Anda di halaman 1dari 2

reaco de amplificao do gene ytfG de E.

coli Thermopol buffer (10x) dNTPs (10 mM) Primer 1 (ytfG_NdeI) (10uM) Primer 2 (YtfG_EcoRI) (10uM) DNA genmico de E.coli (50ng/ul) Taq DNA polimerase (Biolabs) H2O Volume total da reaco : Programa de PCR: (1 ciclo) 3 min 95C (30 ciclos) 45 s 94 C 45s T annealing 1 min 72C 10 min 72C com marcador 1kb ladder (a primeira banda do marcador corresponde a 1 kb) 5 ul 2 ul 3 ul 3 ul 0,5 ul 0,2 ul 36,3 ul 50 ul

(1 ciclo)

Anlise em gel de agarose 1 %

O produto esperado tem 915 bp de tamanho. Limpeza do produto de PCR com kit QIAGEN de limpeza de produtos de PCR, seguindo as instrues do fabricante. Digesto com do produto de PCR com enzima EcoRI (Roche) Produto de PCR ytfG (40 ng/ul) Enzima EcoRI (Roche) Buffer H 10x (Roche)* H20 volume total da reaco 48 ul (aproximadamente 2 ug de DNA) 3 ul 6 ul 3 ul 60 ul

*ver na pgina 1, nas especificaes do enzima a composio do tampo. A reaco foi incubada a 37 C durante 2 horas e depois o produto de DNA foi limpo com o kit de limpeza de produtos de PCR para eliminar enzima, tampo e pequenos fragmentos de nucletidos que foram cortados na digesto. Aplicao em gel do produto limpo para quantificar. Digesto com do produto de PCR com enzima NdeI (Biolabs) Produto de PCR ytfG (digerido com EcoRI) (15 ng/ul) Enzima NdeI (Biolabs) Buffer 4 10x (Biolabs)* H20 volume total da reaco 90 ul (~1,35 ug DNA) 5 ul 10,5 ul 0 ul 105 ul

*ver na pgina 1, nas especificaes do enzima a composio do tampo. A reaco foi incubada a 37 C durante 2 horas e meia, e o enzima foi inactivado por incubao a 65 C durante 20 min (paragem da reaco).

Depois o produto de DNA foi limpo com o kit de limpeza de produtos de PCR para eliminar enzima, tampo e pequenos fragmentos de nucletidos que foram cortados na digesto. Aplicao em gel do produto limpo para quantificar.

Ligao do produto ytfG digerido com NdeI e EcoRI ao vector plasmdico pET24a, digerido com NdeI e EcoRI. Produto digerido YtfG (NdeI/EcoRI) (20 ng/ul) pET24a digerido (NdeI/EcoRI) (40 ng/ul) Buffer T4 DNA ligase (10x) enzima T4 DNA ligase (Biolabs) volume total 11 ul (~220ng/ 885bp tamanho) 1,5 ul (~60 ng/ 5500 bp tamanho) 1,5 ul 1 ul 15 ul

A reaco foi incubada a 16 C durante uma noite (aprox 16h). A razo de insert /plasmdeo ~20x razo= [(220ng/885bp)/(60ng/5500bp)]

PCR de colnias para verificar os clones transformantes positivos (com plasmdeo com insert): Picar um colnia com um palito estril, mergulhar num tubo de 1,5 ml com 50 ul de H2O estril. Agitar o palito, e deit-lo fora. Fazer vortex suspenso no tubo durante 30 s Ferver durante 5 min Centrifugar 1 min a 13000 rpm numa centrfuga de eppendorfs para precipitar os restos celulares. Colocar o tubo em gel e pipetar para um tubo de PCR 15 ul da suspenso sem levar nada do precipitado de restos celulares. Preparar uma mix (mistura reaccional)de PCR: (1reaco) dNTPS (10 mM) 0,6 ul Primer T7 forward (10 uM) 1,5 ul Primer T7 reverse (10 uM) 1,5 ul Buffer Thermopol (10x) 3 ul Taq (Biolabs) 0,2ul H2O 8,2 ul Volume total da mix 15ul Juntar 15 ul de mix a cada tubo de PCR Programa de PCR: (1 ciclo) 3 min (35 ciclos) 45 s 45s 1 min (1 ciclo) 10 min

(11 reaces) 6,6 ul 16,5 ul 16,5 ul 33 ul 2,2 ul 90 ul 165 ul

95C 94 C 55 C 72C 72