TCNICAS DE DETECCIN DE LISTERIA Y C.

PERFRINGENS

DEDICATORIA

A mis padres, que me dieron la libertad de elegir mi propio camino, tal vez a veces con silenciosa comprensin, su ejemplo de trabajo y tenacidad es parte de su valiossimo legado, este logro tambin es su logro. A mis hermanos, en quienes siempre encuentro un abrazo sincero e incondicional y a la sonrisa al volver a casa.

TCNICAS DE DETECCIN DE LISTERIA Y C. PERFRINGENS INDICE DE CONTENIDO

Dedicatoria ..... I Indice de contenido ... II Resumen ... 3

Introduccin - listeria 4 Clostridium perfringens.... 5 Objetivo..6 Capitulo I concepto bsico Listeria....7 Clostridium perfringens...10 Capitulo II tcnicas de deteccin Listeria...13 Clostridium perfringens....34 Conclusiones...40 Bibliografa ..41

TCNICAS DE DETECCIN DE LISTERIA Y C. PERFRINGENS RESUMEN

En este trabajo realizamos el estudio de la presencia DE L.MONOCYTOGENES Y CLOSTRIDIUM PERFRINGENS en diferentes habitas donde se puedan hallar, buscando los tipos o tcnicas que puedan detectarlas. En la listeria ha sido ampliamente estudiada en alimentos, en ensilados destinados al consumo animal, en el ambiente y en muestras clnicas. Las tcnicas de deteccin de Listeria en alimentos no constituyen slo herramientas valiosas para identificar brotes epidmicos, sino tambin para prevenirlos, controlando las contaminaciones durante la produccin y distribucin de los alimentos. La deteccin de Listeria en alimentos se ha ido desarrollando en los ltimos aos y podemos encontrar una gran variedad de mtodos que van desde el aislamiento e identificacin de la bacteria mediante tcnicas microbiolgicas convencionales hasta los ms sofisticados mtodos genticos basados en microarrays, sin olvidar la amplificacin de cidos nucleicos, deteccin de anticuerpos y ELISA. Los mtodos bacteriolgicos convencionales son ms lentos pero muy eficaces, y continan siendo el mtodo de referencia comparado con otros mtodos ms modernos. El Cl. Perfringens es un germen telrico ampliamente distribuido en la naturaleza ( suelo , polvo , sedimento marino ,moscas .. ) que se encuentra en el intestino de hombres sanos , aqu como en ganado porcino y bovino , tambin sanos . Por otra parte, es un germen patgeno para los animales ( enterotoxemias ) y para el hombre ( toxinfecciones alimentarias : Cl. Perfringens tipo A , y enteritis necrtica ,Cl. Perfrinfens tipo C ) . En este trabajo a parte de la listeria tambin se analiza la presencia de C . perfringens con diferentes tipos de muestras utilizando diferentes tcnicas de deteccin.

TCNICAS DE DETECCIN DE LISTERIA Y C. PERFRINGENS INTRODUCCIN

LISTERIA . Las bacterias pertenecientes al gnero Listeria son bacilos gram-positivos cortos, regulares, no esporulados ni ramificados, que suelen observarse en disposicin individual o formando cadenas cortas. En cultivos viejos pueden aparecer formando filamentos de 620 mm de longitud. Presentan de 1 a 5 flagelos pertricos que les confieren movilidad a 28C. Las colonias son pequeas (de 1 a 2 mm tras uno o dos das de incubacin) y lisas. Al observarse a la lupa con epiiluminacin, con un ngulo de la luz de 45-60, se observan reflejos de color azul-verdoso sobre una superficie finamente granular. Su temperatura ptima de crecimiento est entre 30C y 37C, pero pueden crecer a 4C en pocos das. Listeria spp. son anaerobias facultativas, catalasa positivas y oxidasa negativas. Las reacciones de Voges-Proskauer y rojo de metilo son positivas. Hidrolizan la esculina en pocas horas, pero no la urea ni la gelatina; no producen indol ni H2S. Producen cido dela D-glucosa y de otros azcares. El contenido de guanina-citosina de su ADN es bajo, entre el 36% y el 38%. Entre las diferentes especies incluidas en el gnero, Listeria monocytogenes es la nica implicada en patologa humana y es adems de suma importancia en la microbiologa alimentaria por ser causante de algunas enfermedades. La mayora de los casos de listeriosis en humanos detectados en el mbito alimentario se originan por el consumo de comida preparada. A pesar de que se trata de una enfermedad de escasa prevalencia, las autoridades alimentarias recomiendan prestar especial atencin en los platos preparados, que son los que soportan el crecimiento de listeria y desarrollan una alta concentracin a lo largo de la cadena de produccin. Envasado, temperatura, higiene y formacin son cuatro puntos a tener en cuenta para la prevencin de la contaminacin por listeria en alimentos preparados. Segn la Comisin Cientfica sobre Riesgos Biolgicos (BIOHAZ) de la EFSA, que ha tenido en cuenta distintos trabajos realizados a nivel internacional sobre la presencia de listeria en productos alimentarios, el nmero de casos de listeriosis ha aumentado en la UE desde el ao 2000, y en 2006 la cifra de afectados lleg a 1.583. La enfermedad, cuya incidencia es especialmente significativa entre mujeres embarazadas y personas mayores de 60 aos, est relacionada sobre todo con el consumo de alimentos preparados. Debe tenerse cuenta tambin que la bacteria tiene especial capacidad para multiplicarse a temperaturas de refrigeracin, lo que obliga a prestar especial atencin a estas condiciones

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CLOSTRIDIUM PERFRINGENS . El gnero Clostridium est formado por ms de cien especies con limitada relacin gentica y propiedades bioqumicas diversas. Comprende a bacilos grampositivos, anaerobios, esporulados. Son ubicuos pudiendo ser encontrados en el suelo y aguas residuales as como tambin en la flora intestinal de hombres y animales. En su mayora son saprofitos, pero los patgenos pueden causar graves enfermedades como gangrena gaseosa, botulismo, ttanos, infecciones de piel y partes blandas, colitis asociada a antibiticos e intoxicaciones alimentarias. La capacidad para provocar enfermedad esta vinculada a la posibilidad de sobrevivir en condiciones ambientales adversas mediante la formacin de esporas, crecer rpidamente y producir toxinas histolticas, enterotoxinas y neurotoxinas. Clostridium perfringens es la especie del gnero Clostridium ms frecuentemente aislada en materiales clnicos. Es un bacilo gram positivo grande (1m de ancho por 4m de largo, en promedio) de bordes rectos y extremos romos. Desarrolla rpidamente en anaerobiosis, produciendo colonias grandes (1 a 3 m de dimetro) que muestran doble halo de hemlisis en las placas de agar sangre. Sus caractersticas morfolgicas, la demostracin de presencia de esporas, el rpido desarrollo en anaerobiosis y algunas propiedades bioqumicas (lecitinasa) conforman un perfil que facilita su rpida deteccin en el laboratorio. C. perfringens es agente etiolgico de muchas enfermedades y es la tercera causa de toxinfeccin alimentaria bacteriana despus Samonella spp. Y Saphylococcus aureus. Existen dentro de la especie cinco tipos llamados A, B, C, D y E. C. perfringens A es el responsable de la mayora de los procesos infecciosos. Produce una enterotoxina (polipptido de 35.000 daltons de peso molecular) que se comporta como un super antgeno promoviendo la liberacin de mediadores de inflamacin en forma masiva. La enterotoxina es susceptible a pronasa pero no a tripsina ni quimiotripsina. En el intestino delgado, la enterotoxina se une a un receptor de membrana del ribete en cepillo e induce una alteracin de la permeabilidad calcio dependiente resultando en una prdida de iones y metabolitos. Esta prdida electroltica altera la funcin metablica intracelular provocando dao morfolgico y eventual lisis. La enfermedad se produce cuando el individuo ingiere alimento contaminado con un elevado nmero de organismos productores de enterotoxinas (100 millones). Los alimentos que pueden estar contaminados son carnes vacuna, pollo, salsas cocinadas y no refrigeradas. Cuando los alimentos llegan al intestino delgado se produce la esporulacin y la liberacin de enterotoxinas. No son comunes los brotes familiares pero si los producidos a travs de alimentos preparados comercialmente y destinados a restaurantes o instituciones. Para confirmar la existencia de una enfermedad de este tipo es necesario recuperar el agente de la muestra clnica y del paciente. Se deben recuperar al menos 100.000UFC de C. perfringens por gramo de alimento y 1.000.000 de microorganismos por gramo de heces en las primeras 24 horas. Es posible detectar anticuerpos contra la enterotoxina pero ellos no tienen valor protector.

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OBJETIVO.

Determinar la presencia de C. perfringens con diferentes tipos de tcnicas de deteccin Tomar conciencia de los peligros que ocasionan la presencia de estos microorganismos C. perfringens en los alimentos Familiarizarse con las tcnicas y mtodos de deteccin de listeria y aprecias su importancia en la seguridad alimentaria

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CAPITULO I . Concepto Basico

I.- LISTERIA

LISTERIA MONOCYTOGENES

Este microorganismo se aisl sin duda de animales inferiores y de personas enfermas antes de 1926, pero si una caracterizacin lo suficientemente precisa como para permitir su identificacin. En este ao se describi como el agente etiolgico de una epizootia que se daba entre conejos y cobayas de laboratorio, y que se caracterizaba en parte por una monocitosis. El ao siguiente, se aisl este mismo microorganismo de los jerbos en Sudfrica. Ms tarde se admiti que estos microorganismos pertenecan a la misma especie, a la cual despus de una historia taxonmica variada, se le asign el nombre de Listeria monocytogenes, nombre que continua utilizndose.

