U.T.2.

- BIOMOLCULAS

U.T.2.- BIOMOLCULAS 0.- INTRODUCCIN 1.- GLCIDOS 1.1.- ESTRUCTURA 1.2.- FUNCIN DE LOS GLCIDOS 1.3.- PRUEBAS DE IDENTIFICACIN. 2.- LPIDOS 2.1.- ESTRUCTURA Y FUNCIN 2.2. - PRUEBAS DE IDENTIFICACIN 3.- PROTENAS 3.1- AMINOCIDOS 3.2.- ESTRUCTURA DE LAS PROTENAS 3.3.- FUNCIN DE LAS PROTENAS 3.4.- TCNICAS DE EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE PROTENAS 3.5.- PRUEBAS DE IDENTIFICACIN Y CUANTIFICACIN 4.- ENZIMAS 4.1.- ESTRUCTURA Y FUNCIN 4.2.- DETERMINACIN DE ENZIMAS

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0.- INTRODUCCIN De todos los elementos que se encuentran en la naturaleza, solamente unos pocos entran a formar parte de manera permanente de la materia viva, el resto puede aparecer ocasionalmente. Estos elementos se denominan elementos biognicos o bioelementos. - Elementos biognicos primarios: C, H, O y N; son los ms abundantes y junto con el P y el S son imprescindibles para la formacin de las molculas orgnicas. - Adems estn los elementos secundarios tambin imprescindibles para la vida de las clulas: Na, K, Ca, Mg y Cl. - Los oligoelementos son necesarios para el funcionamiento de los organismos y varan de unos seres vivos a otros. Los tomos de los distintos elementos biognicos se combinan entre s para formar las molculas constituyentes de la materia viva, denominadas biomolculas. Si se analizan molculas que componen los seres vivos, se observa que estn compuestas fundamentalmente por tomos de carbono enlazado entre formando cadenas muy largas. Muchos de los compuestos orgnicos son macromolculas, polmeros, formadas por molculas ms sencillas llamadas monmeros. Son monmeros los monosacridos (unidades monomricas de los polisacridos), los aminocidos (unidades bsicas de las protenas) y los nucletidos (de los cidos nucleicos). Los lpidos estn formados unos principalmente por alcoholes y cidos grasos, y otros por la polimerizacin de isopreno. Las biomolculas se clasifican en cuatro grandes grupos, segn sus propiedades: * Glcidos * Lpidos * Protenas * cidos nucleicos

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1.- GLCIDOS Los glcidos son las biomolculas ms abundantes de la Tierra. Son molculas biolgicas, es decir macromolculas exclusivas de los seres vivos, cuya caracterstica qumica principal es su naturaleza polihidroxlica, con otra funcin ms oxidada, el grupo carbonilo de aldehdos y cetonas. Se denominan tambin carbohidratos o hidratos de carbono porque en las primeras molculas aisladas, su frmula emprica presentaba la relacin C:H:O 1:2:1, sugiriendo que por cada carbono hubiese una molcula de agua Cn(H2O)n. 1.1.- ESTRUCTURA Los glcidos estn constituidos bsicamente por C, H, y O, unidos covalentemente, aunque excepcionalmente tambin pueden contener N, P o S. Segn su complejidad se pueden dividir en tres grupos: - Monosacridos, constituyen la unidad bsica de estas biomolculas a partir de las cuales se forman los oligosacridos y polisacridos. Los monosacridos son slidos incoloros y cristalinos, solubles en agua e insolubles en disolventes no polares. La mayora tienen sabor dulce. Los monosacridos son cadenas de tomos de carbono unidos por enlaces sencillos, sin ramificar, unidos un C a un tomo de oxgeno por un doble enlace y el resto a grupos hidroxilo. Si el grupo carbonilo se halla en el extremo de la cadena, es una aldosa; y si est en otra posicin, es una cetosa. C=O H H C ---- OH HO C ---- H H C ---- OH H C ---- OH CH2OH C H2 OH C=O HO C ---- OH H C ---- OH H C ---- OH CH2OH

D- Glucosa heptosas.

D-Fructosa

En funcin del nmero de carbonos, se denominan triosas, tetrosas, pentosas, hexosas y

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- Oligosacridos consisten en cadenas cortas de unidades de monosacridos (entre dos y veinte) unidas por enlaces glucosdicos. Los ms abundantes son los disacridos, formados por dos unidades de monosacrido. Los monosacridos constituyentes se unen mediante un enlace O-glucosdico, que se forma cuando un grupo hidroxilo de un monosacrido reacciona con el carbono anomrico de otro. El compuesto resultante se denomina glucosido. Ejemplos: la lactosa o la sacarosa. - Polisacridos son polmeros que contienen ms de 20 unidades de monosacridos unidos mediante enlaces O-glucosdicos; algunos constan de centenares o millares de unidades de monosacrido. Los polisacridos pueden estar constituidos por un solo tipo de monosacrido, son los homopolisacridos (almidn, glucgeno, celulosa, quitina, ), o por tipos diferentes, los heteropolisacridos (peptidoglucano de la pared bacteriana) 1.2.- FUNCIN DE LOS GLCIDOS Las principales funciones de los glcidos son:

