UNIVERSITATEA BIOTERRA BUCURESTI

FACULTATEA DE MANAGEMENT AGROTURISTIC

NICOLE-LIVIA ATUDOSIEI PAUL STEFANESCU

CURS MICROBIOLOGIE ALIMENTARA

PENTRU UZUL STUDENTILOR IFR / ID

2003

UNIVERSITATEA BIOTERRA BUCURESTI

FACULTATEA DE CONTROL SI EXPERTIZA A PRODUSELOR ALIMENTARE

NICOLE-LIVIA ATUDOSIEI PAUL STEFANESCU

CURS MICROBIOLOGIE GENERALA

PENTRU UZUL STUDENTILOR IFR / ID

2003

PARTEA I NOTIUNI GENERALE DE MICROBIOLOGIE

Capitolul 1

INTRODUCERE IN MICROBIOLOGIE

In acest capitol va sunt prezentate: definitia microbiologiei microbiologia - stiinta a viitorului ? cand a aparut microbiologia ca stiinta individualizata date semnificative pentru istoricul microbiologiei

1.1 DEFINITIA MICROBIOLOGIEI

MICROBIOLOGIA (micros-mic, bios-viata, logos-vorbire) este stiinta care studiaza forma, structura (morfologia), genetica, procesele metabolice din organismele microscopice si submicroscopice. Microbiologia este o stiinta relativ tanara, care prezinta interes nu numai stiintific, ci si practic, pentru diferite domenii ale activitatii umane: medicina, agricultura, alimentatia, biotehnologia, etc. Fiind ea insasi o stiinta ce s-a putut dezvolta ca urmare a dezvoltarii tehnice si tehnologice, microbiologia a luat amploare abia in ultimele decenii ale acestui secol. Acumularile teoretice si practice din domeniile fizicii nucleare, ale biologiei celulare si moleculare, ale tehnicilor informationale, au condus la imbunatatirea logisticii microbiologiei si, implicit, la dezvoltarea rapida a microbiologiei ca stiinta de mare amplitudine. 3

In

unele

ramuri

industriale,

microbiologia

formeaza

cvasitotalitatea

proceselor tehnologice. Se pot exemplifica astfel industriile fermentative, panificatia, productia antibioticelor, s.a., domenii in care cunoasterea fiziologiei si a metabolismului microorganismelor permite dirijarea corecta a proceselor

tehnologice in vederea obtinerii unor produse utile vietii si activitatii umane, de calitate superioara si cu randamente ridicate. Principalele ramuri subordonate ale microbiologiei, cu statut aparte si avand preocupari specifice, sunt:

bacteriologia - se ocupa cu studiul bacteriilor; micologia - se ocupa cu studiul ciupercilor microscopice si macroscopice; protozoologia - se ocupa cu studiul protozoarelor; virologia - se ocupa cu studiul virusurilor; parazitologia - se ocupa cu studiul parazitismului si organismelor parazite; algologia - se ocupa cu studiul organismelor acvatice simple, numite alge.

La aceste discipline microbiologice trebuie adaugate si domeniile aplicative ale microbiologiei:

imunologia - studiaza sistemul mecanismelor de aparare al organismelor, care le protejeaza fata de o eventuala infectie si/sau de orice substanta straina care patrunde in interiorul lor.

microbiologia

sanatatii

publice

si

epidemiologice - are ca scop

monitorizarea si controlul raspandirii bolilor in comunitati; microbiologia alimentelor si a apei - examineaza rolul pozitiv sau negativ al microorganismelor in alimente si apa; microbiologia solului - studiaza interrelatia dintre microorganism, sol si planta, rolul microorganismelor in fertilitatea solului si in circuitul elementelor biogene in natura; microbiologia agricola - studiaza relatia dintre microorganisme si recolte, in scopul cresterii productiei si calitatii acestora; microbiologia petrolului - studiaza rolul microorganismelor in geneza zacamintelor de petrol; 4

microbiologia mediului - studiaza microorganismele prezente in sol, apa si aer, ocupandu-se de solutionarea problemelor practice din domeniul sanitar; biotehnologia include orice proces prin care oamenii utilizeaza

microorganisme sau procese biologice pentru obtinerea unui produs dorit; microbiologia industriala - utilizeaza microorganisme pentru a produce cantitati mari de produsi utili ca: vitamine, aminoacizi, enzime, medicamente; ingineria genetica - implica tehnici care in mod deliberat modifica fondul genetic al organismelor pentru a induce obtinerea de noi combinatii genice. Reprezinta cel mai dinamic domeniu al microbiologiei moderne.

1.2 SCURTA ISTORIE A MICROBIOLOGIEI

Istoria microbiologiei ar putea fi stucturata in patru etape, si anume:

1. Perioada de individualizare ipotetica a factorului determinant al bolilor, in special umane; 2. Etapa cunoasterii nemijlocite a microorganismelor; 3. Perioada de sintetizare si de corelare a cunostintelor stiintifice in domeniul microbiologiei; 4. Etapa contemporana, de interconectare a microbiologiei cu alte stiinte, in scopul ridicarii valorii sale socio-umane.

Timpul si spatiul tipografic nu permit discutarea pe larg a etapelor istorice ale microbiologiei amintite anterior. Din acest motiv, vom puncta numai cateva momente importante ale istoriei microbiologiei. Fara descoperirea instumentului optic numit microscop, lumea vasta si diversa a microorganismelor nu ar fi putut fi cunoscuta. ANTONIE VAN LEEWENHOEK (1632-1723) este cel care a descoperit lumea invizibila a microorganismelor, fiind primul care le-a observat prin marire cu ajutorul microscopului simplu, cu o singura lentila, de constructie personala. Pe baza desenelor detaliate ale "animalculelor" (animale foarte mici,

mobile) observate pe preparate provenind din diferite medii - apa de ploaie, tartrul dentar si apele din canalele de scurgere - acestea au fost ulterior identificate ca 5

fiind reprezentanti ai bacteriilor,drojdiilor si protozoarelor. Astfel, Leewenhoek a atras atentia asupra microorganismelor, fara sa le acorde statutul unor organisme aparte. ROBERT HOOKE, in urma studiilor realizate la microscop, descoperea in 1665 celula, marcand astfel inceputul unei teorii celulare, consolidate ulterior de alti savanti. MATTHIAS SHLEIDEN si THEODOR SCHWANN, in urma cercetarilor, stabilesc clar teoria conform careia toate organismele, deci si microorganismele, sunt alcatuite din celule. Studiile ulterioare privind structura si functiile celulelor au avut la baza aceasta teorie celulara, constituind una din cele mai importante generalizari ale Biologiei. LAZZARO SPALLANZANI (1729-1799) cunoscand indeaproape

microscopul, se ocupa de teoria " generatiei spontane", subiect controversat in acea vreme. Se credea cu toata convingerea ca "dintr-o substanta organica in descompunere se pot naste spontan organisme vii". Aceasta teorie era cunoscuta de pe vremea lui Aristotel si a fost admisa fara obiectii, deoarece asa sustinea marele Aristotel. In anul 1665, biologul florentin FRANCESCO REDI (1626 - 1697) lanseaza primele critici timide in legatura cu teoria anterior amintita, lansand aforismul "omne vivum a vivo" (tot ce e viu vine din ceva viu). Un secol mai tarziu (1765), Spallanzani aduce argumente si combate teoria lui Aristotel, care avea sa domine totusi pana in 1861, cand Louis Pasteur o inlatura definitv printr-o sintagma ramasa celebra: "si microbii trebuie sa aiba parinti". LOUIS PASTEUR (1822 - 1895), chimist, biolog si imunolog francez, unul dintre intemeietorii stiintelor microbiologice, este cel care a infiintat primele laboratoare de cercetare, fiind considerat geniul microbiologiei. Pasteur a demonstrat ca fermentatiile, considerate anterior procese pur chimice, sunt procese biologice determinate de actiunea microorganismelor, in special anaerobe. El dovedeste ca fermentatia este "un act corelativ unui proces vital", o sursa de energie necesara dezvoltarii germenilor, si ca "o fermentatie determinata are fermentul sau determinant". Realizarea faptului ca drojdiile joaca un rol crucial in fermentatii a reprezentat primul concept care asocia activitatea unui microorganism cu modificarile fizico-chimice ale materiei organice. Extinzand 6

cercetarile sale asupra fermentatiilor, a pus in evidenta natura infectioasa a unor boli ale vinului si ale berii. Pentru impiedicarea alterarii vinului si berii, Pasteur a imaginat procedeul incalzirii blande - pasteurizarea - aplicat ulterior si laptelui si utilizat ca procedeu de sterilizare si in domeniul medical. Au fost puse astfel bazele tehnicilor aseptice care constituie in prezent standardele de laborator. Pasteur stabileste principiul specificitatii microbiene, punand bazele teoriei bolilor infectioase si demonstrand ca acestea sunt rezultatul patrunderii in organism a unor agenti patogeni: intre activitatea unui agent patogen si particularitatile pe care le determina exista o anumita specificitate. Pasteur evidentiaza principiul vaccinarii si stabileste bazele stiintifice ale prepararii vaccinurilor. A demonstrat pentru prima data ca agentii patogeni, chiar cei mai periculosi, pot fi modificati pentru a fi folositi ca vaccinuri. El a numit vaccinuri culturile avirulente utilizate pentru inocularea preventiva ce stimuleaza imunitatea organismului fata de tulpina microbiana virulenta. Incununarea operei sale a fost descoperirea vaccinarii antirabice, aplicata pentru prima data la om in 1885.

ROBERT KOCH (1843-1916), savant german contemporan cu Pasteur, a avut de asemenea un rol deosebit in dezvoltarea microbiologiei medicale, prin descoperirea unor numerosi agenti patologici raspunzatori de numeroase boli la om si animale, cum ar fi tuberculoza, holera etc. El a elaborat o serie importanta de tehnici de izolare, utilizand mediile de cultura solidificate (cu gelatina) pe care cresterea microorganismelor se face sub forma de colonii izolate. Cum o colonie microbiana reprezinta descendenta unei singure celule parentale, insamantarea ei ulterioara intr-un mediu steril genereaza o cultura de celule din aceeasi specie sau tulpina. Descoperirea acestei posibilitati de a obtine culturi pure a constituit un progres care a stat la baza Microbiologiei moderne, deoarece a oferit un mijloc simplu si sigur de izolare a bacteriilor, in vedera studierii biologiei lor, a identificarii si incadrarii lor sistematice. Koch a utilizat tehnici de colorare pentru preparatele microscopice (frotiuri) si in 1882 a identificat bacilul care-i poarta numele (B.K.), agentul patogen al tuberculozei. In 1905, Koch este recompensat cu premiul Nobel pentru fiziologie si medicina. HANSEN (1842- 1909) deschide calea Microbiologiei industriale moderne, prin utilizarea culturilor pure de microorganisme ca starteri de fermentatie. 7

I. MECINIKOV (1845-1946), lucrand la Institutul Pasteur din Paris, a evidentiat procesul de fagocitoza, demonstrand pentru prima data rolul leucocitelor din sange in reactiile de aparare ale organismului fata de agentii patogeni, prin inglobarea si distrugerea acestora. P. EHRICH (1854-1915) este creatorul teoriei moderne a dezinfectiei si chimioterapiei selective, sintetizand primele substante chimice active in terapia bolilor produse de spirochete si protozoare. Lucrarile sale au deschis calea spre era substantelor chimioterapice. S. WINOGRADSKI (1856-1953), intemeietorul Microbiologiei solului, a descris procesul de asimilare la organismele chimiosintetizante si fenomenul de fixare al azotului atmosferic de catre microorganisme. A elaborat metode speciale pentru cercetarea activitatii microorganismelor din sol. A. FLEMING (1881-1955) deschide prin lucrarile sale era antibioticelor, de o mare importanta in medicina si biologie. In 1929 el observa ca unele culturi ale mucegaiului Penicillium elaboreaza o substanta antimicrobiana specifica:

penicilina. Acest prim antibiotic a fost mai tarziu purificat de Florey si Chain (1940), care au oferit terapeuticii infectioase un produs stabil, atoxic pentru om si animal, activ in vivo asupra unor specii de micoorganisme. WAKSMAN in 1944 descopera streptomicina, antibiotic elaborat de multe specii de actinomicete si deschide calea pentru obtinerea de noi antibiotice. TWORT si D'HERELLE (1915-1917) au avut un rol deosebit in evolutia conceptelor fundamentale de bacteriologie si virologie prin descoperirea bacterofagilor (virusuri care paraziteaza bacteriile) si a fenomenului de lizogenie. A. LWOFF a adus contributii deosebite la definirea virusurilor, dupa 1953. El a analizat relatia dintre fag si bacterie, precum si fenomenul de lizogenie sugerand interventia unui mecanism similar in patogenia cancerului. Este laureat al premiului Nobel pentru biologie. Agentii infectiosi subvirali au fost izolati in 1971 de DIENER, care a demonstrat ca moleculele de ARN nude, numite viroizi, pot determina efecte patogene la plante. PRUSINER, in 1981-1984, a demonstrat ca moleculele de proteine, numite prioni, pot fi infectioase pentru om si animale.

In Romania, doi savanti de renume mondial, VICTOR BABES si IOAN CANTACUZINO au contribuit la fondarea Microbiologiei moderne. VICTOR BABES (1854-1926) a lucrat in laboratorul lui Pasteur, iar mai tarziu in laboratorul lui Koch. De formatie anatomo-patolog, si-a insusit tehnicile microbiologice si a orientat investigatia medicala spre studiul actiunii reciproce microorganism-gazda. A colaborat cu A.V. Cornil la primul Tratat de Bacteriologie din lume aparut la Paris in 1885. A descoperit noi specii microbiene, a pus in evidenta corpusculii Babes-Negri in celulele nervoase ale indivizilor morti de turbare si corpusculii Babes-Ernst in bacilii difterici. In cercetarile sale asupra antagonismului bacterian a anticipat descoperirea antibioticelor; a studiat numeroase boli infectioase. Este creatorul Institutului "Victor Babes" din Bucuresti si organizatorul primelor laboratoare de igiena si bacteriologie. IOAN CANTACUZINO (1863-1936), format in laboratorul condus de Mecinikov la Institutul Pasteur din Paris, a continuat cercetarile maestrului sau privind imunitatea nevertebratelor. A studiat patogenia holerei, tuberculozei si a altor boli, vaccinul si vaccinarea antiholerica . A creat Scoala contemporana de microbiologie, initial in laboratorul de medicina experimentala al Facultatii de

Medicina din Bucuresti, apoi in Institutul de Cercetari Microbiologice pe care l-a fondat in 1921. Opera acestor doi mari savanti romani a fost continuata de alti savanti de reputatie internationala: Constantin Levaditi, Dumitru Combiescu, Constantin Ionescu-Mihaiesti, Stefan Nicolau, Mihai Ciuca, Gheorghe Zarnea si altii. In perioada de dupa 1910, din totalul premiilor Nobel pentru medicina si fiziologie, peste o treime au fost acordate microbiologilor si specialistilor in discipline inrudite. Microbiologia continua sa progreseze in fiecare an cu ajutorul a noi tehnici si noi date furnizate de cercetare.

Capitolul 2

TAXONOMIE SI SISTEMATICA GENERALA A MICROORGANISMELOR

In acest capitol va sunt prezentate: notiuni privind clasificarea, nomenclatura si identificarea microorganismelor nivele de clasificare desemnarea numelui stiintific al speciilor sistemul natural, filogenetic de organizare a lumii vii

2.1 DEFINITII

Taxonomia se ocupa cu studiul organismelor vii.

clasificarii, nomenclaturii si identificarii

CARL VON LINNE', un botanist suedez, a fost cel care si-a dat seama de importanta existentei unui sistem de recunoastere si definire a proprietatilor organismelor, stabilind reguli fundamentale pentru categoriile taxonomice sau taxoni. Sistemul lui Linne' a servit cu succes la incadrarea in categorii a celor peste doua milioane de tipuri diferite de organisme descoperite ulterior. 10

Clasificarea este aranjarea ordonata a organismelor in grupe, preferabil intr-un sistem bazat pe relatii evolutive. Nomenclatura este procesul de desemnare a numelor pentru diferitele ranguri taxonomice ale fiecarei specii de microorganisme. Identificarea este procesul de descoperire si inregistrare a trasaturilor organismelor, asfel incat globala. Toti acesti termeni se aplica in sistematica, ce reprezinta studiul diversitatii microorganismelor si al relatiilor intre ele. ele sa poata fi introduse intr-o schema taxonomica

2.2 NIVELE DE CLASIFICARE

Taxonii principali intr-o schema de clasificare sunt organizati in 7 ranguri descendente, incepand cu un regn, cel mai mare si cel mai general, si terminand cu o specie, cel mai mic si cel mai specific. Toti membrii unui regn au in comun numai una sau cateva caracteristici generale, in timp ce membrii unei specii au in comun majoritatea caracteristicilor lor, reprezentand toti acelasi fel de organism. Intre nivelul superior si cel inferior, cei cinci taxoni in ordine descendenta sunt reprezentati de: phylum (pentru animale si protozoare) sau diviziune (pentru bacterii, fungi, alge si plante), clasa, ordin, familie si gen. Bacteriile sunt studiate, cu rare exceptii, nu ca indivizi, ci ca populatii obtinute in laborator sub forma de culturi pure. Culturile pure pot fi mentinute in stare viabila, subcultivate, supuse testelor experimentale si transportate de la un laborator la altul. Unitatea taxonomica fundamentala este specia bacteriana, care este definita dupa alte criterii decat la organismele superioare. Pentru bacterii nu exista granite strict naturale ale speciilor, nici separare geografica. Sub aspect practic specia bacteriana poate fi considerata ca o colectie de alte tulpini. Tulpina reprezinta unitatea practica de lucru, fiind formata din descendentii unei singure izolari din mediu, in cultura pura. Colonia reprezinta o aglomerare macroscopica de celule, care apare pe o zona bine delimitata a suprafetei mediului de cultura solid si provine din 11

multiplicarea unei singure celule. Una dintre tulpinile speciei este desemnata ca tulpina tip si serveste ca tulpina purtatoare de nume pentru specie. Tulpinile tip ale speciilor sunt depozitate in asa numitele colectii de culturi (colectii de tulpini). De aici ele pot fi obtinute si utilizate ca tulpini de referinta pentru compararea directa cu izolatele noi in vederea identificarii lor corecte. Genul bacterian este un grup taxonomic bine definit, alcatuit din specii, in mod clar separate de alte genuri.

2.3 DESEMNAREA NUMELUI STIINTIFIC AL SPECIILOR

Pentru desemnarea numelui stiintific sau specific este utilizat sistemul binominal (cu doua nume) al nomenclaturii. Numele stiintific este intotdeauna o combinatie a numelui de gen, urmat de numele de specie (epitetul specific). Initiala genului din numele stiintific este scrisa intotdeauna cu litera mare, iar a speciei cu litera mica. Ambele nume sunt scrise cu caractere italice sau subliniate. Epitetul specific se scrie cu initiala mica si nu se prescurteaza. Pentru denumirile stiintifice se utilizeaza limba latina sau greaca. Numirea unui organism nou descoperit este supervizata de un grup international de experti care verifica daca au fost urmate procedeele standard si ca nu exista deja un nume dat anterior organismului sau un alt organism cu acelasi nume. Denumirea unui numar de specii a fost data dupa numele unui microbiolog care a descoperit microorganismul respectiv sau a adus contributii importante in domeniu. Alte nume provin de la o particularitate a microorganismului (forma, culoare), locul unde poate fi gasit sau boala pe care o produce. Exemplificam cu cateva nume specifice: Pseudomonas tomato - Gr. pseudo = fals; monas = unitate; tomato = fruct. Deci o bacterie care infecteaza tomatele. Lactobacillus sanfrancisco - L. lacto = lapte; bacillus = bastonas mic. O specie utilizata in asociere cu o drojdie ( Saccharomyces exiguus) pentru fabricarea unui tip de paine din San Francisco. Giardia lamblia - de la Alfred Giard, un microbiolog francez si Vilem Lambl, un medic din Boemia, ambii cercetand micoorganismul, care determina o infectie intestinala severa. 12

2.4 SISTEMUL NATURAL, FILOGENETIC, DE ORGANIZARE A LUMII VII

Celebrul botanist Carl Linnaeus, in opera sa "Systema naturae" (1735) a reunit toate microorganismele intr-un singur grup numit semnificativ "Chaos". Robert Whittaker a propus un sistem de organizare format din cinci regnuri de baza: 1. Procaryotae (Monera); 2. Protista; 3. Fungi; 4. Plantae; 5. Animalia. Constituirea acestor regnuri se bazeaza pe: tipul si structura celulara, organizarea si tipul de nutritie.

Regnul Procaryotae - include organisme unicelulare de tip procariot. El cuprinde bacteriile si are doua subgrupe principale: eubacterii - bacterii cu structura celulara procariota caracteristica si archaebacterii - bacterii cu structura celulara si functii atipice. Regnul Protista - contine cea mai mare parte a microorganismelor eucariote unicelulare care sunt lipsite de tesuturi. El cuprinde alge microscopice care se caracterizeaza prin celule fotosintetizante si protozoare care sunt lipsite de perete celular si se hranesc pe seama altor organisme prin ingestie. Regnul Fungi - cuprinde organisme uni- sau multicelulare si uni- sau multinucleate, de tip eucariot. Celulele eucariote prezinta perete celular, nu sunt fotosintetizante si isi dobandesc nutrientii prin absortie. El cupinde microfungi (mucagaiuri si drojdii) si macrofungi.

13

Regnurile Plantae si Animalia nu includ microorganisme, fiind reprezentate de organisme macroscopice, multicelulare. Plantele sunt alcatuite din celule eucariote cu perete celular si sunt fotosintetizante. Celulele animalelor sunt lipsite de perete celular, iar tipul de nutritie pentru acest regn este nutritia ingestiva.

Este important de retinut ca virusurile nu sunt incluse in nici o clasificare, ca o recunoastere a caracterului lor de agenti infectiosi care nu au echivalent in lumea vie.

Capitolul 3

MORFOLOGIA MICROORGANISMELOR

In acest capitol va sunt prezentate: ce si cine sunt microorganismele structura celulei microorganismelor notiuni despre virusuri ce sunt bacteriofagii 14

ce sunt viroizii si prionii

3.1 DEFINITII

Microorganismele constituie un sistem complex de organisme acelulare si celulare, inzestrate cu un metabolism propriu si continuitate genetica, diferite ca morfologie, activitate biologica si pozitie sistematica. Cu toate acestea, tuturor microorganismelor le sunt comune cateva caracteristici: dimensiunile

microscopice, organizarea lor monocelulara si pluricelulara, precum si structura interna relativ simpla. In categoria microorganismelor sunt incluse: 1. virusurile acelulare; 2. bacteriile, drojdiile monocelulare; 3. mucegaiurile, algele microscopice si protozoarele monocelulare si pluricelulare.

3.2 STRUCTURA CELULEI MICROORGANISMELOR

Unitatea morfologica si functionala fundamentala a materiei vii o constituie celula. Se cunosc doua tipuri de celule: procariote si eucariote. Celula procariota este mai simpla ca organizare, fiind fara nucleu, avand ADN dispersat in citoplasma, nedelimitat de membrana, sub forma de molecule mari de ADN spiralat sau sferic. Acest tip de celula este caracteristic bacteriilor, algelor albastre. Tipul mai evoluat, numit eucariot, intalnit la celulele constitutive ale plantelor, ale animalelor si ale unor microorganisme mucegaiuri, drojdii se caracterizeaza prin nucleu individualizat prevazut cu membrana, ce-l delimiteaza de citoplasma. In acest tip de celule, ADN-ul se afla in nucleu, unde alaturi de proteine formeaza cromozomii corpusculi ce se formeaza in timpul diviziunii celulare si care contin informatia ereditara specifica. Celula*, avand forme si dimensiuni diferite, este alcatuita din trei componente principale: citoplasma, nucleu si membrana celulara, constituind 15

protoplastul. Ea este inconjurata de un perete celular, format din polizaharuri, hipo- si glicoproteine, avand rol protector fata de influentele exterioare celulei, care delimiteaza celulele intre ele si participa, alaturi de membrana citoplasmatica la diviziunea celulara. La unele microorganisme, peretele celular este acoperit de o capsula, de cili** sau de flageli** si de pili (fimbrii).

*celula: lat. celulla- camaruta; vacuus gol **cili, flageli organe de locomotie

Citoplasma este un sistem coloidal complex, macro si micromolecular, alcatuit structural din citoplasma fundamentala si din organite. In compozitia ei intra ioni de substante anorganice si compusi organici, alcatuind, de fapt, materia vie. Citoplasma fundamentala reprezinta partea nestructurata a citoplasmei si este transparenta, elastica, in continua miscare si transformare, majoritatea reactiilor biochimice din celula avand loc la nivelul acestui complex coloidal. Organitele reprezinta sisteme structurale subcelulare bine definite ca structura, forma, specializate in activitati intra si extracelulare. Exista doua categorii de organite: comune intalnite in toate celulele organismelor vii, indiferent de origine, reprezentate prin reticulul endoplasmatic, ribozomii (granulele lui Palade*), complexul Golgi, mitocondriile, lizozomii si centrozomul si organite cu rol specific unor anumite celule specializate sub aspect fiziologic, biologic.

*George Emil Palade savant roman, laureat al premiului Nobel pentru medicina, descoperitorul formatiunilor mitocondriale

citoplasmatice si a rolului acestora in celula.

In citoplasma mai pot fi gasite si incluziunile celulare, formatiuni bine conturate, cu sau fara membrana, cu functii temporare compuse din picaturi de grasime, granule de proteine sau glicogen, alte substante dizolvate in apa, reprezentand substante de rezerva si vacuolele , continand substante sub forma de solutii hidrice. RETICULUL ENDOPLASMATIC este o retea canelara ce brazdeaza citoplasma multidirectional, considerat ca un sistem circulator celular deoarece are rolul 16

transportorului de produsi celulari. Datorita reticulului endoplasmatic suprafata de schimb celular intre substantele citoplasmatice si spatiul intercelular se mareste, imbunatatindu-se astfel calitatea si randamentul acestui schimb. Totodata, reticulul endoplasmatic poate sintetiza proteine, lipide si hormoni pe care celula le secreta in lichidul intercelular. RIBOZOMII sunt forme granulare sferice in care are loc sinteza proteinelor, fiind constituite din ARN si proteine. LIZOZOMII sunt organite sferice continand enzime digestive, avand rolul apararii celulelor contra altor microorganisme prin digerarea (liza) acestora. COMPLEXUL GOLGI reprezinta formatiuni membranoase sub forma de pachete asezate in teancuri, amplasate in apropierea nucleului, avand rolul sintetizarii unor substante celulare specifice si de transfer al acestora prin reticulul endoplasmatic in spatiul intracelular. MITOCONDRIILE sunt corpusculi sferici sau ovoidali, granulari, ce contin sisteme enzimatice care participa la transformarile energetice din celula, deci care produc energie celulara. CENTROZOMUL este un constituent celular (organit) care intervine indirect in diviziunea celulara, vizibil la microscopul electronic in vecinatatea nucleului, cu deosebire in timpul diviziunii. Impreuna cu masa citoplasmatica din jurul sau formeaza asa-numita centrosfera. In timpul diviziunii, in jurul centrosferei se contureaza filamente citoplasmatice radiale denumite aster. Centrozomul lipseste din celulele in care nu are loc diviziunea celulara. In interiorul celulelor mai pot fi intalnite organite cu forme variabile pigmentate diferit, cunoscute sub denumirea de cromoplaste, cloroplaste, s.a., avand culori specifice, cu deosebire in schimburile energetice si in reactiile redox si de schimb ionic intra si extracelulare.

Nucleul este o formatiune protoplasmatica a celulei cu o organizare superioara, continand proteine si acizi nucleici (ADN, ARN), fiind responsabil de transmiterea caracterelor ereditare, in diviziunea celulara si in metabolismul celular. Nucleul este bine individualizat in celulele eucariote de o membrana dublu stratificata, avand pori care permit schimbul de substante intre citoplasma si nucleu si se afla de obicei asezat in centrul celulei, fara ca aceasta sa reprezinte o

17

regula generala. Majoritatea celulelor au un singur nucleu, dar exista si celule polinucleare in structuri biologice superioare. Nucleul se compune din: nucleol, carioplasma (suc nuclear) si membrana nucleara. Nucleolul este o formatiune structurala din interiorul nucleului in compozitia caruia intra ARN si ADN, rolul sau fiind acela de formare a ARN-ului pe care-l transfera in citoplasma, transmitand acesteia informatia genetica continuta in ADN si cromozomi. Carioplasma*, sub aspect compozitional, este citoplasma continand in plus cromatina ** formata din acizi nucleici legati de proteine filamentoase, constituind substratul material al cromozomilor - si linina (acromatina)**. *grec. haryon fara nucleu **grec. a fara. Chroma- culoare; parti din nucleu care reactioneaza sau nu la coloranti bazici caracteristici pentru cromozomi W.

Fleming, 1879 Membrana nucleara este formata din trei straturi membranoase stratificate, traversate de pori prin care are loc schimbul de substante intre nucleu si citoplasma.

Membrana celulara (plasmatica) este un invelis extern ce are o structura trilaminara ca si membrana nucleara, structura care face ca ea sa aiba o permeabilitate selectiva fata de substante si determina o anumita sarcina electrica (stratul exterior are sarcina electrica pozitiva, iar cel din interiorul celulei este electronegativ) care imprima membranei celulare un potential electric de membrana si o anumita polaritate. Potentialul electric de membrana este mentinut de ionii de sodiu (Na+) si potasiu (K+) repartizati neuniform in ambele parti ale membranei (cei de potasiu se gasesc preponderent pe partea interna a membranei, iar cei de sodiu sunt in numar mai mare in lichidul intercelular, dar sarcina stratului interior al membranei, din cauza unor anioni in exces, isi mentine sarcina electrica negativa). Membrana devine un sistem bine organizat, care pe de o parte separa celula de mediul sau, iar pe de alta, prin caracteristicile de membrana ultraselectiva, asigura legatura cu acesta, precum si desfasurarea normala a functiunilor ei fiziologice in mediul in care se dezvolta. Permeabilitatea membranei 18

pentru ionii de sodiu creste de peste 500 de ori, devenind preponderenta celei a ionilor de potasiu. Se produce astfel o inversiune a sarcinilor electrice ale celor doua straturi intern si extern ale membranei celulare, cunoscuta sub denumirea de depolarizare, stare ce permite schimbul material si energetic intre celula si exterior prin deplasarea unor compusi ionici chiar impotriva gradientului de concentratie. Mecanismul transportului ionic-imaginativ, asemanator pomparii lichidelor, se face prin consum.

3.3 VIRUSURILE

Virusurile sunt agenti patogeni alcatuiti din proteine si acizi nucleici de dimensiuni extrem de mici - intre 10 si 300 milimicroni vizibile doar cu ajutorul microscopului electronic si activand intotdeauna ca paraziti celulari si intracelulari. Virusurile sunt lipsite de organizare celulara si intracelulara si ocupa un loc intermediar intre moleculele proteice si bacterii, avand forme spatiale diferite: cilindrice, sferice, ovoidale, poliedrice etc. Sub aspect compozitional, virusurile au doar un singur tip de acid nucleic (ARN sau ADN) si nu dispun de un complex enzimatic capabil de reproducere. Odata patrunse in celula gazda, virusurile modifica metabolismul celular, astfel incat, in locul metabolismului celular caracteristic, se substituie metabolismul specific virusului. Bolile produse la plante si la animale de catre virusuri se numesc viroze, ce se manifesta atunci cand sistemul imunitar, genetic sau dobandit, nu mai poate face fata atacului virulent. Virozele cele mai frecvente la om sunt cele ale gripei, ale hepatitelor B si C, ale poliomielitei, febrei aftoase, etc. La plante virozele cartofului, mozaicul tutunului,etc. Constituentii virali - structura virusurilor este atat de regulata si cristalina incat multe virusuri purificate formeaza agregate mari sau cristale daca sunt supuse anumitor tratamente. Organizarea unui virus este simpla si compacta, continand numai acele parti necesare pentru a invada si controla o celula gazda: un invelis si un miez central.

Modelul de organizare a unui virus poate fi prezentat astfel:

19

Capsida Invelis Anvelopa (nu este prezenta la toate virusurile) Particula virala (virion)

Molecula de acid nucleic Miez central (AND sau ARN) = genom viral Diferite proteine (enzime)

Nomenclatura

virusurilor - Comitetul International de Taxonomie al

Virusurilor (ICTV = International Commitee on Taxonomy of Viruses) este autoritatea care furnizeaza sistemul universal de clasificare si nomenclatura virusurilor. Acest sistem se bazeaza arbitrar pe nivele ierarhice de: ordin, familie, subfamilie, gen si specie. Nivelele inferioare speciei (subspecie, tulpina, varianta) sunt stabilite de experti apartinand unor grupuri speciale internationale. Nomenclatura formala a virusurilor nu implica utilizarea termenilor binominali latinizati. Numele de familie, subfamilie si gen se scriu cu litera initiala mare si caractere italice. Numele speciei, cu unele exceptii, nu se scrie cu litera mare si nici cu caractere italice. Exemplu: Ordinul Mononegavirales, Familia Rhabdoviridae, genul Lyssavirus, virus rabic. Nomenclatura virusurilor utilizeaza si termeni vernaculari, informationali: virusul gripal, virusul rabic. Denumirea virusului are diferite proveniente: aspectul microscopic (forma, marimea), zona geografica sau anatomica de izolare, efectele asupra gazdei sau mai multe caractere combinate. De exemplu: togavirus, lat. toga = roba este un virus care are o anvelopa ca o manta; adenovirus, gr. aden = glanda, descoperit pentru prima data in vegetatiile adenoide; herpesvirus, numit dupa caracterul de raspandire al eruptiei herpetice, gr. herpes = a se furisa, etc.

3.4 BACTERIOFAGII

20

Exista unele virusuri care paraziteaza celulele bacteriene si provoaca distrugerea lor. Acestea poarta denumirea de bacterioifagi, mancatori de bacterii si sunt raspandite in toate mediile in care se gasesc bacterii. Caracteristic acestora este forma de cireasa cu coada; capul rotund cuprinzand ADN inconjurat de un invelis proteic,capsida,in care se afla o molecula de AND (sau ARN viral) iar coada,pedicel, formata din proteine, are la partea terminala o zona enzimatica capabila sa dizolve peretele celulei bacteriene, creand o bresa prin care infuzeaza ADN propriu. In prezenta unei bacterii, fagul este absorbit la suprafata celulei bacteriene,dizolva membrana, si prin pedicel injecteaza AND-ul fagic,care preia toate functiile de multiplicare.Prin multiplicarea ADN-ului bacteriofagului are loc dizolvarea celulei bacteriene si eliberarea virusului care poate ataca noi celule. Aceasta comportare reprezinta ciclul litic sau vegetativ,iar bacteriofagul se numeste virulent.. Daca sub aspect medical actiunea bacteriofagilor este benefica, ei fiind folositi in combaterea unor infectii, in unele domenii de activitate, acolo unde se utilizeaza bacterii, de exemplu in biotehnologii, virozarea cu bacteriofagi poate avea efecte catastrofale, compromitand uneori in totalitate productiile. Din acest motiv, cunoasterea fiziologiei si a morfologiei virusurilor bacteriofagi, a conditiilor lor de dezvoltare, constituie un factor esential in salvarea productiei.

3.5 VIROIZII SI PRIONII

Exista un numar mic de entitati cunoscute, ale caror proprietati sunt in dezacord cu definitia virusurilor, ca elemente genetice care modifica procesul celular normal, supunandu-l propriei replicari si care au o forma extracelulara. Ca atare, aceste entitati nu sunt considerate, in prezent, virusuri, desi par strans inrudite cu acestea. Din categoria acestor entitati, care reprezinta o categorie aparte de agenti infectiosi subvirali, fac parte viroizii si prionii. Viroizii sunt molecule mici de ARN circular care nu codifica proteine si sunt total dependente, pentru replicare, de enzimele codificate de celula gazda. Izolati in 1971 de T.O. Diener, viroizii au fost considerati virusuri, ulterior stabilindu-se conceptul de viroid. Spre deosebire de virusuri, la viroizi forma lor extracelulara este aceeasi cu forma intracelulara si nu au invelis proteic (capsida). Viroizii sunt cei mai mici agenti patogeni cunoscuti (de la viroidul cadang cadang al cocotierului 21

care are 246 nucleotide, la viroidul citrus exorticus din 375 nucleotide). Ei reprezinta o categorie speciala de agenti patogeni subvirali, exclusiv la plante, determinand boli grave la importante forme de cultura: tuberculii fusiformi de la cartof; nanismul hameiului; nanismul si marmorarea clorotica la crizanteme si altele. Interesant este ca molecula de ARN infectanta nu contine gene pentru codificarea proteinelor si deci viroidul este total dependent, pentru replicarea sa, de functiile gazdei. Existenta viroizilor ridica mai multe probleme interesante si intrigante in legatura cu boala pe care o reproduc. Localizarea viroizilor, in principal, in nucleul celulei gazda, impreuna cu capacitatea lor de a servi ca matrita ARN-ului, sugereaza ca simptomele de boala pot rezulta din interferenta viroidului cu mecanismele genetice si functiile metabolice ale gazdei. O asemenea interferenta poate determina producerea unor proteine "gresite". In mod cert, viroizii sunt sisteme genetice independente, cu proprietati determinate de secventa nucleotidica a acizilor ribonucleici respectivi. Prionii reprezinta extrema cealalta fata de viroizi, luand in consideratie parametrii care definesc virusurile. Ei au o forma extracelulara distincta, dar forma extracelulara este reprezentata in intregime de proteina. Cu toate acestea, particula de proteina este infectioasa si sunt cunoscuti diferiti prioni care produc o varietate de boli la animale si la om. Termenul de prion a fost introdus de Prusiner S.B., care in 1980 propune ipoteza prionului, pentru a distinge, de viroizi si virusuri, particulele infectioase proteice ce determina un grup de boli

neurodegenerative. Bolile neurodegenerative determinate de prioni sunt in prezent clasificate impreuna, deoarece etiologia si patogeneza lor implica modificarea unei proteine celulare normale numite Prusiner PrP (proteina prionica). Aceste boli se manifesta ca boli infectioase, ereditare si sporadice. Acestea includ: encefalopatii transmisibile, encefalopatii spongiforme, etc. Boli reprezentative: scrapia oilor, boala "vacii nebune", boala Creutzfeld - Jacob, insomnia familiala fatala, etc. Pe langa boala cu urmari grave, infectia prionica are ca rezultat producerea mai multor copii ale proteinei prionice. Aceasta proteina trebuie sa fie codificata de acid nucleic, altfel, existenta prionilor ar pune sub semnul intrebarii modelul central al fluxului de informatie genetica. Cunoasterea viroizilor si prionilor prezinta interes din mai multe motive: extind definitia data virusurilor, fata de care sunt caracterizati; 22

demonstreaza existenta atat a unor modalitati neasteptate prin care elementele genetice se pot replica, cat si a unor modalitati neasteptate prin care pot supune celulele gazda;

determina boli grave care la om au un caracter unic prin aceea ca sunt atat boli genetice (ereditare) cat si infectioase. Biologia prionilor, cu radacini in virologie, neurologie si neuropatologie, a

devenit mai recent corelata cu disciplinele de biologie celulara si moleculara, ca si de chimie a proteinelor. Cunoasterea exacta a modalitatilor de multiplicare a prionilor si de producere a bolii vor deschide cu siguranta noi perspective in biochimie si genetica.

Capitolul 4 BACTERIILE

Acest capitol cuprinde: definitia, morfologia, structurile externe ale bacteriilor; sporogeneza bacteriilor; fiziologia, biochimia si metabolismul bacterian; elemente si notiuni introductive de genetica bacteriana

Bacteriile sunt microorganisme unicelulare de tip procariot care se reproduc asexuat prin diviziune directa (sciziune). Ritmul de diviziune este de 10 12 minute. Ele sunt organisme raspandite in natura, oriunde exista conditii minime de viata. In functie de modul de procurare al substantelor nutritive, bacteriile sunt autotrofe cele care isi pot sintetiza din surse anorganice metabolitii esentiali si heterotrofe acelea care traiesc pe seama unor gazde vii de la care isi procura substantele necesare. Majoritatea bacteriilor patogene ce produc imbolnaviri sunt heterotrofe.

4.1 MORFOLOGIA BACTERIILOR

23

Morfologia propriu-zisa a bacteriilor se refera la: forma celulei, dispozitia spatiala sau forma de existenta, dimensiunile si afinitatea tinctoriala. Principalele forme celulare ale bacteriilor sunt: sferica, cilindrica si curba - spiralata. Forma sferica se refera la coci. Daca celulele formate prin diviziune se separa si raman independente se numesc micrococcus; cand cocii sunt grupati perechi sunt denumiti diplococcus; daca ei sunt dispusi in lant se numesc streptococcus; dispunerea pe doua planuri perpendiculare a cocilor are denumirea de tetrade, iar structura de ciorchine (grupuri neregulate) este denumita staphylococcus. Forma cilindrica alungita, de bastonas poate exista in doua forme si anume: vegetativa care reprezinta starea de viata activa a celulei cu toate functiile normale, si sporulata forma de rezistenta, de autoconservare, pana se indeplinesc conditiile normale de transformare a sporului in forma vegetativa. Sporul este o formatie endocelulara (in interiorul celulei) ce se formeaza pentru asigurarea unei vieti latente a celulei pe timp mai indelungat. Bacteriile izolate asporulate (nesporulate) sunt denumite bacterium, iar cele sporulate se

numesc bacillus. Ambele tipuri de bacterii pot fi dispuse spatial in lant, caz in care se numesc streptobacterii in palisada (ca scandurile gardului), dar mai pot fi si alte aranjamente spatiale. Bacteriile spiralate au corpul format dintr-o jumatate de spira ca semnul virgulei si se numesc vibrioni (vibrio), sau din mai multe spire spirochete (spirochet) nedeformabile ex: genul Leptospira si deformabile ex: genul Borrelia. In afara acestor 3 forme majore de bacterii, mai exista si unele mai rar intalnite in special la germenii saprofiti: forma patrata, elipsoidala denumirea fiind cea de cocobacili,fusiforma, etc. Dimensiunea diametrului cocilor variaza intre 1 5 micrometri, iar bacilii au lungimea de 0,5 10 micrometri si diametrul ntre 0,3 si 0,5 micrometri, ei putandu-se clasifica in: scurti, in lungime medie de 2 micrometri si lungi, la care lungimea este de aproximativ 10 micrometri.