MORFOLOGIA Y TINCION
Listeria monocytogenes es un bastoncillo que no tiene capsula y no forma esporas. En cultivos muy jvenes, se encuentran en forma bacilar, con 0.5m por 1 a 2m, despus se vuelven predominantemente cocoides y generalmente esta es la forma que se observa. En cultivos viejos o en cultivos de la forma rugosa aparecen filamentos de 6 a 12m de longitud. El agrupamiento de las clulas no es caracterstico; pueden encontrarse clulas aisladas, en pares que a veces forman un ngulo agudo y en cadenas cortas. En los cultivos jvenes, los bacilos son invariablemente Gram positivos pero, a medida que el cultivo envejece, la reaccin de Gram se vuelve irregular. Algunas de las tinciones

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sencillas convencionales, por ejemplo, con azul de metileno, no son satisfactorias y deberan utilizarse las tinciones de Gram o giemsa, especialmente para los cortes de tejidos.

FISIOLOGIA
Estas bacterias crecen mejor, sobre todo en un aislamiento primario, en medios relativamente ricos y en presencia de una tensin de oxigeno reducida y de una tensin de CO incrementada. El crecimiento se produce en reacciones neutras o levemente alcalinas y estas bacterias son originadas por su capacidad para crecer bien a un pH elevado, de hasta 9,6 y en presencia de 10% de cloruro de sdico. En medios lquidos, el crecimiento es relativamente lento en ausencia de hidratos de carbono fermentables y puede retrasarse de una a dos semanas, o no producirse cuando el inoculo es pequeo; probablemente esto explique algunos fracasos en el aislamiento de Listeria a partir de materiales patolgicos.

TOXINAS
La infeccin animal producida por L. monocytogenes se caracteriza por la monocitosis; estas clulas pueden constituir hasta un 30% del total de glbulos blancos al cuarto da de la infeccin experimental en conejos. La respuesta se debe en gran parte, a la presencia en el microorganismo de un agente que produce monocitosis. Es un lquido que se libera por rotura mecnica de las clulas y es extrado por ciertos disolventes orgnicos. La actividad esta correlacionada con la virulencia, porque est presente en grandes cantidades en cepas virulentas recin aisladas, disminuye rpidamente coincidiendo con el descenso en la virulencia en cultivos seriados en medios de laboratorio.

LISTERIA EN ALIMENTOS
La listeriosis humana est causada por L. monocytogenes, siendo originada por consumo de alimentos contaminados. L. monocytogenes se encuentra ampliamente distribuida en el ambiente y est presente en bajo nmero en algunos alimentos que no necesitan ser

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cocinados antes de su consumo La listeriosis es tambin un problema emergente para la industria alimentaria como consecuencia del aumento de la incidencia, en los pases desarrollados, de epidemias asociadas al consumo de alimentos contaminados con L. monocytogenes. Este microorganismo supone un problema grave para las empresas alimentarias, ya que su control en las plantas de procesado conlleva una gran dificultad. Su ubicuidad y la alta tasa de mortalidad hacen que L. monocytogenes cobre una

especial importancia desde el punto de vista de la higiene y la salud alimentaria y que sea un microorganismo prioritario en los planes de anlisis de peligros y puntos de control crticos (APPCC) que se llevan a cabo en las industrias alimentarias. Para avanzar en el estudio de la diferenciacin de las cepas de L. monocytogenes que se pueden encontrar en distintos ambientes en las plantas de procesado de alimentos, se suele realizar el serotipado, a pesar de que posee una baja capacidad y que existen cepas no serotipables. La dosis infectiva de L. monocytogenes es de, al menos, 102 clulas viables en el caso de los grupos de riesgo, aumentando esta cifra hasta 104 en el caso de la poblacin sana. Sin embargo, sera importante estudiar la relacin dosis-respuesta de la listeriosis humana y el papel que desempea la virulencia de la cepa involucrada, as como su interaccin con el hospedador. Por esta razn, en la actualidad se sigue considerando que todos los aislados de L. monocytogenes son igual de patognicos, aunque existe cada vez ms inquietud para conocer si la virulencia vara de unas cepas a otras. Una de las lneas ms importantes en la actualidad, es la que investiga la gran capacidad de Listeria de formar biopelculas o biofilms, que le permite acantonarse en la maquinaria industrial y resistir a procesos fsicos y qumicos de eliminacin rutinarios. Por lo tanto, y debido a la importancia de nuestro pas en la produccin de alimentos, es necesario contar con tcnicas adecuadas de control y calidad en los alimentos, ya que esto contribuir a proteger la salud de los consumidores, a la vez que fortalecer la presencia internacional de nuestros productos en el mercado.

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II. CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

Desde 1981, fecha en que achalme lo aisl por primera vez , este bacilo ha sido conocido por diversos nombres ;existen aun ciertas variaciones en la terminologa .En Inglaterra , recibe la denominacin de Clostridium Welchii, mientras que los investigadores americanos lo designan como C. perfringens .

Morfologa

Clostridium perfringens es un bacilo rechoncho , inmvil, grampositivo de longitud variable , que aparece aislado y en cadenas (fig.a). suelen encontrarse capsulas polisacaridas en las preparaciones obtenidas a partir de rganos o lquidos corporales . la informacin de esporas es escasa , y solo se produce en ausencia de glcidos fermentables; son subterminales y no deforman la clula vegetativa en la que se forman.

Fig.(a) clostridium perfringens en un cultivo puro. Obsrvese el tamao, relativamente ms reducido de estas bacterias y las esporas subterminales

Fisiologa
Clostridium perfringens es un anaerobio estricto y crece fcilmente en medios de infusin profundos de cerebro y carne .El crecimiento en medios libres y azucares es limitado .Las condiciones optimas las proporcionan los medios que contienen glcidos fermentables, pero dichos cultivos suelen tener una corta vida media a causa de la escasa formacin de esporas y de la accin destructiva que tienen los cidos formados durante el proceso de fermentacin sobre las clulas vegetativas . Los medios con cerebro y carne no se oscurecen normalmente pero , en presencia de hierro metlico , se produce un cambio de color .Estos bacilos licuan la gelatina pero no digieren el suero o el huevo coagulado .

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Sus requerimientos nutritivos son complejos, aunque pueden crecer en medios sintticos si se suplementan con la mayora de los aminocidos, vitaminas, purinas, pirimidinas ,glucosa y sales.

Tipos
La identificacin serolgica de Clostridium perfringens atendiendo a los antgenos celulares no tiene aplicacin practica debido al gran numero de antgenos que prsentan reacciones cruzadas .Sin embargo, los tipos de Clostridium perfringens se distinguen segn los antgenos filtrados elaborados , sustancias liberadas por la celula , muchas de las cuales son toxicas ; cada una de ellas es antignicamente distina .Las toxinas mas importantes producidas por los tipos de Clostridium perfringens se enumeran ( hemoltica ,letal , necrotizante ; enterotoxina ) La inmensa mayora de las enfermedades causadas por Clostridium perfringens en el hombre se deben al tipo A , pero las infecciones de animales con este tipo son raras .El tipo C es principalmente un patgeno animal , pero algunas cepas de este provocan una enterocolitis necrotizante en el hombre , ilimitada en su mayor parte a nueva guinea .Los tipos restantes de Clostridium perfringens son patgenos animales que raramente se encuentran en las infecciones del hombre. A menos que se especifiquen lo contrario , la denominacin de Clostridium perfringens se empleara aqu para hacer referencia al tipo A.

Toxinas
La toxina X es la que ha despertado mayor inters , ya que es la que tiene una asociacin mas estrecha con la virulencia de C. perfringens en las infecciones de heridas , siendo tambin la toxina mas importante de estas cepas .La toxina x es una fosolipasa C dependiente de calcio , con propiedades letales y hemolticas .Se trata de una enzima de 35000 daltons que contiene zinc, e hidroliza lalectina y las esfingomielinas asociadas a la membrana. A causa de su dependencia del calcio es inhibida por el fosfato .El efecto in vivo de la toxina x es la destruccin de eritrocitos , plaquetas y leucositos , y el debilitamiento de la membrana plasmtica de la celula la muscular. C. perfringens tipo A produce tambin una colagenasa de 80000 daltons , denominada toxina ktoxia K, que acta como un factor de virulencia .Ataca al colgeno del tejido conectivo que soporta las fibras musculares , dando lugar importante como la toxina x , as mientras que el antisuero contra la toxina k no lo es . Adems de estas dos toxinas ,muchas cepas tambin producen hialuronidasa (toxina -u) desoxiribonucleasa (toxina v) y una hemolisina oxigeno labil (toxina o) En general las toxinas formadas por C. perfringens parecen ser responsables en gran medida de la histopatologa observada en la infeccin de heridas .La comparacin de la histopatologa de la enfermedad natural en el hombre , animales de experimentacin infectados y en el musculo infectado normal expuesto a filtrados de cultivo in vitro ha demostrado que los cambio son sustancialmente los mismos en los tres.