Almacenamiento y generacin de energa

Los polisacridos de reserva ms importantes son el almidn de las clulas vegetales y el glucgeno de las animales. funcin estructural y de soporte participacin en procesos de reconocimiento celular La celulosa se encuentra en las paredes celulares de las plantas. Las lecitinas son protenas que se unen a los glcidos con una elevada especificidad y una afinidad entre moderada y alta. Estas lecitinas actan en muchos procesos de reconocimiento intercelular, sealizacin y adhesin y en el destino intracelular de protenas recin sintetizadas. formar parte de otras estructuras, por ejemplo la ribosa y la desoxirribosa como monmeros constituyentes del ARN y ADN respectivamente. 1.3.- PRUEBAS DE IDENTIFICACIN Entre las pruebas de identificacin ms caractersticas de los glcidos se incluyen algunos ensayos colorimtricos que pueden ayudar a clasificar e, incluso, identificar un determinado azcar entre varios posibles. El principal problema es la sensibilidad de algunos de ellos, que los hacen poco tiles en muestras muy diluidas. Estos ensayos no se utilizan en los laboratorios automatizados.

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2.- LPIDOS Los lpidos son un conjunto muy heterogneo de molculas orgnicas, formadas bsicamente por largas cadenas hidrocarburadas, sustituidas o no por grupos alcohol, amino, fosfato, etc, caracterizados por ser apolares, por tanto insolubles en agua pero solubles en disolventes orgnicos, no polares. A pesar de su insolubilidad, la presencia de ciertos grupos funcionales convierte a algunos de estos compuestos en molculas anfipticas, siendo parcialmente solubles en agua y tambin en solventes orgnicos. Qumicamente son muy heterogneos: algunos formados slo por C, H, y O, otros tienen adems P, N o S. Se pueden unir a glcidos formando glucolpidos, o a protenas formando lipoprotenas. 2.1.- ESTRUCTURA Y FUNCIN La clasificacin de los lpidos es compleja. Una clasificacin se basa en la funcin biolgica: lpidos de reserva, lpidos de membrana y lpidos que influyen en el metabolismo secundario de organismos vivos. 2.1.1. ACIDOS GRASOS Son cidos carboxlicos con un nmero par de tomos de C (12-22), suelen ser de cadena lineal, y debido a la geometra de los enlaces, estructuralmente adoptan forma de zigzag. Los cidos grasos estn incluidos dentro de los lpidos de reserva y son las unidades bsicas y ms sencillas de la mayora de los lpidos. El grupo carboxilo terminal puede encontrarse en forma de cido carboxlico libre o ionizado a pH fisiolgico (COO-). Esta caracterstica hace de estas molculas buenos tensoactivos. Pueden ser: - Saturados, sin dobles enlaces en la cadena, por ejemplo el butrico o palmtico. - No saturados o insaturados: con uno ms dobles enlaces (oleico o linoleico). Pueden ser slidos o lquidos: el punto de fusin aumenta con el tamao del cido graso y disminuye con el grado de instauracin. Con menos de 5 C son lquidos, entre 5 y 10 C son slidos-lquidos y si tienen ms de 10 C son slidos. Los cidos grasos no aparecen casi nunca en forma libre, sino que se hallan presenten en distintos lpidos. Los cidos grasos son molculas muy energticas: la oxidacin completa de un cido graso produce muchas ms caloras por gramo que la de cualquier otro compuesto orgnico. Algunos cido grasos (linoleico o linolnico) que desempean funciones importantes en el organismo, son cidos esenciales, no los sintetizan los mamferos y por tanto se deben incorporar con la dieta.

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2.1.2. LPIDOS SAPONIFICABLES Son steres formados por la unin covalente de cidos grasos y alcoholes. Son compuestos de carcter neutro e hidrfobos. Pueden clasificarse en lpidos: * simples: glicridos (steres del alcohol glicerina o propanotriol con cidos grasos, los triglicridos o triacilglicridos si estn esterificados los tres grupos hidroxilo) y cridos (steres de cidos grasos de cadena larga (ms de 10 C) con un alcohol monohidroxlico de cadena larga tambin). Los glicridos tienen funcin de reserva energtica. En los animales se acumula en el tejido adiposo, y puede cumplir otras funciones (aislante trmico, relleno o amortiguar golpes). Los cridos tienen funcin protectora tanto en plantas (superficie de hojas y frutos) o animales (las aves acuticas recubren las plumas para protegerse del agua con unas cera producidas en unas glndulas especiales). * complejos: fosfoglicridos o glicerofosfolpidos (steres de la glicerina con cidos grasos y cido fosfrico, unido ste a su vez, a un alcohol) y esfingolpidos (contienen un aminoalcohol, la esfingosina, al unirse un aminoalcohol a un cido graso por medio de un enlace amida se forma una ceramida). Los fosfolpidos tienen funcin estructural constituyendo la estructura bsica de las membranas celulares. Los esfingolpidos son lpidos de membrana, frecuentes en las membranas celulares de las nueronas. 2.1.2. LPIDOS INSAPONIFICABLES Los lpidos insaponificables constituyen un grupo muy heterogneo de compuestos que no contienen cidos grasos. Se clasifican en: terpenos y esteroides. Los terpenos son lpidos que resultan de la condensacin de varias unidades del hidrocarburo isopreno (2-metil-1,3-butadieno). Se caracterizan por tener dobles enlaces conjugados y por tanto, dar lugar a compuestos coloreados. Son terpenos los carotenos, las xantofilas o la vitamina A. Los esteroides son lpidos derivados del hidrocarburo esterano o ciclopentanoperhidrofenantreno. Dentro de este grupo se incluyen: los esterores (colesterol), los cidos biliares, hormonas esteroideas o la vitamina D o colecalciferol. 2.2. - PRUEBAS DE IDENTIFICACIN Las pruebas de identificacin de los lpidos se basan en su carcter apolar y por tanto su insolubilidad en agua. Adems esta apolaridad se puede utilizar para la extraccin y separacin de los lpidos para su posterior determinacin colorimtrica.