24

4.2 EXAMENUL MICROSCOPIC

Din cauza dimensiunilor foarte reduse, microorganismele nu pot fi vazute decat cu ajutorul unor instrumente si aparate optice. Caracterele morfologice ale coloniilor bacteriene se studiaza in detaliu cu ajutorul lupei, dar forma si structura microorganismelor nu pot fi cercetate decat cu ajutorul micrcoscopului optic si al celui electronic. Cu ajutorul microscopului optic bacteriile pot fi examinate fie in stare nativa, fie dupa ce sunt fixate si colorate (frotiuri).

Examenul preparatelor native

Preparatele native (umede, necolorate) se pot face dintr-o cultura microbiana sau direct din produs. Ele sunt examinate, de regula, intre lama si lamela. Se ia cu ansa sau cu o pipeta Pasteur o picatura din cultura lichida sau din cultura suspensionata in solutie salina fiziologica si se depune pe o lama curata si degresata, peste care se pune o lamela curata. Pentru examinare se plaseaza preparatul nativ pe platina microscopului, se centreaza lumina, se inchide mult diafragma, se coboara condensatorul si se aduce in dreptul preparatului un obiectiv uscat. Se apropie mult de preparat lentila frontala a obiectivului cu ajutorul macrovizei, dupa care se ridica treptat obiectivul pana la aparitia imaginii, care este pusa la punct cu ajutorul vizei micrometrice. Pe preparatele native sunt evidentiate existenta, forma si mobilitatea microorganismelor (care nu trebuie confundata, insa, cu miscarile browniene). Dupa examinare, preparatele care contin germeni vii trebuie puse intr-un cristalizator cu amestec sulfocromic. Preparatele native pot fi examinate si pe fond intunecat, precum si prin procedeul contrstului de faza.

Examenul preparatelor colorate

25

Preparatele colorate prezinta avantajul ca sunt sterilizate prin fixare, sunt usor de manipulat si de examinat si pot fi pastrate mult timp. Aceste preparate permit diferentierea bacteriilor dupa afinitatea lor pentru anumiti coloranti si pot evidentia unele elemente structurale (cili, capsula, spori, granulatii, etc.) prin coloratii speciale. Examinarea preparatelor colorate se face astfel: se centreaza lumina, se ridica condensatorul, se lasa diafragma deschisa si se pune o picatura de ulei de cedru pe frotiu. Cu ajutorul macrovizei se coboara tubul optic si se introduce lentila frontala a imersiei in ulei de cedru pana in imediata apropiere a frotiului. Punerea la punct se face cu ajutorul vizei micrometrice, iar deplasarea lamei pentru schimbarea campurilor microscopice se obtine cu ajutorul carului mobil. Dupa examinare se ridica obiectivul, se sterge uleiul de cedru de pe imersie si se scoate lama de pe platina microscopului.

Coloranti si metode de colorare

Colorantii folositi in mod curent in bacteriologie sunt substante organice, de

obicei colorate, usor solubile, de cele mai multe ori sintetice, avand proprietatea de a colora diferite substraturi chimice. Coloratia se realizeaza prin combinatie chimica, absorbtie sau dizolvare in structura pe care o pune in evidenta. Coloratiile pot fi facute fie pe germeni vii, fie pe germeni omorati. Colorarea microorganismelor vii se face cu coloranti netoxici pe preparate proaspete. Colorarea germenilor omorati este cea mai utilizata in microbiologie. Pentru a fi colorate, bacteriile sunt, in prealabil, supuse unor operatii pregatitoare.

Operatii pregatitoare in vederea colorarii Pregatirea frotiului. Frotiul se prepara prin etalarea produsului de examinat pe o lama curata si perfect degresata, astfel inacat germenii sa formeze un strat subtire, uniform. Etalarea culturii sau a produsului se realizeaza cu ajutorul unei anse de platina sau al unei pipete Pasteur. Se ia o picatura din cultura lichida si se 26

intinde circular pe lama. Cand cultura este pe mediu solid, se racleaza cu ansa sterilizata si racita o prtiune din cultura si se depune pe o lama de sticla, pe care, in prealabil, s-a pus o picatura de solutie salina fiziologica, dupa care se omogenizeaza si se raspandeste uniform pe o suprafata circulara. Frotiul astfel confectionat este lasat sa se usuce la temperatura camerei. Fixarea frotiului. Dupa uscare, frotiul este supus operatiei de fixare prin caldura sau prin lichide fixatoare, cum sunt: alcoolul metilic, alcoolul etilic, alcooluleter, etc. Pentru fixare prin caldura se trece lama de 2-3 ori cu fata opusa frotiului, prin flacara unui bec de gaz. Incalzirea se face la 60 - 70oC (lama este suportata pe dosul mainii). Prin fixare bacteriile sunt omorate, evitandu-se astfel pericolul infectarii. In plus, se mareste aderenta preparatului de lama, iar afinitatea sa pentru colorant creste. O fixare corecta nu trebuie sa produca modificari ale formei si ale structurii microorganismului supus acestei operatii. Mordansarea este tratarea frotiului cu anumite substante chimice, numite mordanti (de exemplu, solutia Lugol), in scopul de a intensifica activitatea colorantilor. Mordantii, prin afinitatea puternica pe care o au atat fata de colorant, cat si fata de substratul supus colorarii, faciliteaza si intaresc legatura dintre acestia, contribuind astfel la obtinerea unei coloratii mai intense si de o calitate mai buna. Pentru colorantii bazici se folosesc mordanti acizi (acid tanic, acid picric, etc.) iar pentru colorantii acizi se folosesc mordanti bazici (sulfat de fier, alaun, etc.)

Prepararea unor coloranti folositi in bacteriologie Colorantii sunt preparati si pastrati in laborator sub forma de solutii alcoolice saturate, cunoscute si sub numele de solutii-mama. Aceste solutii se prepara prin mojararea unei cantitati de 10-15 gr. colorant cu 100 ml alcool de 96o; pentru solutia saturata de violet de gentiana sunt suficiente numai 6-8 gr. colorant. Dupa preparare, solutiile saturate sunt tinute 2-7 zile la termostat la 37oC si agitate de mai multe ori pe zi. Dupa filtrare prin hartie de filtru, solutiile se pastreaza la loc intunecos in flacoane de sticla de culoare inchisa cu dop rodat. In aceste conditii, colorantii pot fi pastrati timp indelungat. Pentru colorarea germenilor se folosesc solutii apoase de colorant. Acestea se prepara dintr-o solutie alcoolica saturata, care este diluata in proportie de 1/10 in apa fenolata 2%. 27

Solutiile apoase pot fi preparate si direct din substanta colorata astfel: 1 gr. de colorant (cristale) este majorat si dizolvat in 10 ml alcool. Se adauga apoi 2 ml fenol si o parte din apa distilata. Dupa ce se amesteca bine, se terc intr-un flacon de sticla in care se adauga si restul de apa distilata pana la 100 ml. Solutia astfel preparata se mentine 24h la termostat, la 37oC, apoi se filtreaza prin hartie de filtru si se transvazeaza intr-o sticla picatoare, fiind buna de folosit. Solutiile apoase de colorant nu pot fi pastrate un timp prea indelungat, deoarece se degradeaza. In coloratiile obisnuite se mai folosesc si alte solutii, ca Solutia Lugol (1 gr. iod, 2 gr. iodura de potasiu si 300 ml apa distilata) si solutia de alcool-acetona (3 parti alcool de 96o si o parte acetona). Coloratiile pot fi simple, diferentiale si speciale.

Coloratiile simple Coloratia cu albastru de metilen. Frotiul uscat si fixat apoi la flacara este acoperit cu o solutie de albastru de metil timp de 1-2 minute. Se spala dupa aceea frotiul cu apa de robinet, se lasa sa se usuce si se examineaza la microscop cu obiectivul cu imersie. Prin aceasta metoda, toate elementele din campul microsopic apar colorate in albastru. Este o coloratie rapida, care pune in evidenta forma, gruparea si, eventual, raporturile germenilor cu leucocitele sau cu alte elemente prezente in frotiu. Coloratia cu fucsina fenicata Ziehl diluata 1/10 se efectueaza in acelasi mod ca si cea cu albastru de metilen. Elementele din frotiu apar colorate in rosu.

Coloratiile diferentiale Coloratia Gram. Este o coloratie foarte utilizata in bacteriologie, deoarece imparte bacteriile in doua mari categorii: bacterii Gram-pozitive si bacterii Gramnegative. Tehnica coloratiei este urmatoarea: frotiul uscat este fixat prin caldura; se acopera lama cu solutie apoasa de violet de gentiana si se lasa timp de 1-2 min.; se indeparteaza colorantul si se acopera lama cu solutie Lugol pentru 2 min.; 28

 se indeparteaza mordantul (solutia Lugol) si se trateaza frotiul cu alcool-acetona timp de cateva secunde; se spala rapid lama cu apa de robinet si se acopera cu fucsina diluata 1/10 in apa timp de 30 sec. pana la 1 min; se indeparteaza fucsina si se spala frotiul cu apa de robinet; dupa uscare se examineaza la microscop cu obiectivul cu imersie. Bacteriile Gram-pozitive rezista la decolorare, ramanand colorate in violet, dar cele Gram-negative sunt decolorate de alcool-acetona si recolorate in rosu. Coloratia Ziehl-Nielsen se aplica in cazurile mycobacteriilor care au in compozitia peretelui celular acid micolic si le confera impermeabilitate la colorantii folositi in tehnica gram. Pentru acesti germeni numiti acid-alcool rezistenti (AAL) se foloseste aceasta tehnica speciala. Tehnica folosita pentru coloratie: frotiul uscat se fixeaza la flacara; se acopera lama cu fucsina fenicata Ziehl si timp de 10 min se incalzeste intermitent, cu ajutorul unei lampi de alcool sau cu flacara unui bec Bunsen pana la emiterea de vapori, fara a se ajunge la fierbere; fucsina evaporata prin incalzire se inlocuieste imediat; se indeparteaza colorantul, se spala frotiul cu apa de robinet si se decoloreaza cu acid azotic diluat 1/3 sau acid sulfuric diluat 1/4; se indeparteaza acidul si se spala lama cu apa de robinet, dupa care se decoloreaza frotiul cu alcool de 96o; se indeparteaza alcoolul si se spala frotiul din nou, cu apa de robinet, dupa care se recoloreaza cu o solutie apoasa de albastru de metilen 1% timp de 1min.; se spala frotiul cu apa de robinet, se lasa sa se usuce si se examineaza la microscop cu obiectivul de imersie.

Coloratii speciale

Metode de punere in evidenta a capsulei bacteriene 29

Metoda Burri. Pe o lama perfect curata se pun o picatura din susopensia de bacterii capsulate si o picatura de tus de China. Dupa ce se omogenizeaza, se face un frotiu prin etalarea amestecului cu o alta lama. Se lasa sa se usuce si se examineaza la microscop cu obiectivul cu imersie. Pe fondul negru al preparatului, bacteriile impreuna cu capsulele lor apar incolore. Coloratia Loeffler cu albastru de metilen se efectueaza cu o solutie invechita de albastru de metilen Loeffler. Prin aceasta coloratie corpul bacterian se coloreaza in albastru, iar capsula, in roz. Coloratia pentru cilii bacterieni. Cilii nu pot fi vazuti la microscopul optic pe preparatele native sau pe frotiurile cu coloratii obisnuite. Pentru a fi pusi in evidenta se folosesc metode speciale de coloratie Metoda Zettnow. Coloratia dupa aceasta metoda se esfasoara astfel: se prepara o suspensie diluata de germeni in apa distilata, astfel incat sa se obtina pe frotiu celule izolate; din aceasta se iau 2-3 picaturi cu o pipeta Pasteur si se depun pe o lamela degresata si flambata; se lasa frotiul sa se usuce, dupa care se fixeaza cu formol diluat 1/10, timp de 10 min.; se pune lamela in apa distilata timp de 3 min dupa care se introduce intr-o solutie de tanin si de tartrat dublu de stibiu si potasiu, incalzita la 60-70oC, timp de 10 min.; se scoate lamela cu o pensa si se clateste bine in apa distilata; se acopera frotiul cu o solutie de sulfat de argint si amoniac care se prepara in momentul folosirii si se incalzeste usor la flacara, timp de 30 - 60 sec.; se spala frotiul cu apa distilata, se usuca si se monteaza in ulei de cedru, prin aplicarea lamelei cu frotiul in jos pe o lama foarte curata, dupa care poate fi examinata la microscop.

Metode de colorare a sporilor

Metoda Gray modificata. Se fac frotiuri care se lasa sa se usuce si se fixeaza prin caldura. Se acopera lama cu o solutie apoasa de verde malahit 5% si se incalzeste de trei ori pana apar vapori. Dupa fiecare incalzire se indeparteaza 30

colorantul si se inlocuieste cu altul proaspat. Se spala apoi frotiul cu apa si se acopera cu o solutie de fucsina diluata 1/10, timp de 1-2 min. Se indeparteaza colorantul, se spala lama cu apa, se lasa sa se usuce si s examineaza la microscop cu obiectivul cu imersie. Sporii apar colorati in verde-albastrui, iar corpul bacterian apare colorat in violaceu. Impregnatia argentica (metoda Fontana-Tribondeau). Aceasta coloratie se foloseste, in special, pentru punerea in evidenta a treponemelor si a leptospireloor. Tehnica este urmatoarea: frotiul uscat nu se fixeaza la flacara; pentru fixare si deshemooglobinizare se acopera frotiul cu solutie Rugge, care trebuie schimbata de trei ori in decurs de 1 min; se spala lama cu apa distilata si se acopera apoi 3 min cu o solutie de acid tanic 5%, care se incalzeste pana la emisie de vapori; se spala cu apa distilata, se lasa sa se usuce si se examineaza la microscop cu obiectivul de imersie. Treponemele si leptospirele apar colorate in negru-brun, iar restul frotiului, in galben. Coloratia May-Grunwald-Giemsa se foloseste in microbiologie pentru colorarea preparatelor de sange, in care se cerceteaza prezenta unor microorganisme, ca: spirochete, hematozoarul palustru, toxoplasma, etc. Frotiul obtinut prin etalarea pe lama in strat subtire a unei picaturi proaspete de sange este fixat prin acoperirea cu solutie May-Grunwald, timp de 4 min sau cu alcool metilic pur, timp de 10 min. Dupa fixare, peste solutia May-grunwald se adauga o cantitate egala de apa distilata neutra sis e lasa 1 min. Se indeparteaza solutia May-grunwald si se acopera lama cu solutie Giemsa diluata (3 picaturi solutie Giemsa la 2 ml apa distilata neutra). Dupa 20 min. se indeparteaza colorantul, se spala lama cu apa distilata, se lasa sa se usuce si se examineaza la microscop. Pe aceste preparate spirochetele sunt colorate in violet, hematozoarul se coloreaza in albastru-violet, etc.

4.2 STRUCTURI EXTERNE ALE BACTERIILOR (Structura extraparietala)

31

Unele bacterii au la exteriorul peretelui celular o structura complexa, ce favorizeaza aderenta acestora la alte structuri sau mobilitatea celulelor. Structurile externe, considerate structuri facultative, sunt capsula, flagelii si pilii, aflati in afara invelisului bacterian. Capsula, stratul ce acopera celula, este de natura mucopoliglucidica sau mucoproteica. Stratul mucilaginos care poate ajunge la grosimi de 2 micrometri imprima bacteriilor proprietati de aderenta si rezistenta la factori chimici si fizici (antibiotice si lipsa de apa). Totodata, datorita calusului unele celule se pot asocia dand formatiuni vizibile cu aspect gelatinos. Capsula reprezinta uneori, datorita rezistentei la agentii fizico-chimici si biologici, un factor de patogenitate si de specificitate antigenica. Flagelii sunt formatiuni filamentoase prezente la unele bacterii, denumite mobile, ca organe de locomotie. Unele bacterii au un singur flagel sau un manunchi de flageli polarizat la un capat al celulei, la altele flagelii sunt amplasati pe intreaga suprafata a celulei in numar foarte mare (de ordinul 100 si 1000), iar lungimea lor poate atinge si 20 de micrometri, caz in care sunt cunoscuti sub numele de cili. Cel mai adesea nu exista simultan cili si flageli. Ca structura, flagelii sunt alcatuiti dintr-o proteina specifica, cu structura helicoidala denumita flagelina. Datorita structurii helicoidale si a specificitatii, flagelina este contractila. Ea se fixeaza la spatiul periplasmic cu ajutorul unor formatiuni denumite carlig si discuri. Flagelii se pot roti cu 40-60 de rotatii pe secunda in ambele sensuri de rotire (dreapta, stanga), imprimand datorita structurii helicoidale o miscare de deplasare a celulei bacteriene cu viteze de 2 pana la 100 de ori mai mare ca lungimea celulei intr-o singura secunda (spre comparare, campionul mondial la 100 m plat este de numai 5-6 ori mai rapid in raport cu inaltimea sa). Celulele mobile cu un singur flagel sunt numite monotriche, cele cu doi flageli, amfitriche, multiflagelate polare, lofotriche, iar ciliatele peritriche. Pilii sunt structuri proteice care acopera complet suprafata bacteriilor; pilii comuni, au rol de aderenta bacteriana; altii sunt implicati in conjugarea bacteriana permitand trecerea materialului genetic de la o bacterie la alta, fiind cunoscuti ca pili sexuali (Factor F). Pilii comuni numiti si fimbrii, sunt apendici filamentari rigizi, ce nu folosesc la deplasare, cu lungimi de aproximativ 1 micrometru si diametrul de 32

circa 3 nanometri; sunt compusi dintr-un singur tip de proteina cu molecula in forma de filament helicoidal. Pe acesti pili exista receptori ce recunosc numai anumite structuri din organism si, prin aceasta, intervin in patogenitate, avand specificitate imuno-patogenica.

4.3 SPOROGENEZA BACTERIILOR

Dupa cum se arata la morfologia bacteriilor, anumite specii de bacterii (de exemplu familia Bacillaceae) au o forma de rezistenta cunoscuta sub denumirea de spor. Forma sporului este sferica sau elipsoidala, dar pot exista mai rar si alte forme (suveica, maciuca), avand dimensiuni reprezentand 5-15% din celula mama. Rolul sporului este asigurarea perpetuarii speciei bacteriene in conditii

nefavorabile, bacteria trecand in aceasta forma de rezistenta, care nu are nici un rol in multiplicare sau patogenitate. Sporul la bacterii prezinta o forma primitiva de diferentiere celulara. El se formeaza ca un tip nou de celula in celula vegetativa, cu ultrastructura, compozitie chimica si enzimatica diferita de ale celulelor vegetative, prezentand o deosebita rezistenta la conditii nefavorabile de mediu. Unele constrangeri mecanice specifice sunt impuse de natura peretelui celular in procesul de sporogeneza, de vreme ce toate bacteriile sporogene cu exceptia genului Desulfomaculum sunt grampozitive. Sporogeneza este un caracter de specie la bacterii din clasa Bacillaceae. La bacteriile anaerobe din genul Clostridium sporul este o structura constanta in timp ce la genul Bacillus sporul apare in mod facultativ. Pentru bacterii, forma caracteristica de spor este endosporul. El apare in interiorul celulei vegetative numite sporangiu sub forma unei formatiuni foarte rezistente in conditii de mediu nefavorabile. Endosporul este o formatiune sferica sau ovoidala al carui volum

reprezinta 5-15 % din volumul si 30% din greutatea sporangelui. Structura clasica a endosporului bacterian este compusa din trei straturi: exina-invelisul exterior, medina-stratul median si altul interior-intina care la randul lor se compun dintr-unul sau mai multe straturi. Sub invelisul sporal se gaseste un al doilea invelis de natura glucoproteica, numit cortex, avand un rol 33

mixt de rezistenta mecanica, de reglare a presiunii osmotice care favorizeaza in anumite conditii transferul apei libere din endosperm spre exterior. In interiorul acesteia se afla celula propriu-zisa protoplastul sporal format din sporoplasma (citoplasma continand organite ribozomiale si nucleoplasma).

Sporularea se poate considera ca are loc in trei etape, si anume: pregatitoare, faza de prespor si stadiul de spor matur.

La inceputul sporularii celula prezinta doi nucleoli complet separati spatiali ce condenseaza intr-un filament axial de cromatina, dupa care acesta se separa din nou in doi cromozomi, dintre care unul migreaza la o extremitate a celulei unde va fi izolat printr-un perete intr-un compartiment corespunzator viitorului spor. In acest compartiment sinteza ADN este inhibata. Aceasta poate fi considerata faza pregatitoare. In continuare are loc sinteza unor substante specifice sporale ce compun protoplastul sporal (presporul) si apoi a peretelui celular peptidoglicanic al viitoarei bacterii, iar cortexul sporal capata structura rigida care ii confera rezistenta deosebita la variatii de temperatura (si peste 100oC) si la scaderea umiditatii. In celula sporala au loc modificari substantiale compozitionale si fiziologice: volumul si greutatea se reduc, continutul de apa scazand de la cca 80% la aproximativ 15%; astfel structura ei gasindu-se acum sub forma de apa legata de diferite componente citoplasmatice, care sa favorizeze ulterioarele reactii biochimice. Modificarile mentionate au drept urmare formarea invelisurilor sporale prin depozitarea pe suprafata cortexului a unor straturi proteice multiple si incorporarea de cisteina*, iar citoplasma devine mai omogena, mai densa. Este faza de maturare, de spor matur, cand sporul se afla in stare de viata latenta (criptobiotica) in care enzimele sporale se afla in stare de inactivare, iar metabolismul endosporului este redus la zero, caracteristic starii de anabioza, desi celula nu este moarta. *aminoacid cu grupari sulfhidrice ce au proprietati de donatori acceptori de electroni, component al acizilor nucleici. Faza de spor matur se caracterizeaza prin acumulare in cantitate mai mare (10 15 %) de acid dipicolinic*, un compus specific capabil sa formeze chelati cu 34

ionii de calciu si/sau magneziu, determinand in aceasta forma modificari structurale in sporoplasma, ce au drept consecinta o crestere a rezistentei sporului la factori nefavorabili de mediu. *acid 2,4 piridin dicarboxilic Astfel, in timp ce celula vegetativa este inactivata la temperaturi putin peste 65oC in cateva minute, endosporul este inactivat termic abia in 10-20 de minute in mediu umed si la 180oC timp de 45-60 de minute in mediu uscat. Aceasta rezistenta la temperaturi ridicate se explica prin continutul mare de proteine cu sulf si a complecsilor acidului picolinic. Sporularea bacteriilor este un proces morfogenetic programat sa se

desfasoare etapizat ,fiind controlat de cca. 50 de gene. Se cunoaste de exemplu ca sporogeneza la Bacillus subtilis este controlata de 42 de gene ale sporula

Formarea sporului presupune o trecere de la un potential genetic total al unei celule vegetative la unul selectiv specific sporului insotit de o regresie a genelor vegetative. Trecerea de la forma vegetativa la sporulare se caracterizeaza printr-un moment critic, dincolo de care nu se mai poate influenta in nici un fel evolutia sporului, fenomenul fiind cunoscut prin sintagma fenomen de angajare. Sporogeneza reprezinta o alternativa a cresterii vegetative de adaptare a celulelor procariote la conditii fluctuante de mediu ce depasesc limitele normale de crestere. In timp ce bacteriile propriu-zise formeaza endospori, bacteriile actomicete, filamentoase si ramificate cu o mare varietate de tipuri morfologice, de regula gram-negative, produc un alt tip de spori numiti actinospori, ce au trei forme principale si mai multe intermediare: sporangiospori, endospori si artrospori (spori hifali). In cazul acestor bacterii sporogeneza este diferita fata de cea

anterior descrisa, avand 4 stadii succesive si anume: la inceput celulele miceliene se spiraleaza, viitorul spor fiind separat de hifa printr-un perete ce determina formarea unor celule egale ce vor deveni spori. Apoi, in hifa sporogena are loc o aparitie a septurilor de sporulare asociate cu prezenta mezozomilor de cca 1-2 micrometri. Septurile apar prin cresterea la distante a unor

spre interior

diafragme inelare duble, ca o continuare a peretelui celular si a membranei citoplasmatice. Urmeaza formarea unui perete helicoidal gros, semirigid, dupa care sporii, initial de forma cilindrica, capata forma elipsoidala, peretele micelian

35

vechi dezintegrandu-se. In faza de spor matur, sporii elipsoidali sunt inlantuiti si legati de filamentul vegetativ doar printr-o singura membrana. Mai sunt si alte tipuri de spori, ca de exemplu cei de origine hifala (artrospori)*, ce provin din ingrosarea peretilor celulelor vegetative si acumularea de substante de rezerva, ori gonidiile rezultate prin contractia, condensarea si divizarea protoplasmei unei celule vegetative avand rol de reproducere (la Leptothrix ochracea), deosebindu-se intre ei atat structural, cat si prin rolul lor biologic.

*arthrom articulatie; askos sac; aktinos - raza; mykes ciuperci; kenis praf; kistis sac, vezica 4.4 FIZIOLOGIA, BIOCHIMIA SI METABOLISMUL BACTERIAN

Bacteriile se caracterizeaza printr-o mare complexitate metabolica si capacitate de adaptare, fiind raspandite peste tot in natura datorita posibilitatilor de a-si schimba metabolismul in functie de conditiile in care se gasesc, iar daca acestea lipsesc, ele construiesc forme rezistente ce le asigura o viata latenta chiar si pentru perioade masurate in sute de ani. Pentru a intelege fiziologia si metabolismul bacterian, in cele ce urmeaza va fi discutata compozitia bacteriana. Dupa cum se stie, toate vietuitoarele, deci si bacteriile, contin in celula apa, proteine, glucide, lipide, minerale, enzime, vitamine si alte substante specifice. chimica si rolul compusilor chimici in fiziologia

Apa reprezint 70-80% din masa celulara si se gaseste sub doua forme: apa libera si apa legata de compusii constituie un mediu propice dispersarii moleculari ai celulei bacteriene. Ea componentelor celulare si participa la

reactiile biochimice din metabolismul bacterian. Metabolismul schimbul de substante chimice dintre celule si mediu - nu poate avea loc decat in solutii

adevarate sau coloidale. Continutul de apa al celulelor permite reglarea presiunii osmotice celulare si utilizarea substantelor chimice la nivel atomic si molecular prin dilutii, disocieri si polarizari. Prezenta apei in celula 36 imprima acesteia

mobilitatea structurala, schimbarea formei si elasticitatea necesara adaptarii la

medii diferite. Intre formele vegetativa si sporulata exista diferente ale continutului de apa, cu deosebire a apei libere, sporii avand doar 15-20% apa sub forma de apa legata. Proteinele participa cu o pondere de 30-80% in masa uscata a celulei bacteriene, la structura careia participa mai mult de 23 aminoacizi, dintre care unii specifici doar bacteriilor, cum sunt: Diaminopimelic, Aminopimelic, Theicoic, sau izomerii seriei D ai Alaninei si Acidului glutamic. Proteinele se gasesc sub forma de aminoacizi, peptide simple sau polipeptide sau participa ca proteine complexe (heteroproteine). Heteroproteinele prezinta cea mai mare importanta pentru fiziologia celulara bacteriana datorita posibilitatii acestora de a realiza multiple combinatii

biochimice complexe in functie de necesitatile fiziologice. Se vor intalni astfel combinatii binare sau polinomiale glucido-lipido-polipeptidice cum sunt

mucoproteinele, cromoproteinele, acizii nucleici, enzimele, s.a. Rolul proteinelor in celula bacteriana este ,de asemenea, complex si vizeaza atat constructia celulara propriu-zisa (rol plastic), cat si transmiterea

caracterelor genetice( energetic, antigenic, patogenic, enzimatic) etc. Enzimele sunt derivati proteici avand celulele bacterie influentand rol biocatalitic; se formeaza in intracelulare (de exemplu

desfasurarea reactiilor

mitocondriale) si extracelulare (cu rol antigenic, patogenic) sau ectocelulare (avand rol in permeabilitatea selectiva). Avand o specificitate de substrat, de grup si sterica, enzimele din zestrea celulei bacteriene cca. 2000 fac parte din toate clasele ligaze. *C. Bodea tratat de biochimie vegetala, vol. I, Ed. Academica Bucuresti, 1964, clasificarea dupa Conp. V int. Biochimie , 1961 Enzimele pot aparea in fiziologia si metabolismul bacteriilor prin inductie, ele numindu-se enzime inductive, existand numai la comanda si in prezenta inductorilor specifici sau ca o zestre celulara, acestea fiind cunoscute sub numele de enzime constitutive. Glucidele reprezint 15-20% din masa substantei uscate a bacteriilor, in compozitia acesteia fiind cuprinse toate tipurile de glucide: omogene sau neomogene, simple si complexe. Ele sunt foarte importante pentru bacteriile anaerobe pentru care constituie singura sursa de nutritie. Rolul glucidelor in celula 37 de enzime*: oxidoreductaze, hidrolaze, transferaze, liaze, izomeraze,

bacteriana este plurivalent si anume: energetic, structural, antigenic, patogenic sau de rezistenta celulara, etc. Este evident ca ele prezinta importanta capitala ca sursa de energie si ca substanta plastica ce intra in constitutia cvasitotalitara a tuturor partilor morfologice celulare. Ca o caracteristica specifica bacteriilor Grampozitive este prezenta complexului poliglucidic neomogen mureina. Lipidele din bacterii variaza in limite foarte largi in raport cu specia microorganismelor, dar si cu conditiile de mediu (metaboliti, substrat etc.) sau stadiul de maturitate. In general, continutul de lipide este de 2-14% din substanta uscata celulara, dar unele mycobacterii (Mycobacterium tuberculosis Koch)au si mai mult(30%). Lipidele bacterine sunt omogene (acizi grasi, gliceride, ceruri)

si complexe (fosfolipide, lipoproteine, lipogliceni, etc.). Ceea ce-i specific bacteriilor este prezenta in celulele lor, in peretele mycobacteriilor, a acizilor grasi micoici (ac. Tuberculostearic , ac. Dicolipenic , ac. Micocerosic ) componenti ai cerurilor. Pentru bacterii este caracteristica lipsa steridelor (esteri ai alcoolilor policiclici numiti steroli). Totusi in Azobacter chroococcum, fixator de azot, s-a gasit un sterol (Schifferd, Anderson, 1936) cu structura neprecizata. Rolul lipidelor este divers, dar functiile energetice si de permeabilitate par a fi preponderente in fiziologia celulara bacteriana. Lipidele complexe, cum sunt fosfatidele, contin elemente structurale atat hidrofile, cat si lipofile, astfel ca solutiile lor apoase, de natura coloidala, joaca un rol important in reglarea

permeabilitatii celulare. Fosfatidele pot absorbi glucide si protide, care pot fi eliberate dupa nevoie, prin desorbtie. In acest fel, ele pot functiona si ca transportori de substante in celulele bacteriene, iar alaturi de acizii ribonucleici au rol in biosinteza proteinelor. Continutul de substante minerale reprezinta 3-30% din substanta uscata a bacteriilor, acesta variind in functie de specie si de varsta. Rolul substantelor minerale rezida in primul rand din faptul ca formarea compusilor la nivel molecular se face sub forma unor complecsi ce contin obligatoriu elemente minerale sub forma ionica. Acestia (de ex. Ca, Mg) intra in structurile celulare, deci au rol

plastic, ori activeaza sistemele enzimatice (citocromoxidazele cu fier), participa la formarea si transformarile acizilor nucleici (fosforul), regleaza presiunea osmotica celulara si permeabilitatea celulara (sodiul, potasiul, sulful), precum si potentialul de oxido-reducere la nivelul celular, etc. Oligo si microelementele minerale,

38

caracterizate prin reactivitate chimica ori labilitate electronica ridicate, sunt intotdeauna intalnite in celulele bacteriene (de ex. K, Na, Fe, Ca, Mg, S, Cu s.a.). Pentru organismul uman, bacteriile sunt o bogata sursa de vitamine, deoarece ele sunt capabile sa sintetizeze aceasta categorie de substante, cu deosebire vitaminele hidrosolubile din grupul B. Astfel, vitamina B1 (tiamina) este sintetizata de bacterii in oxidarile intracelulare si metabolismul glucidelor, ca de altfel si vitaminele B2 (riboflavina) si B3 (vitamina PP), vitamina B4 (adenina) ce participa in calitate de cofactor in reactiile nucleatidelor. Acidul folic (vitamina B9) este cunoscut ca un factor de crestere pentru mai multe specii de bacterii (B.subtilis, Lactobacillus sp. etc.) fiind cofactor necesar biosintezei compusilor purinici. Cresterea unor microorganisme bacteriene, ca de exemplu Lactobacillus lactis Dorner, nu ar fi posibila fara prezenta vitaminei B12 (ciancobalamina). Vitamina H, acidul para amino benzoic, este denumit si vitamina vietii bacteriilor, deoarece reprezinta pentru acestea un metabolit primar absolut necesar vietii si inmultirii lor ,fiind si un factor de crestere. In functie de specie, bacteriile pot sintetiza pigmenti, ce se intalnesc in celula (bacterii cromofore), legati endocelular de perete, ca in cazul stafilococilor (bacterii paracromofore) sau la exteriorul celulei bacteriene, ca la Pseudomonas, bacteriile din aceasta grupa fiind numite cromopare. Pigmentii pot fi sintetizati pentru un anumit scop (de protectie, ca de exemplu carotenoizii, pentru functia de coenzima in sistemele transmitatoare de electroni si de fosforilare oxidativa, de structura, pentru elementele functionale ale mitocondriilor*, ca factor de crestere pentru unele bacterii) sau pot rezulta din procesele catabolice. * mitos fir; chondros graunte; mitocondrie organit subcelular in care se regaseste sediul fosfonilarii oxidative, absenta la procariote Bacteriile mai pot avea o serie de substante avand rol bactericid sau bacteriostatic asupra altor specii sau chiar impotriva propriei specii (substante purtand numele de bacteriocine).

Metabolismul bacterian

Metabolismul reprezinta totalitatea proceselor biochimice intracelulare prin care substratul nutritiv este transformat in energie si compusi celulari. 39

Metabolismul bacterian este de doua tipuri si anume metabolism energetic, prin care se asigura respiratia bacteriana in reactii catabolice de degradare cu eliberare de energie si metabolism de sinteza care asigur, prin reactii anabolice si catabolice, sinteza componentelor celulei bacteriene. Sursele de energie ale metabolismului energetic pot fi lumina in cazul bacteriilor fotosintetizante si reactiile biochimice de oxido-reducere la bacteriile chimio-sintetizante. Energia poate fi eliberata prin procese de oxidare aeroba, in care intervine oxigenul ce se fixeaza pe substrat si anaeroba, prin procesul de

pierdere a hidrogenului, in absenta oxigenului, care este , de asemenea, un fenomen de oxidare in care se pierd unul sau mai multi electroni (sau sarcini electrice negative) ce sunt acceptati de alta substanta. In ambele situatii se poate discuta despre o respiratie bacteriana oxibiotica (aeroba) si anoxobiotica (anaeroba). Interventia directa a oxigenului in respiratia aeroba elibereaza din substrat o cantitate insemnata de energie (de exemplu, prin oxidarea completa a glucozei de catre bacterii aerobe se obtin in final aproximativ 100 calorii/mol). Germenii anaerobi isi procura energia necesara activitatii lor metabolice prin procese fermentative, in absenta oxigenului, mai ales pe seama glucidelor. In acest caz eliberarea de energie este mai mica, iar descompunerea glucozei se

opreste la stadiul de acid piruvic, alcooli sau acid lactic, cantitatea de energie fiind de aproximativ 50 ml/mol. Descompunerea anaeroba a glucozei are loc intr-un proces de fermentatie in care intervin compusii macroenergici* (superenergetici) ai fosforului (ADP, ATP, DNP etc), proces ce decurge in 11 etape succesive (dupa Mezerhof-Emden) ce vor fi abordate la microbiologia speciala. * makros mare; ergos - actiune Bacteriile folosesc pentru respiratia lor cantitati diferite de oxidanti, astfel ca, in functie de potentialul lor de redox**, ele pot fi clasificate in: strict aerobe cuprinzand bacteriile care folosesc ca sursa energetica O2, motiv pentru care dispun de toate enzimele lantului respirator, catalaza si perozidaza (M. tuberculosis); strict anaerobe ce nu supravietuiesc in prezenta oxigenului, folosesc enzime de tip nicotinic si flavinic si nu au peroxidaza si catalaza; aerobe ce traiesc la un potential redox mai mic, au cantitati mici de peroxidaza si se pot adapta ambelor tipuri de respiratie; acest tip de respiratie este adoptat de 40

majoritatea bacteriilor; anaerobe microaerofile - care contin in cantitati mici catalaze si suporta unitati reduse de oxigen molecular. ** potentialul de oxido-reducere este diferenta de potential dintre un electrod inatacabil (platina, aur, carbune) si un sistem de oxidoreducere care elibereaza electroni. Metabolismul de sinteza reprezinta totalitatea proceselor metabolice cu consum de energie care duc la sinteza unor produse necesare cresterii si

multiplicarii bacteriilor. In functie de modul de procurare a acestor substante, pot fi deosebite 3 tipuri de bacterii: autotrofe* - care isi procura carbonul si aportul din substante anorganice (CO2, NH3-, NO3-); heterotrofe* - la care sursele de C si N provin din surse organice si isi pot sintetiza singure metabolitii esentiali; paratrofe* - ce se dezvolta doar intracelular si nu isi pot sintetiza singure metabolitii esentiali. *gr. autos insusi; trephein a hrani; heteros altul; para alaturi.

4.5 CRESTERA, MULTIPLICAREA SI MOARTEA BACTERIILOR

Bacteriile sunt niste fiinte vii si, astfel, ele cresc, se inmultesc si mor. Acest proces complex nu se refera numai la indivizi, ci si la populatia bacteriana in totalitate. In primul caz biologia cresterii si dezvoltarii este dirijata ereditar, in cel de al doilea aceste fenomene depind cu precadere de conditiile de mediu. Cresterea individului bacterian se caracterizeaza prin adaugarea de protoplasma, ca rezultanta a fenomenelor predominant anabolice in raport cu cele catabolice si are ca efect o crestere a suprafetei si a volumului sau. Intre aceste doua caractere exista un raport strans corelat cu etapa de dezvoltare in care se afla bacteria: pe masura ce bacteria creste, se mareste si volumul sau, in timp ce suprafata sa devine proportional mai mica (ipoteza Leuckart Spencer). Cand acest raport creste in favoarea volumului, celula bacteriana tinde sa se divida, sa se multiplice. Cum aparatul nuclear este activ mai ales in momentul diviziunii celulei, volumul bacteriei creste semnificativ in perioada in care aparatul nuclear este in repaus. Raportul volum/suprafata al bacteriei se schimba in favoarea suprafetei odata ce diviziunea a luat sfarsit, dupa care se pregateste un nou ciclu de crestere.

41

Multiplicarea bacteriilor inseamna cresterea numarului de indivizi intr-un mediu de viata favorabil si se realizeaza prin diviziune. Populatia care rezulta prin diviziunea bacteriilor creste in progresie geometrica cu ratia 2, timpul necesar pentru dublarea populaiei numindu-se timp de dublare sau timp de generatie. In raport cu specia bacteriana, multiplicarea atinge un maximum de populatie care se poate mentine o perioada oarecare dupa care incepe declinul ei. Multiplicarea se petrece in faze succesive. Acestea sunt: - faza de lag* sau faza de ajustare, ce se caracterizeaza prin diminuarea numarului de indivizi care constituie inoculul, prin cresterea dimensiunilor germenilor viabili. *engl. Lag intarziere, captusire Este o faza de acomodare a germenilor la noile conditii de viata. Durata de lag este, in general, apreciata pentru bacterii la aproximativ 2 ore, dar ea este in functie de specia bacteriana, cantitatea initiala de inocul si conditiile de mediu. De exemplu, bacteriile termofile si Escherichia coli au o faza de lag scurta (15-20 minute), in timp ce Mycobacterium are una mai lunga. In faza de lag cantitatea de N-total, P-organic, ARN si O2 consumat cresc. - faza logaritmica (exponentiala) de multiplicare este o faza de crestere rapida, in progresie geometrica, a bacteriilor si se caracterizeaza printr-o serie de manifestari cunoscute sub numele de tinerete fiziologica"; microorganismele sunt mai permeabile si mai sensibile la factorii de mediu. Faza dureaza in medie 2-3 ore (M. tuberculosis). Curba de multiplicare evolueaza exponential pana in momentul in care una din substantele nutritive din mediu este consumata, iar in mediu se acumuleaza metaboliti toxici. Metabolitii consumati si produsi in mediu se numesc factori limitanti. In timpul acestei faze caracterele morfologice ale bacteriilor se omogenizeaza, activitatea si echipamentul enzimatic sunt mai bine dezvoltate, proprietatile biochimice si de metabolism se manifesta la parametrii optimi, rezistenta germenilor la agentii fizici, chimici si biologici devine caracteristica speciei. - faza stationara caracterizata prin faptul ca raportul dintre germenii care se divid si cei care mor ramane relativ constant, astfel incat numarul bacteriilor se stabilizeaza. Faza de stationare este denumita si faza de concentratie M, deoarece in aceasta etapa populatia bacteriana atinge un maximum in cultura. 42

- faza de declin (faza de moarte logaritmica) este etapa in care numarul germenilor morti intrece numarul germenilor vii, deoarece consumarea substratului nutritiv si acumularea de metaboliti toxici duc la moartea majoritatii bacteriilor, iar timpul de generatie creste la cateve zile; celulele vii imbatranesc, nu-si mai pastreaza caracteristicile, speciile patogene isi pierd patogenitatea si virulenta. In aceasta faza apar tendintele de sporulare. Ea nu este valabila in cazul culturilor bacteriene continue, caracterizate prin reinnoirea continua a substratului nutritiv si prin recoltarea de asemena continua a germenilor in faza exponentiala. Culturile

continue se fac in scopuri productive si prezinta o deosebita importanta industriala, biotehnologica in domenii de activitate de mare importanta economica si sociala. In fapt, cultura bacteriana este rezultatul inmultirii, cresterii numarului de germeni, intr-un mediu favorabil formandu-se o populatie avand caractere asemanatoare. Aspectul culturii bacteriene depinde de specia, varsta indivizilor precum si de mediul de cultura. Mediile de cultura bacteriana pot fi: artificiale, create in scopul asigurarii tuturor conditiilor pentru dezvoltarea si multiplicarea indivizilor si naturale (vii), avand provenienta animala (ou embrionat, animale de experienta, tesuturi animale, culturi celulare, sange etc.) si vegetala (culturi celulare, meristeme, parti din plante s.a.). Culturile bacteriene pot fi studiate in vitro pe medii de cultura artificiale sau in vivo direct pe mediile naturale, mai ales pentru germenii patogeni. Culturile bacteriene se dezvolta pe medii artificiale lichide si solide. Primele determina aparitia dupa o perioada de 18-20 ore a unei turbiditati (tulbureli) ce poate fi omogena, datorata germenilor de varsta tanara, cu vigoare ridicata care disperseaza uniform si rapid in mediu, denumita culturi S (smooth netede) sau neomogena, cu grade de turbiditate diferite si uneori chiar limpezi dar cu depuneri pe vasele de cultura sau valuri de suprafata, purtand denumirea de culturi R (rough rugoase). Culturile de medii solide sunt obtinute prin insamantarea germenilor bacterieni rezultati din multiplicarea unei singure celule bacteriene si se numesc colonii de culturi pure sau culturi clonare. Colonia bacteriana reprezinta cultura pura aparuta dupa un timp de multiplicare de 2 - 6 ore, n care, din punct de vedere genetic, indivizii sunt identici.

