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30-03-2011

2. Biomolculas composio qumica, estructura e reactividade


AULA 6 BIOQUMICA

EN Z I MA S
PROPRIEDADES, CINTICA ENZIMTICA E REGULAO DA ACTIVIDADE ENZIMTICA

Enzimas catalizadores biolgicos


Enzimas so protenas com funes catalcas So catalizadores biolgicos, ou seja, aumentam a velocidade com que

se atinge o estado de equilibrio Existem outros catalizadores biolgicos, no proteicos, como as ribozimas que so molculas de RNA A estrutura da protena determinante para a eficincia e para a especificidade do enzima. No so necessrios em grande quantidade do enzima em relao ao H2O2 2 H2O + O2 reagente, chamado SUBSTRATO Os enzimas permanecem inalterados Catalizador E activao (J.mol-1) no final do ciclo cataltico, quando ocorre a libertao de produto -75600 Os enzimas so especficos para os Pt coloidal 49140 substratos, mesmo para ismeros 8400 catalase apresentam esteroespecificidade

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Enzimas catalizadores biolgicos


Uma reaco enzimtica pode ser descrita por:
E+S ES EP E+P Decrscimo da energia do estado de transio

Estados de transio multiplos Conformao E ligado a S Conformao E ligado a P

Enzimas classificao e nomenclatura


Os enzimas possuem dois nomes: o nome trivial - designao curta de um enzima (e.g, hexocinase) o nome sistemtico feito de acordo com regras definidas, e que descreve a aco do enzima ao pormenor, identificando-o sem margem de dvida O nome sistemtico acompanhado pelo nmero EC (enzyme comission) Este nmero corresponde a uma reaco especfica

EC 1 . 2 . 3 . 4
1. 2. 3. 4. Corresponde classe de enzima (existem 6) Correponde Sub-classe (no caso da classe 1, define o dador de electres) Corresponde Sub-sub-classe (na classe 1, define o aceitador de electres) Esta posio corresponde ao nmero de srie na Subsub-classe

Na nomenclatura de um enzima, a sua origem (organismo) tambm essencial

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Enzimas classificao e nomenclatura


Nome trivial lcool desidrogenase Nome sistemtico

Alcooloxidoredutase Alcool:NAD+ oxidoredutase

EC 1 . 1 . 1 . 1
lcool + NAD+ Aldedo ou cetona + NADH + H+ + H- (io hidreto) 1. 2. 3. 4. Corresponde classe de enzima (classe 1, das oxidoreductases) Correponde Sub-classe (no caso da classe 1, define o dador de electres) Corresponde Sub-sub-classe (na classe 1, define o aceitador de electres) Esta posio corresponde ao nmero de srie na Subsub-classe

Na nomenclatura de um enzima, a sua origem (organismo) tambm essencial

Enzimas classificao e nomenclatura

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Enzimas classificao e nomenclatura Classe I Oxidoreductases


Catalizam reaces de oxidao-reduo Tm 2 substratos, em que um oxidado e o outro reduzido substrato que vai ser oxidado (que se encontra reduzido): substrato que vai ser reduzido (que est oxidado) oxidoreductase exemplo: Alcool:NAD+ oxidoredutase Incluem-se as Desidrogenases Redutases Oxidases Oxigenases Outro exemplo a lactato desidrogenase

Enzimas classificao e nomenclatura Classe II Transferases


Catalizam reaces de transferncia de um grupo funcional Tm 2 substratos, em que um doa o grupo e outro que vai receb-lo. exemplo: alanina transaminase (ALT) ou alanina aminotransferase ou transaminase glutmico pirvica (TGP)

EC 2.6.2.1 glutamato piruvato 2-oxoglutarato alanina

Outro exemplo so as cinases, que transferem grupos fosfato do ATP para uma biomolcula

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Enzimas classificao e nomenclatura Classe III Hidrolases


Catalizam reaces de hidrlise H um substrato que partido em dois, por quebra de uma ligao covalente, com introduo de um H e um OH em cada um dos produtos exemplo: tripsina

EC 3.4.21.4

Enzimas classificao e nomenclatura Classe IV Liases


Catalizam reaces de eliminao no hidrolticas nem oxidativas H a lise de um substrato com formao de uma ligao dupla *na reaco inversa, uma liase catalisa a adio de um substrato a uma ligao dupla de outro substrato, e assim chamado SINTASE exemplo: piruvato descarboxilase
EC 4.1.1.1

Outro exemplo a ATP sintase


ADP + Pi ATP

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Enzimas classificao e nomenclatura Classe V Isomerases


