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Biologia Molecular e Noções de Biotecnologia

Licenciatura em Ciências Biológicas

Hibridização de ácidos nucléicos Southern Blot (Edwin Mellor Southern)
Aula 09 Prof. Francisco Filho da Silva IFTO – Campus Araguatins

Southern Blot
➯ “O Southern blot é um método da biologia molecular que serve para verificar se uma determinada sequência de DNA está ou não presente em uma amostra de DNA analisada”.

➯ O método foi batizado com o nome de seu inventor, o biólogo britânico Edwin Southern.

Southern Blot .Etapas ➯ Extração do DNA ➯ Digestão do DNA com enzimas de restrição ➯ Preparo da Sonda ➯ Transferência ➯ Hibridização ➯ Detecção .

moléculas de DNA contendo um gene de resistência a uma dada doença em abacaxizeiro (doença fúngica). Como proceder para saber? ➯ Pega-se o tubo contendo o DNA do feijão.Southern Blot ➯ Suponha que haja em um tubo de ensaio. que neste caso será todo o genoma. ➯ Agora queremos saber se um feijoeiro qualquer tem uma sequência parecida. . e aquecese a alta temperatura para promover a separação das fitas.

Aquecimento Tubo 1 sob baixa temperatura agitando por um bom tempo ➯ Em temperatura ambiente há uma tendência de reassociação das moléculas. C e D. ➯ A e A’ são DNA simples fita .Southern Blot Tubo 1 . ➯ A não pareia com B.

. ➯ Ocorrerá um pareamento entre homólogos.Southern Blot ➯ Quero saber se no feijoeiro tem sequência de DNA (gene) homóloga ao do abacaxi. formando moléculas híbridas.

➯ Muitas bandas de DNA .Southern Blot ➯ Como visualizar se houve hibridização ou não? ➯ Ao invés de se trabalhar no tubo. ➯ DNA de milhares de células do feijão (mesmo DNA em todas as células. separa-se o DNA em gel de agarose.

o que fazer? ➯ Utiliza-se reação química com solução alcalina no gel após eletroforese.Southern Blot ➯ Depois de separado não se pode realizar o processo de pareamento (está dupla fita). A desnaturação é necessária porque o DNA nas etapas seguintes irá aderir à membrana e irá parear com a sonda. Desnaturação O gel onde foi feita a eletroforese de DNA é tratado com uma solução alcalina (tipicamente contendo hidróxido de sódio) para promover a desnaturação da dupla fita do DNA.. separando-a em simples fitas..e agora.. de maneira que as ligações se separam. Não se pode aquecer o gel. .

Isso faz com que o DNA passe do gel para a membrana. nylon) é posta sobre o gel. Realiza-se a transferência por meio do fluxo de um tampão apropriado. Uma pressão é aplicada uniformemente sobre o gel (tanto usando-se sucção. ou pondo-se sobre a membrana uma pilha de toalhas de papel com um peso em cima). Corte lateral do gel .Southern Blot ➯ Ainda não dá para juntar com o DNA do abacaxi. onde ele se adere. Transferência do DNA para uma membrana Uma membrana de nitrocelulose (ou. alternativamente. ➯ Transfere-se todas as bandas para uma membrana (bandas separadas.

Southern Blot ➯ Coloca-se uma membrana especial sobre o gel. teremos uma réplica do que estava no gel. . Uso o sistema de fluxo. Todas as moléculas de cada banda migrará para a membrana. Para tanto. ➯ Quando olhar para a membrana. coloca-se um papel poroso embebido em solução.

Não vejo nada na membrana. O DNA. não se reassciam pois está preso à membrana. mesmo em temperatura ambiente.Southern Blot ➯ No dia seguinte. Fixa-se essas bandas na membrana por meio de tratamento térmico (80 oC por uma hora) ou uso UV. teremos uma membrana contendo bandas com DNA simples fita. . ➯ Este processo é chamada de CROSS LINK.

