J no caso do corte vertical, as molculas obtidas tm sequncias Ab e aB. Apesar de B e b, e A e a, serem complementares, Ab (3) diferente de AB (1) e aB (4) no igual a ab (2), pelo que as sequncias resultantes so diferentes da original deu-se recombinao. Caso esta regio seja codificante, o gene pode deixar de ser transcrito ou a sua traduo pode resultar numa protena completamente diferente da protena original. (3) AATCGGTCTTGACTGGG TTAGCCAGAACTGACCC (4) AATCGGTCTTGACTGGG TTAGCCAGAACTGACCC

No processo de recombinao homloga intervm enzimas e protenas especficas, como as DNA polimerase e ligase e protenas SSB. Em E.coli, existem dois sistemas principais que tm um papel fundamental na regulao dos mecanismos de recombinao sistema Rec e sistema Ruv. O Sistema Rec constitudo por 4 protenas RecA e complexo RecBCD, e est envolvido nos passos centrais da recombinao homloga. O complexo RecBCD liga-se ao DNA de cadeia dupla (dsDNA) e processa-o, transformando-o em cadeias simples (ssDNA) prontas a serem utilizadas pela RecA. A protena RecA tem trs locais especficos de ligao ao DNA, pelo que comea por se ligar a ssDNA (1), formando um filamento de DNA-protenas, e, de seguida, associa-se tambm a dsDNA (2). Segue-se o alinhamento das cadeias homlogas e a RecA, custa de ATP, catalisa o emparelhamento da cadeia simples com a sua cadeia complementar proveniente do dsDNA (3), dando origem a um heteroduplex.

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O Sistema Ruv responsvel pela resoluo das junes de Holliday. A protena RuvA reconhece a juno e recruta a protena RuvB. O complexo RuvAB, que tem actividade de helicase, catalisa a migrao da juno, promovendo a variao da extenso do heteroduplex, e RuvC, que tem actividade de endonuclease, cliva as cadeias cruzadas. DNA ligases actuam no sentido de ligar as cadeias das molculas recombinantes, e termina o processo recombinao. A recombinao site-specific apenas requer homologia de pequenas regies especficas e permite a introduo ou perda de informao gentica. A grande variedade de imunoglobulinas do organismo humano deve-se a fenmenos de recombinao site-specific durante a maturao de linfcitos B e a construo de organismos geneticamente modificados pode ser feita utilizando este processo. Na criao de OGMs e tambm em processos de recombinao, por exemplo, entre cromossomas de bactrias e plasmdeos, o que acontece que existem genes flanqueados por informao gentica homloga a uma regio do DNA. Por recombinao, essa informao inserida na molcula. Por outro lado, recombinao entre sequncias homlogas de uma mesma molcula pode levar perda da regio entre essas sequncias.

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Os eventos recombinantes podem ser classificados em dois grupos: Recombinao intermolecular: entre molculas diferentes; o Cross-over simples: forma-se uma nica juno de Holliday; o Cross-over duplo: formam-se duas junes de Holliday; Recombinao intramolecular: entre regies da mesma molcula; o Repeties directas: as sequncias homlogas so exactamente iguais. Implica a perda irreversvel de DNA; o Repeties invertidas: as sequncias homlogas esto invertidas. Pode resultar na perda de funcionalidade de um gene mas um processo reversvel. Este tipo de recombinao muito utilizada por bactrias patognicas que, ao inverterem as suas sequncias, baralham o sistema imunitrio do hospedeiro.

A produo de flagelina, um agente virulento, por parte das salmonelas um bom exemplo de recombinao intramolecular com repeties invertidas. As bactrias podem produzir, alternadamente, flagelina H1 ou H2 conforme a orientao de uma das suas sequncias, o chamado segmento H. Este segmento flanqueado por duas sequncias invertidas, podendo sofrer inverso por recombinao, e contm o promotor do gene da flagelina H2 e de um repressor do gene da flagelina H1. Quando o segmento H se encontra numa orientao que permite a sua transcrio, produzida H2 e silenciado o gene da H1. Quando ocorre recombinao, o gene de H2 deixa de ser transcrito e passa a ser produzida H1. A alterao do tipo de flagelina produzida pela salmonela permite-lhe resistir mais tempo num organismo pois assim que o sistema imunitrio do hospedeiro j est preparado para combater um tipo de virulncia ela altera o tipo de flagelina produzida, desencadeando uma nova resposta imunitria.

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A recombinao no homloga no requer qualquer semelhana entre sequncias de DNA, estando antes associada ao movimento de sequncias transposes, ao longo do genoma. Os transposes so encontrados tanto em procariotas como em eucariotas e, em algumas leveduras e protozorios, fazem parte de mecanismos de regulao de genes. A unidade fundamental dos transposes so as sequncias de insero (IS), sequncias de entre 800 a 2000 nucletidos que contm um gene que codifica a protena transposase flanqueado por curtas sequncias invertidas repeties invertidas (IR).

A transposase responsvel por encontrar sequncias especficas de DNA e cortar a molcula nessa zona, separando a dupla-cadeia e deixando as sequncias complementares por emparelhar. Ao nvel dos transposes, esta protena cliva as extremidades da sequncia de insero e junta a IS cadeia previamente cortada. As falhas no DNA resultantes deste processo so reparadas por DNA polimerase e ligase.

Podemos destacar 2 tipos de mecanismos de transposio: Transposio mediada por DNA: o Transposio conservativa: o transposo move-se do stio dador para o local alvo; o Transposio replicativa: uma cpia do transposo inserida no local alvo, mantendo-se o elemento original;

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Transposio mediada por RNA: feita uma cpia de RNA do retrotransposo que depois traduzida em DNA e inserida no genoma. Este tipo de transposio ocorre, por exemplo, nos retrovrus como o HIV.

A insero de transposes em locais no especficos do genoma pode interferir com a expresso de genes, o que pode ter consequncias negativas para a clula. No entanto, em algumas leveduras e protozorios, transposes fazem parte de mecanismos de regulao gentica. Alguns transposes mais complexos, como os transposes compostos, so formados por genes flanqueados por sequncias de insero. Esses genes, por exemplo de resistncia a antibitico, podem ser copiados para vrios locais do genoma e contribuir para uma maior resistncia por parte desse organismo.