Catalizam reaces de isomerizao exemplo: alanina racemase
EC 5.1.1.1 L-alanina D-alanina

Enzimas classificao e nomenclatura Classe VI Ligases


Catalizam reaces de formao de ligaes entre 2 substratos, que acoplada hidrlise de um composto altamente energtico (ex ATP) exemplo: glutamina sintetase
EC 6.3.1.2

SinteTAse e Sintase no o mesmo

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Determinao da actividade enzimtica


Determinar a velocidade de converso do(s) substrato(s) em produto(s). Vinicial Concentrao ou n mol Produo do produto A velocidade no constante porque: 1. Diminui [S] 2. Ocorre a reaco inversa 3. H inibio por produto 4. H desnaturao do enzima sempre importante determinar as velocidades iniciais, que correspondem regio linear de formao/consumo do produto/ substrato

Consumo do substrato Vinicial Tempo

Actividade enzimtica - unidades


A actividade enzimtica pode ser definida em: Unidades de actividade enzimtica (U) 1 U= 1 unidade de activ enz. = quantidade de enzima que cataliza a transformao de 1 umol de substrato por minuto

Actividade especfica a actividade enzimtica (U) por mg de protena. Outro tipo de unidade o katal, que corresponde a 1 mol de substrato por segundo 1 katal = 6 x 107 U aplica-se a actividades muito elevadas A actividade enzimtica deve ser apresentada, definindo tambm a Temperatura, o pH, o tipo de tampo, a concentrao de substrato e a concentrao de cofactores

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Factores que afectam a velocidade de Reaes Catalisadas por Enzimas


Concentrao do Substrato pH
Deve ser elevada, para no ser um factor condicionante (~10x o KM). Ateno a Deve ser o ptimo para esse enzima. efeitos de inibio por substrato Pode afectar a carga de resduos catalticos no centro activo.

Tampo a) concentrao do tampo (fora inica, capacidade de taponar a reaco) b) composio do tampo (fosfatos e cinases!!!!) Temperatura
Deve ser a ptima. Pode ocorrer desnaturao do enzima

Concentrao de Coenzima/cofactores Activadores Inibidores (incluindo agentes quelantes)

O pH ptimo de um enzima varia de enzima para enzima

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A Temperatura ptima de um enzima est associada temperatura de crescimento do organismo de origem

Enzima humano Actividade

Taq DNA polimerase

37 C 72 C Temperatura

Cofactores, coenzimas, grupos prostticos


Cofactor uma entidade qumica no proteica que necessria para o enzima catalizar a reaco. Os cofactores podem ser metlicos ou os coenzimas, podem estar ligados covalentemente (ou muito fortemente) ligados protena (por vezes designam-se grupos prostticos) ou participarem nas reaces como co-substratos.

Coenzyme Q can exist in three oxidation states: the fully reduced ubiquinol form (CoQH2), the radical semiquinone intermediate (CoQH), and the fully oxidized ubiquinone form (CoQ).

Acetil Coenzima A

Coenzyme Q can exist in three oxidation states: the fully reduced ubiquinol form (CoQH2), the radical semiquinone intermediate (CoQH), and the fully oxidized ubiquinone form (CoQ).

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Cofactores, coenzimas, grupos prostticos


I - Coenzimas envolvidas na transferncia de electres e H
- Nucletidosda Flavina (FAD e FMN) - Nucletidosda Nicotinamida (NAD e NADP) - Coenzima Q (ou Ubiquinol/ubiquinona) - cido Lipico

II - Coenzimas envolvidas na transferncia de grupos


-Nucletidos (ATP, GTP,UTP,CTP) - Tiamina Pirofosfato - Fosfato Piridoxal - Coenzima A - Biotina - Folato

As coenzimas so derivadas das vitaminas

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Cofactores, coenzimas, grupos prostticos


Enzimas com cofactores metlicos so ditas metaloprotenas ou metaloenzimas
1. Os metais so ligados na forma de caties. 2. Podem establelecer ligaes com vrios ligandos simultaneamente. 3. Muitos metais apresentam diferentes estados de oxidao (Fe 2+/3+ Cu +/2+). 4. Estados diferentes de oxidao correspondem a diferentes padres de coordenao Ligado protena leva a alteraes conformacionais da estrutura. 5. O Zn2+ bastante inerte, e serve para consolidar determinada estrutura ou actua como base de Lewis.