43

Dupa aspect, coloniile pot avea o forma geometrica regulata sau neregulata, conturate sau difuze, colorate sau necolorate, lucioase sau rugoase, limpezi, opace sau semimate, cu sau fara caracteristici specifice speciei. Coloniile - S au aspect lucios, cu margini conturate, forma rotunda sau ovoidala, diametru 1-2 mm, consistenta onctuoasa. Coloniile - R au suprafata aspra, forme cu margini neregulate, crenelate, uneori difuze in mediul de cultura, in general colorate si mate. Coloniile - M sunt variante ale tipului S dar contin germeni cu capsula si au o consistenta gelatinoasa sau mucilaginoasa, prezentand tendinta de a difuza in mediu sau de jonctiune intre ele. Coloniile - G sunt colonii pitice obtinute din germeni normali dar afectati de interventii exterioare (ex. antibiotice, antiseptice, carente nutritionale, etc.). Coloniile bacteriene se deosebesc intre ele prin anumite caracteristici de cultura, care, singure sau impreuna, constituie criterii de departajare. Astfel, diametrul coloniei bacteriene imparte coloniile in mari cele care au diametrul mai mare de 2 mm, mijlocii si mici coloniile cu diametrul sub 1 mm. O alta caracteristica este transparenta coloniilor. Sub acest aspect exista colonii translucide, ca cele date de streptococi si opace, caracteristice, in general, coloniilor de stafilococi. In functie de proprietatea de a produce pigmenti, bacteriile pot fi pigmentogene (cromogene), daca produc pigmenti, caz in care: a)se coloreaza doar colonia (cazul bacteriilor cromofore si paracromofore) de exemplu coloniile stafilococice colorate in alb, galben, auriu si b) se coloreaza si mediul, fiind cazul bacteriilor cromopare la care pigmentul este eliberat in exteriorul celulei ca de exemplu bacilul piocianic care sintetizeaza si elibereaza in exterior doi pigmenti: piocanina albastra si pioverina verde. Alte caracteristici ce pot constitui criterii de identificare a coloniilor bacteriene, prezentate si anterior sunt: forma coloniei, rugozitatea coloniei, consistenta, forma conturului marginal, etc.

44

4.6 CULTIVAREA BACTERIILOR

Pentru identificarea unei specii bacteriene, examenul microscopic direct este de cele mai multe ori insuficient, fiind necesara cultivarea agentului patogen pe un complex de substante nutritive adecvate care alcatuiesc mediile de cultura.

Aceste medii de cultura, pentru a fi corespunzatoare, trebuie sa indeplineasca cateva conditii: sa contina substante plastice si energetice necesare cultivarii microbului insamantat, adica sa asigure surse de azot, de hidrati de carbon, de saruri minerale, de apa, de vitamine si factori de crestere necesari dezvoltarii si reproducerii celulelor bacteriene, sa satisfaca cerintele de aerobioza sau anaerobioza ale agentului tinand cont de faptul ca, in timp ce bacteriile aerobe pot folosi oxigenul molecular, cele anaerobe nu se pot dezvolta in prezenta oxigenului liber, sa aiba o concentratie de ioni de hidrogen (pH) optima si sa fie sterile, pentru a permite izolarea in cultura pura a germenului respectiv. Pe masura cunoasterii tot mai aprofundate a exigentelor unei bacterii s-a ajuns la ralizarea unor medii de cultura cu o compozitie adecvata si precisa. In unele cazuri chiar s-a ajuns la situatia optima de preparare a unor medii sinteticestandardizate, nemaifiind necesare ingrediente de origine animala sau vegetala a caror compozitie poate varia foarte mult. In general, mediile de cultura se pot prezenta sub forma lichida (bulion, apa peptonata, etc.) sau solida (medii in care se incorporeaza agrar). In functie de scopul urmarit, mediile de cultura pot fi grupate astfel: medii de izolare, care permit izoalrea bacteriei dintr-un produs patologic; medii de transport, care permit supravietuirea anumitor bacterii ce nu pot fi insamantate imediat dupa recoltare (de exemplu, mediul Stuart pentru Neisserii, Carry-Blair pentru vibrionul holeric, etc.) medii de imbogatire, destinate cultivarii unor bacterii cu necesitati nutritive particulare si care sunt stimulate sa creasca in mod special, deoarece numarul lor este redus in produsul in momentul recoltarii (de exemplu, mediul Muller-Kauffmann pentru salmonele); medii selective, care contin elemente ce permit cresterea numai a anumitor bacterii dintr-un produs (de exemplu, mediul Wilson-Blair pentru bacilul tific); 45

 medii diferentiale, care contin substante ce pun in evidenta unele proprietati biochimice ale bacteriilor studiate. La randul lor, mediile diferentiale pot fi simple (de exemplu, mediul AABTL care pune in evidenta fermentarea lactozei) sau politrope (de exemplu, mediul TSI care pune in evidenta mai multe caractere biochimice). In tehnica prepararii unui mediu nutritiv trebuie sa se aiba in vedere urmatoarele: spalarea si pregatirea corespunzatoare a recipientelor in care se vor prelucra si repartiza mediile; trebuie ca mediile sa fie clare, pentru a se putea urmari aspectul culturii in mediile lichide (modul de tulburare a bulionului) sau morfologia coloniilor pe mediile solide; clarificarea se obtine printr-o filtrare corecta; substantele organice care intra in compozitia mediului trebuie sa aiba calitati nutritive optime si sa nu fie degradate prin tratament chimic sau termic excesiv. Altfel, substratul respectiv devine necorespunzator. La baza mediilor de cultura de origine animala, maceratul de carne este componentul principal. Carnea folosita la prepararea acestuia trebuie sa provina de la vite sanatoase. Maceratul de carne se prepara astfel: carnea proaspata de vita sau de cal se curata de tendoane, aponevroze si de grasimi si se trece prin masina de tocat. La 1000g tocatura se adauga 2000ml apa de robinet si se tine 24 ore la rece (vara la frigider), dupa care se fierbe 30 min., amestecand cu o lopatica de lemn. Se filtreaza apoi prin tifon. Se completeaza cu apa distilata la volumul initial. Maceratul nu se foloseste ca atare, ci serveste la prepararea altor medii. Daca se foloseste imediat, nu se sterilizeaza. Daca se pastreaza in depozit, atunci se sterilizeaza 30 min. la 120oC. Bulionul simplu se prepara astfel: la 1000 ml macerat se aduga 10 g peptona, 5 g sare si se incalzeste pana la fierbere. Se ajusteaza pH-ul la 8, folosind o solutie de hidroxid de sodiu 10%, dupa care se sterilizeaza 30 min. la 120oC pentru precipitarea sarurilor alcalinoteroase. Pentru indepartarea

precipitatului, mediul se filtreaza la cald prin hartie de filtru si se repartizeaza bulionul obtinut in recipiente adecvate intrebuintarii (eprubete sau flacoane) si se sterilizeaza din nou 30 min., dar la 115oC, pentru a nu precipita alte saruri din solutie. 46

La fiecare sterilizare, pH-ul mediului scade cu valori de 0,2. Maceratul de carne poate fi utilizat si la prepararea gelozei simple. Geloza sau agarul se extrage dintr-o alga, este lipsita de substante nutritive si serveste numai la solidificarea mediului. Ramane solid la 37oC, permitand obtinerea de colonii microbiene izolate. Se topeste la 80oC, ramane in stare lichida pana la 45oC si se solidifica la 40oC. La 1000 ml macerat de carne se adauga 10 g peptona, 5 g sare, se dizolva la cald si se adauga apoi 20 g geloza spalata. Pentru spalare, geloza fibre, impaturita intr-un tifon, este lasata cateva ore in apa rece curgatoare. Bulionul cu agar se tine pe foc la fierbere, agitandu-se pana la completa topire a agarului. Se completeaza la volumul initial cu apa distilata, se ajusteaza pH-ul la 8, se sterilizeaza 30 min. la 120oC, dupa care se filtreaza la cald prin hartie de filtru. Se repartizeaza in recipiente adecvate si in eprubete si se sterilizeaza din nou 30 min. la 115oC. Dupa sterilizare, geloza din eprubete poate fi solidificata in pozitie verticala sau prin inclinare. Bulionul simplu si geloza nutritiva simpla se utilizeaza ca mediu de baza pentru prepararea unor medii mai complexe sau ca atare pentru cultivarea germenilor care nu au cerinte nutritive deosebite. Apa peptonata simpla. Se prepara prin dizolvare la cald a 10 g peptona si 5 g ClNa in 1000 ml apa distilata. Se ajusteaza pH-ul la 7,6 cu solutie 10% de NaOH dupa care se autoclaveaza la 120oC timp de 30 min. pentru precipitare. Se filtreaza prin hartie de filtru, se repartizeaza in tuburi sau baloane, dupa necesitati si se sterilizeaza la 115oC timp de 20 min. - pH final: 7,2 - 7,4. Apa peptonata se utilizeaza fie ca mediu de baza pentru testele de

fermentare ale zaharurilor si alcoolilor, fie pentru testele de producere de indol sau H2S. Geloza sange. Se prepara din geloza nutritiva 2% lichefiata si racita la 45oC. La 9 ml geloza se adauga 0,5 - 3 ml sange defibrinat. Se utilizeaza penru cultivarea unor germeni mai pretentiosi (streptococ) sau pentru punerea in evidenta a capacitatii de hemoliza a unora dintre acestia (streptococ, stafilococ). Mediul Veillon. Se prepara dintr-o geloza nutritiva 2% la care se adauga glucoza in proportie de 1 la mie. Se repartizeaza in tuburi, se sterilizeaza 30 min. la 110oC si se solidifca in pozitie verticala - pH final 7,6. Este mediul cel mai simplu

47

utilizat pentru izolarea germenilor anaerobi. Se insamanteaza produsul patologic in profunzimea mediului lichefiat prin incalzire urmata de resolidificare prin racire. Mediul Sabouraud solid se prepara din 1000 ml apa de robinet, 10 g peptona, 20 g glucoza si 20 g agar de fibre. Se dizolva peptona in 250 ml apa la fierbere, se autoclaveaza 30 min. la 120oC si se filtreza.. Se amesteca cele doua solutii filtrate, se completeaza cu apa pana la 1000 ml si se adauga agarul spalat. Se fierbe pana la topirea agarului, se filtreaza prin tifon, se repartizeaza dupa necesitati si se sterilizeaza la 110oC timp de 30 min. - pH final 5,8 - 6,2. Un mediu similar lichid se poate prepara din aceleasi ingrediente minus agarul. Aceste medii se utilizeaza pentru izolarea si cultivarea ciupercilor microscopice. Stabilirea si corectarea pH-ului mediilor de cultura este de o importanta deosebita pentru cultivarea microorganismelor. Este cunoscut faptul ca prin autoclavare pH-ul mediului scade. Pentru acest motiv sunt necesare operatiunile de control si corectare a pH-ului. Determinarea pH-ului se poate face prin metoda electrometrica cu ajutorul unui pHmetru, care este foarte precisa, dar cand nu dispunem de aparatura necesara se poate utiliza metoda colorimetrica. Aceasta din urma se bazeaza pe proprietatea unor substante numite indicatori, de a-si modifica culoarea sau nuanta in functie de gradul de aciditate sau alcalinitate al solutiei in care sunt dizolvate. Principiul metodei consta in compararea culorii solutiei de cercetat in care s-a introdus un indicator, cu o serie de etaloane colorate. Practic, aparatul este compus dintr-un comparator Walpole (stativ cu locuri pentru eprubete si orificii de observare prevazute cu geam mat) si o scara de etaloane numita Scara Michaelis. Etaloanele sunt tuburi de sticla care contin solutii indicator. In locurile 1, 2 si 3 ale comparatorului Walpole se introduc tuburi de aceeasi grosime cu tuburile etalon din Scara Michaeelis. In tuburile 1 si 2 ale comparatorului se pun cate2 ml mediu. In tubul 1 se mai pun 4 ml apa distilata si 1 ml metanitrofenol 0,3% iar in tubul 2 sa adauga numai 5 ml apa distilata. In tubul 3 se pun 7 ml apa distilata iar in locul 4 se pune un tub etalon din Scara Michaelis. Privind apoi prin cele doua orificii laterale, comparam culoarea mediului cu indicator cu aceea a etalonului. Daca nu se potriveste, se schimba tubul etalon cu altul pana cand prin tuburile 1 si 3 vedem aceeasi culoare ca si prin tuburile 2 si 4. Mediul cercetat are pH-ul care este scris pe tubul etalon respectiv.

48

In scop orientativ se poate utiliza metoda rapida a hartiei indicator care, umectata cu solutia de cercetat isi modifica culoarea, dupa care este comparata cu o scara etalon colorata. Dupa verificarea pH-ului mediului de cultura, daca este necesar se ajusteaza cu o solutie de NaOH sau HCl pana la obtinerea unui pH corespunzator.

INSAMANTAREA MEDIILOR DE CULTURA

Multiplicarea si izolarea germenilor este posibila prin insamantarea pe medii de cultura adecvate, sau, in special pentru virusuri, dar si pentru unele bacterii, prin inoculare in tesuturi vii (culturi de celule, oua embrionate, animale de laborator susceptibile). Insamantarea sau inocularea prelevatelor aduse in laborator se face in mod adecvat si cu luarea unor masuri speciale fie pentru evitarea contaminarii personalului care efectueaza operatiunea respectiva si care, mai ales in aceasta faza de lucru cand nu se cunoaste agentul patogen, trebuie sa respecte cu strictete normele de protectia muncii, dar mai ales pentru impiedicarea contaminarii produsului patologic cu agenti microbieni din exterior care nu au nici o legatura cu boala si care pot falsifica rezultatele. Insamantarea produselor patologice se executa in camere de laborator (boxe) cu materiale sterile (medii, placi, tuburi, anse, pipete Pasteur sau gradate, tampoane, etc.) in spatiile sterile din jurul flacarii becului de gaz, si cu recipiente cu substante dezinfectante (ex. amestec sulfo-cromic) si galeti de infecte la indemana. In situatii speciale, cand se banuieste prezenta in produsul patologic a unor agenti microbieni deosebit de periculosi (HIV, virus rabic, etc.) nu trebuie sa lipseasca masca, manusile si ochelarii de protectie, iar manipularea produsului in cursul insamantarii sau inocularii se va face cu o grija deosebita pentru a se evita accidentele care in aceste cazuri sunt de regula fatale. In general, insamantarea se face fie cu ansa bacteriologica ce se sterilizeaza la flacara in timpul lucrului, fie cu pipete Pasteur sau gradate ori cu tampon de vata montat pe o tija, toate in prealabil sterilizate.

Tehnici curente de insamantare a mediilor lichide sau solide 49

Insamantarea in medii lichide

Tehnica insamantarii cu ansa bacteriologica. Ansa cu firul inrosit in flacara se introduce in recipientul ce contine prelevatul, se raceste alipind-o de peretele recipientului, apoi se ia o portiune din produs. Se scoate dopul recipientului cu mediu si se flambeaza gura acestuia. Materialul luat pe bucla ansei din prelevat este introdus in mediul din recipientul deschis sub protectia flacarii. Se descarca ansa pe peretele recipientului, agitand usor lichidul, se flambeaza din nou gura recipientului si dopul cu care apoi se astupa recipientul. Dupa insamantare, ansa se sterilizeaza din nou prin incalzire la rosu. Tehnica insamantarii cu pipeta. Daca se lucreaza cu pipeta gradata, aceasta se scoate din ambalajul steril si se introduce rapid in flacara atat capatul cat si toata lungimea ei. Se controleaza apoi racirea ei prin flambare. Daca se lucreaza cu pipeta Pasteur, se rupe varful efilat al pipetei, dupa care se flambeaza capatul. Pipeta flambata si racita se introduce in recipientul cu produsul prelevat si se aspira de la cateva picaturi pana la 1 sau mai multi ml, in raport cu materialul de insamantat si cantitatea de mediu de cultura. Pipeta trebuie manipulata cu grija pentru a nu uda dopul de vata. Materialul aspirat in pipeta se insamanteaza in recipientul cu mediu nutritiv cu aceleasi precautiuni de flambare a gatului recipientelor si a dopurilor respective. Pipeta folosita se pune intr-un pahar cu amestec sulfo-cromic, aspirandu-se din amestec pana la aproximativ 1 cm sub dop. Tampoanele care au servit la recoltarea produselor patologice vor fi descarcate direct in mediu, dupa care vor fi introduse in tub si puse in galeata de infecte.

Insamantari pe medii solide

50

Tehnica insamantarii in suprafata. Insamantarea pe suprafata mediilor mediilor solide se poate face cu ansa. Cu bagheta de sticla indoita sub forma de L, cu tampoane, cu pipete, etc. In cursul insamantarii se iau aceleasi precautiuni pentru pastrarea sterilitatii ca si la operatiunile de insamantare in medii lichide. Cand se insamanteaza medii care au fost solidifacte in tuburi, in pozitie inclinata, se executa pe suprafata mediului miscari in zig-zag, de la baza catre exterior, cu precautia de a nu zgaria suprafata mediului. In cazul mediilor solidificate in coloana dreapta, insamantarea se face prin intepare in profunzime. In placi Petri, in care s-a turnat un strat de mediu gelozat, insamantarea se poate face cu ansa, cu bagheta de sticla sau cu tamponul de recoltare. Placa se tine in apropierea flacarii iar operatiunea de insamantare trebuie executata rapid pentru a se evita patrunderea altor microorganisme din exterior. Tehnica insamantarii prin incorporare. Se lichefiaza mediul prin incalzire la 80 C, se raceste la 50oC si se introduce produsul de insamantat cu o pipeta sterila. Se omogenizeaza prin usoara rotire a recipientului. Mediul astfel insamantat se toarna dupa caz, in placi Petri sterile, sau se lasa ca atare in recipientul in care s-a facut insamantarea.
o

Tehnici de insamantare cu izolarea agentului microbian in cultura pura

Acestea urmaresc obtinerea dintr-un produs bacterian, in general cu continut polimicrobian, a agentului etiologic, izolat in cultura pura. Debarasarea de celelalte specii microbiene de balast care alcatuiesc flora de asociatie se realizeaza prin diferite metode care pot actiona fie direct asupra florei de asociatie, inhiband-o in dezvoltarea ei, fie indirect, actionand asupra germenului pe care dorim sa-l izolam, favorizandu-I acestuia, in mod cu totul preferential, dezvoltarea. Tehnicile de izolare in cultura pura pot fi generale sau speciale. Tehnicile generale mai frecvent utilizate sunt de dilutii succesive in medii lichide sau de epuizare pe medii solide. Tehnica dilutiilor succesive in medii lichide. In acest scop se utilizeaza un sir de epprubete cu aceeasi cantitate de mediu lichid. Se introduce, cu o pipeta, o picatura din amestecul de germeni in primul tub. Se agita continutul eprubetei.

51

Apoi, schimbandu-se pentru fiecare eprubeta pipetele, se trece succesiv dintr-o eprubeta in cealalta cate o picatura. Aceasta tehnica se completeaza cu efectuarea de treceri pe medii solide: din fiecare tub insamantat se trece, de fiecare cu o alta pipeta, cate o picatura, pe cate un tub sau o placa cu geloza. Aceasta tehnica a dilutiilor succesive se poate face si in lichidul de condensare al mediilor solide, urmand aceeasi metodologie. Tehnica epuizarii ansei pe medii solide se realizeaza prin insamantari cu ansa bacteriologica, incarcata o singura data cu amestecul de germeni, intr-un sir de eprubete cu geloza inclinata, fara a steriliza sau a reincarca ansa bacteriologica pe parcurs. Astfel se epuizeaza continutul ansei si, in final, se ajunge sa se insamanteze numai cateva celule microbiene intr-un tub care prin incubare la termostat vor da nastere la colonii microbiene izolate. O astfel de colonie trecuta (replicata) pe un alt tub cu mediu, dupa incubare da nastere la o cultura pura. Tehnica diseminarii (dispersiei) cu ansa pe medii solide. Cu ansa bacteriologica incarcata cu produsul patologic se descriu pe suprafata unui mediu solid, turnat intr-o placa Petri, niste striuri paralele. Dupa descrierea fiecarui grup de striatiuni paralele, ansa bacteriologica va fi sterilizata prin incalzire la incadescenta si nu va fi incarcata cu inoculul amestec decat o singura data la inceput. In momentul intersectarii cu striurile precedente, ansa este reincarcata cu o cantitate de inocul, dar o cantitate din ce in ce mai mica, pana ce se va ajunge la cateva celule microbiene izolate ce vor fi diseminate pe placa si vor da nastere la colonii microbiene izolate. Tehnici speciale de izolare. Sunt utilizate cand urmarim izolarea anumitor specii bacteriene dintr-un produs polimicrobian. Ele se realizeaza cu diverse mijloace fizice, chimice sau biologice. Dintre mijloacele fixe, de izolare, mentionam incalzirea o ora la 80oC, a amestecului de germeni, care se practica pentru a izola germenii sporulati de formele vegetative de microbi. De asemenea, filtrarea printrun filtru bacteriologic permite izolarea unui virus ce strabate porii filtrului, dintr-un amestec cu bacterii ce sunt retinute de acesta. Ca metode chimice mentionam: mediile de cultura selective care contin un agent inhibitor pentru flora de asociatie (mediul Lowenstein care contine verde malachit inhiba flora de asociatie si permite izolarea bacilului Koch); mediile elective care contin un substrat nutritiv ce, convenind preferential speciei ce dorim 52

sa o izolam, permite dezvoltarea sa mai rapida (mediul Loffler electiv pentru bacilul difteric) si mediile diferentiale care permit relevarea unor caractere enzimatice proprii germenilor vizati de a fi izolati din amestec (mediul Istrati-Meitert utilizat in izolarea dintr-o coprocultura a unor enterobacterii lactozo pozitive sau negative). Ca metode biologice de izolare mentionam metoda de insamantare pe medii cu agenti biologici selectivi, deci utilizarea de medii selective pe baza de antibiotice (mediul selectiv LCN pentru izolarea meningococului care contine Lincomicina, Colimicina si Nistatin), si utilizarea unor animale de laborator pentru izolarea unor specii bacteriene dintr-un amestec - de exemplu, inocularea subcutanata a soarecelui alb cu o sputa in care se gaseste un pneumococ. Dupa 1-4 zile de la inoculare, soarecele face o infectie septicemica letala cu pneumococ, putandu-se izola in cultura pura acest germen din sange. Un alt exemplu il constituie inocularea subcutanata la un cobai a unui produs patologic in care se gaseste bacilul Koch. Din viscerele acestui cobai dupa un interval variabil de timp, 1-6 luni, se va putea izola, in cultura pura, bacilul Koch. Metoda izolarii unui singur microb prin micromanipulare se poate realiza cu ajutorul unui micromanipulator, a unei aparaturi speciale si a unor

microinstrumente (pipete, anse, pense, seringi, etc.) dar metoda nu este de uz curent, ea fiind utilizata exclusiv in scop de cercetare.

4.7 ELEMENTE SI NOTIUNI INTRODUCTIVE DE GENETICA BACTERIANA

Genetica este stiinta care se ocupa cu ereditatea* si variabilitatea materiei vii. Legile geneticii, ale ereditatii si variabilitatii, sunt aceleasi pentru toate fiintele, dar pot infatisa aspecte particulare in raport cu gradul de dezvoltare, de organizare a acestora. * lat. hereditas mostenire; notiunea de ereditate a fost introdusa de H. Spencer (1863) pentru a indica asemanarile dintre parinti si urmasi.

Ereditatea nu este o proprietate invariabila, premanenta, ci se supune legilor generale ale dezvoltarii in care confruntarea dintre stabilitatea caracterelor si tendinta de schimbare este permanenta, avand drept consecinta aparitia 53

indivizilor care ii indeparteaza de exemplarul de origine tipic, cunoscuti sub denumirea de mutante (mutanti). Toate fiintele vii, inclusiv virusurile, bacteriile, fungii, indiferent de originea lor, vegetala sau animala, au o capacitate diferita de variabilitate in raport cu potentialul lor mutagen.

Intre genetica microbiana si genetica fiintelor superioare se pot evidentia unele deosebiri pe care le vom arata in continuare:

a) microorganismele isi asigura descendentii numai pe linie verticala determinand ceea ce se cunoaste sub numele de clone, ca urmare a mutatiilor si a haploidei* ca un fenomen al asexualitatii lor; la fiintele superioare are loc un proces sexual constand din fuziunea completa a doi genomi** proveniti de la o celula mascul si una femela ce da nastere la un zigot***; desi exista procese cu aspect sexual si la unele bacterii, acestea se diferentiaza de cele ale fiintelor superioare deoarece celula bacteriana donatoare lasa, de obicei, numai o parte din genomul sau celulei primitoare, fenomen cunoscut sub numele meromixis, genomul

integrat celulei primitoare fiind denumit endogenot iar fragmentul partial al celulei donatoare, exogenot; din acest motiv celula descendenta este diferita in raport cu cele din care a provenit; * grec. haplos simplu, jumatate; eidos forma; haploidul este o celula somatica care poseda in nucleu un numar impar de cromozomi; haploidia este un fenomen care implica haploizii si totodata un procedeu de a obtine genotipuri homozigote la fiinte superioare. ** grec. genos urmas; genom, termen indus de Winkler (1920) pentru a defini setul complet de cromozomi mostenit ca o unitate de la un parinte. *** grec. zygos a uni, a impreuna: zigot celula diploida rezultata din fuziunea prin fecundarea unui gamet femel cu un gamet mascul, din care se dezvolta embrionul; grec gametes gamet celula sexuala matura b) la bacterii, cromozomul recombinat este un cromozom nou, in care endogenotul si exogenotul este integrat, in timp ce la fiintele superioare cromozomul se formeaza prin schimb reciproc de segmente.

54

In cele ce urmeaza se vor sintetiza si sistematiza principalele aspecte, notiuni si metode referitoare la genetica bacteriana. Asadar, dupa cum s-a amintit mai inainte, zestrea genetica a unei bacterii reprezentate printr-un set complet de cromozomi o constituie genomul bacterian si este organizat nuclear (cromozomul) si extracromozomial, ambele materiale genetice asigurand ereditatea, capacitatea de a transmite descendentilor caracterele distinctive de specie. Potentialul genetic, reprezentand informatia genetica a unei bacterii, poarta denumirea de genotip, iar a celor exprimate, pentru ca nu toate caracterele genetice potentiale se pot exprima real, se numeste fenotip.

Cromozomul bacterian, materialul nuclear al genomului, este compus din mai multe componente si anume: un ADN (acid dezoxiribonucleic) cu doua antene si structura helicoidala (dublu helix), care detine informatia pentru functiile vitale ale celulei (nucleul are un singur cromozom si un singur ADN, celula fiind haploida si nu este invelit de membrana nucleara); gena, o unitate elementara a ereditatii localizata in cromozom, asezata in lant de-a lungul cromozomului si care codifica informatia ce controleaza sinteza, functia si specificitatea unei enzime; cistronul, un segment de ADN care codofica informatia necesara pentru sinteza unei enzime (a unui lant polipeptidic) continand cca. 1500 perechi de nucleotizi aranjate liniar; codonul, reprezentand unitatea morfologica corespunzatoare unei secvente din trei nucleotizi dintr-un cistrom care codifica includerea (sau neincluderea) unui aminoacid intr-un lant polipeptidic*.

*limbajul in care informatia genetica este codificata in ARNmesager considera bazele azotoase adenina-A, guanina-G, citozina-C, timina-T si uracilul-U ca fiind litere care sub forma unei secvente de 3 nucleotizi de baze azotoase formeaza cuvintele; citirea se face succesiv, in grupe de 3 baze, intotdeauna de la capatul genei si in acelasi sens. Codonii pot fi de trei categorii: cu sens, cand specifica aminoacidul ce trebuie inclus in lant, gresit (missens), cand arata un alt aminoacid in locul celui necesar si nonsens, daca nu specifica aminoacizii, dar codifica semnalul stop la implantarea lantului polipeptidic. 55

Acizii nucleici contin in molecula azotoase pirimidice (de obicei citozina si guanina precum si ambele forme de acizi nucleici), un zahar (D-riboza si respectiv 2-dezoxi-Driboza), acid fosforic sub forma unor saruri de Mg, Ca, s.a.

Materialul genetic extracromozomial detine informatii neesentiale, care se pot pierde fara a afecta viabilitatea celulei dar contribuie la variabilitatea bacteriana. El se compune din plasmide si segmente genetice transpozabile continand ADN sub forma de secvente scurte sau mai lungi, care prin inserare in cromozom provoaca succesiunea bazelor azotoase.

Plasmidele se diferentiaza in: plasmide propriu-zise (cu control relaxat), care confera rezistenta la antibiotice, sunt libere in citoplasma si se inmultesc autonom de genofor dar nu se transfera dintr-o celula in alta (neconjugative) si episomii** (cu control strict), elemente genetice neesentiale formate din molecule circulare continand cateva mii de perechi de baze. In celula pot exista in doua stari alternative autonomi in citoplasma sau inserati in cromozomi. **grec. epi pe; soma corp (Thomson, 1931) De fapt, episomii pot fi considerati niste minicromozomi ce pot favoriza conjugarea si recombinarea naturala. Plasmidele propriu-zise sunt de mai multe tipuri: (a) Factorul R, ce detine mai multe gene ce codifica rezistenta la antibiotice (din care una RFT este capabila de a transfera rezistenta, chiar in lipsa factorului F); (b) Factorul F, independent de citoplasma; (c) Factorul COL, ce detine informatii pentru sinteza unor compusi cu actiune antibacteriana (colicine). Episomii sunt plasmide cu control strict si se gasesc in stare autonoma, libere in citoplasma, cand se pot inmulti indepndent de genofor si in stare integrata intr-un anumit punct in genofor, replicandu-se simultan cu genoforul. Episomii au mai multe functiuni si au denumiri ce provin din functia detinuta: Factorul F (Fertility), continand 11 gene, ce codifica sinteza unor componente ale unor pili sexuali, (el putand fi de tip mascul F+ , donator si de tip femel F- , primitor); Factorul Hfr (high frequency recombination), care ofera o frecventa de recombinare de sute de ori mai ridicata ca a factorului F, pe care il contine; Factorul Ti (tumour inducing), agentul inductor al convertirii celulei normale in 56

celula tumorala (gasit prima oara in 1907 de Smith si Townscad in bacteria Agrobacterium tumefaciens); Bacteriofagul, virulent si/sau temperat, cu

proprietatea de a distruge bacteriile prin adsorbtia la suprafata celulei susceptibile, distruge, prin dizolvare, membrana celulara si infecteaza, prin pedicel* ADN-ul specific in bacterie; Factorul Vhf (very high frequency of recombination), are calitatea, in opozitie cu factorul Hfr , de a transfera, cu o frecventa mult mai mare, markerii terminali ai cromozomului, etc.

Ereditatea reprezinta asadar, dupa cum s-a aratat anterior, mentinerea caracteristicilor semiconservativa. de specie a ADN-ULUI cromozomial prin replicare

Variabilitatea biologica reprezinta, in cazul bacteriilor, aparitia unor modificari in celulele fiice, de lunga sau de scurta durata ori definitive. Asadar, variabilitatea biologica poate aparea sub influenta unor conditii de mediu, fiind limitata de genotipul existent si denumindu-se fenotipica**. **grec. phainen a aparea; typos chip, imagine; fenotipul reprezinta totalitatea unui organism la un moment dat (Johannsen, 1909), fiind rezultatul dintre genotip si mediu. In acest caz, ea este de scurta durata si reprezinta totalitatea variatiilor biologice, fiind alcatuita din variatia mediului, provocata de influentele factorilor de mediu si variatia genetica. Daca variabilitatea este rezultatul exclusiv al genelor segregate, al interactiunii si efectului aditiv al actului genelor, ea se numeste variatie (varianta*) genetica si se transmite in descendenta prin replicare, fiind definitiva. *lat. variare a schimba; variatia reprezinta suma patratelor abaterilor de la media aritmetica si se simbolizeaza cu s2 Notand cu urmatoarele simboluri: VB - variabilitatea biologica, cu VM variabilitatea mediului, VG variabilitatea genetica, atunci: VB = VM + VG sau VG = VB - VM Proportia din variabilitatea totala care este controlata de ereditate, in special cea determinata de genele multipla cu efecte aditive (VA) se numeste heritabilitate

57

(H sau h2) si se defineste ca fiind raportul dintre variatia genetica aditiva (VA) si variatia biologica:

h 2 = VA VB =VA VG + VM

Mutatiile, care presupun modificarea secventei bazelor azotoase, astfel incat numarul celulelor descendente difera de cel al celulelor mama, apar in perioada de diviziune celulara exponentiala, din cauza ritmului foarte rapid de crestere in timpul autoreplicarii. Celula care a suferit mutatia se numeste mutant. Mutatiile pot fi spontane, ce apar ca greseli de copiere in timpul autoreplicarii, datorita vitezei de autoreplicare, sau induse de catre factori inductori (agenti mutageni), ce pot fi fizici (radiatii u.v., X, gamma, etc.), chimici (ex. aminopurina) si biologici (de ex. gene supresor non sens care permit inserarea unui aminoacid in lantul polipeptidic al mutantului). Schimbarile ce pot aparea in cursul mutatiilor sunt variate, multiple si de multe ori imprevizibile deoarece actioneaza intr-un lant polimolecular cu sute si mii de secvente diferite, prin inlocuirea, inserarea, surprinderea sau inversarea ordinii bazelor azotoase.

Transferul si recombinarea genetica este cea de a doua cale de a obtine mutanti, prin care, o celula donoare face transfer de material genetic la o celula receptoare, prin transmiterea unor fragmnte de ADN sau al intregului genom al celulei donoare la celula receptoare. Transferul si recombinarea genetica pot fi realizate prin trei modalitati: transformare, transductie si conjugare, pe care le vom descrie in continuare. In cazul transformarii, mutantul preia ADN-ul din cromozomul donorului, in starea fiziologica numita starea de competenta, in care ADN-ul transformat strabate peretele si membrana plasmata. Este un mecanism genetic care determina, de exemplu, rezistenta la antibiotice. Transductia este un fenomen descoperit de Zinder si Lederberg in 1952, care consta in transmiterea caracterelor de la o cultura bacteriana la alta cu ajutorul bacteriofagului, prin inocularea ADN-ului acestuia in celula bacteriana. Dar transductia poate avea loc si dupa urmatorul scenariu: bacteriofagul poate ramane intr-o stare neinfectioasa (stare de profag) cand se fixeaza de cromozomul bacteriei si se divide sincron cu aceasta, comportare numita lizogenie. Genele 58

bacteriene pot fi transferate de la o celula la alta de catre fagii nevirulenti (temperati), caz in care au fost denumiti si fagi transductanti. In fine, cea de-a treia metoda de transfer si recombinare genetica o constituie conjugarea*, care reprezinta un proces ce determina unirea (sinapsa) unor cromozomi in meioza** de la materialul donor la acceptor prin episomi F+ si F(plasmide autonome libere in citoplasma cu functii sexuale). Celula donoare poseda factorul F+ pe care il trece in celula receptoare care contine factorul F-, prin pilii sexuali. Spre deosebire de celulele fiintelor superioare, la care zigotul*** se formeaza din genoamele integrale ale celor doi parteneri, la bacterii, donorul lasa, de obicei, numai o parte din genomul sau acceptorului. In acest caz, fenomenul de transfer partial genetic se numeste meromixis****, iar zigotul partial merozigot. *lat. conjugatio impreunare, unire **grec. meion mai mic; meioza (diviziune

reductionala) este totalitatea fenomenelor complexe premergatoare mature) ***grec. zygotos imperechiat, unit ****grec. meros - parte Conjugarea este calea cea mai frecventa de castigare a rezistentei la antibiotice. Bacteriile, dupa cum se stie, nu au cromozomi in sensul clasic al notiunii, ci ele poseda o singura formatiune cromozomiala circulara alcatuita din ADN dublu catenar cu o lungime de 1000-1400 micrometri care formeaza un singur grup de lincaj. In general, bacteriile sunt complet haploide numai in anumite circumstante, de exemplu atunci cand sunt sub forma de spori. In restul ciclului vital ele sunt partial diploide datorita replicatiei ADN - ului care face ca unele gene sa se regaseasca intr-o singura doza, altele in doua sau chiar patru doze, aceasta formarii gametilor (celule sexuale

deoarece, uneori, inainte de terminarea primei replicatii a ADN - ului, incepe al doilea sau chiar al treilea ciclu de replicatie. Atunci cand replicatia ADN - ului nu are loc, celulele bacteriene sunt haploide, partial diploide sau diploide in functie de momentul cand sinteza ADN - ului a fost blocata.

59

Capitolul 5

CIUPERCI MICROSCOPICE
In acest capitol va sunt prezentate:

ce sunt si unde se intalnesc ciupercile microscopice, cunostinte generale despre mucegaiuri, cunostinte generale despre drojdii (levuri)

60

CIUPERCILE MICROSCOPICE sunt larg raspandite in natura, avand capacitatea de a putea sa se dezvolte pe medii diferite compozitional, dar cu predilectie pe cele glucidice. Ele au efecte benefice sau daunatoare activitatii umane. Printre cele folositoare se pot aminti: obtinerea ingrasamintelor naturale, a composturilor vegetale din resurse neconventionale slab valorificate (scoarta copacilor, resturile vegetale autumnale), producerea unor alimente de mare importanta in alimentatia umana (painea dospita, branzeturile fermentate, vinul, berea si alcoolul), obtinerea unor enzime cu utilitate industriala (amilazele) sau medicala (de exemplu preparate de nucleaze cuplate pe dextran cu actiune antitumorala) etc. Efectele daunatoare mai importante provocate de ciuperci sunt: alterarea alimentelor, producerea unor toxine alimentare (aflatoxine), provocarea unor boli de catre ciuperci (micoze), etc. Ciupercile microscopice se raspandesc usor in natura, cu predilectie prin spori, deoarece sporii produsi de un singur miceliu sunt numerosi, dispun de mijloace ce permit propagarea, si, spre deosebire de sporii bacterieni, sunt in primul rand forme de inmultire si nu de rezistenta. Ciupercile microscopice care prezinta interes pentru agricultura, alimentatie si alte activitati umane fac parte din Regnul Micelia, Subregnul Mycota, Ramura Eumiceta ce cuprinde Micomicete unicelulare (drojdii si mucegaiuri inferioare) si micomicete pluricelulare filamentoase (mucegaiuri superioare).

MUCEGAIURI (MICOMICETE)

5.1 DEFINITIE: Mucegaiurile sunt microorganisme

de tip eucariot, diferentiate

morfologic in monocelulare si pluricelulare, ce se reproduc prin spori rezultati pe cale asexuata, sexuata sau mixta, caracterizate prin: aspect filamentos, lipsa de mobilitate si incapabile de a realiza fotosinteza.

5.2 RASPANDIREA MUCEGAIURILOR

Datorita capacitatii lor deosebite de adaptare la cele mai diverse conditii ale mediului ambiant, mucegaiurile sunt raspandite in toate habitatele* naturale. *lat. habitare a locui; reprezinta conditiile mediului extern in care 61

traieste un organism sau un grup de organisme; sinonim cu biotop. Aceasta capacitate naturala de adaptare se datoreaza faptului ca ele dispun de un echipament enzimatic complex care le permite degradarea unor compusi macromoleculari, foarte diferiti ca structura si compozitie, folositi ca substante nutritiv-energetice. Totodata, necesitatile relativ modeste in privinta umiditatii, a factorilor de crestere, a vitaminelor si a altor compusi nutritivi sau biocatalizatori, contribuie la capacitatea lor de adaptare in aproape orice conditii de mediu. Stratul superficial al solului constituie un habitat in care mucegaiurile sporofite degradeaza compusii organici (hidrati de carbon omogeni si heterogeni, protide, lipide s.a.) din resturile vegetale si animale moarte, fiind considerate agenti tipici ai putrezirii. Prin degradarea compusilor din stratul superficial al solului, mucegaiurile participa la circuitul natural al carbonului, imbogatind solul in compusi cu molecule mai mici, ce reprezinta, la randul lor, mediu propice de dezvoltare al altor microorganisme sau plante. Acestea continua degradarea pana ce, in final, dioxidul de carbon si apa rezultate sunt prelucrate de plante si transformate, in cadrul acestui circuit trofic, in hidrocarbonate, monoze si polioze, prin fotosinteza. Din sol, prin intermediul factorilor fizici si biologici, sporii mucegaiurilor, reprezentand mijlocul principal de reproducere, sunt vehiculati in aer, unde pot supravietui un timp indelungat, dupa care, in lipsa curentilor ,se pot depune pe diverse alte medii in care sporii supravietuiesc perioade mari de timp, chiar zeci de ani, pana se creeaza conditii favorabile de viata. In aceste conditii favorabile are loc germinarea sporilor si dezvoltarea miceliului, vegetativ si producator. Mucegaiurile pot fi intalnite ca parte constitutiva a microflorei epifite a plantelor, unde pot produce alterarea fructelor, legumelor si semintelor. O serie de mucegaiuri patogene gasesc conditii de dezvoltare pe tesuturi vegetale si animale vii, carora le pot produce imbolnaviri (de exemplu malura, rugina, fainarea, fuzariozele la plante, micoze respiratorii, tricofitia, epidermofitica, flavisul la om si la animale). Alte mucegaiuri sunt folosite de om ca agenti productivi de importanta industriala si farmacodinamica in alimentatie, medicina, biotehnologii, obtinandu-se cu ajutorul lor acizi organici (citric, lactic, malic, fumaric), vitamine hidrosolubile (B12) liposolubile (ergosteroli), maturarea unor salamuri crude uscate(tip Sibiu) si branzeturi fermentate (tip Roquefort, cu pasta albastra sau Camembert si Brie cu 62

pasta

moale),

amonificarea

substantelor

proteice

in

timpul

compostarii

ingrasamintelor naturale (in care intervin mucegaiurile Trichoderma Konongi, Aspergillus terricola, Botrytis sp., s.a.), productia de antibiotice (penicilina, streptomicina etc.), ori producerea de proteina, folosindu-se ca materii prime reziduurile petroliere (genurile Mucor, Aspergillus, Fusarium, Cephalosporium).

