Anda di halaman 1dari 4

Isolasi Mitokondria Meskipun dimungkinkan untuk mengukur respirasi oleh jaringan utuh seringkali berguna untuk dapat mengisolasi

tidak terkontaminasi, utuh dan fungsional mitokondria. Kami di sini akan mempertimbangkan beberapa prinsip untuk mengisolasi organel sel. Diskusi ini tidak dimaksudkan untuk menjadi lengkap dan tidak akan menjadi sebuah buku masak dengan resep yang harus diikuti langkah demi langkah. Referensi umum berguna adalah Douce (1985) dan Moller et al. (1996). Pilihan Material Jika tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki masalah fisiologis tertentu, maka bahan tanaman sering didefinisikan dengan baik. Namun, dalam banyak kasus ada beberapa fleksibilitas dalam pilihan bahan dan oleh karena itu bijaksana untuk mengikuti aturan-aturan tertentu praktis: Pilih jaringan yang mudah untuk mendapatkan dalam jumlah yang relatif besar (setidaknya 100-200 g berat basah), seperti umbi-umbian atau hipokotil. Pilih jaringan yang protokol yang baik tersedia. Hal ini dapat mengambil cukup banyak waktu dan usaha untuk mengoptimalkan protokol isolasi. Perhatikan bahwa isolasi mitokondria dari jaringan hijau menyajikan masalah khusus karena besarnya jumlah kloroplas. Akar adalah jaringan yang sangat sulit untuk isolasi mitokondria. Gangguan Organ Tujuannya adalah untuk pecah karena banyak dari sel-sel dalam jaringan mungkin untuk melepaskan sitoplasma mereka dengan mitokondria. Sedangkan jaringan mamalia yang mudah untuk menghomogenkan, jaringan tanaman yang jauh lebih keras terutama karena dinding sel. Ada beberapa homogenizers standar, termasuk mixer dengan pisau berputar atau razorblades, jus extractors, pabrik bola, dan mortir dan alu, dan yang paling cocok untuk bahan tanaman tertentu harus dipilih. Hal ini mungkin melibatkan beberapa percobaan awal optimasi. Homogenisasi Menengah Media untuk hati tikus homogenisasi hanya berisi osmotikum dan buffer. Itu tidak akan bekerja dengan jaringan tanaman karena terganggunya vakuola pusat besar (absen dalam sel mamalia) yang melepaskan isinya cukup asam, sering mengandung fenol dan zat berbahaya lainnya. Mari kita mempertimbangkan komponen media homogenisasi optimal untuk mengisolasi organel utuh dan fungsional satu per satu: Osmotikum. Hal ini diperlukan untuk mencegah mitokondria dari kehilangan konten matriks mereka karena pembengkakan dan meledak. Untuk isolasi tanaman mitokondria ada tradisi menggunakan sukrosa atau manitol pada 0,2-0,5 M, sedangkan 0,15 M KCl standar untuk isolasi mitokondria mamalia. Dalam kasus ini juga tidak meniru justru kondisi di sitosol, tetapi bekerja. Buffer. PH dalam sitosol dari sel tumbuhan adalah sekitar 7,5, dan homogenat harus buffer pada pH 78. Sebuah penyangga karenanya harus disertakan dan sejumlah besar buffer yang berbeda yang tersedia. Pilih satu murah dengan pKa 7-8 (misalnya, 4-morpholinopropane asam sulfonat = MOPS) dan pastikan untuk menggunakan cukup untuk mengimbangi konten vacuolar asam. Jenis jaringan, rasio jaringan / menengah dan konsentrasi penyangga menentukan apakah konten vacuolar asam dinetralkan dengan benar. Jaringan Jelas khusus seperti lemon atau tanaman CAM dipanen larut malam atau di pagi hari memerlukan perawatan khusus!