Cofactores metlicos - exemplos


[Fe-S] clusters Centros de ferro-enxofre

Aconitase (TCA)

Zinc Finger Hemo (metal Fe) Porfirinas outros metais Clorofila (Mg)
3 Zn-finger a promover a ligao ao DNA

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Mecanismo de Aco Enzimtica


1. Centro activo e especificidade
Centro activo o local da protena onde se liga o substrato e onde decorre a catlise enzimtica. o conjunto de residuos de aminocidos (~5% da superfcie da protena) que participam atravs das suas cadeias laterais na catlise chamados grupos catalticos S alguns aminocidos tm grupos catalticos: cistena, histidina, serina, aspartato, glutamato e lisina Os aminocidos no so suficientes e a presena de cofactores no centro activo frequente. Teoria chave fechadura O substrato possui a forma correcta para ligar no enzima Teoria induced fit Alteraes conformacionais que proporcionam a ligao e a catlise

Mecanismo de Aco Enzimtica


2. Mecanismo de aco enzimtica A catlise qumica divide-se em catlise
homognea, heterognea e enzimtica, e a catlise enzimtica tem aspectos comuns a um e outro tipo

3. Catlise cido-base e Catlise Covalente


Na sua maioria os mecanismos de aco enzimtica podem ser considerados:

Catlise cido-base envolve a permuta de ies H+ Catlise Covalente formam-se transitoriamente ligaes covalentes entre as molculas de enzima e de substrato, ou do cofactor. Participam as cadeias laterais de Asp, Glu, Ser, Cys e Lis, que fornecem um par de electres a um centro parcialmente positivo no substrato. Podem formar-se ligaes do tipo: ster serina Tioster Cysteina Acilimidazolo-Histidina Base de Schiff lisina anidrido Aspartato e glutamato Hidrolases, oxidoreductase, isomerases, transferases, liases e sintetases

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Catlise cido-base e covalente


Aminocidos que doam ou aceitam H+

Aco da Quimotripsina
1 -Catlise cido-base 2 -Catlise covalente

Enzimas
CINTICA ENZIMTICA

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Mecanismo da reaco enzimtica


O mecanismo da reaco descreve como se processa a catlise. Na catlise enzimtica usa-se a notao de Cleland Substratos: letras A, B, C.... Produtos: letras P, Q, R... De acordo com o n de substratos/produtos as reaces so Uni, Bi, Ter, Quad. Ou seja A P UniUni A+ B P BiUni A P+Q+R UniTer De acordo com a ordem de ligao dos substratos, o mecanismo pode ser ordenado ou ao acaso Mecanismo BiBi ordenado

Mecanismo BiBi ao acaso

Mecanismo da reaco enzimtica


Se todos os substratos se ligarem ao enzima antes da sada de produtos, a reaco tem um mecanismo sequencial Se entra substrato, sai produto, entra novo substrato, sai produto no sequencial - mecanismo Ping-Pong Mecanismo Mecanismo BiBi ordenado BiBi Ping Pong sequencial

Caso das transaminases, em que o grupo amina fica ligado ao cofactor, fosfato de piridoxal, e sai o oxocido. O cofactor liberta o NH2 e regenerado com a entrada do oxocido, que fica aminado

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Cintica de uma reaco UniUni A equao de Michaelis Menten


A E A+E
k1 k -1

P EA EA E
k2

Conceito bsico: A velocidade inicial (v0) deve ser proporcional concentrao de Enzima v0 = k[E0] A velocidade tambm dependente da [substrato] Assim, [E0] = [E] +[EA] e tb [A0] = [A] +[EA]

E+P

Como [E] <<[A] , a cada instante [A0] [A] Se houver um equilibrio na ligao do substrato (k2 << k -1) ento

[ E ].[ A] [ EA]

v0

V .[ A] K m [ A]

donde

([ E0 ] [ EA])[ A] [ EA] [ E0 ].[ A] [ EA] K [ A]

A velocidade da reaco dada por v0 = k2[EA] Em que V k2[E0] e corresponde velocidade limite E Km a constande de Michaelis, uma constante de dissociao de EA, na assumpo do equilibrio.

Cintica de uma reaco UniUni A equao de Michaelis Menten


A E A+E
k1 k -1

P =V EA EA E
k2

E+P

v0

V .[ A] K m [ A]

V corresponde velocidade limite Km a constande de Michaelis, reflecte a afinidade para o substrato Corresponde concentrao de substrato com a qual se tem metade da V mx

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Cintica de uma reaco UniUni A equao de Michaelis Menten significado do Km e V


A E A+E
k1 k -1

v0
EA EA E
k2

V .[ A] K m [ A]

=V

E+P

Km a constande de Michaelis, reflecte a afinidade para o substrato Um Km elevado significa uma baixa afinidade, um Km baixo uma alta afinidade
Lembrem-se que a concentrao de substrato em que se consegue metade da velocidade mxima (ou seja, da potencialidade cataltica) do enzima.