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Transcrio de DNA
Transcrio o processo atravs da qual se sintetiza RNA a partir da informao contida nos genes da molcula de DNA. Este processo apresenta algumas diferenas nos organismos procariotas e eucariotas e est sujeito a mecanismos de regulao, verificando-se que os genes so transcritos de acordo com as necessidades da clula. O genoma de procariontes constitudo maioritariamente por regies codificantes, isto , regies que contm genes e codificam a sntese de RNA. J nos eucariotas, a maior parte do seu genoma est sob a forma de regies intergnicas regies no codificantes (cerca de 98% do genoma humano so regies no codificantes). Sabe-se actualmente que estas regies, anteriormente sem qualquer funo atribuda e designadas por junk-DNA, tm um papel importante na transcrio. Os genes contm informao para a sntese de vrios tipos de RNA, cujo processo de transcrio o mesmo: RNA mensageiro, mRNA: molde utilizado pelos ribossomas para a sntese de protenas; RNA de transferncia, tRNA: intermedirio entre mRNA e os aminocidos durante a sntese proteica ao nvel dos ribossomas; RNA ribossomal, rRNA: um dos constituintes dos ribossomas. Um gene apresenta 3 regies: Regio promotora: onde se encontra o promotor, o local onde a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrio - essencial ao incio da transcrio mas no transcrito. Tem sequncias especficas em determinados locais as zonas consenso, que so reconhecidas pela polimerase e que tm que ser semelhantes para todos os genes pois nos procariotas s existe uma RNA polimerase (apesar de se verificar a existncia de vrios factores que direccionam a transcrio para locais diferentes, de acordo com as condies a que a clula sujeita). Nos procariotas existem duas zonas consenso de 6 nucletidos cada uma, uma na regio -10 e outra na regio -35, respectivamente 10 e 35 nucletidos antes do inicio da transcrio propriamente dita, em +1 . A regio -10, tambm designada caixa TATA, rica em adenina e timina e, devido natureza mais fraca das suas ligaes, mais sensvel aco das helicases pelo que a cadeia dupla se abre preferencialmente nesta zona.

Os promotores dos eucariotas so maiores e mais complexos. A sua caixa TATA encontra-se na posio -25 e outras zonas consenso localizam-se em -50, -75 e -100.

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Parte estrutural: zona transcrita. Encontra-se apenas numa das cadeias e a sua regio complementar, no codificante, denomina-se zona nonsense. Zona de terminao: onde a transcrio terminada. Na transcrio intervm uma enzima especfica, a RNA polimerase. Esta enzima transcreve a informao contida no DNA para RNA e, semelhana das DNA polimerases, catalisa o crescimento de cadeias de RNA no sentido 5-3. No entanto, no necessita de um primer para iniciar o processo. A RNA polimerase, assim como o processo de transcrio de procariotas e eucariotas apresenta algumas diferenas: A RNA polimerase de E.coli um complexo enzimtico formado por 5 subunidades (duas , , , e ). O factor essencial para o reconhecimento da regio promotora do gene e para a correcta ligao da RNA polimerase ao DNA mas no tem actividade cataltica, libertando-se da enzima quando j se encontram sintetizados alguns nucletidos de RNA;

Nos eucariotas existe uma polimerase diferente para cada tipo de RNA (mensageiro, de transferncia e ribossomal) mas todas so complexos formados por 12 a 17 subunidades e partilham algumas caractersticas, tanto entre si como com a polimerase dos procariotas.
Tipo de RNA sintetizado Genes nucleares mRNA miRNA tRNA rRNA 5.8S, 18S, 28S 5S snRNA e scRNA Genes mitocondriais Genes dos cloroplastos RNA polimerase II II III I III II e III Mitocondrial Cloroplastos

Semelhantes RNA polimerase bacteriana.

O processo de transcrio pode ser dividido em 3 fases: Iniciao: RNA polimerase liga-se a uma zona no especfica do DNA e migra ao longo da cadeia at encontrar o promotor. A liga-se especificamente s zonas -35 e -10 e, ao nvel da caixa TATA, helicases e girases promovem a abertura da cadeia dupla de DNA ao longo de 12-14 nucletidos. A transcrio iniciada na posio +1 pela adio de 2 NTPs cadeia molde e, aps a polimerizao de cerca de 10 nucletidos no sentido 53, o factor libertado e d-se inicio proxima fase. Nota: os nucletidos livres encontram-se na forma de trifosfatos - NTPs, pelo que durante a sua polimerizao so libertadas molculas de pirofosfato (dois fosfato);

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Elongao: o crescimento da cadeia de RNA continua. A polimerase mantm-se ligada ao DNA e vai desenrolando a cadeia dupla sua frente e hibridizando a cadeia que deixa para trs, ficando apenas uma regio com cerca de 15 pares de nucletidos na forma de cadeias simples. A transcrio continua at que a polimerase encontre um sinal de terminao;

Terminao: quando a RNA polimerase encontra a zona de terminao dissocia-se do DNA e o processo de transcrio termina. Existem dois mecanismos diferentes responsveis pela terminao: o Dependente de factor , independente da sequncia: a terminao est dependente de uma protena, o factor , que se liga a longos segmentos (cerca de 60 nucletidos) no final da molcula de RNA; o Independente de factor , dependente da sequncia: a zona de terminao formada por duas sequncias invertidas de citosina e guanina, intercaladas por outras bases e seguidas de nucletidos de adenina. A transcrio das zonas ricas em CG leva associao das bases complementares e formao de uma estrutura secundria - um gancho de terminao, que destabiliza a ligao da RNA polimerase ao DNA e leva sua dissociao. Pgina | 26

Para alm do seu papel na terminao da transcrio, os ganchos de terminao desempenham tambm um papel protector: o RNA mensageiro tem um tempo de vida muito curto, sendo rapidamente digerido por RNAses no sentido 3-5. A formao de ganchos de terminao nos terminais do mRNA dificulta a sua digesto por parte dessas enzimas e funciona como uma forma de proteco, permitindo que o RNA se mantenha integro o tempo suficiente para que ocorra traduo.

O processo de transcrio acima descrito diz respeito aos organismos procariotas. Nos eucariotas, como j vimos anteriormente, a estrutura dos promotores e das RNA polimerases diferente, pelo que vo existir algumas diferenas nos mecanismos de transcrio. O reconhecimento do promotor e a ligao da RNA polimerase no esto associados a um factor mas dependem de diversos factores de transcrio - factores gerais, comuns transcrio de todos os genes, ou especficos para determinados genes. Os factores de transcrio so, geralmente, protenas que tm uma regio que se liga ao DNA e outra regio que interage com outras protenas e estimula a transcrio. Na iniciao da transcrio, a RNA polimerase II associa-se ao promotor, ao mediador e a outros factores de transcrio, dando origem ao complexo RNA polimerase II/Mediador - o complexo de iniciao. A este complexo podem ligar-se ainda estimuladores (enhancers), que so sequncias de DNA que se associam a factores de transcrio que regulam a actividade da RNA polimerase. Os estimuladores situam-se em regies intergnicas que podem estar localizadas em qualquer ponto dos cromossomas, sendo a sua ligao possvel devido existncia de loops na molcula de DNA.

