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Universidad Alas Peruanas Arequipa

PRACTICA N02 MEDIOS DE CULTIVO


I. INTRODUCCIN Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes, preparados en el laboratorio, que suministran los compuestos necesarios para el desarrollo de los microorganismos. Algunas bacterias pueden crecer satisfactoriamente en casi cualquier medio de cultivo, otras bacterias necesitan medios especiales y existen algunas que no pueden crecer en ninguno de los medios desarrollados hasta ahora. Los distintos tipos de medios de cultivo varan segn las necesidades de los microorganismos objeto de estudio, pero todos han de cumplir los siguientes requisitos: Han de contener las sustancias necesarias para el crecimiento del microorganismo que se siembra. Han de mantenerse estriles hasta el momento de la siembra. Los requerimientos para el crecimiento microbiano se pueden agrupar en dos categoras: Fsicos y qumicos. Entre los primeros se incluyen la temperatura, el pH y la presin osmtica; entre los requerimientos qumicos se encuentran el agua, las fuentes de carbono y nitrgeno, las sustancias minerales, el oxgeno y determinados factores orgnicos de crecimiento. Finalmente, una vez sembrados, deben ser incubados a la temperatura y condiciones adecuadas. Requerimientos para el desarrollo bacteriano: Las bacterias y pueden ser divididas Las en auttrofas hetertrofos. primeras

comprenden las bacterias del suelo y el agua que obtienen carbono y nitrgeno de la atmsfera y de la materia inorgnica simple. Las bacterias hetertrofas requieren compuestos orgnicos ms complejos como fuente de carbono y nitrgeno, as como protenas o sus derivados, tambin requieren carbohidratos y grasas. Este ltimo grupo de organismos es el ms importante en bacteriologa mdica. Protenas: Se suministran generalmente como peptonas que se encuentran disponibles en el comercio, preparadas por digestin parcial de carne con enzimas ppticas, consisten en polipptidos, dipptido y aminocidos.

Dr. Ricardo J. Jurez Zevallos Patlogo Clnico

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Carbohidratos: Suministran carbono para las sntesis, y adems su fermentacin libera energa utilizable en el metabolismo. Factores accesorios de crecimiento: Son tambin requeridos por algunas bacterias. Entre ellos estn las vitaminas del complejo B (tiamina, cido nicotnico, piridoxina, botina). Estas sustancias son necesarias y las bacterias no las pueden sintetizar. Otros factores necesarios para algunas bacterias son obtenidos de nutrimentos ms complejos, como el suero, la sangre la yema del huevo, etc. Sales minerales: Elementos como potasio, sodio, calcio, etc. Tambin son requeridos por algunas bacterias en su desarrollo. Atmsfera: Microorganismos aerobios obligados, anaerobios obligados, anaerobios facultativos, etc. Presin osmtica: Las clulas pueden encogerse y ser destruidas (plasmlisis) en soluciones hipertnicas, inversamente, se rompen (plasmoptisis) por entrada de agua, en las soluciones hipotnicas. Temperatura: Para la mayora de bacterias patgenas del hombre la temperatura ptima de crecimiento es de 37C. Luz: La mayora de las bacterias desarrollan en ausencia de luz porque esta puede ser letal. Reaccin: La mayora de las bacterias crece mejor en un medio ligeramente alcalino (pH 7,2- 7,6). II. OBJETIVOS. Preparar medios de cultivo lquidos y slidos. Determinar el uso de esos medios para aislar e identificar a los microorganismos.

III. MATERIALES. Placas Petri. Tubos de Ensayo. Mecheros de Bunsen. Autoclave. Matraces. Pinzas de madera. Bao mara. Trpodes Rejillas de asbesto. Medios de cultivo a prepararse.