O V a velocidade mxima, quando o enzima est saturado de substrato. O V indica o turn over deste enzima (kcat) ou o n de moleculas transformadas por s, por molcula de enzima.

Cintica de uma reaco UniUni A equao de Michaelis Menten significado do Km e V


A E A+E
k1 k -1

v0
EA EA E
k2

V .[ A] K m [ A]

=V

E+P

Caso prtico: tm dois enzimas NOD1 e NOD2, que usam o mesmo substrato. O NOD1 tem Km = 30 M e V = 10 mol.s-1 O NOD2 tem Km = 2 mM, e V = 300 mol.s-1. Quando a concentrao de substrato de 200 M, qual dos enzimas vai ser o mais eficiente a catalizar este substrato? E se a concentrao de substrato for de 10 mM?

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Aplicao da equao de Michaelis Menten a reaces com dois substratos


A E EA A+E
k1 k -1

B EAB EA
k2

P =V E E+P

v0

V .[ A] K m [ A]

A equao de Michealis Menten pode ser aplicada quando h mais do que um reagente, para cada um dos substratos independentemente DESDE QUE o segundo substrato esteja numa concentrao saturante. Ou seja, quando [B] est em excesso, pode-se medir a dependencia da v0 em funo da concentrao de [A] e vice versa. Note-se que os Km para A e para B podem ser muito diferentes.

Determinao de V e Km a partir de resultados experimentais


So feitos vrios ensaios com [E] constante, em que se varia a [substrato] e se medem a velocidade inicial de cada ensaio /reaco. [A] v0 1 2 3 4 5 1 5 10 12 13 Mtodo directo aplicar uma regresso nolinear, com uma funo de hiprbole rectangular

v0

V .[ A] K m [ A]

O excell no faz regresses no lineares

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Determinao de V e Km a partir de resultados experimentais Mtodos de linearizao


So feitos vrios ensaios com [E] constante, em que se varia a [substrato] e se medem a velocidade inicial de cada ensaio /reaco. [A] v0 1 2 3 4 5 1 5 10 12 13 1/[A] e 1/v0

Mtodo de Lineaver-Burk

v0

V .[ A] K m [ A]

Determinao de V e Km a partir de resultados experimentais Mtodos de linearizao


So feitos vrios ensaios com [E] constante, em que se varia a [substrato] e se medem a velocidade inicial de cada ensaio /reaco. [A] v0 1 2 3 4 5 1 5 10 12 13 v0/[A] E v0

Mtodo de Eadie-Hofstee

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Determinao de V e Km a partir de resultados experimentais Mtodos de linearizao


So feitos vrios ensaios com [E] constante, em que se varia a [substrato] e se medem a velocidade inicial de cada ensaio /reaco. [A] v0 1 2 3 4 5 1 5 10 12 13 [A] e [A]/v0

Mtodo de Hanes ou Woolf

Determinao de V e Km a partir de resultados experimentais Mtodos de linearizao


So feitos vrios ensaios com [E] constante, em que se varia a [substrato] e se medem a velocidade inicial de cada ensaio /reaco.

Mtodo linear directo

[A] v0 1 2 3 4 5 1 5 10 12 13

V -[A] E v0 v2 v3

-a1

-a2

-a3

Km

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Inibio da actividade de enzimas


1. A primeira causa pode ser por desnaturao do enzima (causada por temperatura, pH, presena de proteases...) 2. Inibio por produto Quando o produto inibe por recombinao com a forma do enzima do qual se dissociou. Considerando que o passo final a dissociao EP E + P, quando [P] elevado, o equilbrio de dissociao de EP favorece a conformao EP e no a libertao de P. Neste caso, o enzima no fica livre para ligar outro A porque a reaco no termina. 3. Inibio por ponto-morto Efeito de um inibidor Um inibidor ponto-morto aquele que no reagindo nem com substratos nem produtos, forma complexos com diversas formas do enzima: EA + I EAI ou EP+I EIP ou E + I EI

Inibio da actividade de enzimas


Tanto a inibio por produto como Inibio por ponto-morto so inibies reversveis. O resultado haver uma diminuio da velocidade de catlise. Quando o inibidor ou o produto so removidos, por dilise, diluio ou ultrafiltrao o enzima volta a ter a sua actividade inicial. Existem casos de inibio irreversvel, que ocorrem quando h: uma ligao covalente do inibidor ao enzima, ou ligao no covalente mas estvel, ou quando h destruio do centro cataltico.