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A transcrio iniciada quando se d a fosforilao dos resduos de serina e trionina do CDT (carboxi terminal domain), uma sequncia de aminocidos que faz parte da RNA polimerase. Iniciada a transcrio, o complexo de iniciao dissocia-se e o CDT fosforilado permite a ligao de factores de transcrio que intervm na elongao e no processamento de RNA.

Na terminao da transcrio em eucariotas, a RNA polimerase reconhece uma sequncia de terminao e libertada cerca de 10-35 nucletidos depois. As sequncias de terminao, por exemplo AAUAAA, so sempre semelhantes, embora possam no ser exactamente iguais em todos os genes.

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Regulao da Transcrio
O genoma de um organismo contm milhares de genes que no so todos transcritos em simultneo. Existem mecanismos de regulao, tanto em procariotas como em eucariotas, que actuam ao nvel da iniciao ou da elongao no sentido de silenciar ou promover a transcrio de determinados genes, de acordo com as necessidades da clula. Em organismos procariotas a regulao d-se principalmente na etapa da iniciao e pode envolver diversos mecanismos, dos quais iremos estudar dois exemplos: a regulao do opero da lactose e do opero do triptofano em E.coli. (opero ver captulo Traduo)

Opero da lactose
A lactose pode ser degrada em glicose e galactose, molculas de onde extrada energia metablica, por aco de uma enzima especfica, a -galactosidase. Esta e outras enzimas envolvidas no metabolismo da lactose s so sintetizadas quando existe lactose disponvel na clula, evitando assim a sntese de protenas e RNA desnecessrias, pelo que se diz que h regulao da transcrio por induo do substrato. Essa induo pode ser positiva ou negativa, como veremos de seguida. Os genes responsveis por esse metabolismo distribuem-se por uma estrutura monocistrnica e por uma estrutura tricostrnica. O opero da lactose, a estrutura tricistrnica, constitudo um promotor, um operador e por 3 genes que so transcritos em conjunto: Promotor (P): sequncia promotora, local de ligao da polimerase; Operador (O): sequncia qual se pode ligar uma protena reguladora (LacI), que impede a transcrio dos genes do opero; Gene LacZ: codifica a -galactosidase, enzima responsvel pela quebra da ligao glicosdica entre a glucose e a galactose. o gene mais importante, apresentando maior afinidade na regio RBS (RBS - ver captulo Traduo), e o facto de estar na extremidade 5 protege o seu transcrito de mRNA de uma degradao demasiado precoce; Gene LacY: codifica a permease, uma protena de membrana especfica para o transporte de lactose para o interior das clulas; Gene LacA: codifica a transacetilase, uma protena que modifica a galactose mas que no essencial ao seu metabolismo. o gene menos importante. A estrutura monocistrnica consiste em: Promotor (Pi): promotor do gene LacI; Gene LacI: gene repressor que codifica uma protena reguladora (LacI). Na ausncia de lactose LacI liga-se ao operador do opero da lactose e impede a transcrio dos seus genes. Quando h lactose disponvel na clula, esta liga-se protena reguladora LacI, alterando a sua configurao tridimensional. Consequentemente, deixa de existir afinidade entre esta protena e o operador pelo que os genes dos opero podem ser transcritos. So sintetizadas as protenas LacZ, LacY e LacA e a lactose degradada. Este tipo de regulao diz-se por induo negativa visto a presena de LacI impedir a transcrio. Pgina | 29

Apesar de a lactose ser uma fonte de energia, como a glicose um acar mais simples o seu metabolismo mais rpido. Como tal, quando existe glucose disponvel na clula esta vai ser utilizada primeiro e, s quando a glucose se tiver esgotado, que a lactose comea a ser usada como fonte de energia. Na presena apenas de um acar, um grfico do crescimento populacional de uma colnia de bactrias do tipo (1). Mas na presena de dois acares, digamos glucose e lactose, o crescimento do tipo (2) e diz-se um crescimento diauxico. Em (2) verifica-se que as bactrias se dividem exponencialmente para depois o seu crescimento estabilizar (a) medida que o acar mais simples, neste caso a glucose, consumido. Segue-se uma nova etapa de crescimento e estabilizao (b) quando consumido o acar restante, a lactose. Se representssemos os nveis de -galactosidade na clula ao longo do tempo obteramos uma curva do tipo (c).

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Verifica-se ento que a o opero da lactose reprimido na presena de glucose. Esta represso catablica pela glucose mediada por um mecanismo de induo positiva associado aos nveis de AMP cclico (cAMP adenosina monofosfato ciclica): cAMP associa-se a uma protena reguladora, CAP (catabolic activator protein), que se liga a uma sequncia de DNA perto do promotor do opero da lactose. A CAP actua interagindo com a subunidade da RNA polimerase e facilita a sua ligao ao promotor, promovendo a transcrio. Quando os nveis de glucose na clula so baixos h maior produo de cAMP, pelo que favorecido o metabolismo da lactose. Por outro lado, em condies de elevada disponibilidade de glucose, a produo de cAMP baixa e o operador da lactose silenciado.

Resumindo, a regulao da transcrio do opero da lactose uma regulao por induo do substrato: Induo negativa: LacI impede a transcrio. Na presena de glucose LacI desactivado e a lactose degrada; Induo positiva: CAP promove a transcrio do opero. Na presena de glucose cAMP no activa o CAP e no h degradao da lactose. Lactose LacI inactivado cAMP-CAP funcional Elevada transcrio do opero Lactose + Glucose LacI inactivado cAMP-CAP no funcional Baixa transcrio do opero

Em engenharia gentica comum utilizar-se o promotor do opero da lactose (Plac) para clonar genes de interesse em plasmdeos, pois para iniciar a transcrio basta fornecer lactose clula. No entanto, em vez de lactose utiliza-se uma molcula sinttica anloga lactose mas no metabolizvel, IPTG (IsoPropilTrioGalactosdeo), que inibe o repressor LacI mas no consumida pela clula, o que torna o processo mais rentvel e igualmente eficaz.