Ion logam chelators. EDTA biasanya disertakan untuk mengikat terutama Ca2 + dan Mg2 +, yang dinyatakan dapat mengaktifkan enzim proteolitik. Antioksidan. Antioksidan (reduktan) seperti asam askorbat, dithiothreitol, atau sistein digunakan terutama untuk melindungi kelompok sulfhidril pada protein terhadap oksidasi. Bovine serum albumin (BSA). Ini protein dari darah sapi biasanya disertakan untuk melindungi mitokondria: BSA mengikat asam lemak (fungsinya dalam darah) dirilis oleh aksi phospholipases pada fosfolipid. BSA juga dapat mengikat fenolat yang dilepaskan dari vakuola. Kedua kelompok senyawa lain dapat mengganggu nantinya.Selain itu, BSA dapat mencegah protease dari protein mitokondria merendahkan dengan melayani sebagai substrat alternatif hadir pada konsentrasi tinggi. Polivinil pirolidon. Sebuah polimer yang sering termasuk untuk menyerap senyawa fenolik. Penyaringan Untuk menghapus fragmen jaringan yang lebih besar, dinding sel dan sering butir pati, homogenat selalu disaring, biasanya melalui jaring nilon dengan ukuran lubang 30-100 pM. Pemurnian Mitokondria Langkah pertama dari pemurnian biasanya sentrifugasi diferensial. Ini berarti bahwa homogenat disaring disentrifugasi pertama di kecepatan rendah untuk waktu yang singkat (misalnya, 3000 g selama 5-10 menit) dan pelet (fragmen dinding sel yang mengandung, biji-bijian pati, inti, plastida utuh) dibuang. Supernatan kemudian disentrifugasi lebih cepat dan untuk waktu yang lama (misalnya, 10 000 g selama 10-20 menit) dan pelet disebut mitokondria mentah dikumpulkan. Ini berisi membran mitokondria serta peroksisom dan plastid utuh dan rusak. Supernatan dibuang. Segera setelah mitokondria telah pellet dan dengan demikian dihapus dari berpotensi merusak zat larut dalam homogenat, media dapat sangat disederhanakan. Biasanya media mencuci disebut mengandung penyangga hanya osmotikum dan lemah (tidak perlu untuk satu yang kuat karena tidak ada isi vakuola untuk menetralisir). Namun, bisa bijaksana untuk memasukkan EDTA untuk mengikat kation divalen dan BSA untuk menyerap setiap asam lemak yang dikeluarkan oleh aksi phospholipases.Mitokondria mentah resuspended sering diencerkan sampai 50-100 ml dengan media mencuci dan mengalami satu putaran sentrifugasi lambat dan cepat untuk menghilangkan kontaminan lebih. Tujuan dari langkah berikutnya adalah untuk memisahkan mitokondria utuh dari kontaminan. Ini biasanya melibatkan sentrifugasi gradien densitas dengan Percoll baik sendiri (misalnya, Struglics et al. 1993) atau bersama-sama dengan bahan padat lainnya (misalnya, Hari et al. 1985). Percoll (silika koloid dilapisi dengan polivinilpirolidon, PVP) adalah inert dan tidak aktif secara osmotik. Ini memiliki keuntungan lebih lanjut bahwa gradien Percoll adalah diri menghasilkan karena Percoll mikrosfer pelet sangat lambat selama sentrifugasi tersebut. Mitokondria mentah yang berlapis-lapis di atas media mencuci mengandung konsentrasi yang tepat Percoll (biasanya 25-30%). Jika konsentrasi Percoll dan kecepatan dan durasi sentrifugasi telah dipilih dengan benar, mitokondria utuh akan membentuk sebuah band yang berbeda jauh dari kontaminan. Band ini dapat dikumpulkan, dicuci bebas dari Percoll oleh pengenceran diulang dan sentrifugasi, dan baik digunakan segera, atau dibekukan dengan 5% (v / v) dimetilsulfoksida (untuk menjaga integritas) dalam nitrogen cair dan disimpan pada -80 C sampai digunakan. Persiapan ini bisa stabil selama berbulan-bulan, jika tidak bertahun-tahun.