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Las cepas de C. perfringens de tipo C producen una toxina letal y necrtica denominada toxina B .La toxina B esta considerada como la principal en la patognesis de la enterocolitis necrotizante , porque daa las vellosidades intestinales ,permitiendo la unin de C. perfringens , y dando lugar a la necrosis de la pared intestinal.

Enterotoxina
La asociacin de C. perfringens con un tipo de intoxicacin alimentaria desencadeno unas erie de investigaciones dirigidas hacia la bsqueda de una enterotoxina filtrable producida por esta bacteria Las cepas de las intoxicaciones alimentarias producen , en efecto , una exotoxina termolbil activa , en forma extracelular en el modelo del asa ilica ligada del conejo, y que causa diarrea en el mono y en el hombre despus de la administracin oral . La enterotoxina , formada durante la esporulacin por numerosas aunque no todas las cepas del tipo A, asi como por algunos de los tipos C y D , es una protena de unos 25000 daltons . Ha sido purificada por diversos metodos

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CAPITULO II Tcnicas de Deteccin I. LISTERIA

DETECCIN
La presencia de L.monocytogenes ha sido ampliamente estudiada en alimentos, en ensilados destinados al consumo animal, en el ambiente y en muestras clnicas. Las tcnicas de deteccin de Listeria en alimentos no constituyen slo herramientas valiosas para identificar brotes epidmicos, sino tambin para prevenirlos, controlando las contaminaciones durante la produccin y distribucin de los alimentos. La deteccin de Listeria en alimentos se ha ido desarrollando en los ltimos aos y podemos encontrar una gran variedad de mtodos que van desde el aislamiento e identificacin de la bacteria mediante tcnicas microbiolgicas convencionales hasta los ms sofisticados mtodos genticos basados en microarrays, sin olvidar la amplificacin de cidos nucleicos, deteccin de anticuerpos y ELISA. Los mtodos bacteriolgicos convencionales son ms lentos pero muy eficaces, y continan siendo el mtodo de referencia comparado con otros mtodos ms modernos. De acuerdo con la mayora de los Organismos que legislan la presencia de L. monocytogenes en alimentos, los mtodos de aislamiento deben ser lo suficientemente precisos para detectar un microorganismo en 25 gramos de alimento. Esta sensibilidad slo puede lograrse mediante el uso de medios de enriquecimiento. Los agentes selectivos comnmente usados en el enriquecimiento de caldos de cultivo son acriflavina, que inhibe el crecimiento de otras bacterias Gram-positivas; cido nalidxico, que inhibe bacterias Gram negativas y cicloheximida, que inhibe hongos. Otros antimicrobianos utilizados a menudo incluyen el amplio espectro de agentes ceftazidima y moxalactam, as como el cloruro de litio. Otra caracterstica importante del aislamiento de Listeria en los medios de cultivo es la utilizacin de esculina. Todas las especies de Listeria hidrolizan esculina y junto con el hierro frrico da lugar a la aparicin de un intenso color negro.

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Las muestras sospechosas de contener Listeria, por lo tanto, se pueden sembrar en medios de enriquecimiento como LSAM o ALOA, que permite el crecimiento selectivo de esta bacteria. Adems de analizar la morfologa de la colonia en estos medios es interesante analizar las propiedades hemolticas de la misma en placas de agar-sangre, la actividad lecitinasa empleando placas de agar-yema de huevo, o incluso la utilizacin de G-6-P. Todos estos anlisis nos ayudarn a caracterizar la cepa de Listeria que estamos aislando. Una vez que hemos aislado colonias de presuntas Listeria, podemos determinar la especie fcilmente mediante la utilizacin de una corta batera de pruebas bioqumicas llamada API Listeria, comercializada por Biomrieux, o Micro ID. Adems, existe una prueba que discrimina con rapidez las bacterias pato-genas de las a patgenas denominada la prueba de CAMP, que no es ms que la potenciacin del carcter hemoltico de Listeria frente a Rhodococcus equi. Como hemos mencionado anteriormente, esta prueba permite diferenciar rpidamente L. innocua, de L. ivanovii y L. monocytogenes. La mayora de los mtodos alternativos carecen an de la sensibilidad y especificidad que presenta el aislamiento e identificacin clsicos, y las muestras de alimentos deben ser enriquecidas antes de su anlisis. Los mtodos inmunolgicos tienen relativamente una especificidad ms alta en comparacin con los mtodos basados en el anlisis de cidos nucleicos que son mucho ms sensibles. La desventaja de los mtodos moleculares es que las enzimas son a menudo inhibidas por algn componente de los alimentos.

TCNICAS DE DIAGNSTICO

IDENTIFICACIN DEL AGENTE

En la actualidad existen varios mtodos convencionales y rpidos disponibles para la deteccin e identificacin de L. monocytogenes en muestras de alimentos y en muestras procedentes de listeriosis animal. Los mtodos bacteriolgicos convencionales son importantes por varias razones: su empleo permite obtener el microorganismo en cultivo

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puro, lo que ser til con propsitos reglamentarios. Siguen siendo el patrn de oro frente a los cuales se comparan y validan otros mtodos. Normalmente estos mtodos son muy sensibles y no requieren equipamiento sofisticado o caro. Algunas desventajas de este grupo de mtodos incluyen el periodo de tiempo relativamente largo que se necesita para finalizar los protocolos, la experiencia prctica que se precisa en varias manipulaciones, la necesidad de productos qumicos, reactivos y medios muy diferentes, la posibilidad de que algunos microorganismos contaminantes enmascaren la presencia de las bacterias diana, incluyendo una posible falta de deteccin de variantes atpicas del organismo diana y la subjetividad relativa que supone la interpretacin del crecimiento bacteriano en placas de agar con un medio selectivo y diferencial. El aislamiento e identificacin de L. monocytogenes a partir de alimentos, muestras animales, requiere el uso de

medioambientales y muestras clnicas procedentes de

agentes selectivos y procedimientos de enriquecimiento que mantengan los niveles de microorganismos contaminantes en valores razonables y permitan la multiplicacin de L. monocytogenes hasta niveles que sean suficientes para poder detectar este microorganismo. Con este fin, en los primeros tiempos de la bacteriologa clnica listeriana, se utilizaba regularmente el enriquecimiento en fro, explotando la capacidad del microorganismo de multiplicarse a temperaturas de refrigeracin, mientras que las bacterias contaminantes no se desarrollaran bajo estas condiciones. Sin embargo, dicho procedimiento necesita tiempos de incubacin muy largos, a menudo meses, por lo que resulta inadecuado para las investigaciones actuales de brotes de transmisin alimentaria y de casos espordicos, tanto como para la puesta en prctica de programas efectivos de anlisis de riesgos y control de puntos crticos (HACCP) en las plantas de procesamiento y produccin de alimentos. Se han incorporado compuestos selectivos en los medios de cultivo que permiten el crecimiento de L. monocytogenes a temperaturas de incubacin normales; de este modo se acorta el tiempo requerido para el desarrollo selectivo del microorganismo. Ejemplos de estos compuestos selectivos son la cicloheximida, colistina, cefotetan, fosfomicina, cloruro de litio, cido nalidxico, acriflavina, feniletanol, ceftazidima, polimixina B . El diagnstico bacteriolgico de la listeriosis animal ha consistido tradicionalmente en la siembra directa de las muestras en placa con medio de agar sangre o en otros medios de enriquecimiento y, en paralelo, el empleo de la tcnica de enriquecimiento en fro, con subcultivos semanales durante 12 semanas . La introduccin de procedimientos

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alternativos de enriquecimiento y agentes selectivos para el aislamiento de L. monocytogenes a partir de alimentos y de muestras medioambientales ha abierto la posibilidad de utilizar algunas de estas tcnicas para el anlisis bacteriolgico de muestras procedentes de animales con listeriosis. A pesar de los avances conseguidos en el aislamiento de L. monocytogenes a partir de alimentos, todava existe la posibilidad de mejorar en diversas reas. Ningn procedimiento se puede considerar lo suficientemente sensible para detectar L.

monocytogenes a partir de todos los tipos de alimentos . Adems, pueden encontrarse clulas de L. monocytogenes en estado subletal en alimentos procesados debido a la refrigeracin, calentamiento, acidificacin y otros tipos de tratamientos fsicos o qumicos. Estas bacterias en estado subletal necesitan condiciones especiales de cultivo para

reparar el dao, antes de poderse detectar en el cultivo.

a) MTODOS DE CULTIVO
Los mtodos convencionales para el aislamiento de L. monocytogenes a partir de

alimentos que han ganado aceptacin con propsitos reglamentarios internacionales son el mtodo de la Administracin de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) , el mtodo oficial de la Asociacin Oficial de Qumicos Analistas (AOAC) , los Estndares ISO 11290 (31, 32), el mtodo del Servicio de Inspeccin y Seguridad Alimentaria (FSIS) del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) . Dependiendo de la naturaleza de la muestra, un mtodo particular puede ser ms adecuado que otro. El Comit Tcnico de la Organizacin Internacional Estandarizacin ISO/TC 34, Subcomit SC 9, Microbiologa, de para la Productos

Agroalimentarios, afirma que el Estndar ISO 11290, partes 1 y 2 (31, 32) puede utilizarse para la deteccin de L. monocytogenes en una gran variedad de alimentos y productos alimenticios. Aunque reconocen que este estndar puede no ser el ms apropiado en ciertos casos, recomiendan que se lleve a cabo el mximo esfuerzo para aplicar este mtodo, en lo posible. Los mtodos de la FDA y de la AOAC pueden utilizarse para el anlisis de la leche y los productos lcteos.