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Opero do Triptofano
A regulao da transcrio do opero do triptofano pode ser generalizada para os restantes aminocidos e uma regulao por represso do produto final pois, ao contrrio do opero da lactose que est sempre silenciado na ausncia do substrato, o opero do triptofano est sempre activo, sendo reprimido apenas quando este aminocido abunda na clula. A represso da transcrio requer dois elementos: Apo-repressor: protena que por si s no capaz de se ligar ao operador e inibir a transcrio. Necessita de um co-repressor para adquirir a sua forma activa; Co-repressor: elemento que se liga ao apo-repressor, activando o complexo repressor e inibindo a transcrio. Neste caso, o co-repressor o prprio triptofano. O opero do triptofano uma estrutura pentacistrnica que apresenta regies especficas: Promotor (P): regio promotora, local de ligao da polimerase; Operador (O): tal como no opero da lactose, uma sequncia qual se podem ligar protenas reguladoras que impedem a transcrio dos genes do opero; Regio R (R): codifica o apo-repressor; Regio Lder (L) e regio do Atenuador (A): localizadas entre o promotor/operador e os genes. Participam na regulao da transcrio por um mecanismo diferente do repressor, o mecanismo de atenuao; Genes E, D, C, B, A: codificam as protenas que intervm na sntese de triptofano.

Para alm da regulao por um complexo repressor existe um outro mecanismo que controla a transcrio de triptofano. Este mecanismo, associado s regies L e A, de regulao por atenuao e permite que a transcrio seja inibida mesmo quando a quantidade de triptofano na clula no suficiente para activar o apo-repressor ou quando este mecanismo no eficaz. Se no houve represso ao nvel do operador inicia-se a transcrio das regies L e A. O RNA resultante pode ser dividido em 4 zonas 1 (L) e 2, 3 e 4 (A), ricas em contedo CG e que Pgina | 32

tendem a formar ganchos. Dependo dos ganchos que se formam pode ou no ocorrer transcrio: Gancho 2-3, gancho de anti-terminao: este gancho forma-se relativamente longe da RNA polimerase, no a destabilizando, pelo que a transcrio dos genes continua; Gancho 3-4, gancho de terminao: a sua formao destabiliza a RNA polimerase e provoca a sua dissociao do DNA, interrompendo a transcrio. A quantidade de triptofano disponvel na clula que vai determinar o tipo de gancho que se forma.

Logo aps a transcrio inicia-se a traduo da regio L no chamado pptido Lder. Este pptido formado por 14 aminocidos e na posio 11 e 12 requer a introduo do aa triptofano. De acordo com a quantidade de Trp disponvel duas situaes so possveis: Se a concentrao de Trp elevada a traduo rpida, o que apenas permite a formao de um gancho 3-4. A transcrio pra e no sintetizado Trp, que existe em abundncia; Se existe carncia de Trp a traduo mais demorada e as zonas 2, 3 e 4 ficam livres para se associarem entre si. Como o gancho 2-3 mais forte forma-se preferencialmente, implicando a continuao da transcrio e a posterior sntese de triptofano.

A regulao por atenuao exclusiva dos procariotas pois implica que a transcrio e a traduo ocorram em simultneo, o que no se verifica em organismos eucariotas.

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Regulao em eucariotas
Como nos organismos eucariotas no existem estruturas policistrnicas nem ocorre transcrio e traduo em simultneo, os mecanismos reguladores j descritos s se aplicam a seres procariotas. Nos eucariotas existem inmeros factores de transcrio e estimuladores, como j foi visto anteriormente, e vrios mecanismos, como a metilao, que regulam o processo de transcrio. Metilao a adio de grupos metilo no carbono-5 de resduos de citosina que precedem uma guanina, as chamadas ilhas CpG. As enzimas responsveis pela metilao so as metilases e as deacetilases catalisam o processo inverso. A regulao da transcrio d-se pela presena ou ausncia de metilao do promotor de um gene: quando o promotor se encontra metilado verifica-se que a transcrio inibida; se o promotor no est metilado ento a transcrio decorre normalmente.

Nos eucariotas necessria a interaco com vrias protenas e entre diferentes regies do cromossoma para que ocorra a transcrio. No entanto, o DNA encontra-se muito compactado e associado a protenas, as histonas, o que pode comprometer a sua disponibilidade para a transcrio. O DNA precisa ento de ser uma estrutura compacta, para que se possa concentrar no ncleo da clula, mas simultaneamente dinmica, de modo a permitir a transcrio. O genoma dos eucariontes est concentrado no ncleo e organizado em cromossomas. Os cromossomas s se encontram individualizados durante a diviso celular, chamando-se cromatina sua forma indiferenciada. A unidade bsica da cromatina so os nucleossomas, sequncias de cerca de 200 nucletidos enroladas em torno de um conjunto de protenas, as histonas (H1, H2A, H2B, H3 e H4). A cadeia dupla de DNA d duas voltas em torno de dois discos de 4 histonas (H2A, H2B, H3 e H4) empilhados e ligados lateralmente por uma outra histona (H1). Os nucleossomas so depois compactados e, no seu conjunto, podem apresentar-se na forma de: Eucromatina: contm genes e sequncias que participam na transcrio. No est demasiado compactada; Heterocromatina: contm apenas regies no codificantes (por exemplo, a regio do centrmero) e est extremamente compactada. Pgina | 34

A descompactao da cromatina est associada acetilao (adio de grupos acetil - Ac) da histonas e demetilao do DNA. Por outro lado, a compactao da cromatina acompanhada pela metilao do seu DNA e pela desacetilao das histonas.

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Processamento de RNA
Aps a sua transcrio, os RNAs sofrem processamento antes de adquirirem a sua forma funcional. rRNAs e tRNAs de procariotas e eucariotas so processados, em contraste com os mRNAs, em que os nicos sujeitos a este processo so provenientes de organismos eucariotas.

Processamento de tRNA
Os aminocidos so adicionados s protenas durante a traduo por intermdio de RNA de transferncia. Como existem 20 aminocidos tm que existir, pelo menos, 20 tRNAs. Na realidade verifica-se que, conforme a espcie, existem 60 a 80 molculas diferentes de RNA de transferncia, o que indica que um mesmo aminocido pode ser transportado por vrios tRNAs. Cada molcula de tRNA codificada por um gene diferente e da sua transcrio resulta uma sequncia de nucletidos, pr-tRNA, que se organiza numa estrutura secundria caracterstica. Essa estrutura, comum ao pr-tRNA e ao tRNA, em forma de trevo devido s ligaes hidrognio que se estabelecem entre bases complementares e levam formao de ganchos. Por ser muito estvel, permite ao RNA ter um tempo de vida na clula bastante longo. O processamento do pr-tRNA leva sua maturao em RNA e sua activao. O processamento tem duas fases, sendo que em algumas molculas de pr-tRNA ainda necessrio clivar previamente sequncias nos seus terminais, processo levado a cabo pela enzima RNase P. O processamento engloba ento 2 fases sucessivas: Adio de uma sequncia CCA ao terminal 3. Nalguns casos esta sequncia codificada no prprio gene do RNA de transferncia, mas noutros casos tem que ser colocada por aco de uma enzima. neste local que posteriormente se vai ligar covalentemente o aminocido; Alterao de bases. Aproximadamente 10% das bases de nucletidos em posies especficas so modificadas. O papel desta modificao ainda no foi bem esclarecido.