5.3 MORFOLOGIA MUCEGAIURILOR

Mucegaiurile

sunt

celule

de

tip

eucariot,

heterotrofe,

imobile

si

nefotosintetizante. Peretele celular, care asigura forma celulei de mucegai, este mai gros, bogat in celuloza sau chitina, in functie de gruparea taxonomica din care face parte microorganismul, alte polizaharide ca: mucilagii, pectine, hemiceluloze, proteine si pigmenti. Sub peretele celular se gaseste membrana citoplasmatica ce delimiteaza citoplasma, in care se afla toate organitele descrise la drojdii. Membrana citoplasmatica este aderenta la peretele celular, intre cele doua membrane neexistand spatiu. O caracteristica oarecum specifica mucegaiurilor o reprezinta formatiunile vacuolare continand rezerva de glicogen, care formeaza o retea in miceliile tinere, in timp ce in cele batrane se concentreaza in zona centrala. Citoplasma contine, de asemenea, incluziuni lipidice cu lipocromi solubili, taninuri si oxalat de calciu cristalizat. Celula mucegaiului poate avea unul sau mai multi nuclei, in fiecare nucleu gasindu-se 2 - 4 cromozomi. Nucleii sunt mici si delimitati de o membrana celulara. In functie de organizarea celulara, se diferentiaza mucegaiuri

monocelulare, formate dintr-o singura celula, avand ramificatii in care componentele intracelulare, intalnite la microorganismele inferioare, circula liber si pluricelulare, la care peretele celular este comun mai multor celule, separate intre ele de un perete despartitor numit septum. Mucegaiurile, ciuperci filamentoase, formeaza micelii (tal) la care se disting doua structuri morfologice si fiziologice: vegetativa si reproducatoare.

63

Partea vegetativa, numita tal, asigura cresterea mucegaiului si este alcatuita din filamente miceline sau hife tubulare mai mult sau mai putin lungi si ramificate. Ele pot fi septate si neseptate, adesea anastomozate* intre ele. *anastomoza unirea a doua sau a mai multor filamente. Miceliul are o portiune aeriana si una rizoida* situata in mediul pe care se dezvolta. *grec. rhiza radacina; eidos forma; structura filamentoasa care indeplineste rolul de radacina pentru fixarea talului).

5.4 REPRODUCEREA MUCEGAIURILOR

Partea de reproducere si rezistenta este denumita spor, ou sau, artrospor, care ia nastere din tal si este reprezentat din elemente de forma rotunda sau dreptunghiulara cu marime variabila. Sporii pot avea doua origini: sexuata, cand sunt rezultatul fecundarii sau meiozei si asexuata, cand sporii rezulta din mitoze simple si sunt cunoscuti sub denumirea de conidii (conidiospori)* si servesc la inmultirea ciupercilor imperfecte. *grec. konis praf; idion diminutiv

5.5 FORMAREA SPORILOR

Dupa cum s-a aratat, sporii se pot forma prin reproducere sexuata (perfecta), care reprezinta conjugarea (contopirea) a doi gameti din care rezulta un ou. Gametii se formeaza pe doua hife invecinate numite suspensori. Din cei doi gameti rezulta un gametangiu* din care se dezvolta sporul ce are mai multe forme: zigosporul rezultat din conjugarea a doi gameti identici; oosporul ca rezultat al fecundarii a doi gameti heterozigoti (diferiti), numiti anteridium (mascul) si oogomun (femel); ascosporul format din fuziunea a doua celule vecine din acelasi miceliu sau din micelii diferite, in interiorul caruia se formeaza ascospori care se raspandesc in mediul inconjurator; bazidiosporul ce se formeaza in interiorul

64

unei bazidii** - celula binucleata la extremitatea unei hife cuprinzand bazidiospori prinsi cu un peduncul de bazidie. *grec. gametes sot, sotie; anggeion vas, recipient; **grec. basis baza; idion diminutiv.

Formarea sporilor imperfecti prin reproducerea asexuata are loc atunci cand unele celule miceliene devin thalospori sau cand prin morfogeneza unor structuri specializate se transforma in corpi fructificanti. Thalosporii sunt de mai multe feluri, si anume: Blastospori spori obtinuti prin inmugurire; Artrospori (sinonim oidii) formati din ruptura unui filament micelian; Chlamidospori rezultati dintr-o celula a miceliului pe suprafata acestuia si avand o forma ovoidala si un perete protector dublu lamelar. Corpii fructificanti au diferite forme: sporangiospor, conidiofor

(conidie), balistospor, microconidie (aleurie), si macroconidie (megaconidie), despre care vom scrie cateva cuvinte descriptive complementare: Sporangiosporul se formeaza dintr-un filament vertical care se ridica din reteaua filamentoasa a talului. La capatul acestui filament se separa o celula terminala care se umple columela formand o sfera sporangiu, in care se vor diferentia un numar mare de spori sporangiospori endogeni, haploizi (un singur set de cromozomi) si monocelulari. Conidia ia nastere prin condensarea protoplasmei intr-un punct oarecare de pe suprafata unui filament micelian unde apare o formatiune sferica, ovoidala sau alungita, izolata sau grupata in gramezi la suprafata miceliului care cuprinde conidiosporii. Balistosporul are forma rotunda, neregulata, poliforma la capatul unei hife, iar la maturitate este aruncat la distanta. Microconidiile sunt spori de dimensiuni reduse in raport cu alte tipuri de spori, grupati ca un ciorchine sau spic, fixati bine pe hifa reproducatoare (sinonim aleurispori). Megasporul are dimensiuni mai mari si forma fusiforma, intalnindu-se indeosebi la ciupercile dermatofite (paraziteaza pielea) (sinonime: Macroconidie, fus). Fialosporii sunt spori liberi, exogeni, cu forme si dimensiuni foarte diferite in functie de specie, formati pe hife vegetative (g. Aspergillus) sau reproducatoare 65

(g. Penicillium). La suprafata acestora se formeaza un picior avand in capat o vezicula pe care se dezvolta fialidele ce genereaza fialosporii. Diferitele forme de spori se raspandesc in natura, mentinandu-se in starea aceasta pana ajung pe un mediu nutritiv cu suficienta apa care sa le permita absorbtia substantelor nutritive. Transformarea sporilor in forma vegetativa are loc, in general, in urmatoarele faze: intr-o prima faza are loc o absorbtie a apei si o activitate a sistemelor enzimatice, faza care are o durata medie de 3-4 ore;. In cea de a doua faza, sporul germineaza, creste in dimensiuni si formeaza tuburi germinative denumite hife sau tal. Talul se extinde in profunzimea mediului si are rol de absorbant si de sustinere, fiind cunoscute sub acest nume: tal de sustinere sau rizoide. Cu aportul lor, forma vegetativa ce se dezvolta pe suprafata mediului isi asigura stabilitatea si totodata alimenteaza cu apa, substante nutritive si energie intregul fundament micelian. La suprafata mediului hifele de raspandire se dezvolta prin extindere, extindere ce are loc paralel cu mediul prin impingere sau impuls . Mucegaiurile inferioare adopta si modalitatea de extindere prin stoloni*. *lat. stolo lastare; hifa taratoare ce da nastere unui miceliu aerian si unuia rizoid. In stadiul al treilea are loc extinderea coloniala, care, la un moment dat, de maturitate, in functie de specie, se opreste, pregatindu-se de reproducere. In fine, in ultima faza, apar hifele reproducatoare generatoare de spori, alcatuind, impreuna cu talul vegetativ, asa-numitul miceliu, o pasla densa cuprinzand ambele forme. Dezvoltarea mucegaiurilor are loc destul de repede, in 2-4 zile formandu-se colonii vizibile. Atunci cand sporul de mucegai se dezvolta pe un mediu nutritiv solid, de exemplu, pe un produs alimentar), ca rezultat al inmultirii si extinderii miceliene se formeaza colonii fenotipice ca rezultat al interactiunii dintre mediu si caracteristicile genetice specifice ale speciei de mucegai. In cazul mucegaiurilor inferioare, coloniile au aspect paslos, se extind pe intreaga suprafata, fiind colorate diferentiat in raport cu specia si varsta ,de la alb, cenusiu, brun, pana la negru. 66

Coloniile mucegaiurilor superioare, cu miceliu septat, cresc radial si limitat, ajungand, dupa cateva zile (2-3) la un diametru de 3-4 cm. Culoarea coloniei variaza si, in functie de varsta, se inchide, putand fi alba, galbena, bruna, verdemultinuantat, portocalie, nuante de albastru, negru etc. Ele au un aspect paslos, cu tal vegetativ mai slab dezvoltat. Atunci cand sporii se dezvolta pe un mediu lichid, dezvoltarea poate avea, loc, in functie de specie, la suprafata, in adancime (submers) in conditii aerobe si/sau anaerobe. Daca se dezvolta la suprafata mediului lichid, sporii formeaza un voal derna cu aspect de piele, la inceput neteda, care apoi se cuteaza, in aceste pliuri formandu-se sporii. In conditiile inocularii sporilor in interiorul mediului lichid asa-numitele culturi agitate sau submerse acestia netraind in contact cu mediul pe intreaga suprafata sporala si in prezenta oxigenului obtinut prin insuflare cu presiune sau prin agitarea lichidului, se formeaza numai hife vegetative sub forma de sferule (perle), avand culoarea speciei, dar in general albicioasa, deoarece conglomeratele de sferule, destul de numeroase, favorizeaza difractia luminii, avand ca rezultat colorarea alba. Majoritatea biotehnologiilor care folosesc ca agenti mucegaiurile pentru producerea de antibiotice, enzime, acizi organici, aminoacizi, s.a., au adoptat maniera culturilor submerse, a caror dezvoltare si productivitate pot fi controlate mai usor.

5.6 PROPRIETATI FIZIOLOGICE GENERALE ALE MUCEGAIURILOR

Avand un sistem enzimatic divers si adaptabil unor conditii foarte diferite de mediu, mucegaiurile se pot dezvolta pe substraturi de orice natura. Ele pot degrada cu usurinta produse agro-alimentare, vegetale si animale, fibre textile lana, bumbac, sintetice, cauciuc, materiale polimere, beton, lemn, in general

necunoscandu-se multe produse in natura ce nu pot constitui mediu propice dezvoltarii mucegaiurilor, capabile s produca enzime adaptive oricaror materiale organice sau minerale.

67

In functie de utilizarea oxigenului, majoritatea mucegaiurilor sunt aerobe, oxigenul fiind luat atat din aer, cat si din alte surse, ca oxigenul dizolvat in apa, sau anaerobe (de exemplu genul Mucor foloseste oxigenul din hidratii de carbon din mustul de struguri pe care-l poate fermenta pana la concentratii de 1% alcool). Un numar limitat de mucegaiuri sunt microaerofile (provoaca, de exemplu, mucegairea untului sau se dezvolta in camera de aer a oualelor). Fata de umiditate, mucegaiurile sunt foarte putin pretentioase, rezista la uscaciune chiar si sub forma vegetativa, cu atat mai mult in forma de sporulata, ele fiind din acest punct de vedere xerofile, datorita membranei celulare mult ingrosata. Ele pot, astfel, produce degradarea peretilor in incaperile cu condens, fiind capabile sa absoarba apa din mediul ambiant. In raport cu reactia mediului, mucegaiurile se pot dezvolta in limite largi de pH de 2 10, dar, in general, valoarea optima a pH-ului este in domeniul slab acid 5,5 6,5. Sub aspectul temperaturii, majoritatea mucegaiurilor sunt mezofile, temperatura optima de dezvoltare fiind apropiata, in ambele sensuri de 250C. Un numar restrans, in special cele patogene se dezvolta bine la temperaturi in jurul valorii de 370C, iar altele, criofile, sunt adaptate la temperaturi negative Mucegaiurile sunt mai putin rezistente la temperaturile ridicate (80 - 900C) care le inactiveaza in timp scurt; astfel, la temperatura de 880C chiar formele sporulate cele mai rezistente sunt distruse in 10 minute.

DROJDII (LEVURI*)

*franc. lever a ridica: franc. levain - plamadeala

5.7 DESCRIERE GENERALA, IMPORTANTA, ROL, RASPANDIRE

LEVURILE sunt ciuperci microscopice, formand un sistem complex si eterogen de celule eucariote monocelulare, care au drept mod de reproducere general inmugurirea prin mitoza. Unele specii adopta reproducerea prin sporulare, formand ascospori, rezultati pe cale asexuata sau sexuata. 68

Fiind organisme heterotrofe cu metabolism mixt, oxidativ si fermentativ, levurile sunt raspandite in diverse habitate naturale ca rezultat al capacitatii de adaptare in diverse conditii de mediu (sol, apa, aer, produse vegetale si animale). Importanta si rolul drojdiilor rezida din utilizarile lor pe scara larga, industriala, in alimentatie, datorita capacitatii lor de a-si procura energia necesara vietii prin reactii oxidative anaerobe si aerobe care transforma hidratii de carbon naturali in produse de utilitate pentru om (bauturile alcoolice si nealcoolice fermentate, painea dospita, acizii organici alimentari etc.). Unele specii de drojdii sunt cultivate in scopul obtinerii de biomasa bogata in proteine sub forma de izolate proteice, autolizate de de drojdii bogate in vitamine hidrosolubile (din grupul B), liposolubile (din grupul D) si hormoni, utilizate ca aditivi alimentari, preparate enzimatice (ex.: invertaza) sau produse farmaceutice (de ex.: interferonul cu efect antiviral). Alte specii de drojdii (de ex.: Candida albicans) prezinta interes datorita caracterului lor patogen, cunoasterea morfologiei, fiziologiei si a metabolismului acestora fiind necesara in combaterea diverselor boli pe care le pot produce.

5.8 MORFOLOGIA LEVURILOR

Celula de drojdie este de tip eucariot si poate avea, in functie de specie, dimensiuni si forme diferite. Formele mai des intalnite la drojdii sunt cele sferice (ex.: genul Torulopsis), elipsoidale (ex.: genul Saccharomyces), cilindrice (genul Candida), apiculate (de ex.: genul Hanseniospora), dar caracterul de polimorfism este destul de frecvent intalnit la levuri. Dimensiunile levurilor, de 4 pana la 15 micrometri*, sunt, de regula, mai mari ca ale bacteriilor. *un micrometru (micron)= 10-3 mm (10-6 m) Sub aspect morfologic, celula de drojdie se compune din: invelisul

celulei, citoplasma si nucleu. INVELISUL CELULEI se compune din peretele celular, gros de cca. 10 micrometri, avand in compozitie polizaharide omogene si neomogene, inexistente in peretele celulei bacteriene, ca: glucani, manani, chitina** si membrana 69

citoplasmatica cu structura trilamelara similara cu a bacteriilor, compusa din polizaharide, lipoproteine si nucleotide. Invelisul celulei este mai subtire***, mai flexibil la celulele tinere de drojdii, mai gros si mai rigid la cele batrane, care din acest motiv sunt mai putin vulnerabile la actiunea agentilor sterilizanti. ** poliglucida formata din resturi de aminoglucide N acetilate cu structura in fibre asemanatoare celulozei, *** avand cca 250 nm (inm=10-9 m) Unele specii de levuri au celula inconjurata de o capsula de polizaharuri. La nivelul peretelui celular sunt localizate enzime avand un important rol in transferul bidirectional al metabolitilor ce asigura viata celulei (invertaze, fosfataze). Rolul peretelui celular este de a asigura forma celulei,agregarea (aglomerarea) acestora si usurarea depunerii lor in timpul limpezirii vinurilor, de exemplu. Prin indepartarea enzimatica a peretelui celular ramane protoplastul celula de forma sferica utilizat de ingineria genetica in obtinerea artificiala a unor hibrizi, avand caracteristici productive superioare in prima generatie hibrida (fenomen cunoscut sub denumirea de heterozis). Membrana citoplasmatica (plasmalema) are o grosime redusa (8-9 nm), fiind formata din trei straturi de natura lipoproteica. Fractiunea lipidica este

compusa din cca 30% fosfolipide, acizi grasi nesaturati si steroli. Plasmalema are un rol dinamic important in transportul metabolitilor, dar importanta ei rezida si din functia de regulator a presiunii osmotice celulare prin proprietatea sa data de continutul de grasimi de a fi hidrofoba. Ca urmare a acestei proprietati, unele substante foarte necesare celulei, ca de exemplu aminoacizii nepolari, unele vitamine, sterolii hiposolubile sunt admise si transferate in celula. La celulele tinere plasmalema (membrana citoplasmatica) este omogena spre deosebire de cea a celulelor batrane care formeaza pliuri ce maresc suprafata ei. CITOPLASMA* (protoplasma celulei, exclusiv nucleul), situata intre membrana celulara si membrana nucleara, este alcatuita dintr-o matrice citoplasmatica, hiaoloplasma faza solubila in care se afla organitele citoplasmatice comune si specifice, diverse incluziuni si factorii ereditari responsabili pentru ereditatea extranucleara (plasmagenele). 70

In citoplasma se petrec in fiecare secunda cel putin 1500 de reactii diferite, cu precizie mult superioara celor mai perfectionate masini cibernetice, in plus ea avand si capacitatea de a se autoreproduce. Componentele comune tuturor celulelor, aflate in citoplasma drojdiilor au fost discutate la capitolul mofologia celulara. In randurile urmatoare vor fi aratate organitele si incluziunile specifice mai importante:

Incluziunile de glicogen si trehaloza constituie substante de rezerva pe care celula de drojdie le sintetizeaza si acumuleaza in scopuri energetice si de crestere ca masura preventiva la eventuale stari de carenta nutritiva. Oleozomii (sferozomii) sunt incluziuni sferice de lipide avand rol de rezerva energetica in primul rand, dar si pentru scopuri structurale ale membranelor si coloizilor citoplasmatici poli-hetero-proteici-moleculari. Acizii nucleici din citoplasma sunt de tipul ARN: ribozomal, de transfer, transportor, mesager si determina la nivelul ribozomilor actiunea genelor, decodificand mesajul genetic prin sinteza proteinelor specifice. Se mai intalnesc si alte tipuri de acizi nucleici ce au rol in sinteza proteinelor cu functii specifice de agenti antimicrobieni, ca de exemplu ARN - k (killer). In acest caz, este inhibata sinteza de proteine prin perturbarea legarii ARN - t la complexul ARN - m si genereaza producerea de proteine anormale prin perturbarea tripletei de la nivelul ARN. In mitocondrii si plasmide se gaseste si ADN extracromozomial. Microtubulii si microfilamentele sunt organite cu structura de retea

tridimensionala ce mentine configuratia arhitecturala a organitelor intracelulare (asemanatoare unei structuri metalice de sustinere la constructii). Sistemul vacuolar cuprinde un vacuom central delimitat de o membrana

(tonoplast)* cu o structura electrono-microscopica similara plasmalemei si alte cateva vacuole mai mici amplasate in locuri diferite in citoplasma sau tangente la vacuomul central. In interiorul vacuomului au loc o serie de reactii biochimice prin care se produc substante necesare metabolismului si structurii celulare. Asezarea vacuomului central langa nucleul celulei sugereaza posibilitatea ca in interiorul sau sa aiba loc reactii de transfer energetic si nutritiv, vacuomul avand probabil si rolul de interfata intre nucleu si citoplasma. Vacuomul central este vizibil in faza stationara de crestere iar in faza activa sistemul cuprinde mai multe vacuole de 71

dimensiuni mai mici, formand o retea, avand functii de mentinere constanta a presiunii asmiotice. *grec. tonos tensiune; plastos - modelat - specifice celulelor de levuri sunt niste formatiuni care contin enzime purtand numele de peroxizomi. Aceste formatiuni includ oxidaze, catalaze si peroxidaze, enzime avand proprietatea de oxidare a apei, a alcoolilor , favorizand adapatarea celulelor de levuri la conditii aerobe de viata. Celula de drojdie are un singur nucleu de forma sferica sau elipsoidala, situat excentric. Nucleul este delimitat de o membrana proprie si contine mai multi cromozomi. La unele specii de levuri celula este inconjurata de o capsula polizaharidica. Componentele principale ale nucleului sunt cele comune tuturor celulelor si aratate la capitolul morfologia celulei: nucleolul, cromonema, fusul mitotic saude diviziune ansamblu coerent de fire proteice (peste 90 %) si ARN obisnuit, de forma elipsoidala, care apare in profaza si metafaza, in mitoza si meioza si in parte la distributia cromatidelor (in mitoza) si cromozomilor (in meioza) spre cei doi poli celulari (nuclei fii). Celulele de levuri au numar diferit de cromozomi (astfel genul Hansenula are 4 cromozomi, in timp ce Saccharomyces cerevisiae are 17). Unele celule sunt haploide* (un singur set de cromozomi), ca exemplu genurile Candida si Rhodotorula, majoritatea speciilor de drojdii sunt diploide, iar altele, levuri din speciile genului Saccharomyces pot avea ambele numere gametice de cromozomi sau prezinta forme de poliploidie. *grec. haplos - simplu; eidos - forma

5.9 FIZIOLOGIA GENERALA A LEVURILOR

Metabolism

Levurile sunt organisme heterotrofe cu metabolism mixt-oxidativ si fermentativ, sau exclusiv oxidativ. Cele oxidative se dezvolta bine in prezenta oxigenului molecular, folosind ca substante nutritive o gama larga de zaharuri simple pentru procesele respiratorii ce le asigura energia. Marea majoritate a speciilor de drojdie sunt aerobe. 72

Drojdiile cu metabolism fermentativ nu se pot dezvolta in anaerobioza stricta decat in prezenta acidului oleic sau a ergosterolului. Ele se adapteaza la anaerobioza obtinand o mica parte din energia necesara prin fermentarea zaharurilor pe care le transforma in alcool si bioxid de carbon, dar inmultirea lor in acest caz este redusa si lenta. In practica curenta a industriilor fermentative, care utilizeaza asemenea tipuri de levuri, la inceputul fermentatiilor se asigura, din acest motiv, dezvoltarea lor viguroasa prin insuflarea aerului in culturile pure o perioada redusa de timp. Drojdiile sunt, in general, acidofile, ele inmultindu-se in medii acide sau neutre (3,5 7,5 pH), dar limitele superioare ale pH-ului pot atinge si 8,5 8,7, deci domeniul bazic. Temperaturile optime de dezvoltare sunt, in general, cuprinse intre 25 si 30oC, drojdiile fiind microorganisme mezofile. Exista specii si tulpini psihrotrofe ce se dezvolta si se multiplica bine la temperaturi de refrigerare de pana la +5 oC si chiar la valori usor negative, ele avand insemnatate mare la conservarea alimentelor cu ajutorul frigului. Alte specii - in special drojdiile patogene au temperatura optima de dezvoltare la 37 oC. Temperaturi de 70-75o C aplicate pe o durata de minimum 30 de secunde au efect inactivant sau sterilizant datorita plasmolizarii (coagularii) proteinelor din citoplasma celulara. Celulele de drojdie sunt sensibile la modificarea presiunii osmotice, determinata de concentratia substantelor solubile in mediul intracelular.

Comportamentul lor in raport cu aceasta caracteristica este diferentiata, desi, o mare parte dintre speciile de levuri sunt osmofile. Astfel, daca mediul de dezvoltare a celulelor de levuri este hipotonic concentratia mediului este mai redusa ca cea intracelulara apa din mediu patrunde in celula pana la stabilirea izotoniei, aceasta se umfla devine turgescenta*. *lat. Turgescere a umfla In mediu hipertronic celula de drojdie isi reduce concentratia de apa pana la izotonie. O concentratie a mediului in zaharuri mai mare de 65 % are ca urmare detasarea membranei celulare, o stare de plasmoliza si moartea celulei. Acest procedeu de conservare a unor produse alimentare (a sucurilor de fructe) prin cresterea continutului de zahar in mediile de dezvoltare a drojdiilor se numeste zaharoanabioza. 73

Cu toate acestea se cunosc specii de drojdii adaptate mediilor hipertronice ( de ex.: genul Zygosaccharomyces), continand 50-60 % zaharuri (osmotolerante), utilizate in practica vinificatiei pentru obtinerea unor vinuri speciale cu continut ridicat de alcool etilic. Specii de drojdii din genurile Rhodotonela si Sporobolomyces au culoare galbena, portocalie, rosie. Cultivarea unor asemenea specii este facuta in scopul obtinerii unor vitamine, enzime sau pentru utilizarea lor in scopuri genetice.

Reproducerea levurilor

Inmultirea levurilor se face pe doua cai: asexuata si sexuata. Inmultirea asexuata prin inmugurire reprezinta forma generala de reproducere a levurilor si are la baza procesul de mitoza prin care dintr-o celula mama se formeaza o celula fiica identica in continut cu celula mama. Un grup restrans de drojdii cele sporogene sau oxogene, majoritatea apartinand Ascomycetelor se inmultesc prin copularea a doua celule haploide din care rezulta un zigot. Zigotul sporuleaza prin meioza (diviziune reductionala) formand astfel o asca continand ascospori. Reproducerea prin ascosporie este o forma particulara de reproducere la unele levuri din familiila Saccharomyceetaceae care prin adaptare la unele conditii de viata a dobandit genetic aceasta proprietate. Ele produc 2-12 ascospori (in functie de specie) dimensiuni de 2-4 micrometri, de forme diverse. Spre deosebire de celula vegetativa din care s-au format, aceste forme sporulate sunt mai rezistente fata de conditiile improprii de mediu (uscaciune, temperatura, inhibatori etc.). Formarea ascosporilor poate avea loc prin reproducere asexuata, dar si pe cale sexuata. Formarea asexuata a ascosporilor se face fara fecundare, prin

partenogeneza astfel: dintr-o celula de drojdie diploida, care contine doua seturi de cromozomi rezulta patru celule haploide (cu un singur set de cromozomi) prin meioza (diviziune reductionala), in doua etape: mai intai, se formeaza doua celule haploide cu nuclee distincte prin meioza, iar in a doua etapa, ca rezultat al clivarii (separarii) cromozomilor in doua parti se formeaza din nou doua celule, de data 74

aceasta, asadar prin mitoza. Celula vegetativa, ramasa doar cu invelisul celular poarta numele de asca care prin rupere elibereaza celulele haploide ascosporii. Ascosporii mai pot fi formati pe cale sexuata sau copulare, atunci cand exista conditii favorabile si are loc intre doua celule ajunse la maturitate fiziologica. Celulele mature capabile de conjugare numite gameti* vin in contact intr-o zona comuna, zona in care se formeaza un canal de copulare; are loc procesul de meioza si apoi mitoza, formandu-se, in cele doua celule ascospori, de data aceasta diplozi. Conjugarea poate fi izogama intre celule de acelasi fel sau heterogama intre celule din specii diferite, situatie in care ascosporii se acumuleaza in celula cu volumul cel mai mare. un numar egal de

75

PARTEA a-II-a

MICROBIOLOGIE APLICATA

Capitolul 1 METABOLISMUL MICROBIAN

In acest capitol va sunt prezentate:

definitia, caracteristicile si caile metabolice ale metabolismului microbian; tipuri de metabolism: energetic si de sinteza; transportul substantelor

1.1 DEFINITIE, CARACTERISTICI, CAI METABOLICE

Definitie - Denumirea de metabolism vine din limba greaca, insemnand schimbare, modificare. Asadar se poate defini metabolismul microbian ca reprezentand totalitatea schimbarilor chimice, fizice si morfologice care au loc in celula microorganismului. Prin metabolism substantele din mediu sunt transformate (metabolizate) in constituienti celulari, energie si produsi de metabolism. Microorganismele autotrofe metabolizeaza substante anorganice.: dioxidul de carbon, apa, nitratii, elemente metaloide, compusi radioactivi. Cele heterotrofe folosesc in metabolism atat compusi anorganici cat si substante organice. Unii produsi, rezultati in urma activitatilor metabolice, prezinta o importanta deosebita in multe domenii precum agricultura, alimentatia, productia de medicamente, medicina umana si veterinara, etc.

76

Caracteristicile principale ale metabolismului pot fi considerate urmatoarele:

1. prin reactiile metabolice se produce energie care se foloseste imediat in procese de biosinteza, crestere, transport sau se stocheaza sub forma esterilor fosforici ai unor acizi nucleici (de ex. adenozin fosfatii - ADP, ATP). 2. reactiile metabolice dau nastere constituientilor celulari si enzimelor implicate in metabolism; 3. metabolismul este un proces ciclic cu autoreglare ce mentine stabilitatea celulei, specificitatea si intensitatea reactiilor intracelulare, randamentul optim al activitatii celulare; 4. reactiile metabolice evolueaza dupa principiul eficientei maxime, adica productivitate maxima in reproducere, cu consum minim de energie; 5. toate reactiile biochimice metabolice sunt produse si catalizate de enzimele celulei, ce pot actiona (in functie de specificul fiecareia) in interiorul sau exteriorul microorganismului. 6. in procesele metabolice sunt implicati toti componentii celulei, cu exceptia acizilor nucleici, care avand rol ereditar, raman neschimbati.

Necesitatea

intelegerii

modului

de

desfasurare

metabolismului

microorganismelor rezulta din consecintele practice ale acestuia, printre care se amintesc: 1. dezvoltarea unor procedee si practici adecvate impiedicarii proliferarii unor microorganisme daunatoare sau nedorite de om, in profilaxia si combaterea unor boli; 2. stabilirea unor biotehnologii si logistici necesare obtinerii unor produse de utilitate societatii umane, cum ar fi: alimente, medicamente, vitamine, etc.; 3. aplicarea in practica a unor procedee de ecologizare si refacere a mediului ambiental cum ar fi degradarea si utlizarea deseurilor, refacerea terenurilor degradate de scurgerile petroliere prin utilizarea microorganismelor, etc.; 4. bioingineriile genetice, etc.

Caile metabolice prin care se desfasoara reactiile biochimice au loc in secvente enzimatice ce pot produce un metabolit intermediar sau unul final.

77

Numim metaboliti produsele care participa la metabolism, atat cele ce sunt metabolizate, cat si cele rezultate in urma metabolizarii. Caile metabolice sunt dinamice, interdependente, se pot desfasura secvential si (sau) simultan, desfasurarea lor fiind functie de mai multe variabile, printre care: 1. caracteristicile si specificitatea microorganismului; 2. specificul, compozitia si concentratia substratului metabolizat; 3. caracteristicile mediului (temperatura, umiditate, etc.) in care isi desfasoara activitatea microorganismul; 4. concentratia metabolitilor rezultati sau folositi in reactii; 5. prezenta sau absenta unor substante specifice activatoare, inhibitoare, inductoare ale microorganismului sau a unor secvente metabolice.

Desfasurarea secventelor poate fi liniara, atunci cand metabolitul rezultat din reactia enzimatica este folosit ca substrat in urmatoarea treapta, constituind astfel un lant liniar. Alte cai metabolice au o desfasurare ciclica, in care metabolitul utilizat la inceput poate fi regenerat pentru a-l folosi in initierea unui alt tur al ciclului. In anumite stadii secventiale, caile metabolice pot avea o desfasurare ramificata, una sau mai multe secvente producand metaboliti intermediari folositi ca substrat (reactant) pentru o urmatoare secventa (situatie in care tipul de cale metabolica este denumit ramificat convergent). Alteori, daca metabolitul intermediar este folosit ca substrat in doua sau mai multe secvente cu desfasurare simultana, atunci se poate spune ca avem de a face cu o cale metabolica divergenta.

In metabolismul microbian sunt implicate doua tipuri de reactii biochimice, si anume:

1. reactii care au loc cu eliberare de energie (exergonice) cunoscute sub numele de reactii de degradare sau de catabolism (grec. katabole = distrugere, desfacere), acest tip de metabolism purtand numele de metabolism energetic ; 2. reactii de biosinteza, de anabolism (grec. ana = in sus, bole = aruncare) sau de conversie, consumatoare de energie (endergonice) prin care sunt 78

sintetizate substantele compusilor nucleari, citoplasmatici, enzimele si alti compusi specifici celulelor microorganismelor, acest tip de metabolism fiind cunoscut sub numele de metabolism de biosinteza, sinonimele sale fiind anabolismul si metabolismul convertiv.

Cele doua aspecte ale metabolismului reprezinta in fapt doua laturi contrarii ale unui fenomen unitar, procesele de catabolism si anabolism se presupun reciproc, se conditioneaza unul pe altul si se desfasoara simultan in celula microorganismului. Interconditionarea celor doua tipuri de reactii este determinata de faptul ca energia rezultata din reactiile catabolice exergonice este folosita sub forma compusilor macroergici (grec. makros = mare, ergasthai = a lucra) in reactii anabolice consumatoare de energie (sunt cunoscuti multi compusi organici care inmagazineaza energia, printre care amintim: esterii fosforici ai acizilor nucleici, nucleofosfatii ca adenozin, uridinfosfatii, acetil erenzima A, etc.). De asemenea, o parte din metabolitii rezultati din reactiile catabolice pot constitui, partial sau total, reactanti de initiere (substrat ce este folosit) a unor cai anabolice ce conduc la sinteze de compusi celulari necesari dezvoltarii si existentei microorganismului. Prin urmare, caile metabolice centrale , descrise mai inainte, care indeplinesc atat functia energetica cat si cea de furnizoare a precursorilor pentru biosinteza, sunt cunoscute sub denumirea de cai amfibiolice (grec. amphi = amandoua, dublu). Atunci cand o cale metabolica centrala este blocata in functionarea ei, datorita folosirii intermediarilor rezultati in procesele de biosinteza, apar noi cai colaterale, auxiliare, cunoscute sub denumirea de cai metabolice anaplerotice. Prin folosirea acestor cai, celula microbiana se adapteaza rapid la conditii foarte diverse de mediu. Functionarea si interactiunea celor patru tipuri de cai metabolice sunt reglate de niste reactii de tip special (pace-maker), ce intersecteaza punctele esentiale.

1.2 METABOLISMUL ENERGETIC

Metabolismul energetic (catabolic) se desfasoara in doua faze:

79

1. faza descompunerii enzimatice a macromoleculelor in partile lor constitutive: aminoacizi, monoglucide, acizi grasi, etc., fara producere de energie utilizabila; 2. faza degradarii exergonice a constituientilor formati in prima faza, cu producerea unor cantitati importante de energie, utilizabila in alte reactii biochimice; energia este inmagazinata in compusi macroergici de tipul nucleotid fosfatilor.

Degradarea are loc prin reactii de oxido-reducere in care o substanta donor doneaza un electron sau un ion de hidrogen unui acceptor, care astfel sufera o reducere. Reactiile redox sunt reversibile si catalizate enzimatic. Metabolismul catabolic (energetic) este cunoscut si sub denumirea de respiratie celulara si are urmatoarele caracteristici:

se desfasoara etapizat (in trepte); energia se elibereaza in fractiuni, prin reactii de tip redox; energia eliberata este inmagazinata in compusi chimici macroergici de tipul nucleotid fosfatilor si utilizata in reactii de biosinteza (anabolice), energie echivalenta cu 7.3 kcal/mol;

reactiile din metabolismul catabolic sunt juxtapuse celor anabolice; celula microorganismului se "incarca" cu o cantitate de energie specifica, cunoscuta ca incarcare energetica sau energie potentiala, ce este data de suma concentratiilor compusilor chimici macroergici inmagazinati (de ex.: ATP + ADP + AMP care reprezinta cca 15 micromoli / g.s.n. celulara) putand fi calculata cu relatia: Ep = 0.5 (ADP) + 2(ATP) / (AMP) + (ADP) + (ATP) Se intalnesc trei tipuri de respiratie celulara si anume:

1. FERMENTATIA - reprezinta procesul biologic de oxido-reducere producator de energie, in care substantele organice sunt si donori si acceptori de electroni, ca de exemplu zaharurile care prin degradare produc energie inmagazinata in forma de ATP (cca 30%) format prin reactii de fosforilare.

80

Fermentatia constituie modalitatea principala de procurare a energiei la drojdii si bacterii anaerobe, glucidele (in principal glucoza) fiind cel mai des folosita in metabolism, folosindu-se doua cai principale, si anume: - ciclul glicolitic Embden - Mayerhoff - Parnas, cale folosita de majoritatea microorganismelor, in care donorul de electroni este aldehida fosfoglicerica, iar acceptorul final acidul piruvic, care ulterior este utilizat in mai multe tipuri de reactie (vezi mecanismul fermentatiei alcoolice). - calea glucofosfatilor Warburg - Dickens - Horecker, de natura strict aeroba, prin care se inmagazineaza jumatate din energia ciclului glicolitic; ea este o cale de scurtcircuitare (shuntare) a caii glicolitice, fiind folosita pentru sinteza

pentazofosfatilor necesari in sinteza nucletidelor si a altor acceptori de electroni.

Acestor cai li se mai pot adauga inca doua:

- calea Enter - Douderoff (E.D.), care furnizeaza precursori pentru biosinteza ARN si ADN, vitamine si acizi aromatici, fara producere de energie (intalnita la unele specii de bacterii din genul Pseudomonas); calea fosfocetolazei, intalnita la un grup mic de bacterii lactice

heterofermentative si care implica participarea enzimei fosfocetolaza; pe aceasta cale acetil fosfatul este scindat direct dintr-un monoglucid cu 5 sau 6 atomi de carbon. Toate cele patru cai de folosire a monoglucidelor (glucozei) sunt interconectate, avand un important complex enzimatic comun. Totusi,

microorganismele, avand o mare variabilitate genetica, isi aleg calea sau caile majore cele mai convenabile. Chiar aceeasi specie poate folosi, in raport cu conditiile in care traieste, una sau mai multe cai.

2.

RESPIRATIA AEROBA - reprezinta acel tip de respiratie in care

donatorul de oxigen este o substanta anorganica sau organica, iar acceptorul final de electroni este oxigenul, substratul fiind complet oxidat pana la CO2 si H2O. Asadar, respiratia aeroba se caracterizeaza prin aceea ca electronii eliberati prin oxidarea substratului sunt transferati la oxigen prin enzime transportoare, energia rezultata stocandu-se in ATP prin cuplarea acestuia cu reactiile de oxido-reducere. Modalitatea de obtinere a ATP cu reactiile redox este 81

denumita fosforilare oxidativa si are ca rezultat (in cazul substratului de glucoza) o energie de 688 kcal/mol din care cca 40% este inmagazinata in ATP, mult mai mare decat prin fermentatii. Enzimele ce catalizeaza reactiile de transfer de electroni sunt

dehidrogenazele si actioneaza in functie de potentialul lor de redox (rH), de la rH-ul mai negativ la rH-ul mai pozitiv cel mai ridicat. Toate enzimele actioneaza numai in prezenta unor coenzime specifice, astfel: dehidrogenazele pirimidinice au coenzime NAD+ si NADP+ (Eo = -0.32V), cele flavinice folosesc drept coenzime FMN+ si FAD+ (Eo = 0.05V), aldolazele, citocromoxidazele, piruvatdehidrogenaza folosesc drept coenzime citocromii, feredoxina, rubredoxina cu rH negativ, iar kinazele utilizeaza cinonele (coenzimele Q sau ubichinonele) cu rH pozitiv. Sistemul transportor de electroni este localizat in mitocondrii la

microorganismele eucariote si in membrana plasmatica si mezosomi la cele procariote.

3. RESPIRATIA ANAEROBA - este acel tip de respiratie celulara in care acceptorul final de electroni poate fi orice substanta anorganica exceptand oxigenul, iar donorul un compus organic sau anorganic. Ea se intalneste numai la bacterii si este explicitata mai pe larg la partea de microbiologie care se refera la circuitul azotului, fosforului si fierului in sol.

1.3 METABOLISMUL DE BIOSINTEZA (anabolism, metabolism convertiv)

Tipul acesta de metabolism presupune procese biochimice prin care microorganismele isi sintetizeaza, din molecule simple, constituienti celulari, comuni sau specifici, necesari desfasurarii activitatii lor vitale. In reactiile de biosinteza se folosesc produsi si energie inmagazinata rezultate din reactiile de catabolism, ele fiind reactii consumatoare de energie (endergonice). Pentru ca reactiile anabolice sa aiba loc, microorganismele trebuie sa gaseasca in mediu sursele de carbon si de energie, iar calea principala care le furnizeaza sunt reactiile catabolice care se desfasoara simultan cu reactiile 82

anabolice, aceasta fiind o caracteristica a metabolismului, asa cum s-a aratat mai pe larg la inceputul acestui capitol.

1.4 TRANSPORTUL SUBSTANTELOR

Transportul

substantelor

de

la

exterior

in

interiorul

celulei

microorganismului are loc selectiv si in dublu sens, prin mai multe mecanisme, principalele fiind: 1. Difuzia pasiva, care este mecanismul de trecere lenta a substantelor din afara in interiorul celulei si invers, fara consum de energie, pe baza gradientului de concentratie, de la o concentratie mai mare la una mai mica, pana cand concentratiile se echilibreaza. Prin acest mecanism se transfera putine

substante, printre care apa, O2, CO2, acizii grasi, unele substante liposolubile prin membrana plasmatica.