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El mtodo del USDA-FSIS se recomienda para la carne roja y carne de ave (cruda o lista para comer), huevos y derivados y muestras medioambientales. El procedimiento tradicional de aislamiento de L. monocytogenes a partir de tejidos animales consiste en la siembra directa de las muestras en placas con medio agar sangre de oveja u otro medio de cultivo rico y la utilizacin en paralelo de la tcnica de enriquecimiento en fro, con subcultivos semanales durante 12 semanas . El aislamiento mediante siembra directa en placa es relativamente fcil si el microorganismo est presente en gran nmero en un lugar normalmente estril, como sucede en el caso de la forma septicmica de la enfermedad, pero el aislamiento es difcil, sin embargo, cuando el microorganismo est presente en nmero reducido, como sucede en el caso de la forma enceflica o si las muestras estn fuertemente contaminadas con otros microorganismos. La comparacin de la eficacia de la siembra directa en placa, el enriquecimiento en fro y el mtodo de la AOAC, ha establecido claramente la superioridad de este ltimo sobre los otros dos, para el aislamiento de L. monocytogenes a partir de una amplia variedad de material procedente de la necropsia animal, tanto en trminos de tiempo requerido para el aislamiento e identificacin del microorganismo como en tasas de aislamiento . Para la enumeracin de L. monocytogenes se aplica el Estndar ISO 11290, tanto como los protocolos opcionales mencionados en los mtodos de la FDA y del USDA-FSIS.

Aislamiento
Las muestras utilizadas en el anlisis deben ser representativas del alimento, incluyendo la superficie externa e interna. En el caso de la listeriosis animal, las muestras deberan escogerse de acuerdo a la presentacin clnica de la enfermedad: material procedente de lesiones del hgado, riones y/o bazo, en el caso de la forma septicmica; fluido espinal, protuberancia y mdula, en el caso de la forma enceflica; y placenta (cotiledones), contenido abomasal fetal y/o secreciones uterinas, en el caso de aborto. Se deben emplear temperaturas de refrigeracin (4C) para la manipulacin, conservacin y transporte de muestras. Si la muestra ya est congelada, se debera mantener congelada hasta su anlisis. Todos los medios de cultivo preparados tienen que someterse a un control de calidad y ser capaces de mantener el crecimiento del microorganismo objeto de la prueba a partir

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de un inculo pequeo. La cepa de referencia debera cultivarse en paralelo a las muestras sospechosas para correctamente. Estos mtodos de cultivo convencional conllevan un procedimiento de enriquecimiento basado en la utilizacin de medios de cultivo lquidos que contengan agentes selectivos. La naturaleza de los medios y los agentes selectivos varan con el mtodo. Los mtodos de la FDA e ISO incluyen una etapa de pre-enriquecimiento para tratar de recuperar las clulas de L. monocytogenes en estado subletal, mientras que en los mtodos del USDAFSIS y de la AOAC las muestras se procesan directamente en caldo de enriquecimiento. En el caso del mtodo de la FDA, el pre-enriquecimiento se lleva a cabo a 30C durante 4 horas en caldo tripticasa-soja con extracto de levadura (TSB YE) sin agentes selectivos. El protocolo ISO emplea un enriquecimiento primario durante 24 horas a 30C en presencia de agentes selectivos, pero a la mitad de concentracin (caldo Fraser a la mitad). Cuando se trabaja con muestras clnicas, procedentes de listeriosis animal, la cantidad de tejido animal disponible para el anlisis podra no ser suficiente para utilizar la misma cantidad de inculo que se recomienda para el enriquecimiento de las muestras de alimento (25 g o ml). Si este es el caso, se emplea tanto material de muestra como sea posible (intntese 1025 g ml) . Las muestras se enriquecen durante 2472 horas a 30C, 35C 37C, dependiendo del mtodo. El mtodo de la FDA emplea TSB YE con acriflavina, cido nalidxico y asegurar que las pruebas se estn realizando

cicloheximida. El mtodo del USDA-FSIS utiliza dos etapas de enriquecimiento: el enriquecimiento primario se realiza en medio de la Universidad de Vermont (UVM) y contiene cido nalidxico y acriflavina; el enriquecimiento secundario se lleva a cabo en caldo Fraser con cido alidxico, cloruro de litio y acriflavina. El estndar ISO indica el caldo Fraser para el enriquecimiento secundario con agentes selectivos a la concentracin normal, mientras que el enriquecimiento primario se lleva a cabo en caldo Fraser a la mitad, como se indica anteriormente. El mtodo EOAC considera el enriquecimiento selectivo en caldo triptona de soja que contenga acriflavina, cido nalidxico y cicloheximida (medio de enriquecimiento selectivo). Despus de el enriquecimiento selectivo, los cultivos se siembran en placas de agar con un medio selectivo/diferencial para el aislamiento de las colonias presuntivas de L.

monocytogenes. Todos los mtodos utilizan el agar de Oxford, a excepcin del mtodo

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del USDA-FSIS, que emplea una frmula modificada del agar de Oxford (MOX). El agar de Oxford contiene cloruro de litio, cicloheximida, colistina, acriflavina, cefotetan y fosfomicina como agentes selectivos, y las colonias de Listeria spp. son pequeas, negras y rodeadas de un halo negro. Adems del agar de Oxford, el mtodo de la FDA incluye cloruro de litio/feniletanol/moxalactam (LPM) o agar PALCAM y el estndar ISO incluye este ltimo, que contiene cloruro de litio, polimixina B, acriflavina y ceftazidima. El agar MOX, empleado en el mtodo del USDA-FSIS, contiene cloruro de litio, colistina y moxalactam.

Identificacin
Las colonias tpicas de Listeria spp., una vez crecidas en el medio selectivo/diferencial, se seleccionan para su identificacin a nivel de especie, utilizando una batera de pruebas. Estas pruebas comprenden la reaccin a la tincin de Gram, la catalasa, los ensayos de movilidad (en una muestra en fresco observada por microscopa de contraste de fases y despus de su inoculacin en un medio de prueba de movilidad), de hemlisis y de utilizacin de carbohidratos. Algunos protocolos emplean pruebas convencionales y no convencionales disponibles comercialmente, p. ej., el Vitek, el API, el MICRO-ID, los kits de enzimoinmunoensayo (ELISA) y los kits de ensayo de cidos nucleicos que ayudan en la identificacin de L. monocytogenes. La prueba ChristieAtkinsMunchPeterson (CAMP) es una herramienta muy til que facilita la identificacin de las especies de Listeria spp a partir de los aislamientos. Se emplea en los protocolos ISO y de la AOAC y se considera opcional en los mtodos de la FDA y del USDA-FSIS. La prueba es fcil de realizar e interpretar. Consiste en sembrar en estra una cepa -hemoltica de Staphylococcus aureus (ATCC cepa 49444 o 25923, NCTC cepa 7428 o 1803) y de Rhodococcus equi (ATCC cepa 6939, NCTC cepa 1621) formando unas nicas lneas rectas y paralelas, en una placa de agar sangre de oveja o en una placa por la tcnica de la doble capa de agar, con la capa de agar sangre superior muy delgada. Las estras deben tener la suficiente separacin para permitir que las cepas de Listeria de prueba y de control se puedan sembrar perpendicularmente, entre los dos organismos indicadores, sin que los toquen (separados 12 mm). Despus de una incubacin de 2448 horas a 3537C (1218 horas si se emplea la doble capa de agar),

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se considera una reaccin positiva la aparicin de una zona destacada de -hemlisis en la interseccin de las cepas de prueba/control con las cepas indicadoras.