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3.- PROTENAS Las protenas son macromolculas, polmeros de aminocidos dispuestos de forma secuencial. En los seres vivos hay 20 tipos diferentes de aminocidos que pueden formar parte de las protenas. 3.1- AMINOCIDOS Un aminocido es un compuesto orgnico con un grupo amino (-NH 2), un tomo de hidrgeno (-H) y un grupo cido o carboxilo (-COOH), unidos covalentemente a un carbono central, que se conoce como carbono . El cuarto sustituyente es un grupo -R (radical) que vara en los distintos aminocidos. Las cadenas laterales de los aminocidos se distinguen por sus caractersticas qumicas dominantes, que incluyen el carcter hidrfilo o hidrfobo, polar o no polar, y la presencia o ausencia de grupos ionizables:

No polar hidrofbico: glicina (R H), alanina (R CH3) Polar no cargado: tirosina, cistena Polar y cargado negativamente: cido asprtico, cido glutmico Polar y cargado positivamente: lisina

COMPORTAMIENTO CIDO-BASE: La presencia de un grupo carboxilo confiere a los aminocidos un carcter cido, mientras el amino les da carcter bsico. Por ello los aminocidos son anfteros, es decir, pueden actuar como cidos (en medio bsico) y como bases (en medio cido), dependiendo del pH del medio. ESTEREOISOMERIA Y ACTIVIDAD PTICA: En los aminocidos (excepto la glicina que tiene dos sustituyentes iguales (H)) el carbono es asimtrico y por lo que presentan actividad ptica (hay formas levgiras (-) y dextrgiras (+)). Tambin presentan estereoisomera y de cada aminocido puede haber dos enantimeros (forma D y forma L). En las protenas slo hay L aminocidos. Los aminocidos que no puede sintetizar un organismo se llaman esenciales, y deben ser incorporados con la dieta. Los aminocidos se unen por reacciones de condensacin en las que el grupo amino de uno de ellos se une con el grupo carboxilo de otro formando una amida y liberndose una molcula de agua. El enlace covalente formado se llama enlace peptdico, y el compuesto resultante es un dipptido. Este compuesto continua teniendo un extremo con su grupo amino y otro con un grupo carboxilo, por lo que puede volver a condensarse con otro aminocido formando otro enlace peptdico. Cuando se unen muchos aminocidos, se forma un polipptido. Cuando se forma el enlace peptdico desaparecen las cargas elctricas de los grupos carboxilo y amino que participan en el enlace; sin embargo quedan en extremo de cadena los grupos laterales (amino y cido) que pueden llevar cargas elctricas. Para cada protena existe un pH llamado punto isoelctrico, en el que la carga elctrica neta es cero.

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3.2.- ESTRUCTURA DE LAS PROTENAS Para estudiar la estructura de las protenas lo hacemos en varios niveles: ESTRUCTURA PRIMARIA Hace referencia a la secuencia lineal de los aminocidos que forman una protena, es decir, el orden de colocacin de cada aminocido dentro de la cadena. Este orden viene determinado por la informacin gentica de cada protena que dispone la clula. La secuencia primaria es una caracterstica especfica de cada protena y determina los dems niveles de su estructura. La modificacin de la estructura primaria, por pequea que sea, puede alterar o destruir la forma espacial habitual de la protena, y por lo tanto, su funcin. Al unirse los aminocidos, queda un eje de la molcula donde se repiten un grupo carbonilo, un grupo amino y un carbono que lleva unidos un hidrgeno y un grupo lateral (R); los aminocidos comienzan a interaccionar entre ellos y con el medio que los rodea por enlaces dbiles, por lo que el eje de la molcula se pliegue y aparezcan estructuras de orden superior. ESTRUCTURA SECUNDARIA Se refiere a ciertos patrones de plegamiento del eje de la molcula que se repiten en algunas zonas de muchas protenas. Es estructuras son el resultado de la formacin de puentes de hidrgeno entre los tomos que participan en los enlaces peptdicos. Hay dos tipos principales de estructuras secundarias: * La Hlice , en la que el eje de la molcula adopta una estructura ordenada en forma de espiral o hlice que se mantiene por puentes de hidrgeno entre el oxgeno del grupo carbonilo de un aminocido y el hidrgeno del grupo amino de un aminocido siguiente. Los grupos laterales quedan orientados hacia el exterior de la hlice. *La lmina u hoja plegada, en ella dos o ms segmentos de cadena polipptido se mantienen paralelos, extendidos, mediante puentes de hidrgeno entre los tomos de los enlaces peptdicos. Los pliegues de cada uno de los segmentos son debidos a la ordenacin en zig-zag de los tomos del eje de la molcula. Los grupos laterales de los aminocidos quedan saliendo alternativamente hacia arriba y hacia abajo de los pliegues de la lmina. Los segmentos que interacciona pueden estar orientados en la misma direccin (cadenas paralelas) o en direcciones contrarias (cadenas antiparalelas). Cuando un eje no toma una disposicin fcilmente definible hablamos de cadena estadstica o de enrollamiento al azar. Generalmente en una misma cadena polipeptdica hay regiones de hlice , de hoja o de enrollamiento al azar. Las protenas con estructuras de hoja plegad o helicoidal son las protenas fibrosas, que se caracterzan por el predominio marcado de uno de sus ejes sobre los otros dos.