2. Transportul prin transportor este mecanismul prin care un transportor specific (carrier), de natura proteica, situat in plasmalema, fixeaza substanta si o transporta in partea cealalta a membranei. El se realizeaza prin trei modalitati, si anume:

prin difuzie facilitata, transportul substantei fixate pe carrier avand loc, ca si la difuzia pasiva, pe baza diferentei de concentratie dintre cele doua fete ale membranei plasmatice, fara consum de energie, pana la echilibrarea concentratiei.

prin transport activ, realizat cu consum energetic, impotriva gradientului de concentratie. Energia necesara este cuplata la transportorul proteic ce contine un cuplaj complementar pentru substratul respectiv. Aceasta modalitate de transport este folosita de majoritatea microorganismelor pentru glucide, saruri minerale, aminoacizi.

prin translocatie (transfer) de grup, substanta ce trebuie transportata modificandu-si structura chimica la trecerea prin membrana, astfel incat in interiorul celulei nu se mai regaseste substanta initiala. Aceasta modalitate de transfer are loc cu consum de energie si cu participarea enzimelor

83

fosfotransferaze, care au legat fosfatul prin legaturi macroergice ce inmagazineaza energia necesara procesului de transfer.

Capitolul 2 TIPURI IMPORTANTE DE FERMENTATIE INTALNITE IN DOMENIILE AGRO-ALIMENTAR SI AGROTURISTIC

84

In acest capitol va sunt prezentate:

definitiile, agentii de fermentare si principalii factori de influenta ai fermentatiilor; mecanismul fermentatiilor; importanta practica a fermentatiilor

2.1 FERMENTATIA ALCOOLICA

Fermentatia alcoolica si in primul rand produsele acesteia, bauturile alcoolice, sunt cunoscute din cele mai vechi timpuri, iar studierea stiintifica a acesteia a reprezentat, de fapt, inceputurile microbiologiei. Initial, fermentatia alcoolica a fost considerata un fenomen chimic pur, Lavoisier folosind-o pentru demonstrarea principiului conservarii materiei.

Definitie: fermentatia alcoolica consta in transformarea zaharurilor in alcool etilic si acid carbonic sub influenta unor microorganisme, dintre care pe primul loc se afla drojdiile care pot fi considerate ca adevarati agenti ai fermentatiei alcoolice. Exista insa un mare numar de ciuperci care produc descompunerea zaharului cu formare de alcool etilic, atunci cand sunt obligate sa traiasca in conditii anaerobe, asa cum exista si drojdii (Pichia hialospora) incapabile sa produca fermentatia alcoolica.

Agenti ai fermentatiei alcoolice

La inceput, fermentatia se face sub actiunea microflorei spontane. Practica a aratat insa ca microorganismele neselectionate sunt slab si inegal active, motiv pentru care industrial se folosesc drojdii selectionate (cultivate), ce se disting de cele salbatice prin productivitatea lor ridicata si sunt adaptate perfect vietii anaerobe. la fabricarea alcoolului etilic se folosesc drojdiile care apartin genului Saccharomyces Rees (Endomytacceae), din care amintim speciile: S.. cerevisiae,

85

S.elegans, S.. ellipsoideus, S.. fructuus, S.. chevalieri, S.acidifaciens, S. ludwigii,etc. Anumite drojdii osmofile din genul Zygosaccharomyces suporta concentratii mari de zahar, putand produce fermentarea siropurilor concentrate de zahar si a mierii. Se vor aminti in continuare cateva din alte categorii de microorganisme ce pot produce prin fermentatie alcool etilic. - mucegaiuri din fam. Mucoraceae, clasele Phycomycetes (Mucor Eumycetes rouxianus sinonim Amylomyces rouxii, Mucor racemosus, Rhizopus

orizae),(Aspergillus orizae, Penicillium glaucum, Dematium pullulans); - bacterii: Bacillus macerans, Bacillus etilicus, Bacillus gracile, etc.

Natura enzimatica a fermentatiei alcoolice

Dupa ce Pasteur a descris fermentatia alcoolica ca fiind un proces biologic complex, Buchner, in 1897, a demonstrat natura enzimatica a acesteia. Degradarea hidratilor de carbon si transformarea lor in alcool etilic presupune un mecanism cuprinzand reactii enzimatice succesive, reactii ce au loc in prezenta si cu aportul adenozin si tiamin fosfatilor si coenzimei A, precum si a unor vitamine hidrosolubile ca B1, B2, B5, B6, PP, s.a. Principalele enzime implicate in principalele secvente succesive ale acestui mecanism sunt:

in

etapa

de

fosforilare

si

formare

trizofosfatilor:

hexokinaza,

fosfoglucoizomeraza, fosfofructokinaza, aldolaza, s.a.; in etapa de dehidrogenare a aldehidei fosfoglicerice:

glicerofosfatdehidrogenaza, fosfogliceratkinaza, s.a.; in etapa de producere a acidului piruvic: glicerofosfatmutaza, enolaza; in etapa formarii alcoolului etilic: alcooldehidrogenaza.

Principalii factori de influenta a fermentatiei alcoolice

Fermentatia alcoolica fiind o succesiune de reactii catabolice produse de drojdii cu ajutorul enzimelor este influentata de factori implicati in metabolism in 86

mod esential. Se vor aminti, in continuare, cativa factori, considerati mai importanti:

temperatura, ca valoare medie si ca amplitudine intre valorile maxime si minime, fiecare specie de microorganism avand o temperatura optima specifica;

concentratia ionilor de hidrogen (pH), drojdiile dezvoltandu-se in general pe substraturi acide (pH = 3.5 - 4.7); potentialul redox, datorita faptului ca procesele de fermentare sunt, in general, reactii de oxido-reducere; presiunea osmotica - concentratiile ridicate de hidrati de carbon incetinesc mecanismul fermentatiei, drojdiile obisnuite isi intrerup activitatea la presiuni osmotice mai mari de 60 kgf/cm2

concentratia de alcool rezultat - are actiune inhibitoare daca depaseste 4-5% pentru drojdiile de fermentatie inferioare si 18% pentru cele de fermentatie superioare;

activatorii si inhibitorii microorganismelor: antiseptice, microelemente minerale, alcoolul, dioxidul de carbon, oxigenul, etc.

Mecanismul fermentatiei alcoolice

Acesta va fi prezentat schematic, fara comentarii. AMIDON amilaze

MALTOZA amilaze

ZAHAROZA invertaza

GLUCOZA

FRUCTOZA

GLUCOZO - 6 - FOSFAT fosfoglucozoizomeraza 87

FRUCTOZO - 6 - FOSFAT fosfofructozokinaza

FOSFODIOXIACETONA FRUCTOZO - 1.6 - DIFOSFAT fructozofosfatliaza

GLICEROFOSFAT

ALDEHIDA - 3 - FOSFOGLICERICA fosfotrioziizomeraza

GLICERINA

ALDEHIDA - 1.3 - DIFOSFOGLICERICA triozofosfatdehidrogenaza

ACID - 1.3 - DIFOSFOGLICERIC fosfokinaza

ACID - 3 - FOSFOGLICERIC fosfogliceromutaza ACID - 2 - FOSFOGLICERIC enolaza

ACID - FOSFOENOLPIRUVIC

ACID ENOL PIRUVIC

ACID PIRUVIC

ACETIL CoA alcooldehidrogenaza 88

ACID LACTIC

ACIZI TRICARBOXILICI (Ciclul Krebs)

ALCOOL ETILIC

AMINOACIZI

PROTEINE (Ciclul Utter) ACIZI GRASI, COMPUSI STEROIDICI PORFIRINE PENTOZO-FOSFATI (SHUNTARE) GLUCURONIDE

2.2 FERMENTATIA LACTICA

Definitie: prin fermentatie lactica se intelege procesul biologic din care rezulta ca produs principal acidul lactic. Fermentatia lactica este foarte frecvent intalnita in numeroase produse si domenii agro-alimentare cu destinatie umana si zootehnica, fiind produsa in cele mai multe cazuri de bacterii, dar si de drojdii si mucegaiuri.

Agenti ai fermentatiei lactice

Bacteriile care produc acid lactic fac parte din categoria cocilor (grec. kokkos = bob) sau a bacililor (latin. bacillus = bastonas) si ca majoritatea bacteriilor se dezvolta la temperaturi de 28 - 35oC (sunt mezofile). Exista insa si specii termofile (cu temperaturi optime de dezvoltare intre 35 - 62oC) sau psihrofile (care prefera temperaturi scazute, pana la 10oC). Procesul de fermentare poate produce in final doar acid lactic, situatie in care bacteriile lactice se numesc homofermentative, sau pe langa acid lactic, ca produs principal, si alti produsi secundari: alcool etilic, bioxid de carbon, acid propionic, s.a., caz in care agentii de fermentatie se numesc heterofermentativi.

89

Se vor da cateva exemple de agenti de fermentatie lactica, urmand sa se descrie mai pe larg microorganismele la fiecare produs agro-alimentar a carui biotehnologie va fi expusa in partea a 3-a a acestui curs.

Termobacteriii lactice heterofermentative, (in paranteza se dau originea si temperatura optima): Leuconostoc caucasicus (chefir, branza, 37 - 45oC), Lactobacillus lactis (lapte, branza, 36 - 45oC), L. helveticus (branza, 37 - 45oC);

Termobacterii

lactice

homofermentative:
o

L.

bulgaricus

sinonim

Thermobacterium bulgaricum (iaurt, 45 - 62 C), L. thermophilus (iaurt, 45 62oC), L. acidophilus (fecale nou-nascuti, 37-45oC), L. delbruckii (plamezi cereale, 50oC);

Bacterii lactice mezofile heterofermentative: L. buchnerii (vin, plamezi acide, melasa, 28-32oC), L. brevis (lapte, varza murata, 28-32oC), L. pastorianus (bere, 28-32oC);

Bacterii lactice mezofile homofermentative: L. casei (lapte, 28-32oC), L. plantarum (lapte, 28-32oC); Bacterii lactice psihrofile.

Mecanismul fermentatiei lactice

Prin fermentatia lactica, teoretic, dintr-un gram de zahar fermentescibil (de ex.: lactoza - dizaharid compus din glucoza si fructoza, maltoza - dizaharid avand doua molecule de glucoza) se produce un gram de acid lactic. Produsul finit, acidul lactic, poate fi levogir, dextrogir sau racemic, in functie de agentul de fermentatie, temperatura de fermentatie sau compozitia chimica a mediului. Mecanismul fermentatiei lactice este expus in schema urmatoare, in care, cu linii intrerupte sunt aratati produsii intermediari si finali secundari, produsi de bacteriile heterofermentative. Acesti produsi secundari prezinta uneori o importanta deosebita la obtinerea unor alimente cu caracteristici organoleptice (gust, aroma, culoare, miros, consistenta) sau fizico-chimice (goluri interioare, continut de aminoacizi sau polipeptide) specifice

Glucoza 90

Glucozo - 6 - fosfat

Gluconat - 6 - fosfat

Fructozo - 6 - fosfat

Ribulozo - 5 - fosfat

Fructozo - 1.6 - difosfat

Xilulozo - 5 - fosfat

Glicerina

Dihidroacetonfosfat

Gliceroaldehid - 3 - fosfat

Acetil - fosfat

Piruvat

Lactat

2.3 FERMENTATIA PROPIONICA

Definitie: Fermentatia propionica este un proces biochimic anaerob, prin care substratul glucidic este transformat, prin reactii enzimatice datorate enzimelor specifice din componenta bacteriilor propionice, in acid propionic. Fermentatia propionica are importanta speciala in producerea branzeturilor maturate cu pasta tare si goluri interioare (tip Schweitzer), carora le imprima, in afara incluziunilor alveolare, caracteristici organoleptice specifice si o valoare nutritiva ridicata. Totodata, bacteriile propionice produc, la maturarea painii, o fermentatie suplimentara, transformand acidul lactic in acid propionic si bioxid de carbon, imbunatatind gustul si cresterea in volum a painii. In partea de microbiologie aplicata se vor arata si alte aplicatii practice ale acestei fermentatii. 91

Agenti ai fermentatiei propionice

Bacteriile propionice sunt incluse in familia Lactobacteriaceae, genul Propionibacterium. Printre cele mai importante, din punct de vedere al utilitatii in domeniul agroalimentar, se amintesc: Propionibacterium freudenreichii van Niels sinonim cu Bacterium acidi propionici, Propionbacterium shermanii, bacterii utile in sectoarele produselor lactate si de panificatie si Propionibacterium rubrum van Niels, bacterie ce formeaza petele rosii pe branzeturi, Clostridium propionicum Neillonela, s.a., care nu au prea mare importanta industriala. Fiziologic, bacteriile propionice pot folosi ca substrat de fermentatie diverse hexoze (glucoza, lactoza, maltoza), acizi organici (lactic, malic), glicerina, actionand in medii neutre, slab acide (pH optim 6,9) si domenii de temperatura mezofile (35-37oC). Valori de temperatura de peste 60oC le inactiveaza, ca de altfel si concentratii de clorura de sodiu mai mari de 4%.

Mecanismul fermentatiei propionice

Glucoza

Piruvat

(lactat dehidrogenaza) CO2 + Acid lactic + Acid acetic

(transcarboxilaza) Acid oxalilactic

(ac.malicdehidrogenaza) Acid malic

(fumaraza) Acid fumaric 92

(fumaratreductaza) Acid succinic

Succcinil CoA

(metilmalonilCoAmutaza) Metilmalonil CoA

(CoAtransferaza) Propionil CoA

Acid propionic

2.4 FERMENTATIA MALO-LACTICA

Definitie:

fermentatia

malo-lactica

este

un

proces

biochimic

datorat

microorganismelor, sub actiunea carora acidul malic, aflat in fructele necoapte, este transformat in acid lactic si dioxid de carbon. Prin acest proces, aciditatea

93

crescuta a fructelor se reduce cu peste 30%, datorita faptului ca o parte din acidul malic se transforma in dioxid de carbon (0.33g CO2/g acid malic). Agentii fermentatiei malo-lactice

Avand o deosebita importanta in vinificarea strugurilor necopti sau cu aciditate ridicata, aceasta fermentatie este determinata de unele bacterii lactice din genurile: Lactobacillus Beijerinck, Leuconostoc si Pedicoccus, din care amintim: Bacterium gracile, Micrococcus malolacticus, M. multivorax, M. variococcus, Streptococcus malolacticus, S. mucilaginosus vini, Pedicoccus vini.

Mecanismul fermentatiei malo-lactice

Secventele succesive de transformare a acidului malic in acid lactic si dioxid de carbon sunt urmatoarele: 1. Acidul malic, in prezenta difosfopiridin nucleotidei (DPN) si a ionilor de Mg, se transforma, sub actiunea enzimei malat-dehidrogenaza in acid oxal-acetic; 2. Acidul oxal-acetic este decarboxilat in acid piruvic, agentul de reactie fiind enzima oxal-acetat decarboxilaza; 3. Acidul piruvic este redus de lactatdehidrogenaza in acid lactic si dioxid de carbon. Energia de reactie necesara este procurata de microorganismele implicate in transformarea proteinelor din must in azot amoniacal si in degradarea unei parti (30-50%) din acidul malic pana la dioxid de carbon si apa cu eliberare de energie (cca 320 kcal/mol).

Importanta fermentatiei malo-lactice

In anii in care strugurii nu se coc suficient, iar vinurile au o aciditate ridicata, prin reducerea aciditatii datorita acestei fermentatii, vinurile devin mai catifelate si mai agreabile la gust. Podgorenii pot favoriza aceasta fermentatie printr-o serie de operatiuni tehnologice la indemana fiecaruia, care vor avea ca efect nu numai reducerea aciditatii vinului, dar vor impiedica si fermentarea acida a zaharului

94

rezidual. Ca principiu, se poate spune ca o fermentare lactica dirijata prin selectionarea naturala a unor bacterii lactice heterofermentative va avea ca efect favorizarea reducerii continutului de acid malic. Aceasta este posibila prin: tragerea mai rapida a vinului de pe drojdie, agitarea mai energica a drojdiei, sulfitarea mustului, mentinerea temperaturii in domeniul optim al bacteriilor heterofermentative, diluarea mustului si suplimentarea concentratiei de zaharuri, adaugarea unui vin cu pH sub 3,6 mustului ce fermenteaza, etc.

2.5 FERMENTATIA ANAEROBA METANICA

Definitie: prin acest tip de fermentatie are loc o degradare anaeroba a unor reziduuri rezultate din activitatile gospodaresti si transformarea lor in metan, hidrogen si alte produse combustibile, sub actiunea mai multor grupe de microorganisme.

Agentii si mecanismul fermentatiei anaerobe metanice

Deseurile

animaliere,

gospodaresti,

orasenesti,

biomasa

vegetala

autumnala, etc., sunt degradate de trei grupe de microorganisme, si anume:

in prima grupa sunt incluse bacterii anaerobe din genurile Clostridium, Bacteroides, Ruminococcus si Butyrivibrio si bacterii facultativ anaerobe ca Escherichia coli si Bacillus ce degradeaza biopolimerii ca celuloza, proteinele, etc., formand H2, CO2, etanol, acizii formic, butiric, si propionic, alcoolii etilic si metilic;

grupa a doua cuprinde microorganismele ce transforma acesti produsi in aldehida acetica activata si anume genurile: Syntrophobacter, Syntrophomonas si Desulfovibrio;

a treia grupa este compusa din bacterii metanogene ce transforma produsii rezultati din prima si a doua etapa (H2, CO2, alcoolii, acizii, s.a.) in metan. 95

Importanta fermentatiei metanice

Deoarece procesul fermentativ decurge in natura la scara mare, cu o mare productie de energie (echivalenta cu 50 x 1.05 x 109 GJ/an), el ar putea fi folosit prin instalatii simple de fermentare si captare a biogazului la nivelul fermelor si gospodariilor rurale. In urma fermentatiei metanice, biomasa degradata constituie un ingrasamant natural, ecologic, cu continut foarte ridicat de humus, compusi azotati si carbon.

2.6 FERMENTATIA BUTIRICA

Definitie: Fermentatia butirica reprezinta un proces biologic anaerob prin care bacteriile butirice metabolizeaza diverse surse, in speial hidrocarbonati,

transformandu-le in acid butiric. Acest tip de fermentare asigura energia necesara desfasurarii functiilor vitale si multiplicarii agentilor de fermentatie.

Agenti ai fermentatiei butirice

Bacteriile butirice apartin, in marea lor majoritate, cca. 100 de specii, genului Clostridium din familia Bacillaceae, fiind caracterizate prin capacitatea de formare a endosporilor in forma de suveica sau de maciuca, avand dimensiuni mai mari ca celula vegetativa formatoare. Endosporii sunt o forma de rezistenta indelungata in conditii de mediu foarte diferite, a caror distrugere nu se poate realiza decat prin sterilizare la temperaturi peste 130oC, cel putin 20 minute. Bacteriile butirice au un echipament enzimatic foarte diversificat,

permitandu-le sa foloseasca ca mediu de dezvoltare substrate poliglucidice, proteice, pectine cu macromolecule complexe, dar si compusi chimici mai simpli ca de exemplu monoglucide, acizi organici (lactic, propionic), alcooli (glicerina,), compusi cu azot, etc. Morfologic, bacteriile butirice se prezinta sub forma de bastonase care sporuleaza usor. Inainte de sporulare ele se maresc si iau forma de maciuca sau de fus, iar unele specii formeaza in interiorul celulei, inainte de a sporula, o 96

substanta de rezerva, cunoscuta sub numele de granuloza (asemanatoare cu amidonul), sintagma ce a stat la originea denumirii unor specii: Granulobacter. Bacteriile butirice sunt raspandite in pamant, cereale, produse lactate, conserve, materii fecale, etc., efectul prezentei lor fiind, in majoritatea cazurilor, nedorit. Produselor agricole si alimentare le depreciaza calitatea (produc

bombajul conservelor si balonarea tarzie a branzeturilor, imprima un gust specific neplacut unor bauturi alcoolice, etc.). In raport cu produsul finit al fermentatiei, bacteriile butirice pot fi clasificate dupa cum urmeaza:

bacterii butirice propriu-zise (zaharolitice), din care evidentiem speciile mai importante pentru domeniul agro-alimentar: Clostridium saccharobutiricum, Cl. tyrobutiricum, Cl. pasteurianus, Cl. nigricans;

bacterii butirice producatoare de solventi, ce metabolizeaza, de asemenea, compusii hidrocarbonati, dar produc, dupa fermentatia butirica, alcool etilic, acetona, alcooli propilic, butilic, pentilic (propanol, butanol, pentanol), grupa din care se amintesc: Clostridium buthyricum, Cl. acetoaethylicum, Bacillus macerans;

bacetrii peptonolitice, reprezentand o grupa de bacterii de putrefactie, ce foloseste ca substrat peptone, peptide, aminoacizi si alti compusi organici continand azot (de exemplu ureea), dintre care mentionam: Clostridium sporogenes, Cl. hystoliticum, Cl. stiklandi (bacterii alterante ce produc bombarea conservelor), Cl. botulinum, Cl. perfringens (agenti ce produc toxine grave pentru om si animale).

Donker, citat de Motoc, a propus in 1926 urmatoarea clasificare:

genul Aerobacillus - grupeaza bacteriile facultativ anaerobe care ataca zaharurile atat in mediu aerob cat si anaerob, din care fac parte speciile: Bacillus macerans (produce dextine cilice), Bac. acetoaethylicus, Cl. polymyxa;

genul Clostridium - cuprind bacterii strict anaerobe care degradeaza zaharurile numai prin fermentare: Cl. Pasteurianus (produc amareala vinurilor tinere), Amylobacter pectinovorum (agentul topirii inului) etc.; 97

genul Pectoclostridium - ataca glucidele, dar si compusii de degradare a proteinelor, facand o jonctiune intre bacteriile butirice si cele de putrefactie.

Trebuie sa mentionam ca toate clasificarile sunt arbitrare si privite cu rezerva.

Mecanismul fermentatiei butirce

Redam, schematic, mecanismul general al acestei fermentatii. Mecanismul, produsii finali si randamentele variaza larg in functie de mai multi factori, dintre care amintim: natura si specificitatea agentului de fermentatie, compozitia si pH-ul, etc

Glucoza

Acid piruvic

Acid acetic

Acetil CoA + CO2 + H2

Acetona + CO2

Aceto-Acetil CoA

Alcool izopropilic

Butinil - CoA

Alcool butilic

Acid butiric 98

2.7 FERMENTATII OXIDATIVE (AEROBICE) - Fermentatia acetica

Fermentiile oxidative sunt reactii biochimice de natura enzimatica, prin care, in prezenta oxigenului molecular din aer, substantele substratului sunt transformate in acizi organici. Spre deosebire de respiratia aeroba, in care oxidarea substantelor este completa (producandu-se CO2, apa si energie calorica), in fermentatia aerobica, oxidarea se opreste la formarea unor produsi intermediari (acizi). In natura se intalnesc multe asemenea fermentatii, din acestea insa, considerate a fi intalnite mai des in activitatile gospodaresti si in fermele de microproductie sunt: fermentatia acetica, fermentatia pectolitica si fermentatia proteica. In acest curs, in continuare va fi prezentata fermentatia acetica:

Definitie: Fermentatia acetica este un proces biologic aerob, de natura enzimatica, prin care substratul asupra caruia actioneaza microorganismele (alcoolul etilic) este transformat in acid acetic (otetul este o solutie continand 6 9% acid acetic), astfel incat acesta reprezinta principalul produs finit al fermentatiei acetice.

Agenti ai fermentatiei acetice

Principalii agenti ai fermentatiei acetice sunt bacteriile acetice din genurile Acetobacter, Acetomonas (Gluconobacter), cuprinse in familia

Pseudumonodaceae, ordinul Pseudomonodales, bacterii strict aerobe, nesporulate si gram negative. Acestea au forma de bastonase, uneori cu capete rotunjite sau umflate, alteori usor curbate, care se dezvolta sub forma de voal stralucitor, transparent si fragil.

99

In cea mai mare parte, bacteriile acetice sunt mezofile, avand temperatura optima in jurul valorii de 30oC (19 - 36oC), producand acid acetic in concentratii de 2% (Bacterium suboxidans) pana la 11% (B. schutzenbachii). Dupa mediul in care se dezvolta, Hannenberg si Lazar (Citati de D. Motoc) clasifica bacteriile acetice in:

bacterii

acetice

izolate

din

plamezi

amidonoase

(Gluconobacter

suboxidans, Acetobacter industrium); bacterii acetice izolate din bere (Acetobacter kutzingianum, A.

Pasteurianum); bacterii acetice izolate din vin (A. Ascendens, A. Teurianum); bacterii acetice industriale (Bacterium acetigenum).

Mecanismul fermentatiei acetice

Biochimismul fermentatiei este oxidarea alcoolului etilic, formandu-se ca produs intermediar aldehida acetica activata (acetil coenzima A) si apoi hidratata (apa provenind dintr-o reactie conexa, catalizata enzimatic de catalaza in prezenta F.A.D.):

Alcool etilic

Acetil - CoA

Acetil - CoA hidratata

Acid acetic

Importanta practica a fermentatiei acetice 100

Fermentatia acetica prezinta importanta practica in activitatile gospodaresti si industriale. Principalul aspect practic legat de fermentatia acetica este obtinerea otetului folosit la marinarea unor produse culinare si pentru conservarea legumelor si fructelor. De asemenea, fermentarea boabelor de cacao, prin care acestea capata aroma si alte caracteristici organoleptice specifice este acetica. O importanta deosebita o prezinta cunoasterea caracteristicilor

microorganismelor acetice si a mecanismului fermentatiei acetice pentru prevenirea si combaterea otetirii vinului. In vinurile slabe se dezvolta bacterii acetice (mai importante fiind: Acetobacter ascendens, A. orlenense, A. pasteurianus, A. vini acetati, A. xylinoides, A. xylinum), care oxideaza, treptat, alcoolul din vin. Conditiile favorizante ale otetirii vinurilor sunt urmatoarele: continut de alcool sub 12%, aciditate volatila peste 1,4 g/l (in cazul vinurilor albe), respectiv 1,7 g/l (la vinurile rosii), accesul aerului, temperaturi ambiante de 19 - 38oC. Otetirea vinului este o boala grava si periculoasa, deoarece, odata contaminat vinul, nu mai exista remediu curativ. Prevenirea este necesara, in acest scop folosindu-se acidul sulfuros liber, ca antiseptic. Un rol important in raspandirea bacteriilor acetice il are musculita otetului (Drosophyla melanogaster)..

101

Capitolul 3

NOTIUNI GENERALE DESPRE MICROBIOLOGIA SOLULUI, A APEI SI A AERULUI. ROLUL MICROORGANISMELOR IN NATURA.

In acest capitol va sunt prezentate:

microflora solului si importanta acesteia; microflora apei - purificarea apei si a apei potabile;

102

microflora aerului.

Datorita insusirii de a se inmulti repede, microorganismele sunt foarte raspandite in natura, aceasta raspandire depinzand insa de prezenta substantelor nutritive, de temperatura, umiditatea si reactia substratului. Aceste conditii exista, mai ales in sol si, in mod practic, el reprezinta sursa principala pentru microflora din aer si apa.

3.1 MICROFLORA SOLULUI

Microorganismele se pot gasi la mii de metri adancime in ocean, la cativa metri in pamant sau chiar pe stanca goala in desert. Dezvoltarea lor depinde de conditiile de nutritie si de ceilalti factori ai mediului extern. Masa de bacterii este raspandita neuniform in sol, astfel ca, pornind de la straturile superioare catre adancime, numarul microorganismelor devine tot mai mic. Dar nici microflora nu mai este aceeasi, ea modificandu-se in diferite stadii de mineralizare: la inceput bacterii asporogene, apoi sporogene. Astfel, in ordinea succesiunii apar urmatoarele grupe de bacterii:

a. Bacterii nitrificatoare b. Bacterii denitrificatoare

genul Nitrobacter Bacterium denitrificans Bacterium fluorescens

c. Bacterii fixatoare de azot

genul Azotobacter Clostridium pasteurianum

d. Bacterii ce se gasesc in nodozitati la plantele leguminoase e. Bacterii de putrefactie f. Bacterii butirice g. Bacterii sporogene -

Rhizobium phaseolus Rhizobium leguminosarum Bacillus sporogenes Clostridium butyricum Bacillus mycoides Bacillus mesentericus

103

3.2 MICROFLORA APEI

Apa constituie cel de-al doilea mediu natural, dupa sol, pentru dezvoltarea microorganismelor, datorita prezentei substantelor nutritive. In acest caz, bacteriile sunt mai numeroase la circa 5-20 m adancime in apa. La suprafata apar mai ales pe mil. Se intalnesc mai des:

a. Bacterii sulfuroase b. Bacteriile fierului c. Bacterii ce fermenteaza celuloza d. Bacterii de putrefactie e. Bacterii butirice

In apa gasim bacterii asporogene, in mil bacterii sporogene. Apele subterane si de izvor sunt mai sarace in bacterii, din cauza lipsei de substante nutritive. Apa de ploaie si de zapada contine foarte putine bacterii daca cade pe locuri fara praf, in caz contrar continand zeci si sute de germeni.

Purificarea apelor si a apei potabile

Purificarea apelor se poate face natural, proces numit autopurificare, care se poate realiza prin: - diluare prin afluenti; - scaderea substantelor nutritive; - sedimentare; - distrugerea bacteriilor de catre protozoare

Purificarea apei potabile se realizeaza prin diferite procedee combinate: 104

- sedimentare: se reduc cca 75% din microorganisme; - coagulare: se reduc cca 90% din microorganisme; - filtrare: se reduc cca 99% din microorganisme; - tratare cu clor: se aplica numai dupa filtrare.

3.3 MICROFLORA AERULUI

Aerul nu este un mediu prielnic de dezvoltare al microorganismelor. Numarul de germeni din aer depinde de microflora solului deasupra caruia se gaseste; daca microorganismele nu s-ar depune, ele ar fi distruse de lumina.

Rolul microorganismelor in natura

Microorganismele au un rol important in solubilizarea elementelor minerale indispensabile vietii plantelor: calciu, fosfor, potasiu. Se creaza astfel un circuit al diferitelor elemente: carbon, azot, fosfor, sulf.

Circuitul carbonului

- este destul de complex, cuprinzand o serie de etape

principale. Pe scurt, acest proces se desfasoara astfel: in aer exista CO2 care este singura sursa de carbon pentru plantele verzi.; in cloroplastele frunzelor, cu ajutorul energiei solare, CO2 este transformat de catre microorganisme in compusi organici complecsi: glucide, lipide si protide, proces conditionat de existenta unei cantitati suficiente de CO2 in atmosfera.

Circuitul azotului - azotul intra in compozitia tuturor organismelor vii, transformarile compusilor organici cu azot cuprinzand urmatoarele etape:

amonificarea

- faza in care sub actiunea microorganismelor (bacterii,

mucegaiuri, actinomicete), compusii organici azotosi sunt transformati in compusi minerali cu azot si saruri de amoniu;

nitrificarea - a doua faza de transformare legata de oxidarea amoniacului, la inceput in acid azotos si apoi in acid azotic. Este procesul biologic cel mai 105

raspandit in sol si de mare importanta pentru agricultura, deoarece plantele utilizeaza azotul sub forma de nitrati. Are loc sub actiunea a doua grupe de microorganisme, numite generic " bacterii nitrificatoare ": - prima etapa , cu obtinere de acid azotos, se realizeaza de catre bacteriile nitroase, NITROSOBACTERII (genul Nitrosomonas, genul Nitrospira, genul Nitrosocystis); - a doua etapa, cu obtinere de acid azotic, se realizeaza de catre bacteriile nitrice, NITROBACTERII (genul Nitrobacter).

denitrificarea molecular,

- a treia faza in care sarurile azotate sunt reduse la azot actiunea microorganismelor: Bacillus subtilis, Bacillus

sub

mycoides, Bacterium denitrificans, Pseudomonas denitrificans, Thiobacillus denitrificans.

fixarea azotului molecular - ultima veriga, care duce la imbogatirea solului in azot, fenomen foarte important, determinat de faptul ca plantele verzi nu pot asimila singure azot atmosferic. Astfel, prin acest proces, se mentine echilibrul in azot. Fixarea azotului molecular se face cu ajutorul bacteriilor fixatoare de azot nesimbiotice si simbiotice. Dintre bacteriile fixatoare de azot nesimbiotice fac parte: - genul Azotobacter - aerobe - (A. agilis, A. vinelanolii, A. nigricans) - genul Clostridium anaerobe - (C. pasteurianum, C. butyricum, C.

naviculum) - genul Pseudomonas - (P. fluorescens, P. radiobacter) Dintre bacteriile fixatoare de azot simbiotice fac parte cele din genul Rhizobium: (R. phaseoli, R. trifoli, R. japonicum, R. meliloti, R. lupini, R. leguminosarum) Aceste bacterii simbiotice se gasesc in nodozitatile plantelor leguminoase: fasole, soia, mazare, lucerna, trifoi, aceste plante fiind numite imbogatesc solul in azot". " plante ce

Circuitul sulfului - proces cu obtinere de acid sulfuric, este important prin faptul ca formarea H2SO4 usureaza trecerea sarurilor minerale in stare solubila, crescand astfel cantitatea de compusi minerali accesibili plantelor. Procesul este produs de sulfo-bacterii si tiobacterii.

106

Circuitul fosforului - se realizeaza in trei etape:

mineralizarea fosforului organic prin trecerea in fosfati - are importanta deoarece compusii organici cu fosfor nu pot fi utilizati de catre plante; "mobilizarea fosforului" - se face prin actiunea bacteriilor nitrificatoare, a tiobacteriilor; reducerea fosfatilor de catre bacteriile anaerobe, cu formare de acid fosforos, acid hipofosfor si hidrogen sulfurat.

Acest proces duce la pierderea unor fosfati, elemente nutritive pentru plante; poate fi evitat printr-o aeratie buna a solului. In acest sens, se poate folosi un preparat cu bacterii, care imbunatateste nutritia cu fosfor a plantelor. Preparatul se numeste "Fosfobacterin" si transforma fosforul din compusii organici in forma minerala.

Circuitul fierului - fierul intra in constitutia tesuturilor vegetale sub forma de compusi organici. Dupa moartea plantelor, prin diverse procedee de fermentare conduse de microorganisme, compusii organici sunt mineralizati si apoi oxidati de catre bacterii in fier feric, Fe3+, care poate fi din nou folosit de catre plante. Astfel, se realizeaza circuitul complet al fierului.

107

Capitolul 4

AGRICULTURA ECOLOGICA

In acest capitol va sunt prezentate:

definitia compostului - un fertilizant ideal, nepoluant; metode de compostare, tipuri de compost

4.1 COMPOSTUL - un fertilizant ideal nepoluant

108

Agricultura intensiva, de tip industrial, a contribuit si ea la degradarea si poluarea mediului ambiant. Astfel, pe de o parte, "conceptia agrochimica" a dus la neglijarea obligatiei de a intretine fertilitatea naturala a solului prin ingrasarea lui cu materii organice corespunzatoare. Pe de alta parte, organizarea specializata, de tip industrial, a crescatorilor mari de animale, a avut in vedere numai productia animaliera comercializabila, neglijand productia de dejectii, reprezentand astfel o rupere brutala a circuitelor biologice din natura. In urma experientei acumulate in decurs de doua secole, omenirea a tras invatamantul pretios al obligatiei de salvgardare a habitatului in calitate de colaborator al naturii. In acest sens, sarcina principala a epocii actuale consta in dezvoltarea de tehnologii corespunzatoare cu idealul umanist, astfel incat omul sa poata deveni o fiinta cat mai deplin integrata in mediul social si ambianta cosmica. Marele secret, cunoscut de catre antici, redescoperit si fundamentat de stiinta moderna, il constituie tehnica formarii si mineralizarii humusului in practica agricola. O metoda biologica de fertilizare a ogorului consta in incorporarea resturilor vegetale tocate (paie, coceni, tulpini) in aratura, asigurandu-se astfel cantitatea de ingrasamant azotat necesara descompunerii resturilor vegetale. La procesele biotransformarii materialelor organice in sol participa intr-un fel sau altul intreaga microflora a solului. Microorganismele au un rol important in solubilizarea elementelor minerale indispensabile vietii plantelor: calciu, fosfor, potasiu. Se creaza astfel un circuit al diferitelor elemente: carbon, azot, fosfor, sulf. In limbaj stiintific, pentru desemnarea proceselor de descompunere a deseurilor organice si a dejectiilor animale, circula 2 termeni:

1. fermentatie - mai ales cand e vorba de gunoi de grajd 2. compostare - atunci cand alte materiale organice sunt asezate in gramezi si umectate pentru a incepe fermentatia.

Odata cladita gramada de compostare, daca conditiile de umiditate si aeratie sunt asigurate, se declanseaza o serie de procese de descompunere de natura microbiologica si enzimatica, care elibereaza zaharuri simple din celuloza,

109

hemiceluloza, xilani si pectine. in acelasi timp proteinele sunt scindate pana la aminoacizi, iar grasimile in acizii grasi si alcoolii corespunzatori. Aceste substante sunt metabolizate de microorganismele care populeaza gramada de compost. In timpul acestui proces, datorita respiratiei intense, temperatura atinge +70oC. Aceste temperaturi mari asigura sterilizarea materialelor de agentii patogeni pentru om, precum si distrugerea semintelor de buruieni. Prin urmare, se numeste compostare, procesul de transformare pe cale biologica a deseurilor celulozice si proteice, din surse menajere sau industriale, precum si a dejectiilor de animale, intr-un produs nepoluant, cu mare valoare nutritiva si energetica pentru microorganismele din sol si pentru plante, un excelent amendament pentru sol. Produsul obtinut prin compostare se numeste compost Gunoiul de grajd supus fermentatiei este tot un compost, dar in vorbirea curenta I se spune " gunoi fermentat sau putrezit".

4.2 METODE DE COMPOSTARE - TIPURI DE COMPOST

Exista doua tipuri de procese biologice de descompunere a materiei organice: - un proces aerob (fermentare aeroba), cand temperatura se ridica la 65 - 75 oC - un proces anaerob (fermentare anaeroba), la temperatura de cca 30 - 35 oC

Metoda biodinamica de compostare

La nivelul micilor ferme, compostarea se realizeaza dupa acest procedeu. Se fac gramezi de deseuri cu sectiunea trapezoidala, cu baza de 2.5 - 4 m, latimea la varf de 1m, iar inaltimea de maximum 2 m. Raportul intre carbonul organic si azotul total al amestecului ce se composteaza trebuie sa fie intre 11:1 si 29:1. Umiditatea favorabila este cuprinsa intre 45 - 65% (raporatata la substanta proaspata). Gramada se acopera pe toata suprafata cu un strat subtire de pamant, care are rolul sa protejeze gramada in timpul fermentarii contra radiatiei solare si

110

sa nu lase ca amoniacul care rezulta din fermentatie sa se piarda in atmosfera, conservand totodata si umiditatea. Compostarea dureaza, in functie de felul deseurilor, intre 6 si 12 luni. Compostul care rezulta este foarte apropiat prin compozitie de humusul solului. S-a constatat ca substantele solubile in apa, grasimile si pectinele sunt primele care se descompun. Acestea sunt urmate de celuloza, iar lignina este cea mai rezistenta la descompunere. Medicul, chimistul si filozoful german Steiner a propus o tehnologie originala de compostare a gunoiului de grajd. Steiner a enuntat principiile dupa care gunoiul de grajd poate fi transformat intr-un ingrasamant organic concentrat cu efect favorabil pentru mentinerea si cresterea fertilitatii solului. Dirijarea proceselor de fermentare se realizeaza prin biopreparate . Compostul biodinamic poate fi folosit in orice cantitati fara sa provoace dereglari in procesul de crestere a plantelor.

Procedeul Indore de compostare

Compostarea dupa procedeul Indore se face cladind gunoiul de grajd sau orice alt deseu organic animal si vegetal sub forma unei gramezi cu sectiunea triunghiulara cu baza de 1.5 m si inaltimea initiala de 1.5 m, lungimea gramezii fiind dupa voie. Conform procedeului Indore, una dintre conditiile de baza pe care materialele supuse compostarii trebuie sa le indeplineasca este ca amestecul de materiale sa aiba un raport de C:N in jur de 33:1. A doua conditie este ca umiditatea amestecului sa fie cuprins aintre 50 - 65%. Compostarea trebuie sa se desfasoare in primele stadii in conditii aerobe. De aceea, o a treia conditie cere ca materialele care se composteaza sa formeze o gramada afinata pentru a permite accesul aerului. Procesele fermentative sunt dirijate prin operatii periodice de

111

desfacere si recladire a gramezii de compostare, avand grija sa se realizeze o amestecare buna a straturilor superioare cu cele inferioare. Prima remaniere a gramezii se face dupa 2-3 saptamani de compostare, a doua remaniere facandu-se dupa alte 3 saptamani. Temperatura in gramada trebuie mentinuta in jur de 60 oC. Dupa 3 luni de compostare, umiditatea in gramada trebuie sa scada sub 40%, pentru ca procesele fermentative sa inceteze, temperatura scazand si ea la 30oC. Raportul C:N la acest tip de compost este de 18:1 - 20:1.

Metoda de bioconversiune Italcampo a gunoaielor menajere

Cercetarile efectuate la Centrul de studii de biologie a solului din Bologna (Italia) au condus la brevetarea unui procedeu de compostare numit "bioconversia materiei organice". In principiu se prepara o gramada-mama din deseuri organice, in care se inglobeaza biopreparate obtinute din culturi microbiene selectionate in laborator. Dupa ce fermentarea se declanseaza si cuprinde intreaga gramada, materialul in care s-au inmultit culturile de microorganisme este amestecat in proportie de 10% in gramada de compost, care se cladeste sub forma de prisma cu sectiune triunghiulara, avand la baza 6 m, inaltimea de 3 m si lungimea dupa locul destinat. Procesul se desfasoara predominant aerob, temperatura medie in gramada fiind de 55 - 65 oC iar umiditatea optima 45 - 60%. Se fac remanieri periodice la 20 zile, apoi la o luna, acestea putandu-se face mecanizat. Compostul rezulta dupa trei luni de fermentare, find apoi cernut prin site mecanice. Mai departe compostul este macinat si cernut din nou. Pastrarea compostului in saci de material plastic ii confera o conservare de circa 1 an in orice conditii de depozitare.