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Aps o processamento ainda necessrio activar o tRNA, passando este a ser designado aminoacil tRNA. A activao d-se pela ligao de um aminocido ao terminal 3, reaco com gasto de ATP e mediada pela enzima aminoacil tRNA sintetase. Existe uma enzima para cada aminocido, verificando-se que a activao de diferentes tRNAs que transportam o mesmo aa feita pela mesma enzima.

Uma vez activado, o tRNA pode seguir para os ribossomas e intervir na sntese proteica. A sequncia de 3 nucletidos, anti-codo, que permite o reconhecimento do codo de mRNA e a adio do aminocido correcto, oposta ao local de ligao do aminocido, localizando-se no terminal de um dos ganchos da molcula de tRNA.

Processamento de rRNA
Os ribossomas, locais onde ocorre a sntese proteica, so formados por rRNA e protenas ribossomais. Cada ribossoma tem duas subunidades, uma subunidade pequena e outra grande, formadas por diferentes rRNAs que so caracterizados pelo seu coeficiente de sedimentao (S). Tambm os prprios ribossomas se caracterizam por este coeficiente. Os ribossomas dos procariotas, 70S, so formados por 3 rRNAs - 23S, 16S e 5S, que derivam do processamento de um nico transcrito de rRNA. A subunidade pequena, 30S, formada por 21 protenas e rRNA 16S (este rRNA tem valor taxonmico e utilizado para determinar, por exemplo, a espcie de bactrias). Na constituio da subunidade grande, 50S, entram rRNA 5S e 34 protenas. Os ribossomas de eucariotas, 80S, tm 4 rRNAs 28S, 18S, 5.8S e 5S, dos quais apenas o 5S transcrito separadamente. A subunidade pequena, 40S, formada por rRNA 18S e aproximadamente 30 protenas. Na constituio da subunidade grande, 60S, entram rRNA 5S, 5.8S e 28S e cerca de 45 protenas.

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No processamento de rRNA d-se a clivagem do transcrito de pr-rRNA nas sequncias finais. Nos procariotas essa clivagem feita em simultneo para os 3 rRNAs mas nos eucariotas, para alm de o 5S ser codificado separadamente, o transcrito que contm as restantes sequncias primeiro divido em duas molculas precursoras uma que contm apenas 18S e outra onde se encontram 5.8S e 5S, e s depois que estas so clivadas dando origem ao produto final. Posteriormente, o rRNA 5.8S liga-se ao 28S atravs de pontes hidrognio.

Processamento de mRNA
Nos procariotas, o mRNA est pronto a ser traduzido logo aps a transcrio. J nos organismos eucariotas, o transcrito de pr-mRNA sintetizado no ncleo ainda vai sofrer extensas modificaes at poder ser utilizado no processo de traduo. O processamento de mRNA de eucariotas ocorre no ncleo e inclui: Capping em 5: adio ao terminal 5 de um nucletido com uma base modificada, m7G 7-metilguanina. neste terminal que se vo ligar os ribossomas para que se d a traduo completa do mRNA; Poliadenilao: adio de nucletidos de adenina ao terminal 3 e formao de uma cauda poli-A de comprimento varivel (pode atingir as 300 bases). Para alm de regular mecanismos de traduo e estabilidade, esta cauda tem ainda um papel protector na medida que atrasa a digesto do RNA pela RNases, permitindo assim que a sua sequncia codificante se mantenha ntegra durante um perodo de tempo maior. Nota: a poliadeniao no um processo exclusivo dos eucariotas, tendo-se vindo a verificar que tambm ocorre em alguns mRNAs de procariotas; Pgina | 38

Splicing: remoo de intres e colagem de exes - intres so sequncias que no codificam para o mRNA final, em oposio ao exes, que codificam informao para o mRNA maturo. Ocorre em grandes complexos, os spliceossomas, formados por protenas e pequenos RNAs nucleares (snRNA). Os snRNAs reconhecem sequncias nos locais de splicing do pr-mRNA e catalisam a reaco de splicing. A maioria dos genes de eucariotas contm mltiplos intres pelo que possvel juntar exes em diferentes combinaes atravs de mecanismos de splicing alternativo. Estes mecanismos, muito importantes na regulao da expresso gentica, permitem ainda que intres passem a ser considerados exes, no sendo removidos e permitindo novas combinaes.

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Traduo de RNA
Traduo o processo que, ao nvel dos ribossomas, permite a sntese de protenas a partir de mRNA. Os mecanismos de sntese so semelhantes nos procariotas e eucariotas, embora existam algumas diferenas, nomeadamente na iniciao da traduo e no nmero de protenas traduzidas a partir do mesmo mRNA. O mRNA de eucariotas monocistrnico, ou seja, apenas contm informao para a sntese de uma protena. J o mRNA de procariotas pode ser policistrnico, o que significa que pode albergar informao para a sntese de vrias protenas. sequncia de genes contemplados no mesmo RNA, do qual resulta um mRNA policistrnico, d-se o nome de opero. Nos terminais do mRNA, tanto de procariotas como de eucariotas, existem regies no traduzidas (UTR unstranslated regions) que podem conter informao necessria iniciao e terminao da traduo.

O processo de traduo pode ser divido em 3 fases - iniciao, elongao e terminao:

Iniciao: as subunidades pequenas dos ribossomas ligam-se aos locais de iniciao do mRNA e quando encontrado o codo de iniciao (metionina AUG) liga-se a Pgina | 40

subunidade grande e forma-se um complexo funcional. A iniciao depende de diversos factores de iniciao, tanto nos eucariotas como nos procariotas, embora os locais de iniciao sejam diferentes para cada um dos casos. Nos eucariotas, os ribossomas ligam-se ao terminal 5 do mRNA, que reconhecido por ter a base modificada 7-metilguanina, e migram at encontrarem o codo de iniciao. A eficincia da iniciao afectada pela sequncia que rodeia o codo de iniciao que, em certos casos, pode no ser reconhecido. Nos procariotas, como no existe cap em 5, os locais de iniciao so sequncias especficas que precedem o codo de iniciao, as chamadas sequncias ShineDalgarno (SD) ou ribossome binding-site (RBS). Estas sequncias esto presentes antes da informao para a traduo de qualquer protena, mesmo nos mRNAs poliscistrnicos, e so complementares de uma regio do rRNA 16S que constitui a subunidade pequena dos ribossomas procariotas. A maior ou menor afinidade do rRNA com as sequncias SD traduz-se numa maior ou menor traduo, respectivamente, da protena em questo. Deste modo possvel que num mRNA poliscistrnico o balano final das vrias protenas produzidas possa no ser o mesmo. De um modo semelhante, as protenas mais longe do terminal 3 (por onde comea a degradao por parte das RNases) tm maior probabilidade de serem traduzidas;