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ESTRUCTURA TERCIARIA Las protenas se pliegan sobre su estructura secundaria y generan la estructura terciaria. Esta estructura implica al ordenamiento espacial de residuos de aminocidos alejados de la secuencia lineal. Las interacciones que tienen lugar entre los grupos laterales de los aminocidos pueden ser puentes de hidrgeno, puentes salinos, fuerzas de Van der Waals, interacciones hidrofbicas o puentes disulfuro. Hay dos tipos principales de estructuras terciarias: - Protenas fibrosas, son protenas cuya funcin principal es la de proporcionar soporte mecnico a las clulas y organismo, suelen ser insolubles y estn formadas por una unidad repetitiva simple que se ensambla para formar fibras. - Protenas globulares, son protenas solubles y las cadenas polipeptdicas de estas protenas se pliegan con estructuras compactas. Son responsables de la myor parte del trabajo qumico de la clula (sntesis, transporte y metabolismo) ESTRUCTURA CUATERNARIA Este nivel solo se presenta en protenas, llamadas oligomricas, formadas por ms de una cadena de polipptidos. Cada una de las cadenas se llama subunidad de la protena. La estructura cuaternaria se refiere a la estructura espacial global de toda la protena, consecuencia de las interacciones y organizacin en el espacio de las diferentes subunidades. Las interacciones que se producen son las mismas que las descritas en la estructura terciaria. La subunidades pueden ser iguales (homodmero, homotrmero, ) o diferentes (heterodmero, heterotetrmero, ). 3.3.- FUNCIN DE LAS PROTENAS Las protenas tienen capacidad amortiguadora del pH y del equilibrio osmtico y adems otras funciones concretas: -

Estructural, por ejemplo es la funcin del colgeno cuyas fibras dan tensin al Enzimtica, cada reaccin qumica del metabolismo est catalizada por una Reguladora, regulan distintos tipos de procesos metablicos: incluye las

tejido conjuntivo, son soporte mecnico. enzima (catalizadores biolgicos) especfica. hormonas, los factores de transcripcin y factores de reconocimiento. Defensiva, frente a agentes patgenos externos: los anticuerpos son protenas. Transporte unen y transportan molculas ligando (hemoglobina) Contrctil, pueden contraerse, cambiar de aspecto y participar en la formacin Almacenamiento, es el caso de la ovoalbmina, ferritina, casena.

del msculo y del citoesqueleto.

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3.4.- TCNICAS DE EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE PROTENAS Los aminocidos presentan distintas propiedades, cargas elctricas, caractersticas bioqumicas y tamaos moleculares, por ello el comportamiento fsico qumico de las protenas es infinitamente diverso y las tcnicas de extraccin y purificacin tienen un cierto grado de complejidad. El primer paso en el aislamiento de una protena es la ruptura celular, para posteriormente poder extraer la protena con un tampn adecuado. La eleccin del mtodo de ruptura depende de las caractersticas mecnicas del tejido o clulas de donde se va a aislar la protena, as como de su localizacin: Lisis celular, vlido para clulas sin pared celular (animales). Consiste en suspender las clulas en una solucin hipotnica (ms diluida que el interior celular). Debido a la diferencia osmtica el agua difunde al interior de la clula, causando su hinchamiento y ruptura.
-

Destruccin mecnica: la homogeneizacin (haciendo pasar las clulas entre un

tubo y un pistn de vidrio que ajustan casi totalmente); moler en un mortero con arena o almina; molino con perlas de vidrio; o sonicacin (las clulas son sometidas a vibraciones de ultrasonido).
-

Congelacin-descongelacin. La ruptura se produce al someter las clulas a un

cambio brusco de temperatura, congelando primero a -196C y pasndolas rpidamente a temperatura ambiente (25C). El resultado de todos estos tratamientos es un lisado que contiene una mezcla de molculas, membranas y clulas rotas. Esta preparacin se somete a centrifugacin para eliminar restos celulares y separar el sobrenadante, que contiene las protenas solubles del precipitado. Los cambios bruscos de pH, los cidos y bases fuertes, temperaturas extremas y la accin de las proteasas pueden desnaturalizar las protenas, por ello deben ser tratadas con sumo cuidado. Para caracterizar protenas hay que solucionar tres tipos de problemas: purificacin, secuenciacin y determinacin de la estructura tridimensional de la protena. * Purificacin En un extracto celular hay una gran diversidad de protenas que difieren en tamao, forma, carga elctrica, etc. Aprovechando estas propiedades, podemos separarlas y obtener concentraciones elevadas de un solo tipo de protena (purificacin). Las dos tcnicas ms utilizadas para lograrlo son: ELECTROFORESIS. Consiste en aplicar la mezcla de protenas en disolucin a una matriz inerte absorbente de gel de poliacrilamida. Cuando se aplica un campo elctrico, las

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protenas migrarn en una direccin y a una velocidad que dependen de su tamao y de su carga neta. Hay varias posibilidades tcnicas: -

En el isoelectroenfoque, cada protena se desplaza por un gel, con un gradiente de pH, hasta alcanzar su punto isoelctrico, en el cual, al no tener carga neta, se para. En la SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sdico), la mezcla de protenas se trata con el detergente SDS que forma un complejo con las cadenas polipeptdicas que quedan rodeadas por las cargas negativas del SDS. Se suele aadir un agente reductor (mercaptoetanol) para romper los puentes disulfuro intra o intercatenarios. De esta forma, el diferente movimiento de las cadenas polipeptdicas es, bsicamente, consecuencia de su tamao, ms rpido en las ms pequeas.

