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Biologia Molecular e Noções de Biotecnologia

Licenciatura em Ciências Biológicas

Hibridização de ácidos nucléicos Southern Blot (Edwin Mellor Southern)
Aula 09 Prof. Francisco Filho da Silva IFTO – Campus Araguatins

Southern Blot
➯ “O Southern blot é um método da biologia molecular que serve para verificar se uma determinada sequência de DNA está ou não presente em uma amostra de DNA analisada”.

➯ O método foi batizado com o nome de seu inventor, o biólogo britânico Edwin Southern.

Etapas ➯ Extração do DNA ➯ Digestão do DNA com enzimas de restrição ➯ Preparo da Sonda ➯ Transferência ➯ Hibridização ➯ Detecção .Southern Blot .

Como proceder para saber? ➯ Pega-se o tubo contendo o DNA do feijão. . moléculas de DNA contendo um gene de resistência a uma dada doença em abacaxizeiro (doença fúngica). que neste caso será todo o genoma. e aquecese a alta temperatura para promover a separação das fitas. ➯ Agora queremos saber se um feijoeiro qualquer tem uma sequência parecida.Southern Blot ➯ Suponha que haja em um tubo de ensaio.

➯ A não pareia com B. C e D.Southern Blot Tubo 1 . ➯ A e A’ são DNA simples fita .Aquecimento Tubo 1 sob baixa temperatura agitando por um bom tempo ➯ Em temperatura ambiente há uma tendência de reassociação das moléculas.

➯ Ocorrerá um pareamento entre homólogos. formando moléculas híbridas. .Southern Blot ➯ Quero saber se no feijoeiro tem sequência de DNA (gene) homóloga ao do abacaxi.

Southern Blot ➯ Como visualizar se houve hibridização ou não? ➯ Ao invés de se trabalhar no tubo. separa-se o DNA em gel de agarose. ➯ DNA de milhares de células do feijão (mesmo DNA em todas as células. ➯ Muitas bandas de DNA .

A desnaturação é necessária porque o DNA nas etapas seguintes irá aderir à membrana e irá parear com a sonda. Desnaturação O gel onde foi feita a eletroforese de DNA é tratado com uma solução alcalina (tipicamente contendo hidróxido de sódio) para promover a desnaturação da dupla fita do DNA. de maneira que as ligações se separam.. o que fazer? ➯ Utiliza-se reação química com solução alcalina no gel após eletroforese. Não se pode aquecer o gel.Southern Blot ➯ Depois de separado não se pode realizar o processo de pareamento (está dupla fita). separando-a em simples fitas. ..e agora..

Realiza-se a transferência por meio do fluxo de um tampão apropriado. nylon) é posta sobre o gel. Transferência do DNA para uma membrana Uma membrana de nitrocelulose (ou. Corte lateral do gel . alternativamente.Southern Blot ➯ Ainda não dá para juntar com o DNA do abacaxi. onde ele se adere. Isso faz com que o DNA passe do gel para a membrana. ou pondo-se sobre a membrana uma pilha de toalhas de papel com um peso em cima). Uma pressão é aplicada uniformemente sobre o gel (tanto usando-se sucção. ➯ Transfere-se todas as bandas para uma membrana (bandas separadas.

Todas as moléculas de cada banda migrará para a membrana. Uso o sistema de fluxo. ➯ Quando olhar para a membrana. . Para tanto. teremos uma réplica do que estava no gel. coloca-se um papel poroso embebido em solução.Southern Blot ➯ Coloca-se uma membrana especial sobre o gel.

Southern Blot ➯ No dia seguinte. . teremos uma membrana contendo bandas com DNA simples fita. mesmo em temperatura ambiente. Fixa-se essas bandas na membrana por meio de tratamento térmico (80 oC por uma hora) ou uso UV. não se reassciam pois está preso à membrana. ➯ Este processo é chamada de CROSS LINK. Não vejo nada na membrana. O DNA.

ela deve ser marcada de forma permitir a identificação de moléculas híbridas posteriormente. pode se pegar o DNA do abacaxi (sonda) e colocar dentro de um recipiente com uma solução e a membrana. Pode ser utilizado marcação radioativa (32P).Southern Blot ➯ Agora. FEIJÃO Membrana Abacaxi .. ➯ Pode fazer marcação não radioativa também. ➯ Antes de adicionar a sonda.