112

Capitolul 5

MICROFLORA EPIFITA A FRUCTELOR SI LEGUMELOR

In acest capitol va sunt prezentate:

ce reprezinta microflora epifita specifica; tipuri de putrezire a fructelor si legumelor; principalele boli care duc la depreciera legumelor si fructelor in conditii de depozitare; conditiile ambientale din depozite, punctul de inghetare a fructelor si durata de pastrare recomandate pentru unele fructe

5.1 DEFINITII

Pe suprafata fructelor si legumelor exista permanent un numar de microorganisme cu variatii extrem de largi, care creste pe masura ce ele gasesc conditii de dezvoltare. Ele provin din mediul inconjurator, majoritatea din aer, aduse de praf, insecte si animale, dar si din pamant sau din apa pluviala sau cea de irigare. Ajunse pe fructe si legume, unele forme neadaptabile dispar, altele se dezvolta prin adaptarea la conditiile de mediu in care cresc fructele si legumele, formand o microflora epifita specifica. Cunoasterea microflorei specifice este necesara pentru orice fermier si gospodar ce doreste sa foloseasca in mod eficient resursele fructifere si leguminoase ale propriei gospodarii sau ferme. Deoarece unele microorganisme pot produce pagube importante, ele trebuie omorate sau inhibate, altele, a caror activitate este benefica omului (ex.: drojdiile ce fermenteaza mustul fructelor), din contra, trebuie stimulate pentru a se dezvolta in conditii optime. Pe fructe, in functie de caracteristicile fizico-chimice ale acestora, se dezvolta o microflora foarte diversa, atat ca numar, cat si din punct de vedere al speciilor. Variabilitatea este in functie de un mare numar de factori, cum ar fi 113

factorii de mediu, stadiul de dezvoltare al fructelor si legumelor, gradul de coacere, starea compozitionala a acestora, zona de amplasare a culturilor, starea de sanatate si tratamentele fitosanitare aplicate livezilor si culturilor agricole. Numarul lor variaza de la cateva zeci de mii de germeni pe gram pana la cateva zeci de milioane de germeni pe gram (ex: la spanac s-au constatat intre 5 20 milioane germeni / gram) Germenii de microorganisme fac parte din microflora saprofita (grec. Sapros = putred, stricat). Aceasta este parazita, hranindu-se cu substantele fructelor si legumelor in descompunere, dar nu produce, in conditii obisnuite, imbolnaviri, sau patogena, adica, daunatoare sanatatii omului si animalelor. Este dificil a se face o inventariere exhaustiva a microflorei epifite, astfel ca se vor mentiona principalele categorii de microorganisme identificate pe fructe si legume. In general, fructele sunt invadate de mucegaiuri ce distrug, local, pericarpul, permitand patrunderea in interiorul fructului a germenilor de suprafata. Printre cele intalnite cu frecventa mare la mai toate fructele se amintesc genurile Monilia, Phoma, Rhizopus, Penicillium, Oospora, Fusarium, Trichothecium, Aspergillus, etc. (Specii mai importante: Penicillium glaucum, Rhrizopus nigricans, s.a.). Mucegaiurile sunt detinatoarele unui echipament enzimatic foarte divers si eficace, in sensul ca pot ataca aproape orice fel de substrat organic, fapt evidentiat si in partea generala a acestui curs. Ele pot provoca putrezirea umeda si uscata (Alternaria - provoaca putrezirea bruna, Botrytis cinerea - produce putrezirea cenusie, Cladosporium - constituie agentul de putrezire negru-bruna la pepeni, Fusarium si Trichothecium - patrund pe la codita fructelor si a legumelor provocand putrezirea umeda, Penicillium - provoaca putrezirea umeda verde) Prezenta drojdiilor din microflora epifita a fructelor si legumelor are ca efect procese metabolice ce conduc la fermentatii, inmuierea pulpei si, in final, la deprecierea calitativa a acestora. Multe specii de drojdii sunt utilizate in fermentarea alcoolica sau acida a unor sucuri, in vederea obtinerii unor bauturi fermentate. Printre acestea se amintesc: genurile Saccharomyces Rees,

Zygosaccharomyes, Torulaspora, Pichia, Saccharomycodes, Hansenula, etc. In general, bacteriile actioneaza asupra fructelor si legumelor cu reactia mediului slab acida, neutra sau alcalina. Exista si bacterii acido-tolerante (ex: cele lactice), care se dezvolta asociate cu drojdiile de la care folosesc unii factori de 114

crester (biotina) sau metaboliti rezultati din activitatea drojdiilor. Bacteriile epifite cuprind specii din toate categoriile (aerobe, anaerobe, facultativ aerobe, saprofite, patogene, mezofile, termofile, acido-tolerante, etc.) si constituie o microflora specifica legumelor si fructelor. Informatiile referitoare la microflora patogena a fructelor si legumelor pot constitui o baza suficient de bogata pentru lucrari stiintifice de mare amploare. Lucrarea de fata nu-si propune decat abordarea rezumativa a acestui subiect, cei interesati de acest domeniu putand consulta lucrari de bacteriologie sau microbiologie medicala. Cu toate acestea, tinand seama de unele epidemii declansate in ultimii ani, vom aminti pe scurt cateva informatii referitoare la microflora patogena a fructelor si legumelor. Consumarea sau prelucrarea fructelor si a legumelor fara spalarea si chiar dezinfectarea acestora poate deveni periculoasa pentru oameni, din cauza prezentei microflorei patogene epifite sau anaerobe. Unele fructe si legume contin substante ce pot impiedica dezvoltarea acestor microorganisme, caz in care, spalarea lor cu jet de apa sub presiune este suficienta. In alte situatii, simpla spalare este insuficienta, caz in care este necesara dezinfectarea cu produse speciale. Astfel, prin folosirea unor solutii in apa (1-3%) de hipoclorit de calciu (clorura de var), cloramina, formalina, s.a., in care se cufunda timp de 5 - 30 minute produsele vegetale inainte de a fi prelucrate, se obtine un efect sterilizant fara modificarea caracteristicilor organoleptice. Alteori, insa, este necesar sa fie aplicate masuri speciale de sterilizare (termica) pentru a distruge germenii sporulati rezistenti.

Microflora patogena poate proveni din soluri infectate unde se cultiva fructele si legumele, din apa de irigare sau chiar de ploaie, atunci cand atmosfera este poluata, din particulele de praf vehiculate de curnetii de aer, precum si din multe alte surse de infectie (prezenta cadavrelor, etc.) Majoritatea microflorei patogene este constituita din bacteriile ce fac parte din majoritatea familiilor cunoscute, atat bacterii aerobe, cat si germeni anaerobi. Cele mai raspandite specii de bacterii patogene gasite pe fructe si legume fac parte din familia Enterobacteriaceae. Astfel, genul Escherichia provoaca infectiile colibacilare, genul Shigella produce infectia dizenterica, genul Salmonella da

115

salmonazele, genurile Proteus, Aerobacter, Klebsiella si altele produc infectii specifice. Si familia Mycobacteriaceae cuprinde specii patogene pentru om. Specia Mycobacterium tuberculosis din genul Mycobacterium provoaca infectia

tuberculoasa. Genul Brucella din familia Brucellaceae are specii ce produc infectia bruceloasa, boala epidemica raspandita prin contaminare alimentara digestiva sau prin contaminare indirecta si deosebit de periculoasa. Dintre germenii de bacterii aerobe sau facultativ aerobe periculoase pentru om, in microflora epifita a fructelor (in special) si a legumelor, importante sunt bacteriile din genul Brucella, aflate in sol, praf si noroi, care produc infectia bruceloasa. Din genul Bacillus, specia B. anthracis prezinta patogenicitate ridicata pentru om si animale (ovine, in special), producand infectia carbunoasa (buba neagra). Alte specii de Bacillus sunt nepatogene (B. megaterium, B. polymyxa, B. brevis, s.a.). Din microflora anaeroba, bacterii din genul Clostridium , multe specii sunt patogene pentru om si animale, producand toxinfectii foarte grave. (Cl. Perfringens, Cl.. septicum, Cl. botulinum, Cl. tetani, etc.).

5.2 PUTREZIREA FRUCTELOR SI A LEGUMELOR

Putrezirea fructelor si legumelor este produsa de mucegaiuri, incepand cu partile ranite, in care hifele patrund in mod natural. De asemenea, galeriile larvare constituie teren prielnic pentru patrunderea germenilor ce provoaca putrezirea. La deprecierea fructelor si legumelor pot participa si ciuperci saprofite, care actioneaza prin consumarea celulelor moarte, dar dupa un timp ele devin active si trec la parazitism. Dupa cum se arata in capitolul destinat mucegaiurilor, acestea dispun de o mare putere de adaptare metabolica, datorita unui echipament enzimatic foarte divers, ce poate prelucra orice tip de substrat. In cazul alterarii si putrezirii fructelor si legumelor, mucegaiurile actioneaza, sub aspect biochimic, in mai multe etape, simultane sau succesive: 1. hidratii de carbon polimoleculari sunt transformati in zaharuri simple; 2. pectinele sunt hidrolizate in formatiuni moleculare mai mici (acid pectic, s.a); 116

3. din zaharurile simple, prin fermentare se produc alcooli si acizi organici; 4. urmeaza oxidarea acestora la dioxid de carbon si apa; 5. proteinele se descompun pana la aminoacizi, amide, hidroxilamina si amoniac; 6. taninurile sunt distruse sau insolubilizate prin combinare cu proteinele, provocand colorarea specifica (brun-neagra) a fructelor si legumelor putrede.

Redam in continuare cateva tipuri, mai des intalnite, de putrezire ale fructelor si legumelor, precum si agentii ce le produc:

Putrezirea umeda se caracterizeaza prin inmuierea si liza tesuturilor, brunificarea lor si deprecierea caracteristicilor organoleptice ale produsului. Astfel, Phytophtora infestans provoaca mana cartofilor, a rosilor si ardeilor. Se manifesta prin pete brune, la inceput pe suprafata si apoi in adancime. Monilia fructigena produce putrezirea umeda a merelor si perelor necoapte sau mature, manifestata prin gustul astringent pe care acestea le capata si a petelor maronii de pe si din fructele putrezite. Mucegaiul poate suporta si temperaturile negative din congelatoare (-18oC). Putrezirea umeda a cartofului poate fi provocata si de Bacterium xanthochlorum, ce actioneaza concomitent sau dupa unele specii de Phytophtera (Ph.infestans, Ph.parasitica), degradand complet tesuturile si

imprimand un miros urat, insuportabil. Putrezirea umeda a morcovilor si a altor radacinoase se manifesta inca inainte de recoltarea lor prin aparitia unor colonii de mucegaiuri de culoare alba, inmuierea tegumentelor si aparitia zonelor brune in adancime. Raspunzatoare de imbolnavire sunt mucegaiurile Erwinia ,Sclerotinia libertiana si bacteria Bacterium carotovorum.

Putrezirea uscata a legumelor si fructelor se manifesta prin transformarea lor intr-o masa uscata, cenusie sau bruna, spongioasa. Datorita faptului ca amidonul nu este atacat de microorganisme, iar fructul bolnav are un aspect fainos, boala este foarte cunoscuta sub denumirea populara de fainare, iar agentii care o produc fac parte din genul Fusarium.

Putrezirea amara se manifesta prin aparitia unor pete brune in interiorul fructelor si legumelor, care capata un gust amar. Agentii imbolnavirii sunt mucegaiurile:

117

Gloeosporium

fructigenus,

Cephalothecium

roseum,

Trichothecium

link,

Penicillium glaucum, P.italicum, Fusarium putrefaciens, s.a.

Putrezirea nobila este specifica strugurilor recoltati tarziu si se datoreaza mucegaiului Botrytis cinerea. Mucegaiul nobil, cum mai este denumit, produce o imbunatatire a calitatii vinului, deoarece pentru dezvoltarea lui consuma zaharul si acizii organici din struguri, dar, spre deosebire de alte mucegaiuri, consuma mai repede acizii tartric si malic decat zaharurile. Pe de alta parte, prin consumarea zaharului se produce dextranul, un poliglucan omogen cu structura gelatinoasa, si glicerina, acid gluconic, acid citric, acid lactic si alcool etilic. Mucegaiul hidrolizeaza si digera pielita boabelor de strugure, si in consecinta, in perioadele calde si secetoase, strugurele pierde usor apa si se concentreaza in zahar, preazotati si polifenoli. Din aceste motive, vinurile provenite din strugurii atacati de Botrytis cinerea au un buchet specific (asanumitul buchet de mucegai nobil), o culoare cu tendinte de brunificare (necesitand o sulfitare mai puternica), contin mai mult acid gluconic si glicerina, fermenteaza intr-un timp mai indelungat, este licoros si are un gust specific inconfundabil si indescriptibil (ex: vinurile licoroase din podgoriile Cotnarului).

Putregaiul cenusiu. Acelasi microorganism, Botrytis cinerea, se poate dezvolta pe struguri, sau alte fructe si legume postmaturate, mai ales pe vreme umeda, determinand un mucegai cenusiu, pufos, format din miceliu si conidiofor, determinand putrezirea totala a acestora. Mucegaiul se dezvolta mai rapid la temperaturi scazute, intuneric si lipsa curentilor de aer.

Putregaiul alb este o boala foarte raspandita si pagubitoare la radacinoase (morcov, patrunjel, telina, pastarnac, sfecla, cicoare, s.a.) si apare la inceput pe radacinile cu leziuni superficiale (mai ales le cele recoltate si depamantate mecanizat). Pe acestea apar pete de mucegai de culoare alba, apoi se dezvolta un miceliu alb si pufos ca o vata, datorita speciei Sclerotinia sclerotiorum. Conditiile de umiditate si temperatura ridicate favorizeaza dezvoltarea ciupercii.

Putregaiul negru se manifesta prin leziuni adancite acoperite de un strat de miceliu negricios cu aspect catifelat produs de mucegaiul Stemphylium radacinum 118

si se dezvolta mai ales in depozitele de radacinoase, infectia fiind favorizata de umiditatea mai ridicata.

Putregaiul cenusiu apare pe fructele supracoapte de fructe si legume (tomate, ardei, vinete, mere, pere, citrice) si este produs de mai multe specii de Alternaria. Fructele atacate prezinta pe suprafata pete adancite de culoare bruna, cu aspect catifelat si dimensiuni variate, cuprinzand adesea portiuni mari din fruct. Alternariozele sunt periculoase si pentru faptul ca, agentul imbolnavirii se dezvolta foarte bine si la temperaturile scazute din depozitele de pastrare a fructelor si legumelor.

5.3 DEPRECIEREA UNOR LEGUME SI FRUCTE PASTRATE IN DEPOZITELE GOSPODARIILOR MICROORGANISME AGRICOLE SI AGROTURISTICE, PROVOCATE DE

Bacteriozele si micozele cartofului

Cartoful, "cea de a treia paine a romanului", constituie un substrat aproape ideal pentru dezvoltarea microorganismelor: umiditate mare (70 - 80%), cantitate ridicata (16 - 20%) de hidrati de carbon, mono si polimoleculari (glucoza, amidon), accesibili microbilor, continut moderat de substante organice diverse (proteine, minerale, vitamine, s.a.), ce pot asigura dezvoltarea microorganismelor saprofite, bacterii si ciuperci ce degradeaza tuberculul cartofului. Dintre bacterii, Erwinia cartovara var atroseptica provoaca putrezirea umeda in masa a cartofilor. Infectia debuteaza in sol si capata proportii epidemice mai ales in depozite umede, calde, neaerisite. Bacteria dezintegreaza tesuturile interne care se inmoaie. Sub coaja tuberculului se formeaza un lichid mucilaginos cu miros foarte neplacut. Bacteria este mesofila (se dezvolta la 20 - 30oC) si este omorata de temperaturi mai mari de 47oC. Mucegaiurile au o pondere importanta in infectarea cartofului si produc mari pagube mai ales pe perioada depozitarii acestuia. Astfel, Fusarium solani var. coeruleum, Fusarium roseum var. sambucinum, provoaca putrezirea uscata, cu 119

frecventa mai mare la tuberculii loviti, dar la umiditate mai mare de 80%. Aceiasi agenti se dezvolta ca o pasla pe suprafata tuberculului care nu se usuca, ci din contra, se inmoaie si se transforma intr-o pasta urat mirositoare. Limitele largi de temperatura (5 - 30oC), in care isi poate desfasura activitatea, fac din acest mucegai un periculos dusman al tuberculilor de cartof depozitati. Un alt mucegai, Phytophtona infestans, provoaca mana cartofului, o boala foarte raspandita si binecunoscuta de cultivatorii de cartof. Infectarea tuberculilor se face prin conidiile ciupercii ce se formeaza pe frunze si ajung in sol cu apa de ploaie. La recoltare, tuberculii bolnavi nu se deosebesc de cei sanatosi. In primul stadiu al infectiei, pe suprafata lor apar pete mici maronii, putin adancite, care se extind si brunifica tesuturile, inaintand in interiorul cartofului. Masurile profilactice si de combatere a acestei periculoase boli sunt descrise pe larg in lucrarile referitoare la aceasta leguma.

Bacteriozele si micozele tomatelor

Tomatele sunt atacate de un mare numar de microorganisme, incepand din camp si terminand in depozitele de pastrare. Putregaiul umed, produs de Erwinia cartovora, descris mai inainte, este o boala cu frecventa destul de ridicata, bacteria patrunzand in interiorul fructului si producand inmuierea acestuia. Pastrarea tomatelor in depozite cu temperaturi scazute (1 - 2oC), in atmosfera de dioxid de carbon, poate preveni inmultirea mucegaiului. Phytophtora infestans si Ph.parasitica provoaca mana tomatelor, facand leguma neconsumabila. Specii de Alternaria produc alternarioza sau putregaiul brun al tomatelor. In perioada recoltarii, mai ales pe fructele de tomate supramaturate, se dezvolta mucegaiul brun, Botrytis cinerea, si cel alb, Sclerotinia sclerotiorum. Specia de mucegai Rhrizopus stolonifer produce, atat la tomate cat si la ardei, putregaiul moale, miceliile formand la suprafata fructului de tomata o pasla cenusie-negriciasa.

120

Fructele de tomate prinse in camp de temperaturile scazute din cauza brumei devin sensibile la atacul mai multor ciuperci saprofite: Alternaria, Penicillium, Mucor, etc.

Bolile curcubitaceelor

Castravetii, pepenii rosii si galbeni, dovlecii sunt atacati frecvent de mucegaiul Colletotrichum lagenarium, care produce boala numita antracnoza sau manare. Fructele atacate prezinta pe suprafata pete circulare, adancite, de culoare galben - bruna, de dimensiuni variabile. Cand apare fructificarea ciupercii, in dreptul petelor apar puncte mici roz-galbui, dispuse in cercuri concentrice. Ciuperca se extinde in adancime ducand la putrezirea totala a fructului si infecteaza semintele.

Infectiile bacteriene si fungice ale unor leguminoase pentru boabe

Fasolea si Bobul pot fi infectate inca din stadiul vegetativ de o serie de mucegaiuri care produc importante pagube, mai ales in conditii de umiditate si temperatura ridicate. Colletotrichum lindemuthianum produce antracnoza, care se manifesta mai intai prin atacul asupra frunzelor si tulpinelor si se extinde asupra pastailor si boabelor. Pe pastai apar pete circular-ovoidale, delimitate de o margine brun-roscata, pentru ca ulterior, cand ciuperca fructifica, in centrul petelor sa apara o coloratie roz ce apoi se brunifica. Semintele infectate nu-si modifica aspectul si nu pot fi deosebite de cele sanatoase, astfel ca ele pot transmite boala, daca sunt semanate. Fuzariozele si alternariozele sunt printre cele mai raspandite boli la fasole si bob, fiind produse de Fusarium oxysporum faseoli, Sclerotinia sclerotiorum, Alternaria consortiale si Botrytis cinerea, care infecteaza pastaile si boabele, formand pe acestea pete brun-cenusii. Pastaile atacate se usuca, nu mai sunt bune de mancat, iar boabele raman mici si se zbarcesc. Alte boli mai importante ale fasolei si a altor leguminoase pentru boabe (bob, naut) produse de bacterii si 121 ciuperci sunt: rugina (Uromyces

appendiculatus),

vestejirea

bacteriana

(Corynebacterium

flaccumfaciens),

patarea unghiulara (Sariopsis griseola sacc.) care defoliza plantele, mucegaiul cenusiu (Botrytis cinerea), s.a. Combaterea se face printr-un complex de masuri de protectie cuprinzand: folosirea unor soluri rezistente la boli, tratarea semintei folosite, combaterea chimica in perioada de vegetatie cu produse fungicide specifice, in dozele prescrise de fitopatologi.

Mazarea. O boala importanta este arsura bacteriana produsa de Pseudomonas syringae pisi si se manifesta prin aparitia pe toate organele aeriene ale plantei a unor pete mici galben-cafenii ce se necrozeaza, in final pastaile uscandu-se si ramanand seci. Dintre micoze, cele mai des intalnite sunt: mana, a carui agent patogen este Peronospora pisi si antracnoza (ascochitoza), produsa de Mycosphaerella pinodes, Ascochyta pisi si A.pinodella. Boala se manifesta prin aparitia unor pete rotunde de 1-2 mm diametru, de culoare brun-negricioasa, care ulterior se necrozeaza. Pastaile se usuca iar boabele sunt zbarcite si brunificate. Boala este favorizata de umiditatea ridicata si temperaturi de 20 - 30oC. Alte boli ale mazarii sunt: fainarea (Erysiphe pisi), putregaiul alb (Sclrotinia sclerotiorum), septorioza (Septona pisi), fuzarioza (Fusarium

oxysporum). Combaterea lor se face prin tratarea chimica a semintelor cu produse fungicide speciale (Tirandin, Fundazol, etc.), in dozele recomandate de fitopatologi.

Bolile umbeliferelor (morcov, patrunjel, pastrnac, telina)

Bolile acestei categorii de plante, desi apar in general in timpul vegetatiei, mai ales in anii ploiosi, se manifesta in timpul depozitarii, pierderile fiind considerabile daca nu se iau masurile adecvate de depozitare si tratament fitosanitar.

122

Dintre bacterioze, putregaiul moale, provocat de bacteria Erwinia carotovora, este intalnit cu frecventa cea mai mare, mai ales in depozite, putand fi prevenit daca in incinta temperatura este de 1oC si umiditatea relativa a aerului nu depaseste 85%, impunandu-se o buna circulatie a aerului in jurul stivelor. Tratamentul fitosanitar cu produse specifice (Tiradin, Cuzin) se face la seminte, inainte de semanat. Putregaiul alb are ca agent mucegaiul Sclerotinia sclerotirum. Alte boli mai frecvente in timpul depozitarii sunt: fainarea (Erysiphe umbelliferarum), septorioza (Septoria apiicola, S.levistici, S.petroselini), in care apar pete circulare brun-negre, cu puncte albe in centru, ce patrund in adancimea radacinii, distrugand tesuturile, si putregaiul negru, ce se manifesta prin aparitia, in timpul depozitarii, a unor leziuni mari adancite. Tesuturile afectate se inmoaie si au pe suprafata un mucegai paslos (Stemphylium radicinum). Tratamentul fitosanitar se face cu Tiradin, Tecto, s.a., in timpul depozitarii.

Biodegradarea unor legume bulboase (ceapa si usturoiul)

In cea mai mare masura, virozele (dungarea galbena, mozaicul cepei) sunt cele mai raspandite, fiind produse de virusul Allium virus Smith (Marmor cepae Holmes). In timpul depozitarii, bacterioza produsa de Erwinia carotovora este boala principala. Ea se manifesta prin alternarea foilor cu aspect normal cu foi atacate, de culoare galben-bruna, moi, mucilaginoase si avand miros neplacut. Dintre micoze, mana cepei (Peronospora destructor) este boala cea mai importanta a cepei (incidenta peste 60%) si se manifesta prin putrezirea totala a cepei si usturoiului, intr-un ritm rapid (10 ore la 10oC si umiditate relativa a aerului de peste 85%). Prevenirea in timpul depozitarii nu este posibila prin tratamente fitosanitare, acestea trbuind facute in timpul vegetatiei. Putregaiul cenusiu (datorat lui Bothytis allii, B.byssoidea) are ca simptome aparitia unor pete cenusii ce se extind (mai ales la usturoi) si devin negre prin formare de scleroti ce fac interiorul bulbilor uscat. Alte boli ale cepei si usturoiului: helmintosporioza usturoiului

(Helminthosporium allii), a acrei simptomatica este acoperirea bulbilor cu un strat 123

pulverulent negru si fuzarioza cepei si usturoiului (Fusarium sq.), ce provoaca putregaiul alb.

Cateva micoze ale verzei, conopidei si guliei

Mana este boala cea mai frecventa, incepand in camp si continuand in depozite. Simptomatica bolii consta in aparitia unor pete mici, neregulate, albgalbui, avand un puf albicios pe fata inferioara a frunzelor. Boala este provocata de Peronospora brassicae, iar conditiile favorabile infectiei sunt temperaturi de 1015oC si umiditatea relativa a aerului de 90%. Combaterea cu fungicide atat in camp cat si in depozite este eficace, alaturi de utilizarea spatiilor aerisite. O alta micoza mai des intalnita este putregaiul moale, boala produsa de Erwinia carotovora, ce se manifesta prin putrezirea umeda a coceanului, capatanilor verzei si inflorescentei conopidei si transformarea tesuturilor atacate intr-o masa mucilaginoasa, urat mirositoare.

Deprecierea unor fructe pomicole cauzata de microorganisme

Fructele pomicole (merele, perele si gutuile) sunt atacate de un mare numar de bacterii, drojdii si mucegaiuri, care le provoaca degradari biochimice si le depreciaza caracteristicile organoleptice. Prin degradarea tesuturilor celulare, substantele intracelulare devin un substrat propice si accesibil cresterii si proliferarii tuturor categoriilor de microorganisme. In timpul depozitarii fructelor continua procesele vitale de respiratie si transpiratie in cadrul carora se produce apa, dioxid de carbon si energie termica, care favorizeaza inmultirea microorganismelor si reactiile biochimice catabolice. Acest fapt obliga la mentinerea unor conditii de depozitare care sa micsoreze incidenta imbolnavirilor, care, in cazul fructelor de mar, par si gutui sunt: temperatura ambientala intre 0 si 2oC, umiditatea relativa a aerului sub 85%, incaperi cu posibilitati de aerisire (viteza curentului de aer in incinta de cca

124

0.3m/s). In afara acestora, in cele mai multe cazuri se procedeaza la tratamente profilactice si de combatere cu produse chimice recomandate de fitopatologi si admise de legislatia romaneasca, atat in culturi cat si in depozite. Totodata, trebuie sa se depoziteze numai fructe avand rezistenta genetica la atacul diversilor agenti patogeni. Una din micozele merelor, perelor si gutuilor este patarea cafenie, ai carei agenti patogeni sunt mucegaiul Venturi inaequalis (sinonim Endostigme inaequalis) V.pirina si Fusidadium dendriticum. Acestea ataca fructele in toate stadiile de dezvoltare, producand pete circulare, la inceput cenusii, apoi brune, in dreptul carora tesuturile crapa. Fructele tinere se deformeaza iar gustul pulpei atacate este fad. Crapaturile de pe fructe constituie calea patrunderii sporilor de Monilia fructigena, care produce putrezirea bruna sau monilioza, boala cunoscuta de multa vreme in toata lumea si care produce pagube mari in livezi si in depozite. Simptomele acestei boli se manifesta prin aparitia, inca din timpul verii, pe fructele parguite, a unor pete brune ce se intind pe suprafata si cuprind pulpa in adancime, fructul putrezind pana la urma in totalitate. Daca temperatura si umiditatea ambientala sunt ridicate, pe suprafata fructelor, in dreptul zonei putrede, apar sporii ciupercii, sub forma unor pernite dispuse in cercuri concentrice. La temperaturile scazute din depozite, boala se poate extinde, fructele putrezind si innegrindu-se fara ca pe suprafata lor sa mai apara vetrele cu conidiofori. In aceasta faza, boala este cunoscuta sub denumirea de putregaiul negru. Daca mucegaiul patrunde in interior pana la camera semintelor si de aici se extinde in masa fructului, distrugand pulpa, putrezind-o complet, provoaca forma de monilioza cunoscuta sub numele de putregaiul inimii. Merele, perele si gutuile depozitate in spatii nearisite, calde si umede, sunt atacate de mucegaiul Penicilium glaucum, care produce putrezirea albastra. Aceasta boala se manifesta prin aparitia pe suprafata fructelor a unor micelii, conidiofori si conidii de culoare verde-albastra, sub care pulpa fructului putrezeste. La temperaturi scazute (sub 3oC), activitatea mucegaiului este oprita. Adesea se intalneste la merele depozitate boala cunoscuta ca putregaiul amar, provocata de mucegaiul Gloeosporium fructigenum, care patrunde prin leziuni sau intepaturi de insecte. Boala se manifesta prin aparitia, pe fructe, a unor pete brune ce se extind in intreaga pulpa, dandu-i acesteia un gust amar si o culoare bruna. La acest putregai se asociaza si ciuperci saprofite, care grabesc 125

procesul de degradare. In conditii de temperatura si umiditate ridicate, merele, perele si gutuile depozitate pentru iarna pot fi deteriorate de unele specii de Fusarium, care patrund, prin rani sau intepaturi de suprafata, in interiorul pulpei, provocand putrezirea fructelor, in timp ce la exterior se formeaza o pasla miceliana alba sau roza. Fructele de gutui pot fi imbolnavite de patarea bruna, manifestata prin aparitia pe suprafata a unor pete circulare de 2 - 10 mm, avand, la inceput, culoarea crem, iar mai tarziu, brun-roscata. Cand petele de fructe sunt grupate, pulpa crapa, crapaturile inlesnind patrunderea altor microorganisme ce produc putrezirea. Boala este urmare a atacului mucegaiului Fabraea maculata. Piersicile, caisele si prunele sunt foarte sensibile la atacul unor microorganisme ce le pot degrada complet, motiv pentru care, inaintea depozitarii acestora peste iarna, se va face o sortare riguroasa pentru indepartarea oricarui fruct bolnav, lovit sau ranit. O bacterioza raspandita este ulceratia fructelor de piersic, cais si prun, recunoscuta prin aparitia pe suprafata fructului a unor pete circulare avand diametrul de cca 1 mm, culoare galben-portocaliu. Pulpa fructelor se crapa in dreptul petelor, permitand accesul altor agenti de infectie si isi pierde valoarea nutritiva si organoleptica. Boala este produsa de bacteria Pseudomonas syringae. Putrezirea bruna sau monilioza la samburoase se manifesta pentru fructele ajunse la maturitate prin putrezirea pulpei si aparitia unor pete mici sporodochiile, galben - cenusii sau brune, dispuse neuniform pe suprafata fructului. Sporodochiile perforeaza epicarpul iar sucul zaharat se scurge ina afara, lipind fructele in pachete de fructe, putrezite si mumificate. In acest mod, infectia se extind rapid in intreaga populatie de fructe depozitate. Mare parte din pagubele produse in depozite de aceasta boala pot fi evitate, adoptandu-se metoda de depozitare in cofraje prin care poate circula aerul. Agentul patogen este Monilia laxa. Antractnoza nucului este cea mai raspandita si pagubitoare micoza la nuc. Fructele de nuc pot fi atacate in toate stadiile de dezvoltare. Pe suprafata lor apar, la inceput, pete mici brun-roscate si apoi cenusii, ce ating diametrul de 1 - 2 cm, extinzandu-se in faza finala a bolii. Miceliul agentului patologic Gnomonia juglandis patrunde in miez, pe care il altereaza, formand ascospori care pot germina la temperaturi cuprinse intre 5 - 31oC in conditii de umiditate relativa in 126

locurile de depozitare de peste 65%. O alta boala a fructelor de nuc, ce incepe din timpul vegetatiei si continua pe timpul depozitarii este arsura bacteriana, provocata de Xanthomonas juglandis. Ea se recunoaste datorita faptului ca fructele se brunifica, pericarpul si endocarpul putrezesc si se innegresc, pe suprafata fructelor ramanand un excedat apos reprezentat de colonia bacteriana. Citricele (lamaile, portocalele, mandarinele) si bananele fac parte din grupa fructelor perisabile. Durata lor de pastrare poate fi destul mde mare daca fructele sunt depozitate la temperatura de 4 - 6oC si umiditatea relativa a aerului de 80 90%. In perioada transportului, prin manipulari repetate, citricele sunt lovite sau ranite, prin leziunile formate putandu-se dezvolta microorganisme. Cele mai des intalnite microorganisme sunt: Penicillium italicum si P.digitatum, care la inceputul infectiei formeaza pe suprafata fructelor de citrice pete circulare cu diametrul de cca. 5 mm, sub care tesutul este moale si capata culoarea cenusie. La temperaturi de 8 - 10oC (temperatura din interiorul frigiderelor casnice), petele evolueaza rapid, hifele de mucegai formand o pasla moale, la inceput de culoare alba, apoi verde-albastruie sau chiar verde-brun, ceea ce arata ca a inceput fructificarea mucegaiurilor. In aceasta faza, aspectul mucegaiului se schimba, devenind pulverulent, astfel ca se poate extind foarte repede in ambalaje si pe alte fructe sau in depozite. De aceea este recomandabil ca fructele atacate de mucegai sa fie arse, iar depozitele si ambalajele dezinfectate cu solutii dezinfectante (cloramina 2%, formol 1%, cloranil 1%, sulfat de cupru 1%). De asemenea se poate face fumigarea depozitelor si ambalajelor prin arderea sulfului (3-100g/m3) sau a unui amestec de hipermanganat de potasiu cu formol (1g la 10 l), in doze de 1 2 l/m3. Prin adaugarea de formalina peste hipermanganat, in castroane sau farfurii imprastiate in depozit se formeaza un fum abundent, inecacios, care se imprastie in intreaga incapere si in crapaturi, in cca. 12 ore distrugand si formele sporulate ale microorganismelor. Tratamentul se va face cu masca de gaze. Dupa mai mult de 12 ore de la tratament se aeriseste incaperea pana nu se mai simte mirosul de formaldehida. Bananele, pentru a putea rezista pana la comercializare, se depoziteaza functie de gradul de coacere (recunoscut dupa culoarea fructelor) la 12 - 14oC si umiditatea relativa a aerului de 90 - 95%, in camere speciale, aerisite si in prezenta etilenei.

127

Unele boli produse de microorganisme strugurilor de masa

Fiind un produs foarte bogat in substante nutritive si intrand in grupa fructelor perisabile, strugurii de masa constituie un substrat excelent pentru dezvoltarea microorganismelor care-i ataca mai intai pe cei vatamati. Cele mai multe infectii provin din timpul vegetatiei, unele din ele putandu-se amplifica pe perioada depozitarii, care la struguri poate ajunge la 3 - 4 luni. Unele boli ale strugurilor sunt viroze ce infecteaza vita de vie si se transmit si fructelor si semintelor. O viroza des intalnita este scurt-nodarea sau degenerescenta infectioasa (court-noue), ce actioneaza asupra butucului de vie. Ciorchinele de strugure atacat are boabe putine si mici, fiind lipsit de valoare comerciala. Agentul patogen este Marmor viticola, ce se inactiveaza termic la 65oC. Mozaicul nervurian (ingalbenirea nervurilor - yellow vein) este, de asemenea, o viroza frecventa in plantatiile viticole, in urma atacului careia, ciorchinii de struguri raman mici, cu boabe mici si putin numeroase, lipsite de seminte si gust. Ea este produsa de Grapevein mosaic virus. Dintre micoze, cea mai pagubitoare prin aria de raspandire si frecventa aparitiei este mana provocata de Plasmopara viticola. Boala poate incepe, mai ales in anii cu precipitatii abundente, inca din timpul infloririi. Daca apare mai tarziu, dupa ce boabele au atins o anumita marime, miceliul mucegaiului patrunde in boabe pe la baza pedunculelor si se extinde in pulpa care se brunifica. Boabele se zbarcesc si, uneori, se desprind de pe ciorchine si cad. Infectia boabelor mature este cunoscuta de viticultori sub numele de "rot - brun" sau putregaiul brun, iar cea a boabelor tinere, nemature, sub denumirea de "rot-gris". Inaintea depozitarii, strugurii se sorteaza, indepartandu-se ciorchinii bolnavi. A doua boala ca raspandire, dupa mana, este fainarea, cauzata de Uncinula necator, cu forma conidiana Oidium tuckery berk. Atacul pe ciorchini face ca acestia sa se brunifice si apoi sa se usuce in timp de seceta. Pasla miceliana acopera boabele care crapa ca urmare a marimii volumului, continutul acestora oferind mediu propice pentru dezvoltarea altor microorganisme. Daca infectia se produce la inceputul coacerii, pe pielita strugurilor apar pete brune, sub forma unei 128

retele, care depreciaza gustul si valoarea comerciala a ciorchinilor. Strugurii infectati de Oidium tuckeri nu se pot pastra deoarece sunt invadati destul de repede de ciuperci saprofite care provoaca degradarea lor. In orice caz, pentru pastrare este necesara o temperatura de -1oC pana la +1oC. Mucegaiul cenusiu este produs de specii de Botrytis: B.cinerea, B.fuckeliana. Acestea ataca toamna pe boabe, dupa ce se acumuleaza suficient zahar in celule. Boala se produce, de regula, prin intepaturile insectelor, fiind favorizate de rani si crapaturi existente in pielita boabelor, mai ales cand umiditatea si temperatura ambiante sunt ridicate. Boala se manifesta prin brunificarea pielitei, care se desprinde usor de pulpa, boaba putrezita acoperinduse in intregime cu o pasla cenusie. Ea evolueaza rapid prin invadarea altor boabe de catre miceliile ciupercilor. In unele regiuni din Franta (ex. Valea Rinului) sau Romania (Cotnari), ciuperca produce asa-zisul "putregai nobil", ce apare pe ciorchinii cu expozitie solara si bine aerisiti. In acest caz, mucegaiul nu mai fructifica, pielita boabelor se stafideste, capata o culoare vinetie si se subtiaza, astfel incat evaporarea apei se intensifica, iar mustul din bob se concentreaza. Sub influenta putregaiului nobil se pierde peste 50% din productie, prin concentrarea mustului, in schimb se castiga foarte mult calitativ. Prin dezvoltarea sa pe boabele de struguri, Botritis cinerea consuma zaharul si acizii, dar, spre deosebire de alte tipuri de mucegaiuri, acizii organici sunt consumati cu viteza mai mare decat zaharul. Prin fermentarea zaharurilor rezulta glicerina si dextranul (poliglucan omogen), iar in anumite conditii din glucoza se formeaza manita, acid citric, acid acetic, acid lactic si alcool etilic. Musturile provenite di strugurii atacati de putregaiul nobil fermenteaza mai incet, vinurile obtinute au un continut alcoolic mai redus si prezinta un buchet cu totul deosebit, aproape imposibil de definit si cu tendinta de brunificare in timp. Soiurile de struguri de masa au o sensibilitate diferita fata de atacul acestor mucegaiuri nobile, foarte rezistente fiind cele de Coarna neagra, Italia, Afuz-Ali, care trebuie preferate pentru evitarea pierderilor in depozite. Reducerea pierderilor se poate realiza printr-o sortare severa atat la recoltare cat si la conditionare si ambalare in vederea depozitarii, eliminand ciorchinii sau chiar boabele infectate. O alta boala micotica este antracnoza strugurilor, produsa de Ensilnoe ampelina cu forma conidiana Gloeosporium ampelophagum, se manifesta prin aparitia pe pielita boabelor a unor pete mici circulare, de culoare bruna. In dreptul 129

petelor pielita se ingroasa, iar bobul se deformeaza din cauza cresterii inegale. Strugurii infectati au aspect neplacut si sunt lipsiti de valoare comerciala. Soiurile de struguri mai sensibile la antracnoza sunt Sultanina, Afuz - Ali, Regina viilor. In timpul depozitarii strugurilor de masa pot aparea si alte infectii micotice, dintre care amintim: putregaiul alb, provocat de Charinia diplodiella, putregaiul negru, avand ca agent Phoma uvicola si amareala strugurilor data de Melancolium fuligincum. Strugurii de masa mai pot fi degradati de diferite mucegaiuri precum: Rhizopus stolonifer, Penicillium sp., Aspergillus sp., Chladosporium herbarum, a caror activitate este inhibata, insa, de temperaturi de 1oC pana la +0.5oC sau de gazare cu SO2. Pentru a veni in ajutorul studentilor, viitori manageri ai pensiunilor agroturistice sau ai unor sectii rurale de microproductie, sunt aratate, intr-un tabel sintetic, principalele conditii de mediu ambiant recomandate pentru pastrarea fructelor si legumelor, in vederea savurarii acestora in sezonul rece.