.Southern Blot ➯ Agora. Pode ser utilizado marcação radioativa (32P). ➯ Pode fazer marcação não radioativa também. ➯ Antes de adicionar a sonda. FEIJÃO Membrana Abacaxi . ela deve ser marcada de forma permitir a identificação de moléculas híbridas posteriormente. pode se pegar o DNA do abacaxi (sonda) e colocar dentro de um recipiente com uma solução e a membrana.

Southern Blot .

expõe-se a um filme de raio X e obtém-se uma banda preta (radioativa).Southern Blot ➯ Posteriormente. ➯ Trabalhamos portanto com todo o genoma do feijoeiro e apenas uma sequência de DNA do abacaxi. quando lavar a membrana. . ➯ Implica dizer que o DNA do abacaxi ligou-se ao DNA do feijoeiro (há homologia).

Digestão com enzimas de restrição 3. 6. Separação do fragmentos por eletroforese 4. Desnaturação química do DNA 5.Southern Blot.Repetir Passos 1. Extração do DNA 2. Transferência do DNA para a membrana (precisa ter condições para manter o DNA simples fita – solução alcalina desnaturante). Fixação do temperatura). DNA na membrana (alta .

9.Southern Blot.Repetir Passos 7. . A esse processo de eliminação da demais cargas da superfície da membrana dar-se o nome de BLOQUEAMENTO. trato a membrana com DNA de esperma de salmão por exemplo (antes de colocar o DNA sonda). Desnaturar a sonda termicamente. Bloqueio da membrana com DNA inespecífico.: após a transferência. OBS. Marcar a sonda com radioatividade ou luminescência. 8.

Repetir Passos OBS. .Southern Blot. Hibridização OBS. trabalha-se a 62 oC.: Agora é possível dar início ao processo de hibridização (questão de minutos para se fazer esse procedimento). Para tanto. qualquer homologia será mantida a ligação). 10.: é necessário diminuir a velocidade de reação para permitir que a sonda encontre o DNA na membrana. Utiliza-se uma concentração de sais para facilitar o pareamento (nessa concentração de sais.

Repetir Passos 11. .Southern Blot. Lavagem da membrana (não é simples) Normalmente não se faz isso. As ligações que não são muito específicas não se manterão. Trabalha-se com a mesma solução. só que com uma concentração de sais menor.

chama-se ESTRINGÊNCIA.Repetir Passos ➯ Se o nível de homologia é baixo e lava-se com uma concentração de sais baixa. posso remover tudo.Southern Blot. deve se fazer o ajuste dessa concentração de sais. Alta estringência – alta exigência de homologia . ➯ A este processo de ajuste.baixa concentração de sais > Estringência . ➯ Assim.maior concentração de sais .

Southern Blot .

Southern Blot .

Southern Blot .

O restante do trabalho é o mesmo visto anteriormente. . Pode-se extrair estes RNAs e fazer eletroforese (não há necessidade de fazer desnaturação). ➯ Em seguida. ➯ Sabemos que existe homologia de genes do abacaxi no feijão. Será que este se expressa inibindo o fungo no feijoeiro? ➯ Teremos bastante mRNA no citoplasma (simples fita). transfere-se para membrana.Northern Blot ➯ Outro tipo de hibridização é entre DNA e RNA.

podemos dizer que o gene do abacaxi se expressa no feijoeiro inibindo o fungo. ➯ Por meio desta técnica. quando e onde o gene se expressa.Northern Blot ➯ Forma-se portanto moléculas híbridas de DNA e RNA. . Agora. OBS.: o DNA sempre será a sonda. posso saber quanto.

Northern Blot .

.  Muito usado para estudo de expressão gênica ...resumo  O nome Northern vem pela similaridade com a técnica proposta por Southern. mãos... – Proposto por James Alwine 1977  Em vez de DNA. trabalha com RNA  Atua no transcriptoma  É dependente do tecido da planta  É dependente da idade da planta  A extração de RNA é bem mais trabalhosa – Existe RNAse em toda parte – água..  Interessante para checar se um determinado gene está sendo expresso em um determinado tecido.Northern Blot .