Cuadro 1. Diferenciacin de especies de Listeria Especie Hemlisis Produccin de cido Xilosa Ramnosa L. monocytogenes L. innocua L. ivanovii L seeligeri L. welshimeri L. grayi subsp. Grayi _ _ v _ _ _ _ _ _ + (+) _ v _ _ v _ + + + _ _ (+) _ _ + _ _ + + _ S. aureus + R. equi _ Prueba CAMP

L. grayi subsp. _ Murrayi

b) MTODOS DE IDENTIFICACIN RPIDA

MICRO-ID Listeria
El MICRO-ID Listeria es un sistema disponible comercialmente (Organon Teknika Corp., 100 Akzo Ave., Durham, NC 27712, EE.UU.) que ha sido validado por la AOAC (mtodo 992.18) (4) para la identificacin presuntiva de las especies de Listeria aisladas a partir de muestras medioambientales y de alimentos. Supone una alternativa a las pruebas bioqumicas convencionales de los aislados de Listeria spp. mediante los mtodos de la FDA y del USDA-FSIS. Se basa en el principio de que el inculo de la prueba contiene

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enzimas preformados que pueden detectarse despus de 24 horas de incubacin a 37C. La diferenciacin de las especies de Listeria se basa en un derivado del cdigo octal despus de introducir los valores numricos de cada grupo de tres pruebas y en las reacciones obtenidas a partir de la prueba CAMP y las caractersticas de hemlisis, que se ensayan por separado. Sistema de identificacin microbiana automatizada Vitek (Vitek Automicrobic System) es un sistema automatizado de identificacin microbiana que puede emplearse para la identificacin presuntiva delas especies de Listeria de transmisin alimentaria y para la deteccin de aislados diferentes a Listeria. La AOAC lo ha validado como mtodo 992.19 . El sistema utiliza una cmara incubadora con un lector ptico, una unidad de

llenado/sellado para la inoculacin del kit de la prueba y un ordenador. Cada tarjeta de identificacin de las bacterias Gram-positivas (GPI) y de las Gram-negativas (GNI+) contiene 30 pruebas bioqumicas. Los cambios se analizan mediante el ordenador, que asigna al microorganismo problema un gnero y/o una especie. La identificacin de las especies de Listeria requiere la utilizacin de una tarjeta GPI y dos reacciones con la tarjeta GNI+. Sin embargo, para la identificacin de algunas listerias el anlisis debe llevarse a cabo mediante la prueba CAMP, el ensayo de hemlisis y/o la prueba de reduccin de nitratos, como se describe en el mtodo de la FDA. Los microorganismos situados en la categora LM se identifican como L. monocytogenes o L. innocua; en la categora LI, como L. ivanovii o L. seeligeri; en la categora LW, como L. welshimeri; y en la categora LG, como L. grayi o L. murrayi (una subespecie de L. grayi). Los microorganismos de la categora O se clasifican como especies no-Listeria. Se deben realizar pruebas posteriores para identificar las especies dentro de cada categora de acuerdo con el mtodo de la FDA. Otros mtodos disponibles comercialmente para la identificacin de especies de Listeria incluyen el API LISTERIA (bioMrieux), el MICROBACT 12L (Microgen), el Sistema MicroLog (Biolog.), el Sistema de Identificacin Microbiana Sherlock (MIS) (Microbial ID; basado en patrones de cidos grasos) y el Sistema Walk/Away (MicroScan).

MTODOS INMUNOLGICOS DE DETECCIN RPIDA

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Se han desarrollado varios mtodos inmunolgicos para identificar L. monocytogenes en alimentos y los siguientes mtodos disponibles comercialmente estn validados por uno o ms sistemas oficiales de validacin.

Enzimoinmunoensayo colorimtrico monoclonal (Listeria-Tek) El Listeria-Tek es el mtodo oficial 994.03 de la AOAC (8) y se ha diseado para la deteccin de Listeria spp. en productos lcteos, carnes y mariscos. Como en la prueba se utilizan anticuerpos monoclonales (MAbs) pueden producirse reacciones cruzadas con otras Listeria spp., por tanto, la prueba no es confirmatoria para L. monocytogenes. Los cultivos de enriquecimiento que den positivo siguiendo este mtodo se siembran por estra en medios selectivos y las colonias sospechosas se identificarn mediante pruebas bioqumicas como L. monocytogenes segn el mtodo de la FDA. Slo ser vlido un resultado positivo, si los controles negativo y positivo dan unas lecturas de absorbancia aceptables.

Mtodo colorimtrico de deteccin mediante un enzimoinmunoensayo

policlonal (TECRA Listeria)

El TLVIA es el mtodo oficial 995.22 de la AOAC y se ha diseado para la deteccin de Listeria spp. En productos lcteos, mariscos, carne de ave y carnes (excepto carne cruda picada) y verduras de hoja. Los cultivos de enriquecimiento que den positivo deben inocularse en medios selectivos y las colonias sospechosas se identificarn de acuerdo a los criterios especificados en los mtodos de la FDA y del USDA.

Mtodo Assurance de enzimoinmunoensayo policlonal El enzimoinmunoensayo Assurance Listeria es el mtodo oficial 996.14 de la AOAC y puede utilizarse para la deteccin de Listeria spp., incluyendo L. monocytogenes, en

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productos lcteos, carnes rojas, cerdo, productos avcolas, frutas, frutos secos, mariscos, pastas, verduras, quesos, piensos, chocolate y huevos. Las lecturas por encima del valor de corte se consideran presuntos positivos y a continuacin los cultivos enriquecidos se confirman mediante cultivo e identificacin que se describen en el mtodo de la FDA. los procedimientos de

Ensayo visual de inmunoprecipitacin (VIPTM) El ensayo VIPTM es el mtodo oficial 997.03 de la AOAC . Puede utilizarse para la deteccin de L. monocytogenes y otras Listeria spp. en productos lcteos, carnes rojas, cerdo, aves y productos derivados, mariscos, frutas, verduras, frutos secos, pastas , chocolate, huevos y harina de huesos. La prueba se lleva a cabo con un cultivo enriquecido de las muestras problema. Las pruebas con resultado presunto positivo deben confirmarse mediante los procedimientos de cultivo e identificacin que se describen en el mtodo de la FDA.

Mtodo de deteccin mediante ensayo VIDAS LIS Este enzimoinmunoensayo fluorescente (ELFA) es el mtodo oficial 999.06 de la AOAC . Tambin ha sido validado por la Asociacin Francesa de Normalizacin (AFNOR) y por el Plan de Evaluacin de los Mtodos Microbiolgicos Europeos (EMMAS) (13). Se emplea para la deteccin de productos lcteos, verduras, marisco, carnes crudas y de ave, as como para la deteccin de antgenos de Listeria spp. en carnes procesadas y de ave. Este inmunoensayo se realiza con un instrumento automatizado VIDAS. El ordenador compara el valor obtenido con un patrn y se genera un informe positivo o negativo. Los resultados positivos deben confirmarse mediante mtodos de cultivo estndar como se describe en el mtodo de la FDA. Otros mtodos inmunolgicos disponibles comercialmente han conseguido la validacin mediante sistemas oficiales entre los que se encuentra el VIDAS Listeria monocytogenes (LMO) ELISA (bioMrieux), validado por la AFNOR; el Transia Plate Listeria ELISA

(Transia, Diffchamb Ltd), validado por la AFNOR; el EIAFOSS Listeria automated ELISA

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(Foss Electric), validado por el Instituto de Investigacin de la AOAC; el mtodo inmunocromatogrfico REVEAL para Listeria (Neogen Corporation), validado por el

Instituto de Investigacin de la AOAC; el mtodo inmunocromatogrfico Clearview Listeria Rapid Test (Oxoid), validado por la AFNOR, el EMMAS y el Instituto de Investigacin de la AOAC, y la prueba Listertest (Vicam) basada en la separacin inmunomagntica validada por el Instituto de Investigacin de la AOAC . Otros mtodos inmunolgicos disponibles comercialmente son el Transia Plate Listeria monocytogenes ELISA (Transia, Diffchamb Ltd), la prueba con Dynabeads anti-Listeria (Dynal Ltd) basada en la separacin inmunomagntica, el Listeria UniQueTM ELISA (TECRA), la prueba Microscreen Listeria de aglutinacin en latex (Microgen BioProducts Ltd),y el ensayo Listeria Rapid Test EIA (Oxoid). Mtodos de reconocimiento de los cidos nucleicos Se han desarrollado varios mtodos basados en el reconocimiento de los cidos nucleicos para identificar L. monocytogenes en alimentos. Algunos se han validado mediante uno o ms sistemas oficiales de validacin y estn disponibles comercialmente.

Ensayo GENE-TRAK para Listeria El ensayo GENE-TRAK para Listeria es un mtodo colorimtrico de hibridacin del ADN para la deteccin de las secuencias de Listeria, que ha sido validado por la AOAC como mtodo 993.09 para ser utilizado con productos lcteos, carnes y mariscos. La AFNOR tambin ha validado este ensayo. Debido a que existe la posibilidad de reacciones falsopositivas, las muestras positivas deben confirmarse mediante mtodos de cultivo estndar. Las partes de la prueba que den resultado positivo en el ensayo de hibridacin del ADN deben confirmarse mediante la siembra por estra en placa de una suspensin microbiana en tampn fosfato salino empleando un medio selectivo para Listeria, seguido de la identificacin bioqumica de los aislados presuntos Listeria, como se describe en el mtodo de la FDA.

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Sistema BAX El USDA-FSIS ha adoptado el sistema BAX basado en la PCR (Qualicon) como su nuevo mtodo de deteccin de L. monocytogenes en muestras enriquecidas de carne roja y de ave. Este mtodo consigue reducir el tiempo del resultado de las muestras negativas verdaderas en 24 horas y reduce los resultados falsos-positivos, con un lmite de deteccin superior a 1 ufc/g en 25 g de muestra. A continuacin todas las muestras que se identifiquen como presunto-positivas para L. monocytogenes se deben confirmar mediante cultivo segn el mtodo convencional.

Prueba GENE-TRAK para Listeria monocytogenes La prueba GENE-TRAK para L. monocytogenes (GENE-TRAKTM Systems) es un

mtodo basado en la hibridacin con una sonda que ha sido validado por la AFNOR .

Prueba confirmatoria Gen-Probe (AccuProbe) para Listeria monocytogenes La prueba Gen-Probe (AccuProbe) Listeria monocytogenes Confirmatory Test (GenProbe) es otro mtodo basado en la hibridacin con una sonda que ha sido validado por la AFNOR .