Cuando hay una mezcla de muchas de muchas protenas diferentes se realizan electroforesis bidimensionales. Primero se separan las protenas en un gel estrecho por isoelectroenfoque. Despus, este gel se coloca en la parte superior de otro gel mayor y las protenas son sometidas a una SDS-PAGE en direccin perpendicular a la usada en primer lugar. CROMATOGRAFA.

Las separaciones cromatogrficas se basan en las diferencias de carga, tamao o afinidad de las diferentes protenas. Cromatografa en papel, el absorbente lo constituye un papel de filtro; una vez corrido el disolvente se retira el papel y se deja secar, se trata con un reactivo qumico con el fin de poder revelar las manchas de protenas. Cromatografa en capa fina, se realiza sobre una capa delgada (100-200m de gel de slice) que constituye la fase estacionaria, depositado sobre una capa rectangular de vidrio, plstico o aluminio, generalmente. La cromatografa en columna, en esta tcnica se aplica la mezcla de protenas en disolucin a la parte superior de una columna cilndrica, llena de una matriz slida (fase estacionaria) permeable sumergida en el solvente (fase mvil). Luego, se bombea una gran cantidad de solvente a travs de la columna que obliga a fluir a la mezcla de protenas a lo largo de la columna. Las diferentes protenas se van desplazando a distinta velocidad segn su grado de interaccin con la matriz. As pues, las protenas pueden ser recogidas separadas a medida que salen por el fondo de la columna. Podemos variar el tipo de matriz para separar las protenas en funcin de su carga elctrica, su tamao, su capacidad para unirse a determinadas molculas, etc.

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Cromatografa lquida de alta presin (HPLC), se utiliza una presin muy elevada para forzar el paso del disolvente (fase mvil) por la columna que contiene partculas muy finas (fase estacionaria) consiguiendo as separaciones de gran resolucn. * Secuenciacin Para establecer la estructura de una protena, un dato esencial es su secuencia de aminocidos. Podemos considerar varias posibilidades: Para pptidos de hasta 30 aminocidos, podemos usar los llamados secuenciadotes de aminocidos, que repiten automticamente una serie de reacciones qumicas que van eliminando el aminocido amino-terminal y lo van identificando. Cuando la protena tiene ms de 50 amnocidos, se rompe en una serie de fragmentos peptdicos resultantes, se secuencian y se recompone la protena original por las secuencias solapadas de pptidos que se hayan obtenido. En la actualidad la tcnica ms empleada es indirecta. Se determina la secuencia de tan slo unos 20 aminocidos de la protena para disear a partir de ella una sonda de ADN que nos permita buscar en colecciones de fragmentos de ADN clonados (libreras de ADN) el que determina la protena. A partir de la secuencia del ADN se deduce la secuencia de aminocidos. * Determinacin de la estructura tridimensional de la protena Conocida la secuencia de aminocidos, se usan mtodos que determinan la posicin en el espacio de todos o de algunos de los tomos de la molcula, y con la ayuda de ordenadores se construye un modelo de cmo puede ser la estructura espacial. Se usan dos tcnicas: Difraccin de rayos X. Se requiere partir de cristales de la protena sobre los que se dirige un haz de rayos X y, a partir del patrn de difraccin que provocan, se puede deducir la posicin de los tomos en los cristales. Resonancia magntica nuclear RMN. Es muy utilizada para protenas pequeas y dominios proteicos. Slo requiere usar una disolucin muy concentrada. Ofrece informacin slo sobre la posicin de los ncleos de hidrgeno. 3.5.- PRUEBAS DE IDENTIFICACIN Y CUANTIFICACIN