Conditiile ambientale din depozite, punctul de inghetare a fructelor si durata de pastrare recomandata pentru pastrarea unor fructe

130

Specia

Conditiile
temperatura ( C)
o

ambientale
umiditatea (%) 90

Durata de pastrare

Punctul de inghetare
(oC)

Caldura degajata
(kcal/zi) 2700

Banane verzi Banane mature Caise Gutui Grapefruit Lamai verzi Lamai mature Mandarine Mere

12 - 14

8 - 10 zile

-0.3

14 - 15

90

2 - 5 zile

-0.5

3400

-0.5 +0.5 -0.5 - 0 10 - 15 11 - 15

90 90 85 - 90 85 - 90

2 - 4 sapt. 2 - 3 luni 3 - 6 luni 1 - 4 luni

-1 -2 -1 -1.6

320 -

0-5

85 - 90

3 - 6 luni

-1.8

2-7

85 - 90 88 - 92

3 - 6 luni 4 - 8 luni

-0.9 -2.3

110

soi 0

rezistent Mere sensibil Pere soi -1 90 1 - 3 luni -1 160 soi 3 - 4 88 - 92 3 - 6 luni -2 430

timpuriu Pere tarziu Piersici Portocale Struguri -0.5 2-7 -1 - 0 85 - 90 85 - 90 85 - 90 2 - 5 sapt. 1 - 4 luni 2 - 4 luni -0.7 -0.4 -2 100 430 200 soi -0.5 90 3 - 6 luni -1.2 160

Lutz M.S., Hardenburg R.E. : The commercial storage of fruits, vegetables and florist and nurseystocks; U.S. Dept. Agr. Handbook, No.66, 1968

131

5.4 CATEVA INFORMATII GENERALE ASUPRA MICROFLOREI FRUCTELOR SI LEGUMELOR DESHIDRATATE

Pe suprafata produselor agroalimentare deshidratate se gasesc numeroase specii de bacterii si ciuperci patogene si saprofite. Printre acestea se gasesc speciile aerobe Bacillus subtilis, B.polymyxa, B.cereus, anaerobe Clostridium botulinum, Cl.butiricum, sau facultativ anaerobe ca Bacillus coagulans. Toate aceste specii au fost enumerate datorita faptului ca sunt patogene pentru om, caruia ii provoaca diverse boli sau toxinfectii periculoase si chiar fatale, rezistand, prin sporii lor, la tratamentele termice folosite la deshidratare. O serie de bacterii din familia Enterobacteriaceae pot fi de asemenea intalnite pe produsele vegetale deshidratate, specii de Aerobacter, Erwinia, Escherichia, Salmonella si Proteus provocand toxinfectii alimentare grave (salmoneloza, colibaciloza) sau contribuind la alterarea si deprecierea caracteristicilor organoleptice ale produselor

deshidratate. Dintre mucegaiuri mai frecvent se intalnesc Rhizopus, Botrytis, Aspergillus, Penicillium, Trichothecium, Fusarium, Cladosporium, Alternaria. Prezenta lor pe fructele si legumele deshidratate indicand umiditatea ridicata a acestora, conditiile precare de depozitare, manipulare si transport.

132

Capitolul 6

PRODUSE SI BIOTEHNOLOGII TRADITIONALE IN GOSPODARIILE RURALE, PENSIUNILE AGROTURISTICE SI FERMELE AGRICOLE

6.1 Bauturi de casa, fermentate, din fructe si legume

De multe ori, abundenta de fructe depaseste nevoile de consum in stare proaspata sau conservata. La aceasta se adauga refuzurile rezultate la sortari si fructele cazute inaintea sau in timpul culesului. O posibilitate de valorificare mult raspandita este transformarea lor in bauturi alcoolice prin fermentare.

133

In functie de produsul obtinut in urma fermentatiei fructelor, deosebim doua categorii de bauturi de casa: fermentate, consumate sub forma binecunoscutelor vinuri (fructine sau cidruri de imitatie) si distilate, obtinute prin distilarea intr-o a doua etapa si cunoscute sub denumirea de rachiuri. Ambele categorii de bauturi se pot obtine din orice fruct si leguma ce contine o cantitate mai mare sau mai mica de zaharuri capabile a produce alcool prin fermentare, fie separat, fie in amestec, iar uneori, "ajutate" prin adaosuri de zahar, glucoza si alte zaharuri, avand concentratii si coeficienti de puritate variabile, provenite din alte surse, de obicei industriale (zahar brut si rafinat, siropuri de glucoza, etc.). Prepararea bauturilor de casa fermentate decurge, in general, intr-o maniera comuna, adica cuprinde "operatii tehnologice" ce vor fi aratate, pe scurt, in continuare. La inceput fructele si legumele trebuie selectate, in sensul ca vor fi alese numai fructele sanatoase, bine coapte, pentru a avea un continut cat mai mare de zaharuri. Se evita, pe cat posibil, fructele necoapte, acre sau bolnave. Intr-o a doua etapa tehnologica, fructele si legumele se spala pentru a indeparta impuritatile organice si minerale de pe suprafata lor, precum si eventuale urme de pesticide cu care au fost tratate in timpul vegetatiei. Spalarea se face prin scufundarea in apa (pentru fructele cu textura tare: mere, pere, gutui, etc.) si jet de apa pentru fructele mai moi (capsuni, cirese, visine, s.a.). In etapa urmatoare se face maruntirea fructelor prin razuire, folosirea masinilor de tocat in situatia fructelor tari si zdrobire sau presare (pasatricizare) in cazul celor moi. Dupa posibilitati, in functie de "dotarea tehnica" a fiecarui producator, (roboti de bucatarie, etc.), se alege procedeul cel mai convenabil. Modul de dirijare al fermentatiei materiei prime este hotaratoare asupra calitatii si randamentului bauturii de casa. Obtinerea unor bauturi cu concentratie ridicata de alcool etilic, ca produs al fermentatiei principale, dar si a unor produse secundare de fermentatie, importante in crearea "buchetului" specific bauturii respective, reclama un anumit continut de zaharuri fermentescibile si prepararea unui inocul (maiaua) de drojdii adecvat. De aceea, se recomanda folosirea unor culturi de drojdii selectionate (de obicei, de tipul celor de bere sau spirt). Se pot obtine rezultate bune si cu drojdii din specii spontane, daca li se asigura conditiile de temperatura pentru inmultire si fermentare. Aceasta se poate realiza, in

134

prealabil, folosind cantitati reduse de must, similar celui ce va trebui fermentat, asigurandu-se conditiile optime de inmultire viguroasa a drojdiilor (temperatura si concentratia de zaharuri), asa cum se va arata in continuare:

1. Temperatura de fermentare. Temperaturile extreme la care se poate produce fermentatia sunt de minimum 7oC si maximum 37oC. Temperatura optima este de 18 - 28oC, in functie de speciile intrebuintate, fara a depasi valoarea de 30oC. 2. Concentratia in zahar. Viteza de fermentatie creste proportional cu concentratia pana la cca. 1 - 2%, apoi ramane relativ constanta pentru a scadea daca ea depaseste 20%, considerandu-se limita superioara ca fiind 60% zahar, suportata numai de unele specii de drojdii (Zygosaccharomyces). 3. Concentratia de alcool. Drojdiile de vin pot produce cantitati de alcool pana la 17 - 18% fara ca sa se manifeste o actiune inhibitoare. Drojdiile de fermentatie inferioara, insa, nu suporta concentratii mai mari de 5%, iar drojdiile osmofile (genul Zygosaccharomyces), suporta concentratii mai mari de zahar (fermenteaza siropurile si mierea cu concentratii de 60%) si de alcool (chiar pana la 22%). 4. Cantitatea de drojdie (maiaua). Exista o relatie direct proportionala intre concentratia de maia si viteza de fermentare. In general este bine sa se foloseasca o cantitate ce reprezinta 4 - 7% fata de mustul supus fermentarii. Exista multe tipuri de drojdii. Cele folosite in prepararea vinurilor (cidrurilor) de casa sunt drojdiile de paine sau de bere presate sau granulate, dar se pot folosi si drojdii de vin selectionate de producator. Producatorii casnici de vinuri pot lua propria decizie cu privire la calitatea drojdiei folosita in functie de preferinta personala si de tipul de must ce se preleveaza, pe baza experientelor prealabile acumulate. Se recomanda folosirea unei linguri - site (cca. 4g) de drojdie uscata granulata pentru un litru de must. 5. Specificitatea drojdiilor folosite. In raport cu sistemul enzimatic cu care sunt dotate, drojdiile pot produce fermentatia cu viteze diferite. Specificitatea drojdiilor se manifesta prin structura chimica a zaharurilor pe care le fermenteaza. Astfel, drojdii din acelasi gen (Saccharomyces Rees), se comporta diferit vis-a-vis de natura zaharurilor pe care le pot fermenta, exemplele urmatoare fiind edificatoare in acest sens. S.chevalieri si S.italicus 135

fermenteaza glucoza, zaharoza si maltoza si nu fermenteaza rafinoza; S.ellipsoideus fermenteaza glucoza, galactoza, fructoza, zaharoza, maltoza si 1/3 din rafinoza; S.veronae fermenteaza zaharurile mai inainte amintite cu exceptia galactozei; S.florentinus, S.carlsbergensis si S.uvarum fermenteaza complet toate mono, di si trizaharidele, in timp ce Torulaspora delbrueckii actioneaza numai asupra glucozei si galactozei. 6. Substantele stimulatoare si inhibitoare. Unele elemente minerale (fosforul, sulful, fierul, magneziul, cuprul, zincul, s.a.), factori vitaminici sau coenzime (vitaminele B, acidul paraaminobenzoic, coenzima A, etc.) au rol de activatori ai reactiilor enzimatice specifice fermentatiei alcoolice. Altele, ca antibioticele produse de alte microorganisme, acizi organici, florurile, bazele cuaternare de amoniu, antisepticele, etc. actioneaza ca inhibitori ai fermentatiei alcoolice, in anumite concentratii. Stimularea cresterii si inmultirii drojdiilor se face prin adaugarea de substante nutritive, in general similare celor folosite la flori, sau de drojdie ramasa dupa limpezirea unei sarje anterioare, dar se poate prepara un nutrient complex dupa urmatoarea formula: acid tartric 0.5g, sulfat de amoniu 0.4g, sulfat de magneziu 0.05g, acid citric (sare de lamaie) 0.4g, fosfat de potasiu 0.2g la 100 ml vin; caz in care se ajusteaza pH-ul solutiei la valoarea de 4,5 prin aduagarea de acid citric, tartric sub forma de solutie 20% sau suc de lamaie natural sau artificial.

Principalii agenti ai fermentatiei alcoolice a musturilor de fructe si legume sunt, in general, drojdiile din categoria celor de vin din clasa Ascomycetae, ordinul Endomycetales, familiile Endomycetaceae, Torulapsidaceae si Rhodotorulaceaae, din care enumeram: genul Saccharomyces Rees, speciile sporogene: S.elegans, S.chevalieri, S.fructum, S.heterogenicus, S.oviformis, S.veronae, S.italicus, S.ellipsoidus, S.carlesbergensis, genul Zygosacchaaromyces, genul Torulaspora (de ex. Torulaspora rosei), genul Pichia (P.membranefaciens, P.fermentaris), genul Hansenula (H.saturnus), genul Saccharomycodes (S.ludwigii) si genurile asporogene Kloeckera, cuprinzand speciile K.apiculata, K.jensenii,

K.africanackera, etc. Drojdiile din genul Kloeckera se gasesc pe toate fructele, vinurile provenite din ele fiind fermentate spontan numai de aceste drojdii. Astfel, vinurile de mere devin buchetoase datorita drojdiilor din genul Kloeckera ce formeaza alcool pana la 5 - 6%, dar nu au capacitatea de a fermenta zaharoza si 136

maltoza (motiv pentru care zaharul eventual adaugat va trebui transformat, prin fierbere cu apa acidulata, in glucoza si fructoza - asa numitul zahar invertit). Tinand seama de cantitatile relativ mici de bauturi de casa fermentate ce se obtin din fructe, precum si de sezonul cald in care acestea se prelucreaza, pericolul cel mai mare de stanjenire a fermentatiei provine din temperaturile ambientale ridicate la care se adauga caldura eliberata in procesul de fermentatie. Din acest motiv este recomandabil ca fermentarea sa se faca in incaperi cu temperaturi relativ constante la valoarea optima de dezvoltare a drojdiilor (23 28oC), iar atunci cand acestea depasesc 30oC se recomanda racirea vaselor de fermentare prin acoperirea cu materiale imbibate in apa si ventilarea acestora. In aceste conditii, fermentarea in vase (damigene) de sticla, ceramica sau butoaie de lemn curate si sulfitate in prealabil poate dura 7 14 zile, timp in care ea se desfasoara cu intensitate mare, manifestata prin eliberarea intensiva de dioxid de carbon (asa numita "fierbere cu bule"). Dupa aceasta prima faza a fermentatiei lichidul se limpezeste, iar particulele in suspensie se depun la inceput sub forma de sediment. Este momentul separarii partii limpezi de sediment prin sifonare ("tragere") cu ajutorul unui furtun si transferarea lui in vase curate, sulfitate, sau, pentru unele bauturi spumante de casa, direct in butelii de sticla rezistente (tip sampanie), in care fermentatia va continua, lent, timp mai indelungat si la temperaturi mai scazute (10 - 18oC). In principiu, in acest mod pot fi valorificate toate musturile de fructe si legume cu continut suficient de zaharuri (in jur de 250g/l) provenite din materia prima sau adaugate sub forma de siropuri. Spre exemplificare, se va arata in continuare cum se prepara cidrul.

Cidrul este o bautura fermentata obtinuta din mere. Productiile obtinute din plantatiile de mere depasesc adeseori posibilitatile de valorificare si depozitare in stare proaspata, obligand producatorii sa le transforme in bauturi fermentate, denumite vinuri de mere sau cidruri. Franta este tara cu cea mai mare productie din acest vin, care, in cea mai mare parte (85 - 90%) este supus distilarii pentru obtinerea rachiului de mere invechit cunoscut sub numele de Calvados. Si la noi sa extins producerea rachiului de mere, insa el se obtine direct prin fermentarea merelor si distilarea borhotului fermentat, fara a mai trece prin faza de must de mere. 137

Merele din sortimente diferite, de preferat sortimente mai acrisoare dar sanatoase, bine coapte si nelovite, sunt spalate si zvantate. Ele se maruntesc prin diferite procedee si utilaje (zbrobitoare, razuitoare, masini de tocat, etc.) din inox sau emailate, pregatindu-se in acelasi mod ca pentru obtinerea sucului de mere, adica masa rezultata se transfera la o presa manuala de stors, in saculete de panza rezistenta, sau la o pasatrice, extragandu-se cat mai mult suc (incalzirea pana la 55 - 65oC mareste randamentul si inhiba o parte din enzimele ce provoaca innegrirea mustului). Sucul rezultat se trateaza cu dioxid de sulf in solutie (2 - 3g SO2/hl) sau metbisulfit de potasiu (4 - 5g/hl) ca antioxidanti care previn innegrirea mustului obtinut, deoarece este stiut ca merele, perele, gutuile, prin maruntire se innegresc in prezenta aerului transmitand acest defect si cidrului obtinut din ele. Randamentul de extractie folosind utilajele amintite se ridica la 50 - 60%. Mustul tratat este depozitat in incaperi racoroase sau camere frigorifice (la temperaturi sub 10oC) timp de 8 - 12 ore pentru limpezire - deburbare (fr.debourber = a curata). Partea limpede este colectata prin sifonare cu un furtun, iar sedimentul se refoloseste cu alte sarje. Mustul limpede sulfitat, continand zaharuri (cca. 50 - 100g/l) este supus corectarii concentratiei de zahar prin adaos de zaharuri, tinand cont ca, teoretic, din 17g zahar rezulta 1o alcoolic la litru, iar cidrul va trebui sa aiba o tarie alcoolica de cel putin 12%. Adaosul de zahar in cazul descris va fi diferenta dintre continutul de zaharuri existent in must (masurabil cu refractometrul de mana) si cel necesar pentru taria de 12o alcoolice. Acest mod de calcul este valabil pentru toate musturile din care se prepara bauturile fermentate de casa. Mustul astfel pregatit este insamantat cu inoculul de drojdii pregatite in prealabil din drojdii ce se comercializeaza sau din drojdiile de vin selectionate chiar de producator. In ambele cazuri, este bine ca inoculul (maiaua) sa se prepare separat, in cantitati mici la inceput (0.5 - 1l) si sa fie inmultit ulterior in 1 - 3 etape, inainte de a fi folosit in proportii de 3 - 7% pentru fermentarea cidrului. Prepararea inoculului este foarte simpla si poate fi facuta de orice persoana, indiferent de gradul de pregatire. O cantitate (50 - 100g) de drojdie comerciala este introdusa in 0.5 - 1l must ajustat cu zahar (pana la 210g/l), avand temperatura de 18 - 25oC. Pentru omogenizare se amesteca intr-o butelie de sticla sau polietilena, colorata si inchisa cu un dop prevazut cu o mica gaura.

138

Butelia va plina doar trei sferturi. Se lasa la fermentat o perioada de 24 ore, timp in care se agita, usor, de cateva ori. Intr-un alt vas de 4 - 10 ori mai mare, prevazut cu dop si palnie de fermentare, se pregateste un must asemanator celui ce se doreste a fi fermentat si se transfera maiaua primara preparata, operandu-se in acelasi mod descris anterior. Maiaua secundara se foloseste ca inocul de productie, in proportiile amintite pentru fermentarea mustului. Asadar, este necesar, ca inainte sa inceapa vinificarea, sa se estimeze cantitatea de must ce urmeaza a fi prelucrata. Cu aceasta ocazie se atrage atentia ca este posibil sa se adauge apa (in proportie ce nu va depasi 30%), cu conditia ca apa sa fie in prealabil declorinata si sterilizata, inainte de amestecare, prin fierbere minim 40 de minute si racita la temperatura de 25 - 30oC. Durata fermentatiei zgomotoase in conditii normale dureaza cam 7 - 10 zile, dupa care ea conyinua lent cateva zile. Cam la 2 - 3 saptamani dupa terminarea fermentatiei, cidrul se limpezeste si se trage de pe drojdie, trecand partea limpede intr-un vas afumat cu 1/4 - 1/2 baton de sulf si se infunda, ori se transfera in sticle pentru a fi consumat ulterior, ingrijindu-se la fel ca si vinul din struguri. Un cidru bine pregatit si ingrijit, cand este consumat dupa cativa ani, va crea consumatorului senzatii de placere de neuitat, contribuind totodata la mentinerea unui echilibru mineral-vitaminic, deoarece cidrul este bogat in magneziu, siliciu, fier, potasiu, calciu, acid malic si vitaminele A, B si C. Drojdia tulbure de pe fundul vasului se poate folosi drept inocul pentru alte sarje de vin sau se valorifica in mai multe moduri: fabricarea picheturilor utilizate pentru obtinerea rachiurilor distilate; amestecarea cu pulpa de mere, apa si zaharsi reluarea fermentarii pantre obtinerea concomitenta a pichetului si a borhotului din care prin distilare se obtine rachiul de mere; distilarea impreuna cu alte drojdii si borhoturi pentru obtinerea rachiurilor naturale, etc. In afara de cidrul original de mere, in gospodariile rurale, si nu numai, se mai pot prepara si alte bauturi din fructe, denumite impropriu "vinuri de fructe", deoarece notiunea de vin se refera exclusiv la cel obtinut din fructele vitei de vie. Prin analogie, bauturile fermentate obtinute din alte fructe, ar putea purta numele de fructinuri, completate cu denumirea fructei majoritare (in cazul unor combinatii sau cupaje). Ele se prepara in acelasi mod cu cel descris in cazul merelor, 139

tinandu-se

seama

insa

de

unele

caracteristici

ale

fructelor

prelucrate:

(randamentul la presare - mai mare in cazul fructelor moi; continutul de zaharuri uneori mai mare sau mai mic ca in cazul merelor; aciditatea fructelor - mai redusa in cazul unor fructe ca zmeura si capsuna, sau mai mare la visina si coacaza alba). Alteori, pentru combaterea si ameliorarea unor caracteristici organoleptice si fizico-chimice ale musturilor, se fac amestecuri (cupaje) din doua sau mai multe fructe sau legume, ce ar putea deveni secretul producatorului.

Fructinul de coacaza (albe, rosii si negre) se prepara in zonele in care aceste fructe se afla din abundenta, in plantatii amenajate sau in flora spontana. Prelucrarea fructelor decurge in mod similar cu prelucrarea strugurilor: zdrobirea boabelor, presarea, corectarea continutului de zaharuri prin adaos de zahar industrial, corectarea aciditatii prin adaos de apa fiarta si racita, adaugarea de maia de drojdii selectionate sau spontane, fermentarea la 18 - 22oC, tragerea de pe depozit dupa fermentare, tragerea in sticle sau damigene dupa fermentare. Fructinul de pere si gutui se prepara in acelasi mod ca si cidrul, dar timpul de inmuiere se prelungeste la 2 - 3 zile, fiind necesara o protectie prin sulfitare, deoarece pulpa de gutui se innegreste prin oxidarea acizilor tanici in prezenta aerului. Corectarea concentratiei de zaharuri, prin adaugarea de zahar industrial si a aciditatii ridicate prin diluarea cu apa, sunt obligatorii. Fructinul de stafide (smochine, curmale) are urmatoarele ingrediente: 0.250 - 0.500 kg stafide, 1 kg zahar, 4 l apa, 20 g drojdie, substante nutritive pentru drojdie, 1 cana de ceai negru tare, 8 10 g acid citric. Metoda de lucru: Se curata si se spala stafidel si se scot samburii curmalelor, apoi acestea se maruntesc prin masina de tocat. Tocatura este transferata in vasul de fermentare impreuna cu siropul de zahar preparat separat, se adauga maiaua de drojdie, se amesteca bine si se acopera cu un tifon sau panza curata. Fermentarea se face de obicei la temperatura de 20 - 28oC timp de doua saptamani, timp in care amestecul se agita zilnic cu o lingura de lemn, timp de 2 - 3 ori. Dupa limpezire, fructinul limpede este tras in vasele de pastrare (damigene, sticle), avandu-se in vedere ca acestea sa fie complet pline. Peste depozitul ramas se poate prepara o a doua transa de bautura prin adaugarea ingredientelor amintite (cu exceptia fructelor deshidratate).

140

Acest fructin este o bautura cu un buchet deosebit de apreciat, are o culoare galben-aurie si, in functie de concentratia zaharului adaugat si de cum este condusa fermentatia, se obtin sortimente cu tarii alcoolice diferite (intre 8o si 16o) si variante de desert, demiseci sau seci. De asemenea pot fi realizate diferite cupaje, folosindu-se si alte fructe sau musturi din fructe in amestec, avand caracteristici organoleptice specifice si chiar anumite proprietati farmacologice (de ex. afrodisiace). Fructinul din fructe de maces se prepara din fructe proaspete sau usacte de maces. Fructele de maces sunt cunoscute si apreciate pentru continutul lor ridicat de vitamina C si flavonoide (vit. P). Ele se recolteaza toamna, cand sunt coapte. Apoi sunt curatate, spalate si uscate, iar daca se folosesc fructele proaspete, acestea se maruntesc prin masina de tocat. Fructele uscate se maruntesc prin spargere. Se mai poate folosi si pulpa de macese, fara samburi, (feinschnitt), ce se procura de la magazinele de plante medicinale. Ingrediente: 0.5 kg macese uscate (3.5 - 4 kg macese proaspete), 1.5 kg zahar, 2 lamai, cca 20 g substante nutritive, 10 l apa. Metoda de lucru: Fructele de maces, uscate sau proaspete se maruntesc. Cele proaspete se transforma intr-o pasta grosiera din care este dificil sa se extraga sucul si de aceea se adauga zahar pentru macerare (20% din cantitatea totala de zahar necesar) si se amesteca bine. Amestecul rezultat se opareste cu 4 l apa fiarta, iar dupa racire se adauga drojdia de bere amestecata in prealabil in 2l sirop racit la 20 - 25oC. Se ajusteaza cantitatea cu apa fiarta si racita. Vasul este acoperit cu panza curata si pus la fermentare la 18 - 28oC, amestecandu-se zilnic. Dupa 5 - 7 zile se adauga inca 1 - 2 l sirop, preparat din restul de zahar prevazut in reteta, pentru inviorarea fermentatiei. Fermentatia continua inca cca. O saptamana, iar dupa limpezire fructinul este transferat in recipientii de "asezare" a sedimentului fin, avandu-se grija ca acestia sa fie complet plini. Dupa limpezire, fructinul de macese este tras in buteliile sau recipientii de consum. Vasele de limpezire se dezinfecteaza prin afumare cu bioxid de sulf sau metabisulfit, in proportiile mentionate mai inainte, folosindu-se de obicei sticle incolore clatite in prealabil cu bioxid de sulf, care se dopiuesc si se tin in camari racoroase, pentru consumul curent. Pentru pastrari mai indelungate, sticlele se stivuiesc in pozitie orizontala.

141

In vederea imbunatatirii buchetului se pot adauga, inainte de faza de fermentare, flori de soc sau alte plante aromate, in cantitati mici (cca. 5 - 10 g la 10 l fructin). Modul de preparare poate fi simplificat in sensul folosirii intregii cantitati de zahar inca de la inceput, inocularea de drojdii facandu-se dupa racirea intregului amestec la temperatura de fermentare.

Vinuri de struguri. Lucrarea de fata, nefiind un manual de oenologie, va trata tematica obtinerii diferitelor tipuri de vinuri in regim gospodaresc, din resursele fermelor agricole proprii, sau folosind materii prime cumparate de la alti producatori in cantitati mai mici. Problemele legate de pregatirea inventarului gospodaresc au fost partial prezentate anterior sau vor fi studiate din alte surse bibliografice, unele din ele mentionate la sfarsitul acestui curs. Principalele categorii de vinuri abordate in aceasta lucrare sunt: vinurile albe, roze, rosii, aromate, spumante, din struguri hibrizi producatori, vinurile amestec (crusoane), cocteilurile, etc. Materia prima pentru obtinerea vinurilor o reprezinta strugurii - fructele vitei de vie (Vitis vinifera) - iar tehnica aplicata acestora este asemanatoare celei descrisa la prepararea fructinurilor. Se va rezuma totusi aceasta tehnologie fara a intra insa in detalii. Prima etapa este culesul strugurilor. Se va recolta numai cantitatea de struguri ce va fi prelucrata in aceeasi zi, evitandu-se zdrobirea strugurilor. Pentru transport se pot folosi vase sau saci din materiale plastice curate. Prelucrarea se va face imediat pentru a evita fermentarea, in special cea acetica. Vinificarea incepe cu zdrobirea strugurilor cu ajutorul unui zdrobitor cu cilindrii canelati din lemn. Zdrobirea se poate face impreuna cu ciorchinii sau dupa dezbrobonirea (separarea boabelor) manuala sau mecanica pentru obtinerea unor vinuri mai fine). Dupa zdrobire, mustuiala (zdrobitura) este transferata intr-un vas cu fund perforat din care se poate scurge liber mustul ravac. Strugurii zdrobiti ramasi dupa scurgerea ravacului, purtand denumirea de bostina, sunt supusi presarii in piese simple confectionate din lemn sau alte materiale nemetalice - care depreciaza calitatea mustului. Presarea se face lent, de mai multe ori, cu pauze pentru a usura scurgerea mustului. Pentru presare in piese manuale de lemn se 142

folosesc panze albe, rezistente si curate. Mustul ravac si cel de presare se colecteaza in vase curate si se lasa sa se limpezeasca natural timp de 16 - 24 ore la racoare sau artificial, prin adaugarea de 8 - 10g metabisulfit de potasiu (dizovat in prealabil intr-un litru de apa) la fiecare hectolitru de must sau 5 - 10g bioxid de sulf / hectolitru. Sulfitarea este necesara, avand mai multe roluri: antiseptic, antioxidant, accelerator de sedimentare acidifiant, fixator de culoare. Specialistii oenologi recomanda ca adaugarea bioxidului de sulf sa se faca in mai multe etape, astfel incat toate adaosurile sa nu depaseasca 100mg/l SO2 total, din care 10mg/l SO2 liber. Si adaugarea de taninuri (taninul de castan apropiat ca structura de cel al vitei de vie) in cantitate de 5g/hl are rol stabilizator si de accelerare a sedimentarii. In retetele de preparare a fructinurilor se recomanda folosirea decoctului din frunze de ceai, datorita continutului mare de tanin, recomandare valabila si in cazul mustului de struguri. Numeroasele impuritati aflate in must, cunoscute sub denumirea de burba trebuie indepartate. Operatia aceasta se numeste deburbare si poate fi realizata gravitational, prin filtrare sau centrifugare. Rolul ei este asigurarea unui must limpede. Pentru marirea gradului de limpezire, a protejarii impotriva oxidarii si stabilizarii mustului, acesta se trateaza cu

bentonita (dizolvata in prealabil in apa si nu in must, pana la obtinerea unui gel). Bentonita se adauga in must inainte de fermentare, in cantitate de 30 - 50 g/hl. Mustul limpede astfel obtinut este supus fermentarii. In acest scop se face insamantarea cu maia de drojdii (inoculare), selectionate sub forma lichida sau uscata. Cantitatea de levuri uscate este de 10 - 15g/hl, iar in cazul celor sub forma lichida este de cca. 5l/hl de must. Totodata, se adauga si nutrienti de fosfor si azot(ex: fosfat acid de amoniu ) pentru activarea inmultirii drojdiilor, in doze de pana la 0.06g/hl, dizolvati intr-o cantitate mica de must, inainte de adaugare. Fermentatia mustului se face in vase de lemn, materiale plastice, sticla, emailate sau inox, prevazute cu palnii de fermentatie - tip gat de lebada - cu dop de apa sau cu dopuri avand tuburi flexibile introduse cu un capat intr-un vas cu apa, care impiedica intrarea aerului dar permite iesirea dioxidului de carbon rezultat din fermentare. Temperatura de fermentare este cea optima pentru drojdii (18 - 28oC). In primele 5 - 7 zile fermentatia se desfasoara viguros, cu zgomot, dupa care timp de 10 - 15 zile ea are loc linistit. La sfarsitul fermentatiei palniile de

143

fermentare se scot si se pun dopuri fara sa fie presate, pentru a permite gazului carbonic sa iasa afara.

Prepararea maialei de drojdii uscate active

Prepararea se desfasoara in patru etape succesive:

1. Rehidratarea drojdiilor: Intr-un vas bine spalat si dezinfectat se pune 1l apa calda la 30oC in care se dizolva 500g zahar. Se presara drojdiile uscate (granule sau pulberi) agitand energic si continuu apa, pentru evitatrea cocoloaselor. Fermentarea incepe aproape imediat, iar dupa 30 minute ele devin foarte active, fapt observat prin degajarea puternica a dioxidului de carbon. Se lasa in acest stadiu inca 30 minute. 2. Adaptarea drojdiilor la must: Intr-un recipient cu capacitatea de 4 - 5 ori mai mare ca primul, de preferat din sticla sau material plastic, se amesteca 1 l must limpede, 1 l sirop sterilizat de zahar (250 g/l fiert cu 5 g acid citric intr-un litru de apa timp de 15 minute si apoi racit la 40oC) si 1 l mediu nutritiv apos preparat din 10 g fosfat acid de amoniu dizovat in apa calda la 40oC. Se amesteca pentru omogenizare dupa care se adauga maiaua de drojdii. Se amesteca bine, iar vasul se acopera cu o panza alba curata. Dupa doua ore fermentatia alacoolica ajunge la stadiul de activitate intensa care va continua 24 ore. Temperatura ambientala va fi de 15 - 20oC, concentratia initiala de zahar a amestecului intre 140g/l - 200g/l, aciditatea (exprimata in g/l H2SO4) 2.5 - 3.5, iar pH-ul 3.8 - 4.2. La sfarsitul acestui interval maiaua secundara va avea urmatoarele caracteristici: Lichid tulbure mai deschis la culoare din cauza continutului mare de levuri (drojdii), avand continut de zahar total de 30 - 45g/l, o concentratie alcoolica de 10 - 11% si aciditatea totala de 3.5 g/l-6 g/l. 3. Prepararea maielei de productie se face in scopul asigurarii unei cantitati suficiente de drojdii pentru intreaga cantitate de must, cunoscut fiind faptul ca, pentru o buna fermentare, raportul dintre maia si cantitatea de must este de 1/5 - 1/4. Prepararea se face intr-un vas cu gura larga din sticla sau material plastic cu capacitatea de 20 - 50 l, in care se amesteca 20 l must limpede 144

(continand 180 - 230 g/l zaharuri), 5 l mediu apos nutritiv (50 g fosfat acid de amoniu sau alti nutrienti dizolvat in 5 l apa calda la 40oC) si maiaua secundara de levuri. Se lasa la fermentat 24 ore, timp in care se amesteca de 3 - 4 ori pentru omogenizare si acrare. Caracteristicile maielei de productie (tertiara) de buna calitate trebuie sa fie urmatoarele: continutul de zahar 60 - 80 g/l, continutul de alcool 10 - 11%, aciditatea totala de min. 4 g/l. Daca aspectul maielei nu este laptos iar caracteristicile de mai inainte nu sunt indeplinite, se mai adauga pentru activarea inmultirii drojdiilor inca 10 - 15 l must zaharat (continand peste 200 g/l zaharuri), acid citric (cca. 5 g pentru marirea aciditatii totale), vitamina B1 (cca. 50mg sau un comprimat farmaceutic) ori B complex (un comprimat dizolvat) si fosfat acid de amoniu (cca. 5 g), lasandu-se la fermentat inca 12 ore. 4. Maiaua astfel obtinuta se adauga in mustul limpede (1 - 1.5 hl) in care s-au dizolvat nutrientii, vitaminele si eventual zaharul necesar pentru aceasta cantitate. Fermentarea se va desfasura in conditiile aratate anterior.

Vinurile albe se prepara din soiuri de struguri albi (Feteasca alba, Feteasca regala, Riesling, Pinot gris, Traminer, Chardonnay, Muscat, Chasselas, Afuz - Ali, etc.) sau din rosii si negri cu sucul necolorat (Monastul, Chasselas violet, etc.) Vinurile rosii se prepara din struguri rosii sau negri, mustul fiind fermentat pe bostina (pielite, miez si seminte) pentru ca substantele colorante, aromele, taminurile din seminte si pielitele sa treaca in must. Strugurii folositi provin din soiuri cu pielita colorata (Babeasca neagra, Feteasca neagra, Pinot noir, Cabernet Sauvignon, s.a.) si cei cu pielita si miezul colorate (Alicante Bouchet, Merlot, Muscat Hamburg, etc.), precum si din hibrizi rosii si negri producatori. Prelucrarea se face numai la strugurii copti cu un continut de zaharuri de 180 - 200 g/l si aciditate de 4 - 5 g/l. Mustuiala se sulfiteaza (5 - 10 g/hl) si se supune fermentarii adaugandu-se 2 - 3 l/hl maia de drojdii si nutrientii de activare a drojdiilor. Fermentarea vinurilor rosii dureaza 5 - 6 zile, timp in care stratul de pielite format la suprafata lichidului (asa-numita "caciula plutitoare") este periodic scufundat de 2 - 3 ori pe zi cu linguroaie de lemn.

145

Cand vinul este destul de colorat si suficient de astringent se face tragerea vinului (ravacitul) de sub bostina, printr-o canea, iar bostina se preseaza amestecandu-se vinul ravac cu vinul rezultat de la presare. Amestecul este "tras" in vase curate si afumate cu sulf, prevazute cu palnii de fermentare pentru fermentarea in continuare. Opreratiile urmatoare sunt similare cu cele de la prepararea vinului alb. Prepararea vinurilor aromate (tamaioase) se face in mod similar cu metoda aplicata la vinurile rosii, cu deosebirea ca fermentarea mustului pe bostina este de numai 2 - 3 zile. Recoltarea strugurilor tamaiosi (Muscat Ottonel, Tamaioasa romaneasca, Busuioaca de Bohotin, Busuioaca roza, Muscat Hamburg, s.a.) se face cand incep sa se stafideasca (au 250 - 280 g/l zaharuri). Se pot obtine vinuri aromate si prin adaugarea la inceputul fermentatiei a unor flori sau parti de plante aromate ale caror arome se armonizeaza cu buchetul vinului (ex: flori de soc, iasomie, frunze de indrusain, busuioc, etc.). Aceasta metoda se poate aplica cu bune rezultate la vinificarea hibrizilor direct producatori (hibridul Noah sau Nova) din care se obtin vinuri cu un buchet specific - denumit foxat (deoarece il apropie de mirosul neplacut cu care vulpile isi marcheaza teritoriul).

Strugurii avariati, partial sau total, indiferent de culoare sau aroma, se vinifica in alb, cat mai rapid posibil, luandu-se masuri de dezinfectie cu doze mai mari de dioxid de sulf sau metabisulfit. Tescovina se trece la fermentat imediat in vederea obtinerii rachiului de tescovina, iar mustul este insamantat cu drojdii selectionate, preparate separat in must de calitate, cantitatea de maia fiind de 2 4 ori mai mare. Se obtin rezultate bune prin pasteurizarea repetata (tindalizare) a mustului limpede, ajustarea continutului de zahar si a aciditatii, adaugarea de tanin (5 - 10 g/l) si insamantarea cu drojdii selectionate sau uscate in cantitatile aratate la vinurile albe.

Prepararea vinurilor aromatizate (vinul pelin, vermutul, bitterul, vinurile tonice, vinurile aperitive, vinurile medicinale).

Vinul pelin este un sortiment de vin special, obtinut prin adaugarea florilor uscate (200 - 300 g/hl in saculeti de panza) sau a maceratelor din flori de pelin in 146

mustul supus fermentarii, pentru a-i imprima gustul amarui si aroma de pelin. Pentru ca vinul sa capete un gust mai placut, impreuna cu floarea de pelin se mai adauga si o mica cantitate de gutui taiate felii, iar pentru a-l armoniza sub aspect gustativ, el se cupajaza cu alt vin. Daca producatorul nu are inca experienta necesara, este sfatuit sa faca in prealabil incercari pe microprobe, adaugand, la inceput, cantitati reduse de extract, pe care le va mari progresiv, pana la obtinerea gustului dorit. Vinurile pelin se obtin in mai multe subsortimente: pelin sec, pelin dulce, pelin "de mai". Pelinul dulce se prepara din boabe de struguri care se pun la fermentat intregi. In vase se adauga floare de pelin, gutui taiate si must proaspat. Dupa umplere, vasul se infunda si se lasa sa fermenteze 3 - 4 luni, cand strugurii se scot si se preseaza. El se mai poate prepara si dintr-un vin sec caruia i se adauga macerat de pelin, must concentrat prin fierbere sau sirop de zahar (pana la o concentratie de 180 - 200 g/l determinata refractometric). Pelinul de mai se prepara din vin sec, must concentrat sau sirop de zahar (15 - 20 g/l) si un macerat preparat din urmatoarele ingrediente (pentru 1 hl): 200 250 g flori de pelin (Artemisia absinthum), 50 g pelinita (Artemisia austriaca), 20 30 g samanta de coriandru (Coriandrum sativam), 20 g cuisoare (Caryophylli flos), 30 - 40 g scortisoara (Cinnamomi cortex) si 25 - 50 g coji de gutui (Cydonia vulgaris). Ingredientele se macereaza in 2 l alcool 60% timp de 8 - 10 zile, alcoolatura astfel obtinuta adaugandu-se peste un hectolitru din vinul pregatit asa cum s-a aratat mai inainte.

Vermutul este o bautura alcoolica obtinuta din vin cu adaos de alcool etilic, macerat aromat din plante si zahar, avand concentratia alcoolica de 16 - 18%, continut de zaharuri de 100 - 180 g/l (vermutul sec numai 64 g/l) si un gust caracteristic, placut si catifelat, predominant de pelin. Vermuturile pot fi albe sau rosii, seci sau desert si se servesc atat ca bauturi aperitive cat si ca deserturi. Ele se servesc bine racite, in pahar aperitiv sau tumbler (pahar mare), fara gheata, cu o rondela de lamaie sau portocala ca decor pe marginea paharului si, la cerere, cu sifon foarte rece. Cele mai renumite marci de vermut sunt cele franceze (Chastnet, Chambery, Dubonnet, etc.) si italiene albe si rosii, seci si dulci (Cinzano, Martini, Riccadonna, Gancia, etc.). 147

Pentru obtinerea vermutului, ingredientele componente (vinul, siropul, esenta si alcoolul) se amesteca in vederea cupajarii in vase de sticla sau plastic, in urmatoarea ordine: esenta din plante, alcoolul, siropul si vinul, si eventual cantitatea de acid organic (tartric sau citric). Componentele se amesteca bine pana la omogenizare. Se corecteaza gustul si aroma vermutului preparat si se lasa la macerat 1 - 3 luni pentru maturare si armonizare. Dupa aceasta perioada de timp, vermutul se decanteaza de pe sedimentul format si se trage in sticle. Acestea se pastreaza in pivnite racoroase si uscate. In continuare sunt expuse doua retete de vermut: Rosu: 10 l vin rosu (12o), 0.94 l alcool (80o), 1.6 kg zahar, 0.2 l macerat de plante, 15 g acid tartric (citric), 5 - 10 g caramel. Alb: 10 l vin alb (12o), 0.94 l alcool (80o), 1.6 kg zahar, 15 g acid tartric (citric), 10 g flori de pelin, 5 g coji de protocale, 2 g coji de grapefruit, 10 g samanta de coriandru, 1 g cuisoare, 1 g seminte de anason (Pimpinella anisum).

Bitterul este un aperitiv preparat din vin alb sau negru, esente si macerate din plante aromate, fructe de citrice, alcool si zahar. Continutul de alcool variaza intre 25 si 30%, iar cel de zahar intre 50 si 200g/l. Sunt cunoscute 3 grupe de bitter: aperitive (Camparri, Rossi), stomahice (Fernet) si amestecuri (Orange, Amer, Peach, s.a.). Campari este bitterul cu cea mai mare popularitate. El are 27% alcool si 160 g/l zahar. Bitterul este limpede, cristalin, fara sedimente, are gust si miros fin, caracteristic produsului (amarui). Exista nenumarate retete de bitter, unele mai complicate ca altele, astfel incat, in continuare, vom prezenta unele retete mai usor de realizat in gospodariile agroturistice: 50 g gentiana (Gentiana punctata, G.lutea), 20 g scortisoara, 10 g flori de pelin, 3 g coji de portocala, 10 g coji de lamaie, 100 g miez de nuca, 10 g samburi de migdale amare (Prunus amygdalus), 10 l vin rosu. Bitterul autohton "Taina plantelor" (dupa Maria Pop) contine urmatoarele plante din care se face extractul: aloe, ghintura, ienupar, smirna, angelica, iris, tintaura, origan, salvie, sanziana, pedicuta, galbenele, salcam, sofran, frasin, mesteacan, troscot, afin, nuc, soc, coada soricelului, coada calului, menta, sunatoare, maces, pelin, cimbrisor, fenicul, coacaz, scortisoara. Conform declaratiilor autoarei, bitterul preparat din aceasta esenta (si respectand probabil caracteristicile compozitionale ale bitterului) are proprietati terapeutice deosebite: inlatura oboseala si stressul, 148

stimuleaza digestia, dezintoxica organismul, etc. Un bitter "fortifiant" se poate prepara si din 100 l must proaspat in care se adauga un saculet cu urmatoarele cantitati de plante uscate: 3 g gentiana, 100 g tintaura, 100 g coaja de portocala, 100 g floare de pelin, 5 g radacina de obligeana, 100 g miez de alune maruntit, , 80 g ciumarea, 50 g pelin mic, 50 g salvie, 50 g radacina de stanjenel, 5 g chinina galbena, 30 g scortisoara si 15 g cuisoare.