Elongao: a cadeia polipeptdica cresce pela sucessiva adio de aminocidos. A traduo inicia-se pelo terminal N (amina) da protena e segue at ao seu terminal C (carboxilo). O mecanismo de elongao muito semelhante em procariotas e eucariotas. subunidade pequena dos ribossomas encontra-se ligado o mRNA (a ligao corresponde a 9 nucletidos, 3 codes) e a subunidade grande tem 3 locais de ligao para tRNA activado, os locais APE: o Local A - aminoacyl: onde se liga o aminoacil-tRNA que contm o aminocido a ser adicionado ao pptido em crescimento; o Local P peptidyl: local onde se encontra ligado o peptidil-tRNA, isto , o tRNA cujo aminocido j se encontra ligado ao pptido em formao; o Local E exit: local de sada.

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Quando o ribossoma atinge o codo de iniciao liga-se um tRNA de metionina ao codo iniciador e recrutada a subunidade grande do ribossoma. Formado o complexo, o tRNA de metionina encontra-se no local P e o local A fica vazio. O tRNA complementar do prximo codo ocupa ento o local A, forma-se uma ligao peptdica entre os aminocidos adjacentes e o tRNA iniciador muda-se para o local E, sendo depois expulso. No ribossoma, o mRNA desloca-se 3 nucletidos no sentido 53, ou seja, desloca-se um codo, levando a que o segundo tRNA passe para o local P e que o local A fique livre para a ligao de outro tRNA. Este processo repete-se at que seja encontrado um codo stop e a sntese da protena termine.

Os ribossomas podem existir livres ou associados ao retculo endoplasmtico rugoso. Muitas vezes uma protena traduzida longe do local onde actua pelo que se torna necessrio proceder ao seu transporte. Nalguns casos, o mRNA codifica uma sequncia sinal no terminal amina (N) que no tem actividade cataltica e que participa no transporte da protena, sendo libertada assim que esta atinge o seu destino final. Pgina | 42

Assim que um ribossoma se afasta do local de iniciao um outro ribossoma pode ligar-se e dar incio traduo de mais uma protena. assim possvel que um mesmo mRNA seja traduzido em simultneo por vrios ribossomas, que esto usualmente espaados de cerca de 100 a 200 nucletidos, e a cujo grupo se d o nome de polissomas.

Durante a traduo, a cadeia polipeptdica que vai sendo sintetizada fica sujeita a interaces entre os seus aminocidos constituintes. Como a configurao final de uma protena funcional influenciada pela sua sequncia total de aa e pelo meio em que se encontra, para prevenir a formao de estruturas tridimensionais antes de ser terminada a traduo e antes de a protena ter sido transportada para o seu local de aco, um conjunto de protenas estabilizam a sequncia linear de aminocidos. Quando a cadeia polipeptdica j foi toda sintetizada e j se encontra no local em que necessria, essas protenas, os chaperes, dissociam-se da cadeia e permitem ento que a protena adquira a configurao tridimensional que a torna funcional.

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Terminao: encontrado um codo stop e a sntese termina. A protena libertada e o ribossoma dissocia-se. No existem tRNAs com anti-codes complementares aos codes stop. Quando se atinge um codo stop este reconhecido por factores de terminao, que so protenas que se ligam ao local A e estimulam a hidrlise da ligao peptdica entre o pptido at a sintetizado e o tRNA no local P. A protena ento libertada, assim como as subunidades do ribossoma e o tRNA.

A informao para a ordenao dos aminocidos est contida nos genes, existindo um cdigo de correspondncia cdigo gentico entre as 4 letras do RNA e os 20 aminocidos conhecidos. Ao conjunto de 3 nucletidos, tripleto, necessrios para a sntese de um aminocido chamamos codogene (DNA), codo (mRNA) e anti-codo (tRNA). O cdigo gentico apresenta diversas caractersticas: Universal: comum a quase todas as clulas; No ambguo: a um tripleto de nucletidos corresponde apenas um aminocido; Redundante/degenerado: vrios codes podem sintetizar um mesmo aminocido. A degenerescncia do cdigo gentico vai de 1 a 6 (aminocido arginina est associado a 6 codes difernetes); O terceiro nucletido no to especfico. A degenerescncia d-se muitas vezes na terceira base; O tripleto AUG tem uma dupla funo: codifica o aminocido metionina e ao mesmo tempo um codo de iniciao. Podem existir outros codes de iniciao mas a metionina o mais comum; Os tripletos UAA, UAG, UGA so codes de finalizao ou codes stop: no codificam qualquer aminocido e sinalizam o fim da sntese proteica.

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Ciclo Celular
O conjunto de transformaes sofridas por uma clula desde a sua formao at sua diviso conhecido como ciclo celular. Este processo, comum a todos os organismos vivos, inclui perodos de desenvolvimento e perodos de diviso, respectivamente interfase e fase mittica. Durante a diviso celular uma clula-me origina duas clulas-filhas geneticamente iguais a si. O seu DNA duplicado e os organelos, enzimas e outros constituintes da clula so repartidos pelas duas clulas-filhas. Interfase: perodo compreendido entre o final da diviso celular e o incio da diviso seguinte. Corresponde a 90% da vida da clula e um perodo de intensa actividade biossinttica, verificando-se o crescimento e duplicao do contedo celular, incluindo o seu DNA. Nesta fase os cromossomas no so visveis ao microscpio ptico. A interfase engloba ainda 3 perodos difererentes: Intervalo G1 ou ps-mittico: caracterizado por uma intensa actividade biossinttica havendo a formao tanto de protenas, enzimas e RNA, como de organitos celulares. Est compreendido entre o fim da mitose e o inicio da replicao do DNA. A clula passa a maior parte do seu tempo de vida nesta estado; Perodo S ou perodo de sntese de DNA: d-se a replicao do DNA e cada cromossoma passa a ser constitudo por dois cromatdeos ligados por um centrmero; Intervalo G2 ou pr-mittico: d-se essencialmente a sntese de biomolculas necessrias diviso celular, como fibras e o fuso acromtico. Este perodo, compreendido entre o final da replicao do DNA e o incio da diviso celular, corresponde a um grande crescimento celular. Fase mittica: fase em que se d a diviso celular, engloba duas etapas mitose e citocinese: Mitose: perodo correspondente diviso do ncleo. Est dividido em 4 subfases: o Profase: Nesta etapa, a mais longa da fase mitticca, a cromatina condensa-se gradualmente em cromossomas bem definidos. Cada cromossoma agora composto por dois cromatdeos unidos pelo centrmero, uma sequncia especfica de DNA qual se liga um disco proteico, o cinetocoro. Os dois centrolos (nas clulas animais) ou o citoesqueleto (nas clulas vegetais) presentes na clula comeam a afastar-se em sentidos opostos e do origem ao fuso acromtico ou mittico, constitudo por um sistema de microtbulos proteicos que se agregam para formar fibrilhas. Os centrolos dirigem-se para os plos e o invlucro nuclear e os nuclelos desagregam-se; o Metafase: os cromossomas atingem a condensao mxima e os pares de centrolos esto nos plos da clula. Algumas fibrilhas do fuso acromtico ligam-se aos cromossomas e estes dispem-se com os centrmeros no plano equatorial e os braos para fora, formando a chamada placa equatorial; o Anafase: os dois cromatdeos separam-se e passam a constituir dois cromossomas independentes que migram para cada um dos plos da clula, processo chamado ascenso polar. No final desta fase, os dois plos da clula contm molculas de DNA equivalentes;