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4.- ENZIMAS Las enzimas pueden definirse como los catalizadores biolgicos de las diferentes reacciones qumicas que se producen en los seres vivos. 4.1.- ESTRUCTURA Y FUNCIN Las enzimas son la clase ms extensa y especializada de protenas. Su funcin es la de catalizar reacciones qumicas especficas en los seres vivos. Son protenas globulares, solubles en agua y se difunden con facilidad en los lpidos orgnicos, catalizando miles de reacciones qumicas. Es decir, las enzimas son de naturaleza proteica, protenas de elevado Pm, algunas incluso mayores que el sustrato o grupo funcional sobre los que actan. Atendiendo a su composicin qumica se distinguen dos tipos de enzimas: a) La molcula enzimtica est formada solamente por secuencias de aminocidos, es decir, se trata de protenas simples o puras. Entonces la actividad enzimtica depende solamente de su estructura como protenas. b) HOLOENZIMAS En la mayora de los casos sin embargo, se trata de protenas conjugadas formadas por dos componentes, uno de naturaleza proteica, APOENZIMA, y otro no proteico denominado COFACTOR. HOLOENZIMA = APOENZIMA + COFACTOR El apoenzima no es ms que una especie de soporte del cofactor. Es de naturaleza proteica y, por tanto, formado por cadenas de aminocidos. Determina la especificidad de la reaccin enzimtica. El cofactor es la fraccin que caracteriza el tipo de reaccin enzimtica, reaccin que solamente se desarrollar cuando el sustrato quede unido especficamente al apoenzima. Por esta razn puede haber (coenzimas) comunes a muchas enzimas, desempeando la misma accin enzimtica (deshidrogenacin, oxidaciones, etc.), y sin embargo mostrarse especficos para las distintas reacciones, segn el apoenzima al que se unen, ya que este es el que marca la especificidad. La naturaleza qumica del cofactor es sumamente variada. Si el cofactor se halla unido por enlaces covalentes a la porcin proteica de la enzima se le denomina GRUPO PROSTTICO; si est unido por interacciones no covalentes, se denomina COENZIMA (lo que est unido a la enzima son molculas orgnicos). El cofactor pueden ser simples cationes metlicos como el Fe, Mg, Mn, Cu, Zn, etc., es decir, oligoelementos; en otras ocasiones se trata de sustancias qumicas mucho ms complejas que con frecuencia tienen naturaleza vitamnica (principalmente del grupo vitamnico B).

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MECANISMOS DE ACCIN ENZIMTICA Para que una reaccin se lleve a cabo es necesario que la o las sustancias que van a reaccionar reciban una determinada cantidad de E que las active denominada Energa de Activacin. Segn se ve en la figura para que la sustancia A se transforme en C, es necesario aportarle una determinada Eact. (calor, e-, etc.). Pero podemos convertir esa Eact. en otra energa ms pequea E, utilizando un catalizador.

Los catalizadores son pues aquellas sustancias capaces de facilitar y acelerar las reacciones, por disminuir la energa de activacin. No intervienen la reaccin que catalizan, es decir, actan solamente por su presencia. Por ello terminada la reaccin, el catalizador queda libre y puede volver a ser utilizado. El mecanismo de accin enzimtica podra representarse as: A + B + Catalizador ==== AB + Catalizador De esta forma utilizan los seres vivos sus propios catalizadores, las enzimas. La unin enzima-sustrato se debe a fuerzas moleculares de carcter dbil, que se rompe con facilidad tras la accin enzimtica. Esta unin tiene lugar en el centro activo, zona especfica de la enzima. E + S ====== ES ==== P + E A) ESPECIFICIDAD DE LA ACTUACIN ENZIMTICA La actividad cataltica de las enzimas est relaciona con su estructura tridimensional proteica (al desnaturalizarse se pierde la actividad enzimtica). La especificidad enzima-sustrato viene determinada por dos caractersticas: El sustrato debe poseer algn grupo funcional que le permita unirse a la enzima y situar la molcula de forma precisa sobre el centro activo. El sustrato debe poseer un enlace qumico especfico, susceptible de ser atacado por la enzima. Puede ocurrir que la enzima se una otro grupo distinto del sustrato, provocando dicha unin una reorientacin del sustrato que coloque el enlace sobre el que ha de actuar el centro activo de la enzima en la posicin correcta. Algunas enzimas poseen una especificidad casi absoluta por determinado sustrato; otras por el contrario, pueden actuar sobre sustratos distintos, con algn rasgo estructural comn.
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Las enzimas presentan dos tipos de especificidad: De accin, cuando intervienen en un nica reaccin De sustrato o o o absoluta, si actan sobre una sustancia determinada de grupo, si lo hacen sobre un grupo de enlaces estereoqumica, cuando actan sobre uno de los dos ismeros pticos

B) FORMACIN DEL COMPLEJO ENZIMA SUSTRATO La naturaleza proteica de las enzimas hace que los aminocidos que forman la cadena polipeptdica desempean funciones diversas. Aminocidos catalticos constituyen el lugar de unin o centro activo de la enzima. Es el punto donde se produce la actividad de la misma. Los aminocidos de unin facilitan la formacin del complejo enzima-sustrato. Otros aminocidos suministran lugares de unin adicionales para otros ligandos. Otros son necesarios para mantener la estructura tridimensional de la enzima. La superficie de la molcula enzimtica posee una alta reactividad qumica, debido a las caractersticas de las cadenas laterales de aminocidos y a la orientacin que stas poseen. La fijacin con el sustrato constituye la primera fase del proceso cataltico de la enzima. Despus de la fijacin se consiguen elevadas velocidades en las reacciones qumicas, por: la correcta posicin en que la enzima coloca al sustrato para las reacciones posteriores el aumento de concentracin de las molculas de sustrato en el centro cataltico la induccin de cambios energticos que favorecen la accin cataltica

C) CARACTERSTICAS DE LOS CENTROS ACTIVOS El centro activo de una enzima suele estar formado por un residuo de aminocido extraordinariamente activo. El centro activo se une al sustrato y, si existe, al grupo prosttico, contribuyendo con sus cadenas laterales o grupos catalticos a la formacin o rotura de enlaces. Generalmente el c.a. constituye una parte pequea de la molcula de la enzima. Posee una estructura tridimensional en forma de hueco (generalmente hidrfoba) donde actan las cadenas laterales de los aminocidos con poder cataltico. D) COMPLEJOS MULTIENZIMTICOS Para conseguir una eficiencia mxima en las reacciones metablicas stas se acoplan, es decir el producto de una de ellas es el sustrato de la siguiente. El mantenimiento de estas rutas metablicas, se ve favorecido por la organizacin de las enzimas, que forman complejos