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Tipos de inibio reversvel Inibio competitiva ou especfica


Inibio competitiva ou especfica Grfico de lineweaver-Burk

A velocidade limite mantm-se constante, mas o Km diminui

Tipos de inibio reversvel Inibio cataltica ou anticompetitiva


Inibio cataltica ou anticompetitiva Grfico de lineweaver-Burk

Nesta inibio o parmetro constante Km/V

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Tipos de inibio reversvel Inibio mista


Inibio mista Grfico de lineweaver-Burk

Nesta inibio o V diminui e o Kmapp constante

Tipos de inibio reversvel Efeitos nos parametros cinticos

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Determinao das constantes de inibio e do tipo de inibio


Para determinar as constantes de inibio que caracterizam o inibidor: Ki (constante de dissociao de EI)

Kii (constante de dissociao de EAI)


Podem-se usar a mesma tipologia de mtodos lineares, mas em vez de serem em funo de [A], so em funo de [I]

semelhana do Km, o Ki baixo indica forte afinidade para o inibidor, logo um inibidor mais forte

Determinao das constantes de inibio e do tipo de inibio


Mtodo de Dixon 1/v0 vs. [I]

1/(1-Ki/Kii)V -Ki
[I]

-Ki [A]/v0 vs [I]


[A]/v0
Mista

[I]

[I]

Mtodo de Cornish Bowden


[A]/v0

[A]/v0
No-competitiva

-Kii [I]

[I] Km(1-Ki/Kii)V -Kii

Km/V

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Os inibidores de enzimas tm papeis fundamentais na regulao das vias metablicas

Os inibidores no so necessriamente susbstncias txicas. Os inibidores podem ser molculas (metabolitos) finais de uma via metablica, que actuam negativamente sobre enzimas do incio da via. A este tipo de regulao chama-se Feedback negativo

Enzimas
REGULAO DA ACTIVIDADE ENZIMTICA

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Regulao por ligao de ligandos (efeito alostreo)


O efeito alostreo resulta da ligao de um ligando (substrato, ou outro diferente) a outro centro de ligao no enzima. Esta ligao leva a alteraes conformacionais (alosteria) que modulam a actividade do enzima (positivamente ou negativamente (inibidores no competitivos) Exemplo de efeito positivo Regio cataltica Regio regulatria Este tipo de regulao est na base do modo de funcionamento de receptores de membrana que ao ligarem um ligando no exterior da clula, transmitem um sinal via activao/inibio de uma actividade cataltica intrinsica. (Muitas vezes cinases)

Regulao por modificao covalente reversvel


1. Fosforilao-desfosforilao
Cascatas de sinalizao intracelular

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Regulao por modificao covalente reversvel


1. Fosforilao-desfosforilao
Cascatas de sinalizao intracelular

(KKK) Cinase da cinase da cinase (KK) Cinase da cinase

(KK) Cinase que activa factores de transcrio por fosforilalos.

Regulao por modificao covalente reversvel


1. Fosforilao-desfosforilao Existem outros tipos de modificaes covalentes, mas so menos relevantes para regulao enzimtica 1. Ligao covalente de resduos lipidicos ou glicidicos 2. Acetilao de grupos amina terminais Cascatas de sinalizao intracelular 3. Metilao
4. Formao ou quebra de pontes persulfureto (organismos fotossintticos, mas no animais) 5. Nitrosilao de cistenas ou hemos e nitrao de tirosinas Formam-se da reaco com o NO que produzido pelas NO sintases. Tem papel importante na regulao neuronal e vascular.

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1.Regulao por modificao covalente irreversvel 2.Regulao por controlo da concentrao de enzima
1. Protelise de zimogneos
Zimogneos so pro-enzimas que esto inactivas. Quando so hidrolisadas por uma protease ou peptidase (reaco de protelise) ficam activos. Exemplo o tripsinognio do suco gstrico.
Tripsinognio Enteropeptidase Tripsina Activao do quimotripsinognio Activao da proelastase Activao da procarboxilase autoactivao

2. Regulao dos nveis de enzima Degradao no proteassoma + -

Regulao gentica dos nveis de transcrio

Alostrea

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bibliografia
Capitulo 18, 19 e 20

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Questes

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