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Telofase: a separao dos dois conjuntos de cromossomas finalizada pela formao da membrana nuclear. O fuso acromtico desaparece e os cromossomas relaxam novamente, tornando-se indistintos. O nuclolo reconstitudo e cada ncleo entra na interfase.

Citocinese: perodo correspondente diviso do citoplama e individualizao das duas clulas-filhas. Nas clulas animais a separao das clulas ocorre por estrangulamento da membrana. No entanto, nas clulas vegetais, devido existncia de parede celular, isso no possvel. O complexo de Golgi liberta lamelas/vesculas que se alinham na regio equatorial e se fundem formando a membrana plasmtica. Posteriormente, vo depositar-se, nessa mesma membrana, fibras de celulose que vo dar origem parede celular. Durante o ciclo celular pode no ocorrer citocinese e as clulas passam a ser polinucleadas, dizendo-se que tm uma estrutura cenoctica ou que formam sacos de ncleos. Alguns tipos de glbulos brancos e clulas do msculo cardaco podem apresentar estas estruturas e durante o desenvolvimento embrionrio comum a citocinese no conseguir acompanhar a diviso nuclear.

A quantidade de DNA existente na clula vai variando ao longo do ciclo celular. Durante a Interfase, no perodo S, a replicao do DNA faz com que a sua quantidade aumente de Q para 2Q. Quando se d a Anafase essa quantidade volta a ser reduzida de 2Q para Q.

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Meiose o processo de diviso nuclear atravs do qual se formam 4 ncleos haplides (n) a partir de uma clula diplide (2n). O nmero de cromossomas da clula reduzido para metade pelo que a meiose tambm pode ser chamada de reduo cromossmica. A meiose, tal como a mitose, precedida pela replicao do DNA dos cromossomas. A esta replicao seguem-se duas divises consecutivas. A primeira diviso chama-se diviso reducional, ou diviso I, e a segunda diviso tem por nome diviso equacional, ou diviso II. Estas divises do origem a 4 clulas diferentes entre si, cada uma das quais com metade do nmero de cromossomas da clula inicial. Interfase: semelhante interfase descrita para a mitose. Precede a diviso I e, durante o perodo S, d-se a replicao do DNA. No final desta fase cada cromossoma constitudo por dois cromatdeos. Diviso I: nesta diviso, um ncleo diplide (2n) origina dois ncleos haplides (n). Como ocorre uma reduo no nmero de cromossomas, esta diviso tambm designada diviso reducional. Profase I: a etapa mais longa e complexa. Os cromossomas condensam e os cromossomas homlogos emparelham, juntando-se gene a gene. Ao par de homlogos tambm se chama bivalentes ou ttradas cromatdicas. Durante o emparelhamento surgem pontos de cruzamento entre dois cromatdeos irmos, os chamados pontos de quiasma ou sinapses. Pode ocorrer rotura de cromatdeos e trocas recprocas de segmentos de DNA, fenmeno que se designa crossing-over. Os centrolos migram para os plos da clula e o invlucro nuclear desintegra-se;

Metafase I: os bivalentes ligam-se a microtbulos do fuso acromtico pelos centrmeros e os pontos de quiasma localizam-se no plano equatorial do fuso acromtico. A orientao de cada par d-se ao acaso; Anafase I: os dois cromossomas homlogos de cada bivalente separam-se e migram aleatoriamente para plos opostos da clula; Telofase I: Em cada plo da clula constitui-se um ncelo haplide (n) cujos cromossomas apresentam dois cromatdeos. Os cromossomas descondensam, tornando-se mais finos e mais longos. O fuso acromtico desaparece e o invlucro nuclear reorganiza-se. Em alguns casos, segue-se a citocinese e formam-se duas clulas haplides.

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Pode ou no existir uma Interfase entre a diviso reducional e a diviso equacional mas, em qualquer dos casos, no se verifica a replicao do material gentico. Diviso II: nesta diviso ocorre a separao de cromatdeos, obtendo-se assim, quatro ncleos haplides (n), cujos cromossomas so constitudos por um nico cromatdeo. Pelo facto de se manter o nmero de cromossomas, esta diviso tambm designada de diviso equacional. Esta diviso da meiose em tudo muito semelhante diviso celular por mitose: Profase II: Os cromossomas constitudos por dois cromatdeos tornam-se mais grossos e curtos. Organiza-se o fuso acromtico e o invlucro nuclear desaparece; Metafase II: Os cromossomas no seu mximo encurtamento dispem-se com os centrmeros na zona equatorial do fuso acromtico.; Anafase II: Os dois cromatdeos de cada cromossoma separam-se pelo centrmero, passando a constituir cromossomas independentes, e migram para plos opostos da clula; Telofase II: Os cromossomas descondensam, tornando-se mais finos e longos. Organiza-se o invlucro nuclear e formam-se ncleos haplides. D-se a individualizao das clulas e a partir de uma clula diplide formam-se quatro clulas haplides.

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A quantidade de DNA das clulas varia ao longo da meiose. Durante a interfase que precede a diviso I d-se o replicao do DNA, passando a sua quantidade para o dobro - 2Q para 4Q. Na Anafase I, devido separao dos cromossomas homlogos, a quantidade de DNA diminui para 2Q. Na Anafase II, devido separao dos cromatdeos, o DNA volta a diminuir para metade, passando agora de 2Q para Q.