Southern Blot .

➯ Implica dizer que o DNA do abacaxi ligou-se ao DNA do feijoeiro (há homologia). .Southern Blot ➯ Posteriormente. expõe-se a um filme de raio X e obtém-se uma banda preta (radioativa). ➯ Trabalhamos portanto com todo o genoma do feijoeiro e apenas uma sequência de DNA do abacaxi. quando lavar a membrana.

Separação do fragmentos por eletroforese 4. 6.Southern Blot. Extração do DNA 2.Repetir Passos 1. Fixação do temperatura). Transferência do DNA para a membrana (precisa ter condições para manter o DNA simples fita – solução alcalina desnaturante). DNA na membrana (alta . Desnaturação química do DNA 5. Digestão com enzimas de restrição 3.

Desnaturar a sonda termicamente. 8.Repetir Passos 7. .: após a transferência. A esse processo de eliminação da demais cargas da superfície da membrana dar-se o nome de BLOQUEAMENTO. Bloqueio da membrana com DNA inespecífico. 9. OBS.Southern Blot. Marcar a sonda com radioatividade ou luminescência. trato a membrana com DNA de esperma de salmão por exemplo (antes de colocar o DNA sonda).

Repetir Passos OBS. trabalha-se a 62 oC. Para tanto. qualquer homologia será mantida a ligação). .: é necessário diminuir a velocidade de reação para permitir que a sonda encontre o DNA na membrana. 10.Southern Blot. Hibridização OBS.: Agora é possível dar início ao processo de hibridização (questão de minutos para se fazer esse procedimento). Utiliza-se uma concentração de sais para facilitar o pareamento (nessa concentração de sais.

. Lavagem da membrana (não é simples) Normalmente não se faz isso. Trabalha-se com a mesma solução. As ligações que não são muito específicas não se manterão.Southern Blot. só que com uma concentração de sais menor.Repetir Passos 11.

deve se fazer o ajuste dessa concentração de sais. Alta estringência – alta exigência de homologia .Southern Blot.baixa concentração de sais > Estringência .maior concentração de sais .Repetir Passos ➯ Se o nível de homologia é baixo e lava-se com uma concentração de sais baixa. ➯ Assim. posso remover tudo. ➯ A este processo de ajuste. chama-se ESTRINGÊNCIA.

Southern Blot .

Southern Blot .

Southern Blot .

transfere-se para membrana. . ➯ Sabemos que existe homologia de genes do abacaxi no feijão. Pode-se extrair estes RNAs e fazer eletroforese (não há necessidade de fazer desnaturação). Será que este se expressa inibindo o fungo no feijoeiro? ➯ Teremos bastante mRNA no citoplasma (simples fita). ➯ Em seguida.Northern Blot ➯ Outro tipo de hibridização é entre DNA e RNA. O restante do trabalho é o mesmo visto anteriormente.

quando e onde o gene se expressa. OBS. . Agora.Northern Blot ➯ Forma-se portanto moléculas híbridas de DNA e RNA. posso saber quanto.: o DNA sempre será a sonda. ➯ Por meio desta técnica. podemos dizer que o gene do abacaxi se expressa no feijoeiro inibindo o fungo.

Northern Blot .

 Interessante para checar se um determinado gene está sendo expresso em um determinado tecido... trabalha com RNA  Atua no transcriptoma  É dependente do tecido da planta  É dependente da idade da planta  A extração de RNA é bem mais trabalhosa – Existe RNAse em toda parte – água..Northern Blot .  Muito usado para estudo de expressão gênica .resumo  O nome Northern vem pela similaridade com a técnica proposta por Southern... – Proposto por James Alwine 1977  Em vez de DNA. mãos..