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Cuadro 1. Algunos sistemas comerciales rpidos para la deteccin y la confirmacin de Listeria1

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Cuadro 2. Algunos sistemas comerciales rpidos para la deteccin y la confirmacin de Listeria1

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TIPIFICACIN
La identificacin reglamentaria de L. monocytogenes no exige ninguna tipificacin

especfica de los aislados. Sin embargo, los esquemas de tipificacin pueden ser de utilidad en las investigaciones epidemiolgicas, en el seguimiento de los casos medioambientales y en la vigilancia de los casos de salud pblica. Listeria monocytogenes puede tipificarse mediante diferentes aproximaciones incluyendo el serotipado, el fagotipado, la electroforesis de enzimas multilocus (MEE), el anlisis del ADN mediante enzimas de restriccin (empleando enzimas con alta frecuencia de corte y electroforesis en gel convencional o utilizando enzimas con baja frecuencia de corte y electroforesis en gel de campo pulsado [PFGE] para separar los fragmentos), tipificacin basada en la secuencia de los cidos nucleicos y la amplificacin aleatoria del ADN polimrfico (RAPD). Se recomienda que la tipificacin de los aislados de L. monocytogenes se remita al centro de referencia apropiado debido a la necesidad de reactivos especficos, de procedimientos que aseguren una calidad rigurosa y de algn equipamiento sofisticado.

Serotipado
Las cepas de Listeria pueden asignarse a 13 serotipos diferentes, basndose en su combinacin de antgenos somtico (O) y flagelar (H). Aunque todas ellas se consideran patgenos potenciales, la mayora (>95%) de los aislados clnicos humanos, pertenecen a tres serotipos: 1/2a, 1/2b, y 4b. Comparado con otros mtodos de tipificacin, el serotipado presenta un poder de discriminacin bajo, pero puede proporcionar una

informacin valiosa para facilitar el descarte de aislados que no forman parte del brote. Frecuentemente, los aislados procedentes de alimentos o de fuentes medioambientales no son tipificables con los antisueros de tipificacin estndar.

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Fagotipado
La tipificacin por bacterifagos es una tcnica con un buen poder de discriminacin y que puede utilizarse para tipificar un gran nmero de aislados. Sin embargo, las colecciones de fagos disponibles en la actualidad no pueden tipificar una proporcin alta de cepas (2051% en el caso de la coleccin internacional de tipificacin de fagos). Debido a los requisitos rigurosos de estandarizacin y a la naturaleza biolgica de los reactivos, esta tcnica se practica slo en laboratorios especializados de referencia nacionales e

internacionales y est sujeta a una considerable variabilidad experimental y biolgica. A pesar de estos problemas, la tipificacin con fagos sigue siendo el mtodo ms prctico y adecuado de aplicacin en casos de brotes agudos y extensos .

Electroforesis de enzimas multilocus Esta tcnica se basa en las diferencias en la secuencia de nucletidos que provocan distintas movilidades electroforticas de ciertos enzimas metablicos seleccionados en geles de almidn y puede emplearse en la tipificacin de cepas bacterianas relacionadas. Sin embargo, la MEE slo es moderadamente discriminatoria cuando se utiliza en investigaciones epidemiolgicas que involucran a L. monocytogenes. Algunas cepas pueden carecer de ciertas actividades enzimticas y, por tanto, la tcnica puede resultar complicada. Debido precisamente a su naturaleza, los resultados procedentes de diferentes laboratorios son muy variables .

Anlisis del ADN cromosmico mediante endonucleasas de restriccin El anlisis del ADN cromosmico mediante endonucleasas de restriccin (REA) es un mtodo til de tipificacin de L. monocytogenes. Como estas enzimas son muy

especficas en el reconocimiento de las secuencias de nucletidos, los fragmentos resultantes de la digestin del ADN, de tamaos y movilidad electrofortica diferentes, reflejan las diferencias genmicas, lo que resulta en unas huellas dactilares especficas para cada una de las distintas cepas relacionadas. El mtodo presenta un grado alto de reproducibilidad debido a la especificidad de las endonucleasas de restriccin. De las endonucleasas de restriccin probadas con L. monocytogenes en un estudio multicentro

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de la Organizacin Mundial de la Salud (WHO), las ms utilizadas fueron HaeIII, HhaI y CfoI (23). Sin embargo, debido al nmero elevado de sitios potenciales de reconocimiento enzimtico en el genoma bacteriano, a veces las huellas dactilares complejas se desarrollan con baja resolucin o con solapamiento de las bandas, lo que dificulta su interpretacin. La tcnica no es adecuada, por tanto, para comparar un gran nmero de patrones de cepas o para elaborar bases de datos dinmicas. Cuando se combina el REA con un anlisis de hibridacin de tipo Southern, que emplee sondas cromosmicas marcadas, slo se detectarn los fragmentos de restriccin especficos asociados con los loci cromosmicos correspondientes, por lo que se analizar un nmero significativamente reducido de fragmentos de ADN. Esta tcnica se conoce como anlisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP). Cuando se utilizan sondas de ADN correspondientes a los RNA ribosmicos, se detectan nicamente los fragmentos de restriccin concretos asociados con los loci

cromosmicos de los ARNr. Esta tcnica se denomina ribotipado y se utiliza ampliamente en la tipificacin de L. monocytogenes, principalmente con la endonucleasa de restriccin EcoRI. Sin embargo, esta tcnica tiene un poder de discriminacin menor que el fagotipado, el REA o la MEE. La compaa Qualicon ha diseado un sistema de ribotipado automtico, el RiboPrinter, que genera, analiza y almacena los patrones de huellas de ribotipado de diversas bacterias, incluida Listeria. Si se emplean endonucleasas de restriccin con baja frecuencia de corte para digerir ADN cromosmico ntegro, tales como los enzimas ApaI, SmaI, NotI o AscI, se obtienen fragmentos muy grandes. A causa de su tamao, estos fragmentos grandes no se pueden separar cuando se someten a una electroforesis convencional en gel de agarosa. Sin embargo, aplicando cambios peridicos de la orientacin del campo elctrico a lo largo del gel, a travs de pulsos, los fragmentos grandes pueden avanzar lentamente en la matriz de agarosa y separarse de acuerdo a sus diferencias de tamao. Esta tcnica se conoce como electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) y ha revolucionado la separacin precisa de los fragmentos de ADN de tamao superior a 40 kilobases. La PFGE se aplica en la tipificacin de L. monocytogenes y se ha visto que es un mtodo muy reproducible y discriminatorio. Particularmente, la PFGE es til para la tipificacin de los aislados del serotipo 4b, los cuales no se tipifican de forma satisfactoria mediante la mayor parte de los mtodos de tipificacin disponibles. Las principales desventajas de la PFGE son el tiempo de duracin del procedimiento (23 das) y el gasto de grandes cantidades de

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enzimas de restriccin que son caras, al igual que el equipamiento necesario para llevarlo a cabo. Si se emplean endonucleasas de restriccin con baja frecuencia de corte para digerir ADN cromosmico ntegro, tales como los enzimas ApaI, SmaI, NotI o AscI, se obtienen fragmentos muy grandes. A causa de su tamao, estos fragmentos grandes no se pueden separar cuando se someten a una electroforesis convencional en gel de agarosa. Sin embargo, aplicando cambios peridicos de la orientacin del campo elctrico a lo largo del gel, a travs de pulsos, los fragmentos grandes pueden avanzar lentamente en la matriz de agarosa y separarse de acuerdo a sus diferencias de tamao. Esta tcnica se conoce como electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) y ha revolucionado la separacin precisa de los fragmentos de ADN de tamao superior a 40 kilobases. La PFGE se aplica en la tipificacin de L. monocytogenes y se ha visto que es un mtodo muy reproducible y discriminatorio. Particularmente, la PFGE es til para la tipificacin de los aislados del serotipo 4b, los cuales no se tipifican de forma satisfactoria mediante la mayor parte de los mtodos de tipificacin disponibles. especializado

Tipificacin basada en la secuencia de los cidos nucleicos Aunque se han publicado trabajos acerca del anlisis de la secuencia de genes nicos como medio para tipificar las cepas de L. monocytogenes, la determinacin de la

variacin allica de genes mltiples se presenta como una metodologa de tipificacin muy prometedora para este microorganismo. Este enfoque se ha descrito para un grupo reducido de otros microorganismos y se conoce como tipificacin basada en la secuencia multi locus (MLST) . Se han utilizado con un buen grado de discriminacin entre las cepas analizadas la amplificacin directa y la secuenciacin de nucletidos as como una

aproximacin alternativa que apunta a los cambios genticos variables directamente en un formato de micromatriz de ADN . Debido a que la MLST se basa en la secuencia de nucletidos, es muy discriminatorio y proporciona resultados precisos. Los elementos de secuencia corta repetitiva estn ampliamente distribuidos entre las bacterias y las unidades palindrmicas, conocidas como palndromes extragnicos repetitivos (REP), constituyen la familia mejor caracterizada de secuencias bacterianas repetitivas. Los elementos REP estn presentes en L. monocytogenes y se ha utilizado

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con xito una PCR basada en la secuencia de estos elementos (rep-PCR) para tipificar cepas de dicho microorganismo. Los cuatro principales grupos de cepas identificados por este mtodo coincidieron con el origen de su aislamiento.