As mutaes cromossmicas do-se precisamente durante a meiose, podendo acontecer em diversas etapas: - durante a diviso I, pela no disjuno dos cromossomas homlogos; - durante a diviso II, pela no separao dos cromatdeos; - quando ocorre crossing-over.
Mitose 1 2 No ocorre Igual No ocorre Igual Anafase Crescimento e reparao das estruturas do organismo Meiose 2 4 Ocorre Metade Ocorre Diferente Anafase II Produo de gmetas ou esporos

N de divises N de ncleos formados Emparelhamento de cromossomas homlogos N de cromossomas das clulas-filhas em relao s clulas-me crossing-over Informao gentica das clulas-filhas em relao s clulas-me Diviso do centrmero Funo

A progresso do ciclo celular regulada por factores externos e internos, como o tamanho da clula, a quantidade de nutrientes disponveis, a presena de factores de crescimento, etc. Um dos mecanismos de regulao est associado acumulao e degradao cclica de ciclinas durante o ciclo celular. Existem vrios tipos destas protenas, designadas ciclina A a ciclina H, cada uma dedicada a uma etapa do ciclo celular, que so sintetizadas e degradadas por protelise ao longo do ciclo.

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As ciclinas podem associar-se a enzimas com actividade fosforilativa, as cinases Cdk (cyclindependent kinases), de modo a formarem o complexo MPF maturation promoting factor, que promove a entrada da clula na fase mittica. A associao de uma ciclina B, sintetizada durante a fase G2, a uma cinase Cdk1 (inactiva) leva formao de um complexo Cdk1/ciclina B (MPF) e fosforilao de determinados resduos de trionina (14 e 161) e de tirosina (15). A fosforilao de tri-14 e tir-15 provoca uma inibio da enzima e impede que esta entre prematuramente em mitose. Segue-se a desfosforilao desses resduos, ficando apenas fosforilado o resduo de tri-161. Esta uma fosforilao activadora, verificando-se que activa o complexo MPF e despoleta a desagregao da membrana nuclear, a reorganizao do citoesqueleto e a condensao dos cromossomas, permitindo assim a entrada da clula na fase mittica. Terminada essa fase, a ciclina dissociase da Cdk1 e destruda por protelise. A cinase desfosforilada e a clula inicia a citosinese e a interfase.

Durante o ciclo celular existem pontos de controlo durante os quais a clula verifica o seu estado e coordena os eventos que ocorrem em cada fase, prevenindo que a clula passe para uma fase se os eventos da fase anterior ainda no terminaram ou no ocorrem de forma correcta. Alguns mecanismos de regulao actuam nos perodos G1, S e G2 e na fase mittica: No final do perodo G1 diversos mecanismos verificam se existe DNA danificado e, em caso afirmativo, procedem sua reparao para que a clula possa entrar no perodo S e iniciar a replicao do seu DNA. Mesmo que o DNA no se encontre danificado algumas clulas podem no iniciar o perodo S, permanecendo num estado de latncia designado estado G0. O tempo de permanncia nesse estado muito varivel e, em alguns casos, como nos neurnios e fibras musculares de um indivduo adulto, podem mesmo no reiniciar o ciclo celular; Durante o perodo S h monitorizao contnua do DNA replicado de modo a que qualquer mutao, base incorrecta ou replicao incompleta seja reparada antes da diviso celular; No final do perodo G2 h outro momento de controlo em que se verifica a integridade do DNA replicado. Se a replicao do DNA foi completa e bem sucedida prossegue-se para a mitose; Pgina | 51

Na fase mittica verifica-se se o fuso acromtico est correctamente formado e se os cromossomas esto alinhados na placa equatorial, podendo ser divididos igualmente entre as duas clulas-filhas.

Em resposta s deficincias encontradas durante os pontos de controlo, o ciclo celular e a replicao do DNA de uma clula podem ser inibidos. Por exemplo, quando o DNA se encontra danificado verifica-se o aumento de um factor de transcrio, o p53, que induz a transcrio do gene p21. Este gene, por sua vez, permite a sntese de protenas que se ligam s cinases e ao complexo MPF, inibindo o ciclo celular e a replicao de DNA.

Mutaes do gene p53 e de outros genes supressores de tumores so muito frequentes em clulas tumorais, dando origem aos chamados oncogenes que promovem a formao de tumores. As clulas que apresentam estes genes tm tendncia a crescer descontroladamente e a no sofrer fenmenos de apoptose. Uma clula danificada deve ser destruda, quer por aco de macrfagos quer por apoptose morte celular programada. A activao intrnseca da apoptose est dependente das Pgina | 52

mitocndrias: num dos transportadores electrnicos destes organelos d-se a produo de citocromo-c, uma protena que activa as caspases, uma classe de proteases que degradam o DNA no ncleo da clula. Este processo regulado por dois genes, Bcl2 e BAX, que bloqueiam e promovem a apoptose, respectivamente. Algumas clulas tumorais produzem demasiado Bcl2 dando origem a cancros resistentes quimio e radioterapia.

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Laboratrio Restrio de plasmdeos

O material gentico dos procariontes consiste, na maioria dos casos, numa molcula circular de DNA que se encontra numa regio do citoplasma da clula designada por nucleide. Os plasmdeos so molculas circulares de DNA existentes normalmente no interior de bactrias e cuja replicao independente da do DNA cromossmico. Os plasmdeos podem ser modificados geneticamente mediante a sua recombinao com genes exgenos, que so introduzidos numa regio do plasmdeo designada por regio de mltipla clonagem (multiple cloning site - MCS). Este processo inicia-se pela aco de enzimas de restrio endonucleases, que, ao reconhecerem determinadas sequncias especficas, cortam a molcula de DNA nessa regio. De referir que no caso de um vector de clonagem iremos obter um nico fragmento de restrio enquanto no DNA cromossmico se obtm vrios fragmentos, pois podem existir vrias regies reconhecidas pelas endonucleases de restrio. O gene a ser introduzido, previamente cortado pelas mesmas enzimas de restrio, ser fixado no plasmdeo mediante a aco de DNA ligases, voltando este a adquirir a forma circular. Outras regies igualmente importantes nos plasmdeos so as marcas de seleco (selectable marker) e a origem de replicao (origin of replication - Ori). As primeiras permitem isolar os plasmdeos recombinados mediante a introduo de genes que conferem, por exemplo, resistncia a um antibitico. Deste modo, na presena do mesmo, as bactrias que sobrevivem sero as que possuem o plasmdeo recombinado. A segunda regio (Ori), contm uma sequncia de nucletidos responsvel pela activao do processo de replicao do DNA plasmdico.

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