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IV. TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO Existe una gran variedad de medios para el cultivo de los microorganismos en el laboratorio, la mayora de ellos pueden adquirirse ya elaborados, necesitando algunos slo la adicin de agua o la esterilizacin. Los medios de cultivo pueden clasificarse: a) POR SU CONSISTENCIA: 1. Medios Lquidos o Caldos: Son aquellos que contienen, disueltos en agua, los nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos. 2. Medios Slidos: Contienen nutrientes disueltos en agua pero se les aade un agente solidificante. El Agar es un polisacrido complejo que se obtiene de algas rodofceas de origen marino cuyas propiedades son de gran utilidad en la preparacin de medios de cultivo slidos: No es degradado enzimticamente por los microorganismos (a excepcin de algunos microorganismos de ambientes marinos), funde aproximadamente a 100C y permanece en estado lquido mientras la temperatura no descienda por debajo de 45-50C. Adems, una vez solidificado se puede incubar a temperaturas elevadas sin que se lice. Generalmente el Agar se aade, para solidificar un medio lquido, en una concentracin del 1,5%. Los medios con Agar se envasan en tubo o en placa de Petri. 3. Medios Semislidos: Son similares a los medios slidos, pero la concentracin del agente solidificante es menor, generalmente del 0,4% con lo que, una vez solidificados mantienen una consistencia gelatinosa. Se utilizan, por ejemplo, para determinar la movilidad de los microorganismos. b) POR SU ORIGEN 1. Medios complejos: Contienen todos los nutrientes necesarios para el crecimiento de muchos tipos de microorganismos, pero no se conocen todos los componentes que forman parte de ellos, ni las concentraciones exactas de cada uno de ellos. Muchos de sus componentes proceden de la degradacin parcial de tejidos o productos animales, de plantas o de microorganismos que son fuente de aminocidos, azcares, lpidos, vitaminas y minerales. Ejemplos de dichos componentes son las peptonas o triptonas (protenas animales digeridas enzimticamente), el extracto de carne y el extracto de levadura. Como ya se ha mencionado, en estos medios suelen encontrarse azcares pero en muchos casos los medios complejos son suplementados con glucosa. Un ejemplo de medio nutritivo complejo es el caldo nutritivo, que contiene peptona y extracto de carne. 2. Medios definidos: Son aquellos que contienen los distintos nutrientes en forma de productos qumicos puros (pero no extrapuros) y en concentraciones conocidas. As, un medio definido que permita el desarrollo de un microorganismo hetertrofo y "poco exigente", como E. coli, debera contener sales inorgnicas y fuentes de carbono y nitrgeno: MgSO4, KPO4H2, Na2PO4H, glucosa y NH4Cl. Otros elementos esenciales, como hierro, manganeso y cobre, se encuentran generalmente presentes como contaminantes de los productos qumicos antes citados, en cantidades suficientes para el crecimiento.

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3. Medios semisintticos: Es una mezcla de los anteriores. Llevan algunas sustancias qumicas cuya naturaleza y cantidad conocemos, junto con sustancias de naturaleza y composicin indefinidas c) POR SU COMPOSICIN: Muchos medios de cultivo utilizados en el laboratorio son medios generales en los que se pueden desarrollar una gran variedad de microorganismos con distintos requerimientos nutricionales. Sin embargo, en algunas ocasiones, es necesario aislar a partir de una muestra un microorganismo que se encuentre en un bajo nmero y que pueda ser enmascarado por otros microorganismos presentes en un nmero ms elevado. En esos casos es recomendable utilizar medios de cultivo que ayuden a separar y diferenciar dichos microorganismos o que, de forma selectiva, favorezcan el crecimiento de alguno de ellos. Estos medios pueden ser: 1. Medios Enriquecidos: Son los medios comunes , a los que se aaden ciertos productos, a manera de suplemento nutritivo (sangre, suero, glucosa, hemoglobina, etc) que permiten el aporte de factores de crecimiento o sustancias que neutralizan agentes inhibidores del crecimiento, en bacterias exigentes. Ejemplo agar sangre, etc. 2. Medios de Enriquecimiento: Son medios lquidos que por su composicin qumica favorecen o permiten la multiplicacin de unas bacterias, inhibiendo parcialmente la de otras. Ejemplo el medio Muller-Kauffman que permite el crecimiento de Salmonella e inhibe el de numerosas coliformes. 3. Medios Selectivos: Son aquellos que permiten el crecimiento de un tipo determinado de microorganismos, inhibiendo el desarrollo de los dems. Algunos de estos medios contienen un agente selectivo como antibiticos, productos qumicos, colorantes, etc. Entre los agentes selectivos podemos citar el cloruro sdico, que en concentracin elevada inhibe la mayora de los microorganismos excepto los microorganismos halotolerantes, como son los estafilococos, o la azida de sodio, que inhibe el crecimiento de bacterias Gram negativas al fijarse al hierro de la porfirina del sistema citocromo, permitiendo seleccionar los estreptococos, que carecen de este sistema, as como otros Gram positivos De la misma manera, la bilis y sales biliares convierten los medios de cultivo a los que se aaden en selectivos para Salmone lla ya que, adems de inhibir a los microorganismos Gram positivos, en concentraciones elevadas inhiben tambin a bacterias Gram negativas fermentadoras de lactosa. Los colorantes, como el verde brillante, inhiben selectivamente las bacterias Gram positivas, siendo tambin inhibidor para la mayora de las bacterias intestinales excepto para Salmon ell a. Este colorante es la base del medio Agar Verde Brillante, utilizado para el aislamiento de Salmone lla a partir de muestras fecales. Los medios selectivos pueden serlo tambin por su pH, as el Agar glucosado de Sabouraud ajustado a pH 5,6, se usa para el aislamiento de hongos, que a ese pH crecen mejor que las bacterias.