Hasil panen adalah 1-50 mg protein mitokondria per 100 g berat segar tergantung pada jaringan. Ini merupakan paling 20 persen% dari mitokondria dalam jaringan. Subfractionation dari Mitokondria Mitokondria berisi empat kompartemen, masing-masing dengan pelengkap yang unik dari protein, membran luar (yang mengandung sekitar 7% dari protein), ruang intermembrane (mungkin 1-2%), membran dalam (50-60%) dan matriks (30-40%). Ada kalanya diinginkan untuk dapat mengisolasi tersebut, misalnya ketika mencoba untuk melokalisasi suatu fungsi yang diberikan dalam mitokondria, dan biasanya dilakukan dengan cara berikut (misalnya, Agius et al. 2001)

kompartemen. Media hipotonik menyebabkan mitokondria membengkak karena matriks membutuhkan air. Karena luas permukaan membran dalam (IMM) sangat melebihi dari membran luar (OMM), istirahat yang terakhir, melepaskan isi ruang intermembrane (IMS) bersama-sama dengan beberapa OMM. Penambahan osmotikum menyebabkan minus mitoplasts-mitokondria (beberapa) OMM-untuk kontrak membuat mereka kurang rentan terhadap kerusakan mekanis. Para mitoplasts dapat pellet dan subfractionated ke IMM vesikel (= partikel submitochondrial atau SMP) dan matriks dengan sonikasi dilanjutkan dengan sentrifugasi diferensial. Ketika sonication dilakukan dalam media tinggi garam, SMP berada di dalam-out, yaitu, mereka memiliki orientasi yang berlawanan dari IMM secara utuh mitchondria (et al Moller 1987.). The SMP terkontaminasi dengan OMM beberapa. OMM ini terisolasi dari supernatan mitoplast dengan sentrifugasi. Hasil dari OMM kecil, tetapi relatif tidak terkontaminasi oleh IMM. Protein Intermembrane ditemukan dalam supernatan OMM. Simbol: Kecil-kotak matriks protein, misalnya, malat dehidrogenase, Triangles-intermembrane protein ruang (tidak ada penanda dikenal untuk tanaman mitokondria), Square-dan-lingkaran-FoF1-ATPase (= ATP sintase) dalam membran dalam dengan F1 menghadapi matriks. (Klik gambar untuk memperbesar.) Membran luar yang pecah baik oleh pembengkakan osmotik atau solubilisasi selektif dengan digitonin, deterjen khusus. Dalam kedua kasus, sangat penting untuk menghindari pecah membran batin karena pelepasan matriks bahkan dari beberapa persen dari mitokondria akan menyebabkan kontaminasi yang sangat besar dari ruang intermembrane, yang kecil dalam volume. Pellet mitokondria. Supernatan berisi ruang intermembrane ditambah membran luar dari setidaknya sebagian kecil dari mitokondria (biasanya hanya 10-20%). Membran luar bisa pellet dari supernatan ini dan protein intermembrane ruang yang tersisa dalam larutan. Para mitoplasts mitokondria-sering disebut pellet, yang mitokondria tanpa outer membran-kemudian terganggu, (misalnya, dengan sonikasi), dan membran dalam pellet. Yang meninggalkan protein matriks dalam supernatan. Membran dalam biasanya reseals setelah pecah dan membentuk vesikel disegel, (disebut partikel submitochondrial) dengan keberpihakan yang dapat bervariasi tergantung pada metode gangguan dan kondisi (Moller et al. 1987). Perhatikan bahwa fraksi membran dalam biasanya berisi beberapa kontaminasi membran luar (misalnya Agius et al. 2001). Metode untuk Purity Menetapkan, keutuhan, dan Fungsi dari Fraksi Hal ini sering penting untuk menentukan tingkat kemurnian mitokondria dan subfraksi mereka (Agius et al. 2001). Keutuhan mitokondria biasanya didirikan dengan tes enzim yang mengambil keuntungan dari fakta bahwa membran utuh tidak permeabel terhadap molekul tertentu. Misalnya membran mitokondria luar tidak tembus sitokrom c, yang 12,5 kDa protein yang terlalu besar untuk melewati pori-pori membran luar, dan NADH tidak dapat melewati membran dalam utuh.

Fungsi biasanya diuji dengan menggunakan elektroda oksigen Jika tingkat menunjukkan mitokondria yang tinggi konsumsi oksigen, rasio tinggi kontrol pernafasan (> 3) dan ADP: O rasio dekat dengan nilainilai teoritis = mereka berada dalam kondisi sangat baik. Perhatikan bahwa untuk mitokondria dengan aktivitas oksidase cukup alternatif (diukur dalam kehadiran KCN inhibitor oksidase sitokrom), rasio kontrol pernapasan dan ADP: O rasio harus diukur dengan adanya inhibitor oksidase alternatif seperti asam salicylhydroxamic