Amplificacin aleatoria del ADN polimrfico

de forma arbitraria bajo

Cuando en la PCR se emplean cebadores seleccionados

condiciones de baja estringencia, con ADN cromosmico de L. monocytogenes como molde, los perfiles de los productos de la amplificacin generados son tiles para la tipificacin de las cepas. La RAPD es una alternativa viable al fagotipado y presenta un grado elevado de discriminacin. Sin embargo, a pesar de su simplicidad relativa y su capacidad discriminatoria, su desventaja principal es la reproducibilidad irregular de los perfiles. Las condiciones de baja estringencia para templar los cebadores provoca una polimerizacin con eficiencias diversas y, por tanto, las cantidades de ADN producidas pueden variar ampliamente entre los diferentes productos de la amplificacin procedentes de un aislado concreto, lo que dificulta la comparacin e interpretacin de los perfiles de la RAPD. La tcnica requiere un gran acuerdo de estandarizacin y regularidad para obtener resultados fiables . Basndose en los resultados del estudio multicentro de tipificacin de L. monocytogenes de la WHO , que compara diversos mtodos de tipificacin diferentes mediante la utilizacin de una coleccin bien definida de aislados, se seleccionaron para la estandarizacin en Fase II, el serotipado, el fagotipado, el REA, la PFGE y la RAPD. Finalmente este esfuerzo debera resultar en una coleccin seleccionada de mtodos estandarizados de tipificacin de L. monocytogenes.

PRUEBAS SEROLGICAS
Tradicionalmente las pruebas serolgicas no se han utilizado para diagnosticar la listeriosis. Han sido poco fiables, carentes de sensibilidad y de especificidad. Se han intentado sin xito varios formatos, incluyendo la tcnica ELISA, la fijacin del complemento y la icroaglutinacin, en el diagnstico de casos de listeriosis humana demostrada en cultivo, incluso en ausencia de inmunosupresin. Se ha observado una

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considerable reaccin cruzada con determinantes antignicos de otros organismos Grampositivos. Por otra parte, L. monocytogenes es un microorganismo ubicuo y es muy comn Muchos la exposicin habitual de los animales y del hombre a este microorganismo. individuos sanos son portadores intestinales (26%) y en el hombre se ha

descrito la prevalencia de anticuerpos sricos anti-L. monocytogenes en un nivel tan alto como del 53%. El nivel de portadores en los animales es similar al de humanos, con algunas diferencias dependiendo de la especie y una tasa algo mayor durante la estacin de estabulacin en comparacin con la de pastoreo de los animales. El descubrimiento reciente de que la hemolisina de L. monocytogenes, la listeriolisina O (LLO), es el principal factor de virulencia y que puede estimular una respuesta de anticuerpos, ha hecho reanudar el inters acerca de la posibilidad de utilizar las pruebas serolgicas para el diagnstico de la listeriosis, en particular en los pacientes afectados en el sistema nervioso central, con lquido cerebro espinal y sangre estriles, y en los casos de listeriosis perinatal. En el diagnstico de la listeriosis experimental de ovejas se aplica un ELISA indirecto basado en la deteccin de los anticuerpos anti-LLO (37). Sin embargo, la LLO est relacionada antignicamente con varias citolisinas, entre ellas la

estreptolisina O (SLO) de Streptococcus pyogenes, la pneumolisina de S. pneumoniae y la perfringolisina de Clostridium perfringens. Los problemas de reactividad cruzada de los anticuerpos anti-LLO con las citolisinas, particularmente con la SLO y la neumolisina, han obstaculizado el desarrollo de pruebas serolgicas especficas y fiables basadas en la deteccin de anticuerpos anti-LLO. Adems, los anticuerpos anti-LLO se encuentran en una proporcin de individuos sanos y pacientes con infecciones producidas por otras bacterias, hongos o virus (27%, en conjunto), aunque con ttulos inferiores a los presentados por pacientes con listeriosis. La absorcin de los antisueros que se van a diagnosticar con la SLO es slo parcialmente efectiva para eliminar la reactividad cruzada completa. Estos ensayos experimentales se han utilizado en algunas investigaciones epidemiolgicas y como apoyo al diagnstico de infecciones del sistema nervioso central con resultado negativo en cultivo. Las formas recombinantes de la LLO se han probado como alternativas a la LLO de tipo silvestre como antgeno de diagnstico en ensayos de inmunoelectrotransferencia. Actualmente ste es un campo en evolucin y todava tendremos que esperar para conseguir el desarrollo de pruebas serolgicas validadas y fiables para el diagnstico de la listeriosis.

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II. CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

DETECCION
MATERIAL Tubos de ensayo con tapon de rosca de 10 x 150mm Tubos de ensayo de 16 x 160 mm Gradillas Pipetas de 1ml esteriles Estufa de cultivo Asa de cultivo Hilo de cultivo

Agar lactosa leche yema de huevo ( LYL) Medio basal Composicin : Lactosa Sol. Acuosa rojo neutro ( 10g/l) Agar Caldo de carne 12 g 3,25ml 12 g 1,000 ml

Disolver por calentamiento .Ajustar el ph a 7,5. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos Emulsion de yema de huevo Leche desnatada esterul Solucin de tioglicolato sdico Composicin : Tioglicolato sdico Agua destilada Esterilizar por filtracin Medio completo Composicin : 12 g 1,000 ml

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Medio basal Emulsion de yema de huevo Leche desnatada Solucin de tioglicolato sdico 1,000 ml 37,50 ml 150 ml 10 ml

Al medio basal, licuado y atemperado a 50 C, se aaden la emulsion de yema de huevo y la leche desnatada esteril , previamente calentada a 50 C .Inmediatamente despues se aade la solucin de tioglicolato, todo ello en condiciones aspticas.Mezclar bien y preparar placas de Petri Solucin de ringer con cistena Composicin : Cloruro sdico Cloruro potsico Cloruro clcico Carbonato sdico L- Cisteina Agua destilada 2,25 g 0,105 g 0,12 g 0,05 g 0,30 g 1,000 ml

Disolver. Ajustar el pH a 7. Distribuir en tubos de ensayo a razn de 9 mililitros .Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15minutos. Caldo lactosa sulfito ( CLS ) Composicin : Peptona de casena Extracto de levadura Cloruro sdico Lactosa L- cistena Agua destilada 5g 2,50 g 2,50 g 10 g 0,30 g 1,000 ml

Disolver los ingredientes . Ajustar el pH a 7,1 .Distribuir en tubos de ensayo con campana Durham , a razn de 8 ml .Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos .Este medio se conserva a temperatura de refrigeracin ( 4 C ).

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En el momento de su utilizacin , se lleva a un bao de agua en ebullicin durante 5 minutos .Enfriar y aadir , a cada tubo , 0,5 ml de solucin acuosa al 1,2 por 100 de metabisulfito sdico anhidro y 0,5 ml de solucin acuosa al 1 por 100 de citrato frrico amnico .Las dos soluciones acuosas se esterilizan por filtracin en el momento de ser incorporadas al medio , utilizando membranas filtrantes de 0,45 um.

TECNICA Metodo de recuentro en tubos

La siembra de la muestra, preparada adecuadamente , se hace en la masa de medios de cultivo que llevan sulfito en su composicin . A partir de la serie de diluciones decimales , y por duplicado, se siembra 1 ml de las distintas diluciones en tubos de ensayo de 10 x 150 mm con tapon a rosca , esteriles .Inmediatamente se vierten , en cada tubo , 15 ml de agar tripton sulfito neomicina (TSN) , licuado y atemperado a 45 C -50 C . Una vez solidificado el agar , se vierten sobre su superficie unos 3ml de parafina esteril .Incubar a 46 C durante 24 horas .Esra temperatura es selectiva para el aislamiento de clostridium perfringens. El medio TSN es selectivo para Cl. Perfringens .En su composicin intervienen : polimixina B , neomicina y sulfito sdico, sustancias que inhiben el crecimiento de la flora competitiva y otros clostridium .Algunos otros clostridium sulfito- reductores son inhibidos por los antibiticos y por la temperatura selectiva para Cl. Perfringens que se utiliza (46C) .El sulfito sdico , en presencia de las sales de hierro del medio , es reducido a sulfuro de hierro y da lugar a colonias negras . El recuento de Cl. Perfringens se obtiene contando el numero de colonias tpicas crecidas en el tubo y multiplicando por su factor de dilusion : se obtiene asi el numero de colonias por gramo o mililitro del alimento en estudio. El procedimiento ,muy selectivo, sirve para obtener recuentos ,exclusivamente .No se aconseja cuando sea necesario tomar colonias para ser confirmadas , puesto que , al oxidarse en contacto con el oxigeno del aire , palidecen por oxidacin del sulfuro de hierro .