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multienzimticos, lo que permite que la transferencia de sustrato sea muy efectiva. Ello hace innecesario una gran concentracin de sustratos. NOMENCLATURA DE LAS ENZIMAS Las enzimas se nombran con el nombre de la sustancia sobre la que actan con el sufijo -asa. As por ejemplo la enzima que desdobla la maltosa se denomina catalasa. Otras enzimas conservan nombres antiguos por ejemplo, la pepsina o tripsina, que desdoblan prtidos. Esta nomenclatura no siempre ha resultado prctica y por esta razn, y porque el nmero de enzimas identificadas est aumentando se ha adoptado una clasificacin sistemtica. Este nuevo sistema divide a las enzimas en seis clases principales, cada una de las cuales se divide a su vez en subclases, de acuerdo con el tipo de reaccin catalizada. CLASE I.- xido-reductasas, reacciones de xido-reduccin AH2 + B == A + BH2 Reducido

Oxidado

Deshidrogenasas, separan H del sustrato Oxidasas y Reductasas, toman e- del sustrato y los ceden al oxgeno A-R + B == A + B-R

CLASE II.- Transferasas, transferencia de grupos funcionales de un sustrato a otro CLASE III.- Hidrolasas, reacciones de hidrlisis introduciendo grupos -H y OH A + B == AOH + BH + H2O Pueden ser esterasas, protidasas, amidasas CLASE IV.- Liasas, adicin a dobles enlaces (C=C; C=O; C=N) sin hidrlisis, reacciones de rotura o soldadura de sustratos sin intervencin del H2O C=A + B-H == B-C-A-H CLASE V.- Isomerasas, reacciones de isomerizacin A-B == B-A CLASE VI.- Ligasas o sintasas, formacin de enlaces con escisin del ATP A + B ====== A-B ATP ADP + Pi Cada enzima es designada por un nombre recomendado generalmente corto y apropiado para su uso habitual. Por ejemplo, en la reaccin: ATP + creatina == ADP + fosfocreatina Tambin se puede designar por un nombre sistemtico que identifica la reaccin que cataliza: creatn-fosfotransferasa. Por ltimo, si se precisa una identificacin inequvoca (en investigacin), cada enzima se identifica por un nmero de clasificacin de 4 cifras. La enzima del ejemplo anterior sera: E.C. 2.7.3.2

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E.C.: Comisin de Enzimas 2. Nombre de la clase, (transferasas) 7. Subclase (fosfotransferasas) CINTICA ENZIMTICA

3. Sub-subclase (fosfotransferasas con un grupo nitrgeno como aceptor) 2. Designa la creatn-quinasa

Las reacciones catalizadas por enzimas presentan un rasgo caracterstico: la saturacin con el sustrato. La concentracin del sustrato hace variar la v de una reaccin catalizada por un enzima segn la figura

A una concentracin de sustrato baja, la velocidad inicial de la reaccin vo es casi proporcional a la concentracin de sustrato y la reaccin es aproximadamente de 1 orden con respecto al mismo. Sin embargo, a medida que la concentracin de sustrato aumenta, la v de la reaccin disminuye y deja de ser aproximadamente proporcional a la concentracin de sustrato, y el orden de reaccin es mixto. Si seguimos aumentando la concentracin de sustrato, la v de reaccin llega a ser prcticamente independiente de la concentracin de sustrato y se aproxima asintticamente a vcte; en este intervalo la reaccin es esencialmente de orden cero con respecto al sustrato, y se dice entonces que la enzima se halla saturada con su sustrato. Todas las enzimas muestran el efecto de saturacin, pero varan ampliamente con respecto a la concentracin de sustrato que se necesita para que se manifieste. La ecuacin de MICHAELIS-MENTEN nos expresa la relacin matemtica entre la vinicial de una reaccin catalizada por una enzima, la concentracin de sustrato y ciertas caractersticas de la enzima. Esta ecuacin es la ecuacin de velocidad para las reacciones catalizadas por enzimas que solo actan sobre un sustrato. La teora de Michaelis-Menten supone que: la enzima E se combina en primer lugar con el sustrato S para formar el complejo enzima-sustrato E-S a continuacin este ltimo se escinde en una segunda etapa, para formar enzima libre E y producto P

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E + S ====== ES (1) ES ====== E + P (2) (Etapa limitante de la velocidad de reaccin) Se supone que estas reacciones son reversibles. Segn las ecuaciones que definen las dos etapas de la reaccin: v = k3 [ES] pero ni k3 ni [ES] podemos determinarlo directamente. La formacin de ES a partir de E y S es una reaccin de 2 orden y la ecuacin de velocidad ser: d[ES] ---------- = k1 ([ET] [ES]) [S] dt donde [ET] es la concentracin total de enzima, tanto libre ([E libre]=[ET] [ES]) como combinada. Cuando la velocidad de formacin de ES es igual a la de desaparicin, es decir cuando el sistema ha alcanzado el estado de equilibrio (aquel en el que la [ES] permanece constante): k1 ([ET] [ES]) [S] = k2 [ES] + k3 [ES] ([ET] [ES]) [S] k2 + k3 ----------------------- = ------------- = KM [ES] k1