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4. Medios Diferenciales: Son aquellos diseados para distinguir unos microorganismos de otros, a partir de una poblacin mixta, por la apariencia distinta que toman sus colonias. Estos medios de cultivo ponen de manifiesto propiedades que un determinado tipo de microorganismo posee. Por ejemplo, los medios diferenciales llevan incluido un indicador de pH, que pone de manifiesto la degradacin de un nutriente especfico (generalmente un azcar) por el cambio de color que se origina cuando ste es metabolizado, como en el caso del medio CLED. Los medios diferenciales pueden ser adems selectivos, si se aaden agentes que inhiben el crecimiento de determinados microorganismos. En este caso va a ser posible distinguir diferentes tipos microbianos dentro del limitado grupo de microorganismos que pueden crecer. As, el medio EMB de Levine es selectivo para las bacterias Gram negativas por contener dos colorantes, eosina y azul de metileno, que inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas. Es tambin un medio diferencial, porque distingue las bacterias que fermentan la lactosa (con produccin de cido) de las no fermentadoras. La formacin de cidos a partir de lactosa hace que ambos colorantes precipiten en la superficie de las colonias, que aparecen de color morado. En ciertas ocasiones, como ocurre en el caso de E. coli, las colonias presentan adems un brillo metlico. El Agar Mac Conkey es otro ejemplo de medio selectivo y diferencial. La presencia de sales biliares y cristal violeta inhiben el crecimiento de bacterias no entricas; la fermentacin de lactosa con liberacin de productos cidos hace virar un indicador de pH incorporado en el medio.

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V. PREPARACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO La preparacin de medios de cultivo se ha simplificado en gran medida por la comercializacin de medios deshidratados, en los que los diferentes nutrientes se encuentran ya mezclados en las debidas proporciones, siendo slo necesario la adicin de la cantidad correcta de agua destilada para disolver sus componentes. Cuando se prepara un medio lquido se debe disolver totalmente todos sus componentes en agua destilada. A continuacin el caldo se envasa en los recipientes adecuados (matraces o tubos), tapando los mismos y esterilizndolos. La preparacin de un medio slido puede hacerse de dos maneras: Preparar el caldo y aadir Agar al 1,5% o bien utilizar un medio slido comercial. Independientemente de la forma elegida para hacerlo, la preparacin de los medios de cultivo slidos requiere procedimientos especiales, ya que el Agar es insoluble en agua. Por ello, una vez aadida el agua, se debe calentar la mezcla hasta 100C, para permitir que el Agar se funda y quede incorporado al resto de los nutrientes disueltos. El medio fundido se dispensa en tubos o matraces, que se tapan y se esterilizan.

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Los medios slidos contenidos en tubos pueden dejarse enfriar en posicin vertical, si van a ser inoculados en profundidad, o bien pueden inclinarse para que al solidificarse en esa posicin adopte la forma inclinada que proporciona una mayor superficie de siembra. Si se desean preparar placas de Petri, se utilizar el medio de cultivo que ha sido esterilizado en un matraz y, una vez atemperado, se verter en placas vacas en un ambiente asptico, como el que proporciona la proximidad de la llama de un mechero o una campana de flujo laminar. En algunas ocasiones, el medio de cultivo destinado a placas puede conservarse estril en tubos, que se fundirn al bao Mara cuando se vayan a preparar las placas. Si se han de incorporar al medio compuestos termolbiles, como vitaminas o antibiticos, se esterilizarn stos por filtracin y se aadirn al medio de cultivo previamente esterilizado en autoclave y una vez que este se haya atemperado. En todos los casos se han de seguir las instrucciones del fabricante. La conservacin de los medios ya preparados puede hacerse a temperatura ambiente, pero es preferible conservarlos a 4C para retrasar su deshidratacin. VI. CUESTIONARIO 1. Qu usted entiende por medio de cultivo? 2. Cules son los objetivos de la nutricin microbiana? 3. Cmo se clasifican los medios de cultivo atendiendo a su composicin? 4. Qu es un medio artificial? 5. Cmo se clasifican los medios de cultivo atendiendo a los objetivos de su empleo? 6. Qu informacin aportan los medios diferenciales? 7. Cmo se denomina el producto que se aade a los medios de cultivo para sodificarlos? 8. Cules son los compuestos nutritivos bsicos? 9. Qu compuestos podemos incorporar al medio de cultivo que le sirva a la bacteria como fuente de nitrgeno? 10. Qu compuesto nutritivo aporta el carbono que le sirve a la bacteria para obtener energa? 11. Explique como usted realiza la pesada de un medio de cultivo deshidratado. 12. Describa como se hidrata el medio de cultivo una vez pesado. 13. De cuantas maneras se puede ajustar el pH del medio de cultivo? 14. Cmo se distribuye el medio de cultivo antes de su esterilizacin? 15. Cmo se conservan los diferentes medios una vez elaborados? 16. Cmo se comprueba la esterilidad de los medios de cultivo recin elaborados? 17. Qu proceder debe seguirse cuando se va a realizar la siembra en un medio que est conservado en refrigeracin?

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