Metodo por la tcnica del numero mas probable ( NMP) ( Procedimiento cuantitativo en medio liquido )
A partir de la serie de diluciones decimales , se procede como sigue : Sembrar 1 ml de la dilucin 1:10 , en cada uno de los 5 tubos que constituyen una primera serie y que contiene 10 ml de RCM Sembrar 1ml de ladilucion 1:100 , en cada uno de los 5 tubos que constituyen una segunda serie y que contienen 10 ml de RCM

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Sembrar 1 ml de la dilucin 1:1.00, en cada uno de los 5 tubos que constituyen una tercera serie y que contienen 10 ml de RCM Incubar las tres series de cinco tubos a 46 durante 48 horas , con lectura a las 24 horas De cada tubo con crecimiento , se siembra 0,5 ml por diseminacin con asa de vidrio, sobre la superficie bien seca de placas que contienen agar triptosa sulfito cicloserina con yema de huevo ( TSCY ). Una vez seca la siembra diseminada , se cubre el agar con una capa del medio de cultivo agar triptosa-sulfito- cicloserina sin yema de huevo , esteril.Incubar en anaerobiosis a temperatura de 46C durante 24 horas .Las colonias tpicas ( colonias negras de 1-3 mm, rodeadas de un halo blanco debido a la reaccin de la yema de huevo ) se confirman. Segn el numero de tubos positivos confirmados como clostridium perfringens , se hace la lectura en la tabla NMP de tres series de cinco tubos . Esta lectura expresara la cantidad de grmenes por gramo o mililitro de muestra en estudio. Confirmacin Los distintos medios que se utilicen para la confirmacin deben ser regenerados preciamente, por calentamiento en agua hirviendo durant 10 minutos . Todo medio de cultivo cuya superficie esta en contacto con la atmosfera lleva en su interior aire disuelto, que prejudica el desarrollo de la flora anaerobio. Con la regeneracin se logra expulsar este aire , al producirse dilatacin .Durante la permanencia en el bao de agua hirviendo es conveniente dar pequeos golpes de vez en cuando para facilitar la evacuacin de las burbujas. Se selecciona un minimo de 2 colonias tpicas crecidas sobre agar TSCY y se siembran individualmente en tubos con agar LYL , para comprobar su pureza .Incubar a temperatura de 46C en anaerobiosis durante 24 horas. Las colonias crecidas despues de la incubacin se siembran por picadura en agar para la fermentacin de la lactosa ( FL) y en tubos con medio TEL .Incubar a 46C , en anaerobiosis , durante 24 horas .En los cultivos obtenidas, se pueden observar las siguientes reacciones: Fermentacin de la lactosa con produccin de gas : se manifiesta por un viraje del medio FL del rojo al amarillo , con formacin de burbujas de gas . Movilidad , se manifiesta por un crecimiento difuso a lo largo de la lnea de siembra en el medio TEL . Cl. Perfringens fermenta la lactosa con produccin de gas y es inmvil. Pruebade Willis : placas con agar LYL bien secas se marcan con rotulador en la parte inferior y extrema de la placa .En una de las mitades se extienden unas gotas antitoxina diagnostica de Cl. Perfringens tipo A y se dejan secar . Se

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extienden por toda la placa, incluidas las dos mitades, colonias crecidas sobre el agar de aislamiento TSCY , comenzando por el lado que no tiene antitoxina y marcando en toda la placa cuatro lneas espaciales . Incubar en anaerobiosis a temperatura 46 C de 18-24 horas .El crecimiento de clostridium perfringens en esta prueba se manifiesta por un rea de crecimiento blanco y denso que rodea las lneas de siembra , nicamente de la mitad de la placa en la que no existe antitoxina Cl. Perfringens tipo A . La fermentacin de la lactosa hace que aparezca color rojo en el medio de cultivo , a lo largo de la lnea de siembra .

Tecnica para la numeracin en medio liquido

A partir de la serie de diluciones decimales , utilizando como diluyente solucin de ringer con cistena , regenerado durante 10 minutos en bao de agua hirviendo yu enfriando inmediatamente , se procede como sigue : Sembrar 1ml de cada uno de los tubos de la serie por duplicado , en otros tantos tubos con caldo CLS regenerado , evitando que se mezcle en exceso para mantener correctamente la condiciones de anaerobiosis . Incubar a 46 C durante 18-24 horas es anaerobiosis. La presencia de Cl. Perfringens se manifiesta por un precipitado de sulfuro de hierro que seala su poder sulfito reductor .La aparicin de gas en la campana durham revela la fermentacin de la lactosa con produccin de gas. Los tubos positivos se multiplican por el factor de dilucin para saber el numero de Cl. Perfringens por gramo o mililitro de alimento. Es un mtodo sencillo , que selecciona a Cl. Perfringens de otros clostridium sulfitoreductores . Unicamente tiene interferencias con Cl. Perfringens , pero hay que tener en cuenta que la presencia de este ultimo germen en los alimentos es muy rara.

PRUEBAS RAPIDAS PARA LA INDENTIFICACION PERFRINGENS TIPO A

DE

CLOSTRIDIUM

Para la deteccin de cepas enterotoxigenicas de Cl. Perfringens tipo A , existen pruebas DNA que se utilizan en laboratorios especializados ( Van Damme ,1990) . Para el manejo en laboratorio con menos recursos , existen mtodos miniaturizados preparados comercialmente , que se utilizan para la identificacin de las formas vegetativas: API 20 A (galera de identificacin bioqumica de bacterias anaerobias estrictas ) API ATB 328 ( galera de identificacin rpida de bacterias anaerobias estrictas ). An IDENT ( identificacin de anaerobios ) Minitek anaerobios.

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Son una alternativa a los mtodos convencionales , con la ventaja de poder estudiar gran cantidad de caracteres y utilizar menos tiempo . Para la puesta en evidencia de las enterotoxinas elaboradas por Cl. Perfringens tipo A , se han utilizado diversos mtodos : Mtodos biolgicos Mtodos serolgicos Mtodos inmunoenzimaticos Metodos de cultivos celulares .

Los mtodos biolgicos incluyen : La medida del liquido acumulado en el asa ileal ligada del conejo .Es la tcnica biolgica mas antigua . La ingestin oral ( con resultado de diarrea ) o la inoculacin de la toxina a analizar en el estomago de ratones ( con resultado de muerte ) La medida de la actividad eritematosa y el incremento de la permeabilidad capilar en la piel de cobayas por inoculacin intradrmica de la toxina .

Estos primeros mtodos han sido sustituidos por tcnicas serolgicas .Estas tcnicas se utilizan para la deteccin de enterotoxina de Cl. Perfringens tipo A a partir de filtrados de cultivo .Durante cierto tiempo se utilizan mtodos basados en tcnicas de inmunoprecipitacin : Doble gel difusin en agar Electroinmunodifusion. Contrainmunoelectroforesis Gel difusin simple

Recientemente , basndose en la prueba RPLA ( reversed passive latex aglutination ) se han elaborado un Kit sensible y sencillo . Se utiliza para la deteccin de enterotoxinas en heces y en filtrados de cultivos bacterianos .Este Kit RPLA (Denka- seken ;unipath ) , permite a los laboratorios corrientes determinar la produccin de enterotoxina en el sobrenadante de filtrados de cultivos bacterianos y en muestras de heces , como ya se ha sealado .El mtodo se considera eficaz para la determinacin y cuantificacin de la enterotoxina .Su sensibilidad alcanza , aproximadamente , 3 ng/ml. Es menos sensible que el mtodo ELISA , pero tiene la ventaja de ser de fcil manejo y utilizar reactivos sencillos. El mtodo ELISA para la investigacin de enterotoxina elaborada por Cl. Perfringens tipo A , requiere una tcnica estndar sobre el crecimiento colonial crecidas durante 48 horas se separan con papel de filtro .En su lugar se colocan discos de nitrocelulosa para absorber la enterotoxina que se detecta en 24 horas por el mtodo ELISA ( Stelma ,1985 ) .En aos recientes, han adquirido mucho inters las pruebas con tejidos celulares ( mahoney ,1989)

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PREVENCION Y CONTROL DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TIPO A
Cl. Perfringens tipo A , como ya se ha sealado , es una bacteria esporulada ( los esporos no se suelen ver in vitro ), inmvil , anaerobia , con capsula la mayora de Para evitar la aparicin de toxinfecciones alimentarias por Cl. Perfringens tipo A conviene , adems , limitar la contaminacin de los alimentos en su estado crudo .En el caso concreto de las carnes , es necesario respetar estrictamente las condiciones higienicas del sacrificio y las manipulaciones posteriores efectuadas en el matadero , trasporte y venta . En todos los casos , el control de la temperatura es el punto primordial para afianzar la seguridad del consumidos ( Hall , 1986)

CONCLUCION

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BIBLIOGRAFA

http://cdigital.dgb.uanl.mx/te/1020118504.pdf - clostridium perfringens http://www.elergonomista.com/microbiologia/perfri.htm - clostridium perfringens http://books.google.com.pe/books?id=9EIfkks8uxMC&pg=PA111&lpg=PA111&dq= deteccion+de+clostridium+perfringens+en+alimentos&source=bl&ots=RHaRYZelg e&sig=jjgtqkTHFtjYOWtipXaJTqqkFuU&hl=es419#v=onepage&q=deteccion%20de%20clostridium%20perfringens%20en%20ali mentos&f=true - ( investigacion y recuento de clostridium perfringens ) http://es.scribd.com/doc/6593534/Microbiologia-de-Alimentos-Practica-n08Deteccion-de-Listeria - Tcnica de deteccin de listeria http://es.scribd.com/doc/6674027/Microbiologia-de-Alimentos-Practica-n14Aislamiento-e-identificacionde-Clostridium-perfringens - tecnica de deteccion de clostridium perfringens libro de microbiologa de los alimentos

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