Constante de Michaelis-Menten

Cuando la enzima se halle saturado, se alcanzar la velocidad inicial mxima, todo la enzima estar en forma de ES, es decir la [ET]inicial = [ES] cuando la enzima est saturada y como v = k3[ES], si [ES] es mxima, v es velocidad mxima: vmx = k3[ET] Con lo que la ecuacin de Michaelis-Menten, que es la ecuacin de la velocidad para una reaccin de un solo sustrato catalizada enzimticamente sera: vmx [S] v =----------------------KM + [S] [ET] KM = [S] ---------- - 1 [ES] vmx v KM = [S] ------------v Porque k3[ET] KM = [S] ---------- - 1 k3[ES] v KM = [S] (vmx v) v KM + v [S] = [S] vmx [ET] [ES] KM = [S] -------------------[ES] vmx KM = [S] ---------- - 1 v vmx [S] v = ----------------------KM + [S]

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Las dimensiones de KM, para una reaccin de un solo sustrato son moles/litro y la constante es independiente de la concentracin de la enzima. Por tanto KM se podra definir como la concentracin de sustrato a la cual la velocidad de la reaccin es la mitad de la velocidad mxima. K M es una magnitud determinada experimentalmente. En algunas reacciones en la que k2 es muy grande en comparacin con k3, KM es aproximadamente igual a la constante de disociacin del complejo enzima-sustrato KS, que tambin se designa como constante del sustrato [E] [S] KS = -------------[ES] KM proporciona una idea de la afinidad de la enzima por el sustrato; a menor KM, mayor afinidad y por tanto una formacin ms rpida del producto final [E] [S] KM = -------------[ES] Cuanto ms elevado es KM tanto ms sustrato se necesita para alcanzar una velocidad de reaccin igual a vmx, mientras que la [ES] en el equilibrio ser baja y la formacin de producto final lenta. Por otro lado, al igual que ocurre con la mayora de las reacciones qumicas, la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas se incrementa generalmente con la temperatura, dentro del intervalo en el que la enzima es estable y permanece totalmente activo. As en muchas reacciones enzimticas la velocidad se duplica, aproximadamente por cada 10C de aumento de la temperatura. Las enzimas exhiben tambin un pH ptimo en el cual su actividad es mxima; por encima o por debajo de ese pH la actividad disminuye. FACTORES QUE AFECTAN A LA ACTIVIDAD ENZIMTICA Las enzimas, debido a que son protenas, pueden ver modificada su actividad si se produce algn cambio en las condiciones de medio que afecten a las estructuras de la protena enzimtica, por ello la actividad de la enzima, depende estrechamente, entre otros, de los valores de presin, temperatura y pH del medio. a) Influencia de la presin b) Influencia del pH c) Influencia de la temperatura d) Cofactores e) Proenzimas o zigmenos f) Inhibicin de la actividad enzimtica g) Enzimas alostricos

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h) Isoenzimas INHIBICIN ENZIMTICA A partir del estudio de los inhibidores de las enzimas se ha obtenido informacin de importancia sobre el mecanismo y los caminos de las catlisis enzimticas, la especificidad de sustrato de las enzimas, la naturaleza de los grupos funcionales en el centro activo y la participacin de ciertos grupos funcionales en el mantenimiento de la conformacin activa de la molcula de enzima. La inhibicin enzimtica constituye el mecanismo de control de las reacciones metablicas que tienen lugar en los seres vivos. Inhibicin irreversible: la enzima se une covalentemente al inhibidor, de forma temporal o permanente, presentando una disociacin muy lenta. Tambin se conoce como envenenamiento de la enzima. Inhibicin reversible: se produce un rpido equilibrio entre la enzima y la sustancia inhibidora. Hay tres tipos principales de inhibicin reversible de las enzimas:
1.

Inhibicin competitiva: el inhibidor (se asemeja al sustrato) puede combinarse con la enzima libre de tal modo que compite con el sustrato normal para unirse al centro activo y formar un complejo enzima-inhibidor. Su accin puede invertirse por incremento de la concentracin de sustrato, ya que la enzima siempre tiene ms apetencia por su sustrato que por el inhibidor. La unin del sustrato y del inhibidor al centro activo son mutuamente excluyentes. La presencia de un inhibidor competitivo disminuye la velocidad de la catlisis, al reducir las molculas de S que se pueden unir al enzima.

2. Inhibicin acompetitiva, en ella el inhibidor no se combina con la enzima libre ni afecta a sus reaccin con el sustrato normal, sin embargo, el inhibidor se combina con el complejo enzima-sustrato para formar un complejo inactivo enzima-sustrato-inhibidor, que no experimenta su transformacin posterior en el producto final. El grado de inhibicin aumenta cuando la concentracin de sustrato se ve aumentada. Es frecuente en las reacciones de dos sustratos.
3.

Inhibicin no competitiva. Los inhibidores no competitivos se unen a un centro de la enzima distinto del activo, a menudo para deformar al enzima, de modo que no puede formarse el complejo enzima-sustrato a su velocidad habitual para liberar los productos de reaccin. Algunos tipos especiales son reversibles; generalmente si se deforma la estructura de la molcula, la inhibicin es irreversible. Los inhibidores no competitivos reaccionan reversiblemente tanto con la enzima libre como con el complejo enzimasustrato.

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4.2.- DETERMINACIN DE ENZIMAS

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