Vinurile spumante sunt produse obtinute din vinuri obisnuite carora li se adauga un supliment de zahar (eventual substante aromatizante), urmata de o a doua fermentare in butelii. Acest tip de vin se prepara mai putin in gospodariile rurale, producerea lui necesitand o activitate mai laborioasa si o grija deosebita din partea producatorului. Totusi, in multe gospodarii, se produce acest tip de vin din struguri sau alte fructe, fiind cunoscute sub numele de vinuri petiante, vinuri spumante la care dioxidul de carbon este de origine endogena, dar are o presiune mai mica (1 - 2.5 atmosfere) decat a vinurilor spumante (3.5 atm). Acestea sunt produse dupa metoda champenoise sau metoda naturala (rurala), pe care o vom prezenta pe scurt in continuare. In aceasta categorie pot fi incluse si vinurile si fructinurile cu continut normal sau scazut de alcool (5 - 12%) si adaos de arome, cele mai des intalnite dintre acestea fiind: socata, vinurile coober, fructinul de coacaze rosii (vinul de rujincini), cidrul spumant, gama acestor bauturi fiind foarte larga. Materia prima a vinului spumant o constituie vinul sau fructinul, preparat asa cum s-a aratat in sectiunile de mai inainte, sau vinul partial fermentat (9 - 10o alcoolice), oprindu-se fermentatia la un moment dat prin pritociri repetate la intervale mai dese de timp, pentru inlaturarea generatiilor succesive de levuri si odata cu ele saracirea mustului in elemente nutritive ale cresterii si inmultirii acestora. Astfel, fermentatia alcoolica este incetinita inainte de consumarea zaharului din must, acesta fiind introdus in butelii unde isi continua fermentatia alcoolica, obtinandu-se vinul spumant. In prezent, in locul pritocirilor repetate se procedeaza la filtrarea mustului fermentat cand acesta contine 8 - 9% alcool si la continuarea fermentarii in butelii, de cele mai multe ori dupa adaugarea unui sirop de zahar (pentru 10 l vin spumant, siropul se prepara din 1.6 kg zahar dizovat la cald in 2 l de vin alb limpede sau apa, peste care, dupa racire, se adauga 100 ml coniac sau alcoolaturi 149

(esente) aromate din plante si 10 g acid citric sau tartric), astfel ca in final sa rezulte un must cu concentratie de zahar de 220 - 230 g/l. Fermentarea in butelii presupune folosirea unor butelii rezistente la presiuni de 2 - 3 atm., a unor dopuri legate de gatul buteliei cu sarma si timp mai indelungat (30 - 90 zile, cateodata mai mult) la temperatura de 16 - 18oC. Producatorii care vor sa faca deodata cantitati mai mari de vinuri (fructinuri) spumante pot folosi recipienti din polistiren armat cu fibre de sticla (cu inchidere etansa si robinet de scurgere amplasat la cca. 10 cm de fund) sau confectionate artizanal din inox pentru apa carbogazoasa si prevazute cu un cap de sifon (teava din interiorul sifonului va avea capatul la cca. 10 cm de fundul sifonului). Capacitatea lor poate varia intre 100 si 200 l pentru primul tip si 5 - 25 l pentru sifoanele din inox. Pot fi folosite si alte tipuri de recipienti si materiale din care se confectioneaza acestea (fara materiale corozive sau care pot imprima gust si miros neplacut bauturii), cu conditia ca ele sa reziste la presiuni ridicate de 2 - 5 atmosfere. Procedeul este apropiat de cel al vinurilor spumante obtinute prin metoda rezervoarelor inchise in flux discontinuu: Charmant si Asti spumanti.

Vinurile speciale ameliorate dupa retete speciale, cunoscute si transmise in plan familial, pot constitui ca "specialitate a casei" un punct de atractie pentru o pensiune turistica rurala. Asemenea marci de vinuri au devenit celebre in intreaga lume si fac faima locurilor lor de origine. Aceste vinuri sunt alcoolizate pana la 17 22% alcool si tratate dupa metode si retete speciale, unele tinute in secret pana in zilele noastre. Vinul de Xeres (Jeres sau Sherry), denumit astfel dupa orasul Xeres din Spania, se obtine din soiurile de Palomina si Piedro-Ximenes. Strugurii sunt culesi la continutul de 25 - 27% zahar si 4 - 5% aciditate, se zdrobesc si se preseaza, obtinandu-se mustul care se fermenteaza mai lent, la 18 - 20oC, dupa metode specifice. Vinul de Xeres are o tarie alcoolica de 18 - 20.65, continutul de zahar de 20 - 67 g/l si are un gust asemanator nucilor verzi si foilor de tutun, precum si un buchet placut catifelat, dificil de precizat. Alcoolizarea se poate face si cu coniac de vin sau rachiu de drojdie sau tescovina provenite din aceiasi struguri. Vinul de Malaga se obtine din soiurile de struguri Piedro-Ximenes, Lavren, Perruna, Molar, Malvasia, cultivati in regiunea din jurul orasului Malaga (Spania), culesi la coacerea deplina. Mustul obtinut se alcoolizeaza usor, se lasa sa 150

fermenteze, transformandu-se in vin care se foloseste ca materie prima pentru pregatirea vinurilor tip Malaga. In afara de vin se mai folosesc si alte ingrediente: Arropa - concentrat de must, Maestro - un amestec de must si alcool, Tierno - un amestec hidroalcoolic, Color - un must colorat. Din aceste ingrediente, dozate in proportii diferite, se obtin diverse tipuri de vinuri de Malaga. Vinul de Malaga are o culoare de chihlimbar, gust amarui, miros specific, gudronat, continut de alcool de 16 - 17% si de zahar de 18 - 195. Cel mai bun si renumit sortiment este Malaga Lagrima, obtinut din struguri stafiditi pe butuc cateva saptamani de la recoltarea dupa coacerea naturala. Vinul de Madeira se prepara din struguri Verdhelo, Sercial, Tinto, Malvasia, din care se obtine un must fara dezbrobonarea ciorchinilor, care sunt fermentati, obtinandu-se la inceput un vin astringent care se alcoolizeaza cu rachiu de tescovina pana la 20% alcool. Vinul brut se supune cupajarii si tratamentului termic special (in camere de madeirizare), durata si intensitatea tratamentului fiind secrete pastrate de secole. Vinul de Madera este sec (0.6 - 2% zaharuri), are culoarea chihlimbarului, gust si nuanta de caramel, buchet specific, placut si indescriptibil si un continut de alcool de cca. 18%. Vinul de Porto se prepara din soiurile de struguri rosii Bastardo, Alvaretio, Souzia si Turigo si din struguri albi din soiurile Muscat, Verdhelo si Malvasia. Strugurii sunt recoltati la un grad de coacere avansat dar nestafiditi si se zdrobesc impreuna cu ciorchinii. Dupa 14 ore de fermentare a mustuielii, mustul este colectat si alcoolizat cu distilat de vin. Fermentarea mustului si prelucrarea lui se fac in vase de lemn de mici capacitati, la temperaturi ridicate (28 - 32oC), temperaturi la care se si pastreaza in depozite de suprafata. Se deosebesc 3 sortimente de vin de Porto: alb, rubiniu (rosu) si comun. Cel mai raspandit sortiment este Porto alb, de culoare aurie, chihlimbarie, gust dulce, buchet placut, catifelat si continut de alcool de 18 - 23%.

Vinuri si fructinuri amestecate. Aceste bauturi se prepara prin amestecarea mai multor sortimente de bauturi alcoolice sau nealcoolice la care se adauga fructe, siropuri de fructe, etc. Crusoanele sunt amestecuri de vinuri cu lichioruri, distilate alcoolice si fructe, preparate dupa retete diverse, purtand denumirea vinului care participa in

151

proportie de peste 70%: cruson de vin, cruson de sampanie, cruson de Madera. Iata doua exemple: 1. vin rosu 2.5 l, lichior de cirese 200 ml, coniac 200 ml, fructe intregi si taiate (cirese, piersici, caise, mere) in amestec 400 g se amesteca intr-un bol de sticla cu capacitate adecvata. Se serveste rece, frapat. 2. vin alb 250 ml, vin rosu 750 ml, rom 50 ml, coniac 50 ml, zahar pudra 200 g, fructe aromate (visine, caise, capsuni) 1 kg se amesteca, se frapeaza si se serveste cu sifon rece in pahare aperitiv, tubulare sau cupe. Cvasul este o bautura slab alcoolica, racoritoare, cu gust dulce acrisor, preparata din fructe, cereale si apa, puse impreuna la fermentat timp de 12 - 14 ore la temperatura de 22 - 28oC. Apoi se trage in sticle unde fermenteaza in continuare cateva zile la temperaturi mai scazute 10 - 15oC. Depozitarea se face in incaperi reci. Gustul, aroma si culoarea sunt imprimate de fructele adaugate, taria alcoolica este de 1.5 - 3.5%, aciditatea depaseste 10 g/l iar continutul de zahar variaza, in functie de reteta folosita, intre 60 - 200 g/l. Sunt aratate, in continuare, cateva retete de preparare a cvasului ce pot fi aplicate in gospodariile rurale: 12 l apa, 1 kg paine de secara (paine neagra), 600 g miere (800 g zahar), coaja unei lamai, 100 g stafide, 25 g drojdie de bere; painea taiata felii este uscata in cuptor, feliile asezandu-se intr-un borcan de 15 l. Se pune coaja de lamaie taiata marunt si se toarna deasupra apa clocotita. Se acopera cu o panza alba, curata, lasandu-se la racit pana ajunge la 37 - 40oC. Intr-un alt borcan mic se pregateste drojdia prin dizolvare in apa calduta (30oC) amestecata cu miere sau zahar (250 g/l) pana cand se produce o spuma la suprafata, moment in care ingredientele din reteta si drojdia preparata se amesteca cu apa calduta din borcan. Dupa cca. 12 - 14 ore de fermentare, timp in care se amesteca cu o lingura de lemn de 2 - 3 ori, mustul in fermentare este filtrat prin 2 panze avand un strat de vata la mijloc si se transfera in buteliile de depozitare, in fiecare sticla adaugandu-se 2 - 5 stafide. Sticlele se infunda cu dopuri ce se leaga cu sarma pentru a rezista la presiune si se depoziteaza cateva zile in pivnite sau alte spatii racoroase pentru fermentarea in buteliile de consum. Cvas de lamaie: 5 l apa, 250 g zahar, 5 - 6 lamai, 2 linguri de miere, drojdie de bere (5 g), stafide. Ingredientele, cu exceptia drojdiei, stafidelor si cojii de lamaie, se fierb aproximativ o ora, dupa care se adauga coaja de lamaie si se lasa sa se raceasca. Dupa racire se adauga drojdia si o parte din stafide si se lasa 152

la fermentat, restul operatiilor fiind aceseasi ca la cvasul clasic. Pentru prepararea diverselor cvasuri se pot folosi si alte fructe si legume (visine, cirese, capsuni, sfecla rosie, morcovi, telina, mere, pere, caise, etc.). Pentru reducerea aciditatii este bine sa se adauge in amestec o jumatate de lingurita de bicarbonat de sodiu alimentar.

6.2 Bolile si defectele de origine microbiana ale bauturilor fermentate din fructe si legume

a. boli provocate de microorganisme aerobe

Floarea vinului se manifesta la vinurile slab alcoolice, ce nu contin dioxid de C si de S liber, expuse la aer sau tinute in vase incomplet umplute, in incaperi calduroase, prin aparitia unui voal alb sau galben cenusiu si se datoreaza drojdiilor Mycoderma vini din genurile Hansenula, Pichia, Zygopichia, Torula, etc. Culoarea vinului (fructinului) nu se schimba, insa celelalte caracteristici organoleptice se schimba in rau iar concentratia alcoolului scade. Profilaxia bolii se poate realiza prin mentinerea vaselor de vin pline si pastrarea lor in incaperi racoroase. Vinurile trebuie sa aiba minimum 10% alcool. Boala poate fi oprita prin filtrarea si pasteurizarea vinului, dupa care vinul se poate cupaja cu un vin sau fructin mai alcoolic. Otetirea vinului (cidrului) are loc in special la vinurile slab alcoolice, in prezenta aerului. Boala se manifesta si la fructinuri si cidru, prin aparitia unui voal transparent la suprafata lichidului, ce apoi se ingroasa si devine mat. Fermentatia alcoolica si transformarea in acid acetic se datoreste bacteriilor acetice din genul Acetobacter (A.orleanense, A.vini-acetati, etc.) Un rol in raspandirea bacteriilor acetice il are musculita otetului (Drosophyla melanogaster). Pentru prevenirea bolii, care nu are un remediu curativ, este recomandabil tratamentul cu dioxid de sulf a vinului si inventarului de vinificare. Neutralizarea acidului acetic cu carbonat de calciu sau tartrat de potasiu, urmata de filtrare, pasteurizare termica si cupajare poate avea rezultate, cu conditia trecerii la 153

consumul imediat al vinului, dar acest lucru trebuie sa se petreaca numai la inceputul bolii. Fiind o fermentatie aeroba, vasele continand vinul trebuie sa fie pline si etansate.

b. boli produse de microorganisme anaerobe

Borsirea vinului (manitarea) se datoreaza unei fermentatii manitice (manita sau manitolul este un hexaalcool cu 6 atomi de carbon) provocata de mai multe specii de bacterii, printre care Bacterium mannitopoeum, Bacterium intermedium, Micrococcus acidovorax si se dezvolta la temperatura optima de 25 30oC, dar si la temperaturi mai ridicate (36oC) la care se face, uneori, vinificarea. Combaterea bolii se face prin tratamentul termic peste 60oC al vinului, cresterea concentratiei de dioxid de sulf la min. 100 mg/l, alcoolizarea vinurilor la peste 14%, marirea concentratiei de zahar a vinului. Prevenirea se poate face prin: racirea mustului in timpul fermentatiei, acidularea musturilor prin adaugarea de acid tartric sau citric. Balosirea. Vinul atins de aceasta boala (in special cel alb) se tulbura, devine vascos si isi pierde fluiditatea, iar cand boala este avansata, se transforma intr-o masa mucilaginoasa din care se degaja bule de dioxid de carbon. Mirosul vinului nu se schimba, dar gustul devine fad. Boala se manifesta mai ales la vinurile tinere, cu aciditate slaba si continut scazut de alcool (sub 10%). Vinurile rosii, mai bogate in taninuri, sunt mai rar atacate de microorganismele care produc boala: Bacillus viscosus vini, drojdia Dematium pullulans sau specii din genurile Pichia si Torula. Temperatura optima de dezvoltare a acestor microorganisme este de 30oC. Microorganismele amintite nu actioneaza la vinurile bogate in taninuri (> 20 g/hl), cu aciditate libera peste 19 la mie, concentratie alcoolica mai mare de 14% si continut de SO2 de 10 g/hl. Boala poate fi combatuta si prin pasteurizare. Amareala vinului se intalneste mai ales la vinurile rosii si vechi. Vinurile bolnave au un miros caracteristic intepator, de acizi volatili, gust amar-iute si aspect tulbure datorita insolubilizarii materiilor colorante si numarului mare de bacterii (Bacillus amaracryllus) care ataca glicerina transformand-o in acroleina (aldehida acrilica). Boala poate fi prevenita prin ingrijirea vinurilor puse la 154

invechire, pritrociri repetate pentru aerarea vinului si tratarea cu dioxid de sulf. Ea poate fi combatuta in faza initiala prin pasteurizarea vinului la 60 - 65oC timp de 1 2 minute, tratarea cu dioxid de sulf peste 50 mg/l, cleire si filtrare urmata de reinocularea cu drojdii selectionate. Dupa tratament, vinul usor manitat se cupajeaza cu un vin normal si se consuma cat mai repede. Fermentarea propionica a vinurilor este provocata de mai multe specii de bacterii: Bacillus saprogenes vini, Bacterium tartarophorum, Bacterium

mannitopoeum, B.gracile, etc. Vinurile atacate sunt cele slabe in alcool si zahar, care devin tulburi, au un gust neplacut si se brunifica. Pus in pahar, acesta formeaza valuri matasoase. Bacteriile ataca acidul tartric si sarurile lui pe care il transforma in acid acetic, lactic si propionic. Profilaxia si combaterea sunt asemanatoare celor aplicate la vinurile bolnave descrise pana acum. Boala mai este cunoscuta de enologi sub denumirea de boala intoarcerii vinului.

155

BIBLIOGRAFIE

NESTORESCU si colegii - Bacteriologie medicala; Ed. Medicala, Bucuresti, 1965 LUCIA DEBELEAC, M.C. POPESCU-DRANDA - Microbiologie;Ed. Medicala Amaltea, Bucuresti, 1994 D. MOTOC - Microbiologia produselor alimentare; Ed. Tehnica, Bucuresti, 1964

156

D. BARZOI - Microbiologia produselor alimentare de origine animala; Ed. Ceres, Bucuresti, 1985 I. MARINESCU - Microbiologie si Biochimie, manual pentru licee industriale; Ed. Didactica si Pedagogica, Bucuresti, 1981; D. PANAITESCU, Al. BREZEANU - Microbiologie si parazitologie, manual pentru licee sanitare; Ed. Didactica si Pedagogica, Bucuresti, 1976 I.C.VOICULESCU, C.POPOVICI - Biologie, anul I de liceu; Ed. M.E.I, Bucuresti, 1974 T.CRACIUN, LUANA-LEONORA CRACIUN - Dictionar de biologie; Ed. Albatros, Bucuresti, 1989 I.Gh.TUDOSE - Genetica microorganismelor; Editura Didactica si Pedagogica, Bucuresti, 1982 MARIA RABEGA, C.RABEGA - Vitamine, enzime si hormoni; Ed. Albatros, Bucuresti, 1983 C. BODEA - Tratat de biochimie vegetala, Ed. Academiei, Bucuresti, 1964 L.GAVRILA, Al. IONESCU - Biologia reproducerii, mediu si biodiversitate; Constanta, 1964 VALENTINA DAN - Microbiologie, note de curs; Universitatea din Galati, 1993 G. ZARNEA - Tratat de microbiologie generala I si II; Ed. Academiei, Bucuresti, 1984 D. BUIUC - Microbiologie medicala; Ed. Didactica si Pedagogica, Bucuresti, 1992 St. KISS si colegii - Enzimologia mediului inconjurator, enzimele si fertilitatea solului; Ed. Ceres, Bucuresti, 1991 V. STANESCU - Igiena si controlul alimentelor; Ed. Fundatiei Romania de maine, Bucuresti, 1998 AXENTA SEVER BANCIU, DELIA CIACOI-DIMITRIU - Descoperiri epocale in biochimie; Ed. Albatros, Bucuresti, 1990 VERONICA DINU, E.TRUTIA, ELENA POPA-CRISTEA, AURORA POPESCU Biochimie medicala, mic tratat; Ed. Medicala, Bucuresti, 1998 VICTORIA HERLEA - Microbiologie generala; Ed. Univers, Bucuresti, 1998 DORINA MARTIN, M. MARTIN - Bauturi de casa din fructe si legume; Ed. Ceres, Bucuresti, 1986 I. PUSCA - Bauturi spumante in gospodarie; Ed. Ceres, Bucuresti, 1988 V. IONESCU-SISESTI, P. PAPACOSTEA, G. STEFANIC - Compostul, ingrasamant din deseuri organice; Ed. Stiintifica si Enciclopedica, Bucuresti, 1980 Al. IONESCU - Agricultura ecologica; Ed. Ceres, Bucuresti, 1982 G. STEFANIC - Proteina direct din azotul atmosferic; Ed. Stiintifica si Enciclopedica, Bucuresti, 1983

157

G. BARBU - Turismul si calitatea vietii; Ed. Politica, Bucuresti, 1980 IULIANA POPOVICI, D. LUPULEASA, ANISOARA HRISCU - Dictionar farmaceutic; Ed. Didactica si Pedagogica, Bucuresti, 1997 VIORICA ISTUDOR - Farmacognozie, fitochimie, fitoterapie, vol.I; Ed. Medicala, 1998

158

OBIECTIVELE, CONTINUTUL, CUVINTELE-CHEIE SI REZUMATELE CAPITOLELOR CURSULUI INTREBARI AJUTATOARE PENTRU STUDENTI, IN SCOPUL INTELEGERII NOTIUNILOR PREZENTATE IN FIECARE CAPITOL

PARTEA I NOTIUNI DE MICROBIOLOGIE GENERALA

Capitolul 1 INTRODUCERE IN MICROBIOLOGIE

Obiective urmarite: familiarizarea studentilor cu disciplina de microbiologie si cu impactul acesteia asupra activitatii umane de zi cu zi din diferite domenii de activitate; cunoasterea ramurilor subordonate ale microbiologiei si cu ce se ocupa fiecare in parte; cunoasterea istoricului microbiologiei si a personalitatilor sale marcante, de la primul sau pas descoperirea microscopului pana la aparitia celui mai dinamic domeniu al microbiologiei moderne ingineria genetica; intelegerea importantei acestei discipline pentru profilul ales de studenti.

Continut: 1.1. 1.2. Definitia microbiologiei; Scurta istorie a microbiologiei.

Cuvinte-cheie: micros, bios, logos, bacteriologie, micologie, protozoologie, virologie, parazitologie, algologie, microscop, biotehnologie

Rezumatul capitolului: In acest capitol va sunt prezentate: 1

microbiologia ca stiinta biologica, a rolului acesteia in diferitele domenii ale activitatii umane: medicina, agricultura, alimentatie, biotehnologie etc.; ramurile subordonate ale microbiologiei, cu statut aparte si preocupari specifice; domeniile aplicative ale microbiologiei; scurt istoric al microbiologiei, structurat in patru etape; personalitati marcante din lumea microbiologiei.

Bibliografie selectiva: VICTORIA HERLEA Microbiologie generala; Ed. Univers, Bucuresti, 1998; G. ZARNEA Tratat de microbiologie generala I si II; Ed. Academiei, Bucuresti, 1984.

Intrebari: 1. Este microbiologia o stiinta a viitorului ? 2. Cand a aparut microbiologia ca stiinta individualizata ? 3. Exemplificati prin date semnificative etapele istoricului microbiologiei. 4. Cu ce se ocupa micologia ? 5. Importanta microbiologiei sanatatii publice si epidemiologice. 6. Importanta microbiologiei agricole.

Tema de casa: 7. Referat privind importanta microbiologiei pentru diferitele domenii ale activitatii umane.

Capitolul 2 TAXONOMIE SI SISTEMATICA GENERALA MICROORGANISMELOR

Obiective urmarite: intelegerea de catre studenti a clasificarii, nomenclaturii si identificarii microorganismelor; cunoasterea semnificatiei numelui stiintific al speciilor si scrierii corecte a acestuia; cunoasterea sistemului de organizare a lumii vii, alcatuite din cele 5 regnuri de baza, in functie de tipul si structura celulara, organizarea celului si tipul de nutritie a organismului.

Continut: 1.3. 1.4. 1.5. 1.6. Definitia microbiologiei; Nivele de clasificare; Desemnarea numelui stiintific al speciilor; Sistemul natural, filogenetic, de organizare a lumii vii.

Cuvinte-cheie: taxon, tulpina bacteriana, colonie, sistem binominal, sistem filogenetic, regn

Rezumatul capitolului: In acest capitol va sunt prezentate: notiuni privind clasificarea, nomenclatura si identificarea microorganismelor; nivele de clasificare; desemnarea numelui stiintific al speciilor; sistemul natural, filogenetic de organizare a lumii vii.

Bibliografie selectiva: VICTORIA HERLEA Microbiologie generala; Ed. Univers, Bucuresti, 1998;

VALENTINA DAN Microbiologie note de curs, Universitatea din Galati, 1993.

Intrebari: 1. Ce reprezinta taxonomia ? 2. Definiti specia bacteriana. 3. Explicati numele stiintific binominal al microorganismelor, cu exemple. 4. Ce cuprinde regnul Procaryotae ? 5. Ce cuprinde regnul Fungi ? 6. Ce cuprinde regnul Animalia ?

Tema de casa: 1. Referat privind studiul diversitatii microorganismelor si importanta existentei sistemului de recunoastere si definire a proprietatilor organismelor.

Capitolul 3 MORFOLOGIA MICROORGANISMELOR

Obiectivele urmarite: cunoasterea de catre studenti a celulei de tip procariot si de tip eucariot; cunoasterea componentelor principale ale celulei eucariote, precum si a sistemelor structurale subcelulare ale acesteia; cunoasterea virusurilor ca microorganisme acelulare, parazite obligatoriu intracelular; modelul de organizare si de actiune al virusurilor; cunoasterea bacteriofagilor, a viroizilor si prionilor si a impactului acestora cu lumea macro.

Continut: 1.7. 1.8. 1.9. Definitii Structura celulei microorganismelor Virusurile

1.10. Bacteriofagii 1.11. Viroizii si prionii

Cuvinte-cheie: procariote, eucariote, citoplasma, nucleu, membrana celulara, virusuri, virioni, bacteriofagi, viroizi, prioni

Rezumatul capitolului: In acest capitol va sunt prezentate:

ce si cine sunt microorganismele; structura celulei microorganismelor; notiuni despre virusuri; ce sunt bacteriofagii;
ce sunt viroizii si prionii.

Bibliografie: I. MARINESCU Microbiologie si Biochimie, manual pentru licee industriale; Ed. Didactica si Pedagogica, Bucuresti, 1981; NESTORESCU si colegii Bacteriologie medicala; Ed. Medicala, Bucuresti, 1965 LUCIA DEBELEAC, M.C. POPESCU-DRANDA Microbiologie, Ed. Medicala Amaltea, Bucuresti, 1994 D. MOTOC Microbiologia produselor alimentare; Ed. Tehnica, Bucuresti, 1964 D. BARZOI Microbiologia produselor alimentare de origine animala; Ed. Ceres, Bucuresti, 1985.

Intrebari: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Diferenta dintre celula procariota si cea eucariota. Rolul ribozomilor. Rolul nucleului celulei eucariote. Explicati modul de organizare a unui virus. Ce sunt bacteriofagii ? Explicati importanta cunoasterii viroizilor si prionilor.

Capitolul 4 BACTERIILE
Obiectivele urmarite: cunoasterea si intelegerea de catre studenti a morfologiei bacteriilor; cunoasterea fenomenului de sporogeneza bacteriana; intelegerea fiziologiei, biochimiei si metabolismului bacterian; cunoasterea notiunilor de genetica bacteriana.

Continut: 1.12. Morfologia bacteriilor 1.13. Structuri externe ale bacteriilor 1.14. Sporogeneza bacteriilor 1.15. Fiziologia, biochimia si metabolismul bacterian 1.16. Cresterea, multiplicarea si moartea bacteriilor 1.17. Elemente si notiuni introductive de genetica bacteriana.

Cuvinte-cheie: coci, bacili, vibrioni, spirochete, coloratie Gram, coloratie Ziehl-Neelsen, flageli, capsula, pili, spori, metabolism, medii de cultura, ereditate, cromozom bacterian, mutatii, transductie, conjugare bacteriana

Rezumatul capitolului: Acest capitol cuprinde: definitia, morfologia, structurile externe ale bacteriilor; sporogeneza bacteriilor; fiziologia, biochimia si metabolismul bacterian; elemente si notiuni introductive de genetica bacteriana.

Bibliografie selectiva: I.Gh.TUDOSE Genetica microorganismelor; Editura Didactica si Pedagogica, Bucuresti, 1982;

VALENTINA DAN Microbiologie note de curs, Universitatea din Galati, 1993. VICTORIA HERLEA Microbiologie generala; Ed. Univers, Bucuresti, 1998; G. ZARNEA Tratat de microbiologie generala I si II; Ed. Academiei, Bucuresti, 1984.

Intrebari: 1. Ce sunt stafilococii ? 2. Ce sunt bacilii ? 3. Dati exemple de tehnici de colorare a bacteriilor. 4. Diferenta dintre bacteriile capsulate si cele necapsulate. 5. Ce sunt flagelii ? 6. Ce reprezinta sporogeneza ? 7. Explicati multiplicarea bacteriilor. 8. Ce reprezinta metabolismul bacterian ? 9. Ce sunt bacteriile anaerobe ? 10. Explicati fenomenul de conjugare bacteriana.

Tema de casa: 11. Referat exemplificati cateva medii de cultura pentru bacterii mai des utilizate, dand si retetele acestora.

Capitolul 5 CIUPERCI MICROSCOPICE

Obiectivele urmarite: cunoasterea si intelegerea de catre studenti a aspectelor benefice si daunatoare ale microfungilor, respectiv drojdiilor si mucegaiurilor; cunoasterea morfologiei, reproducerii, sporularii mucegaiurilor si a

principalelor proprietati fiziologice ale acestora; cunoasterea importantei, morfologiei si fiziologiei drojdiilor.

Continut: 1.18. Definitie 1.19. Raspandirea mucegaiurilor 1.20. Morfologia mucegaiurilor 1.21. Reproducerea mucegaiurilor 1.22. Formarea sporilor 1.23. Proprietati fiziologice generale ale mucegaiurilor 1.24. Descriere generala, importanta, rol, raspandire drojdii 1.25. Morfologia levurilor 1.26. Fiziologia generala a levurilor 1.27. Reproducerea levurilor.

Cuvinte-cheie: mucegaiuri, levuri, ascospori, sporangiospori, conidiofori, hialoplasma, ADN extracromozomial, organisme heterotrofe

Rezumatul capitolului: In acest capitol va sunt prezentate:

ce sunt si unde se intalnesc ciupercile microscopice; cunostinte generale despre mucegaiuri; cunostinte generale despre drojdii (levuri).

Bibliografie selectiva: I.Gh.TUDOSE Genetica microorganismelor; Editura Didactica si Pedagogica, Bucuresti, 1982; VALENTINA DAN Microbiologie note de curs, Universitatea din Galati, 1993; VICTORIA HERLEA Microbiologie generala; Ed. Univers, Bucuresti, 1998; G. ZARNEA Tratat de microbiologie generala I si II; Ed. Academiei, Bucuresti, 1984.

Intrebari: 1. Definiti mucegaiurile. 2. Definiti levurile. 3. Explicati reproducerea sexuata la mucegaiuri. 4. Explicati importanta si rolul drojdiilor din industria alimentara. 5. Explicati inmultirea asexuata prin inmugurire a drojdiilor.

Tema de casa: 6. Referat Importanta drojdiilor si mucegaiurilor pentru industria alimentara.

10

PARTEA II NOTIUNI DE MICROBIOLOGIE APLICATA

Capitolul 1 METABOLISMUL MICROBIAN

Obiectivele urmarite: cunoasterea si intelegerea de catre studenti a metablismului energetic si de sinteza al microorganismelor; intelegerea notiunilor de microorganisme autotrofe si heterotrofe; intelegerea importantei transportului substantelor intre celula si mediul extern.

Continut: .1. .2. .3. .4. Definitie, caracteristici, cai metabolice Metabolismul energetic Metabolismul de biosinteza Transportul substantelor.

Cuvinte-cheie: metabolism, autotrof, heterotrof, metaboliti, fermentatie, difuzie, anabolism, catabolism

Rezumatul capitolului: In acest capitol va sunt prezentate: definitia, caracteristicile si caile metabolice ale metabolismului microbian; tipuri de metabolism: energetic si de sinteza; transportul substantelor.

Bibliografie selectiva: G. ZARNEA Tratat de microbiologie generala I si II; Ed. Academiei, Bucuresti, 1984; VICTORIA HERLEA Microbiologie generala; Ed. Univers, Bucuresti, 1998; D. PANAITESCU, Al. BREZEANU Microbiologie si parazitologie, manual pentru licee sanitare; Ed. Didactica si Pedagogica, Bucuresti, 1976; 11

D. BARZOI Microbiologia produselor alimentare de origine animala; Ed. Ceres, Bucuresti, 1985.

Intrebari: 1. Definiti anabolismul. 2. Explicati faza descompunerii enzimatice a metabolismului energetic. 3. Definiti fermentatia. 4. Explicati transportul substantelor prin difuzia pasiva. 5. Explicati transportul substantelor prin translocatie. 6. Definiti respiratia anaeroba.

Tema de casa: 7. Referat privind caracteristicile prinicipale ale metabolismului microbian.

12

Capitolul 2 TIPURI IMPORTANTE DE FERMENTATIE INTALNITE IN DOMENIILE AGRO-ALIMENTAR SI AGROTURISTIC

Obiectivele urmarite: cunoasterea principalelor tipuri de fermentatie si a factorilor de influenta ale acestora; intelegerea mecanismului biochimic al fermentatiilor; intelegerea importantei fermentatiilor pentru domeniul agro-alimentar.

Continut: 1.28. Fermentatia alcoolica 1.29. Fermentatia lactica 1.30. Fermentatia propionica 1.31. Fermentatia malo-lactica 1.32. Fermentatia metanica 1.33. Fermentatia butirica 1.34. Fermentatia acetica

Cuvinte-cheie: fermentatie, pH, activatori, inhibitori, mecanism biochimic, bacterii lactice, fermentatii anaerobe, fermentatii oxidative

Rezumatul capitolului: In acest capitol va sunt prezentate: definitiile, agentii de fermentare si principalii factori de influenta ai fermentatiilor; mecanismul fermentatiilor; importanta practica a fermentatiilor.

Bibliografie selectiva: VICTORIA HERLEA Microbiologie generala; Ed. Univers, Bucuresti, 1998;

13

D. BARZOI Microbiologia produselor alimentare de origine animala; Ed. Ceres, Bucuresti, 1985; AXENTA SEVER BANCIU, DELIA CIACOI-DIMITRIU Descoperiri epocale in biochimie; Ed. Albatros, Bucuresti, 1990; V. STANESCU Igiena si controlul alimentelor; Ed. Fundatiei Romania de maine, Bucuresti, 1998.

Intrebari: 1. Aratati diferenta dintre fermentatiile anaerobe si cele aerobe; 2. Care sunt agentii fermentatiei alcoolice ? 3. Factorii de influenta ai fermentatiei lactice. 4. Importanta fermentatiei malo-lactice. 5. Definiti mecanismul fermentatiei acetice. 6. Agenti ai fermentatiei acetice.

Tema de casa: 7. Descrieti, la alegere, un tip de fermentatie anaeroba si un tip de fermentatie aeroba.

14

Capitolul 3 NOTIUNI GENERALE DESPRE MICROBIOLOGIA SOLULUI, A APEI SI A AERULUI. ROLUL MICROORGANISMELOR IN NATURA
Obiectivele urmarite: intelegerea si aprofundarea notiunilor generale privind microflora solului, a apei si a aerului; intelegerea importantei microorganismelor pentru circuitul elementelor in natura.

Continut: 1.35. Microflora solului 1.36. Microflora apei 1.37. Microflora aerului

Cuvinte-cheie: microflora, bacterii fixatoare de azot, bacterii de putrefactie, purificare, amonificare, nitrificare, denitrificare, fixarea azotului molecular

Rezumatul lucrarii: In acest capitol va sunt prezentate: microflora solului si importanta acesteia; microflora apei - purificarea apei si a apei potabile; microflora aerului.

Bibliografie selectiva: VICTORIA HERLEA Microbiologie generala; Ed. Univers, Bucuresti, 1998; Al. IONESCU Agricultura ecologica; Ed. Ceres, Bucuresti, 1982.

15

Intrebari: 1. Cum se poate realiza autopurificarea apei ? 2. Explicati circuitul azotului in natura. 3. Explicati circuitul carbonului in natura. 4. Explicati circuitul sulfului in natura. 5. Explicati circuitul fosforului in natura.

Tema de casa: 6. Referat Rolul microorganismelor in natura.

16

Capitolul 4 AGRICULTURA ECOLOGICA

Obiectivele urmarite: intelegerea notiunii de agricultura ecologica; intelegerea notiunii de compost, privit ca un fertilizant ideal nepoluant; cunoasterea principalelor metode de compostare folosite pe plan national si international.

Continut: 1.38. Compostul un fertilizant ideal nepoluant 1.39. Metode de compostare tipuri de compost

Cuvinte-cheie: ecologie, compostare, biotransformare, biodinamica, bioconversiune

Rezumatul capitolului: In acest capitol va sunt prezentate:

definitia compostului - un fertilizant ideal, nepoluant; metode de compostare, tipuri de compost.

Bibliografie selectiva: Al. IONESCU - Agricultura ecologica; Ed. Ceres, Bucuresti, 1982; V. IONESCU-SISESTI, P. PAPACOSTEA, G. STEFANIC Compostul, ingrasamant din deseuri organice; Ed. Stiintifica si Enciclopedica, Bucuresti, 1980.

Intrebari: 1. Definiti notiunea de compostare. 2. Explicati metoda biodinamica de compostare 3. Explicati metoda de bioconversie a gunoaielor menajere.

17

Tema de casa: 1. Referat - Tehnica formarii si mineralizarii humusului in practica agricola.

18

Capitolul 5 MICROFLORA EPIFITA A FRUCTELOR SI LEGUMELOR

Obiectivele urmarite: intelegerea de catre studenti a notiunii de microflora epifita specifica pentru categorii diferite de fructe si legume; importanta cunoasterii tipurilor de putrezire a fructelor si legumelor; importanta cunoasterii principalelor grupe de microorganisme epifite patogene; cunoasterea conditiilor ambientale din depozite in vederea cresterii duratei de pastrare a produselor horticole.

Continut: .1. .2. .3. Definitii Putrezirea fructelor si legumelor Deprecierea unor legume si fructe pastrate in depozitele gospodariilor agricole si agroturistice provocata de microorganisme .4. Cateva informatii generale despre microflora fructelor si legumelor deshidratate.

Cuvinte-cheie: microflora epifita, microflora patogena, putrezire, bacterioze, micoze, umbelifere, caldura degajata, punct de inghetare, produse deshidratate

Rezumatul capitolului: In acest capitol va sunt prezentate: ce reprezinta microflora epifita specifica; tipuri de putrezire a fructelor si legumelor; principalele boli care duc la depreciera legumelor si fructelor in conditii de depozitare; conditiile ambientale din depozite, punctul de inghetare a fructelor si durata de pastrare recomandate pentru unele fructe.

19

Bibliografie selectiva: VICTORIA HERLEA Microbiologie generala; Ed. Univers, Bucuresti, 1998; D. MOTOC Microbiologia produselor alimentare; Ed. Tehnica, Bucuresti, 1964 T.CRACIUN, LUANA-LEONORA CRACIUN Dictionar de biologie; Ed. Albatros, Bucuresti, 1989 IULIANA POPOVICI, D. LUPULEASA, ANISOARA HRISCU Dictionar farmaceutic; Ed. Didactica si Pedagogica, Bucuresti, 1997

Intrebari: 1. Clasificati tipurile de putrezire a fructelor si legumelor. 2. Dati exemple de boli produse de microorganisme la cartofi. 3. Dati exemple de boli produse de microorganisme la umbelifere. 4. Descrieti deprecierea unor fructe pomicole cauzate de microorganisme. 5. Dati exemple de boli produse de microorganisme strugurilor de masa; 6. Dati exemple de boli produse de microorganisme vinului.

Tema de casa: 1. Descrieti conditiile ambientale din depozite pentru urmatoarele fructe: mere, pere, piersici, citrice, struguri, caise, banane.

20

Capitolul 6 PRODUSE SI BIOTEHNOLOGII TRADITIONALE IN GOSPODARIILE RURALE, PENSIUNILE AGROTURISTICE SI FERMELE AGRICOLE
Obiectivele urmarite: cunoasterea si intelegerea principalelor etape folosite in obtinerea vinurilor; cunoasterea principalelor factori ce influenteaza fermentatia alcoolica; cunoasterea metodei de preparare a maialei de drojdii uscate active; cunoasterea unor retete ecologice de obtinere a unor bauturi de casa fermentate din fructe si legume.

Continut: .1. .2. Bauturi de casa fermentate din fructe si legume Bolile si efectele de origine microbiana ale bauturilor fermentate din fructe si legume.

Cuvinte-cheie: fermentatie alcoolica, distilate, fructine, cidruri, must, maia, vinuri aromatizate, bitter, vermut, crusoane, microorganisme aerobe / anaerobe

Rezumatul capitolului: in acest capitol sunt prezentate principalele bauturi de casa obtinute in mod ecologic, prin fermentatie, din fructe si legume; descrierea principalilor parametri ce favorizeaza desfasurarea in conditii optime a fermentatiei alcoolice; exemplificarea principalilor agenti ai fermentatiei alcoolice; descrierea retetelor unor bauturi fermentate: cidrul din mere, fructinul de coacaze, fructinul de pere si gutui, fructinul din macese, vinuri albe, vinuri rosii, vinuri aromate, vinuri pelin; retete pentru bauturi-aperitiv: vermut, bitte;

21

retete pentru obtinerea de vinuri speciale ameliorate: vinul de Xeres, vinul de Malaga, vinul de Madeira, vinul de Porto; retete de crusoane si de cvas; descrierea bolilor si defectelor de origine microbiana ale bauturilor fermentate din fructe si legume, datorate nerespectarii conditiilor de procesare si depozitare.

Bibliografie selectiva: DORINA MARTIN, M. MARTIN Bauturi de casa din fructe si legume; Ed. Ceres, Bucuresti, 1986 I. PUSCA Bauturi spumante in gospodarie; Ed. Ceres, Bucuresti, 1988 V. STANESCU Igiena si controlul alimentelor; Ed. Fundatiei Romania de maine, Bucuresti, 1998 VALENTINA DAN Microbiologie, note de curs; Universitatea din Galati, 1993.

Intrebari: 1. Care sunt principalii factori ce influenteaza fermentatia alcoolica ? 2. Descrieti prepararea maialei de drojdii uscate active necesare pentru fermentatia alcoolica. 3. Particularitati in prepararea vinurilor aromatizate. 4. Ce determina amareala vinului ? 5. Ce determina otetirea vinului ? 6. Descrieti floarea numita floarea vinului.

Tema de casa: 1. Importanta obtinerii unor produse alimentare ecologice din fermentarea alcoolica a unor fructe si legume. Exemple de retete.

22