INDICE

INTRODUCCIN I. Plasmodium sp. A. RESPUESTA INMUNE FRENTE A Plasmodium 1. RESPUESTA INMUNE HUMORAL 2. RESPUESTA INMUNE CELULAR B. INMUNIDAD ADQUIRIDA 1. Vacunas dirigidas contra la fase pre-eritroctica 2. Vacunas bloqueadoras de la transmisin 3. Vacunas eritrocticas
4. Pptidos como candidatos a vacunas y Malaria

Pg.3 Pg.4

II.

Leishmania sp. A. RESPUESTA INMUNE FRENTE A Leishmania

Pg.10

1. LA RESPUESTA INFLAMATORIA EN LA INFECCIN POR Leishmania 2. EL PAPEL DEL COMPLEMENTO EN LOS PROCESOS DE LISIS Y FAGOCITOSIS DE Leishmania 3. PAPEL DE LAS CLULAS T CD4+ EN INFECCIN POR Leishmania 4. PAPEL DE LAS CLULAS T CD8+ EN INFECCIN POR Leishmania 5. LAS CLULAS ASESINAS NATURALES (NK) B. INMUNIDAD ADQUIRIDA 1. VACUNAS DE PRIMERA GENERACIN 2. VACUNAS DE SEGUNDA GENERACIN a. Vacunas basadas en antgenos purificados de Leishmania

III.

Trypanosoma cruzi

Pg.17

A. RESPUESTA INMUNE FRENTE A Trypanosoma cruzi B. INMUNIDAD ADQUIRIDA 1. Respuesta inmune protectora citotxica mediada por linfocitos TCD8+ y auxiliadora mediada por linfocitos TCD4+ 2. Inmunidad y vacunas experimentales en la Enfermedad de Chagas

3. Principales riesgos que se relacionan con el uso de vacunas de ADN IV. Toxoplasma gondii A. RESPUESTA INMUNE FRERNTE A Toxoplasma gondii 1. RESPUESTA INMUNE INNATA 2. RESPUESTA INMUNE CELULAR 3. RESPUESTA INMUNE HUMORAL B. INMUNIDAD ADQUIRIDA 1. Posibilidades de una Vacuna para Toxoplasmosis Pg.28

CONCLUSIONES BIBLIOGRAFA APENDICES

Pg.36 Pg.38 Pg.40

INTRODUCCION

El control inmunolgico de los parsitos intracelulares es un fenmeno complejo y en el cual se requiere tanto de los mecanismos de inmunidad natural como los diferentes componentes, especfico y no especficos del sistema inmune. Sin embargo, aun cuando la inmunidad natural, la inmunovigilancia y todos los mecanismos efectores, especficos o no, estn activados y en funcionamiento, los parsitos son capaces de sobrevivir dentro del hospedero evadiendo su sistema de defensa. Entonces se puede evidenciar algunos tipos de reaccin del sistema inmune frente a diferentes parsitos. Finalmente estos parsitos pueden ser causantes de lesiones destructivas y/o de la muerte del

hospedero. Es bien conocido el hecho de que los parsitos pueden alterar o manipular los mecanismos inmunitarios de respuesta del hospedador y de esta forma evadir su ataque y alcanzar un perfecto estado de simbiosis y la perpetuacin de su especie. En el presente trabajo hacemos una revisin de la respuesta inmune frente a parsitos intracelulares, poniendo como ejemplo algunos protozoarios como Plasmodium sp., Leshmania sp., Trypanosoma cruzi y Toxoplasma godii, por ser los parsitos ms estudiados debido a su importancia epidemiolgica a nivel mundial adems de su prevalencia en nuestro pas. Para conocer el mecanismos d invasin de estos parsitos es necesario conocer su ciclo de vida por lo que hemos tratado de resumirlo y hacerlo lo ms entendible posible, para poder centrarnos en el aspecto inmunolgico. Una de las dificultades con las que nos topamos al hacer esta revisin fue la diversidad de informacin respecto al tema, por lo que se tuvo que seleccionar las fuentes ms confiables, siempre tratando de mantener la lnea central del tema y evitando caer en redundancias. Todo este trabajo se ha realizado con el fin de comprender mejor los aspectos inmunolgicos frente al ataque de parsitos intracelulares y as complementando de esta manera el conocimiento adquirido tanto en las aulas como el laboratorio.

I.

Plasmodium sp.

Existen cuatro especies de plasmodios que pueden afectar al hombre: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae y Plasmodium ovale. De todos ellos la infeccin por Plasmodium falciparum es la que causa una enfermedad ms grave siendo la que mayor nmero de muertes produce. Los vectores de esta enfermedad son diversas especies del mosquito del gnero Anopheles. Como es sabido, tan slo las hembras de este mosquito son las que se alimentan de sangre para poder madurar los huevos.

Plasmodium sp. es un protozoo con un ciclo de vida bastante complejo que comprende una fase asexual o esquizogonia en el hospedero humano, y una breve fase sexual obligatoria en el mosquito vector. En el humano, la infeccin comienza con la picadura de la hembra del gnero Anopheles infectada, la cual introduce las formas del parsito denominadas esporozotos, que circulan por corto tiempo e invaden las clulas hepticas para formar los esquizontes tisulares. Estos lisan los hepatocitos y liberan miles de merozotos (10.000 a 30.000 merozotos) que invaden los glbulos rojos. Dentro del glbulo rojo, los merozoitos maduran a los estadios de anillo, trofozoto y esquizonte eritroctico. El esquizonte maduro rompe el eritrocito y libera merozotos que posteriormente invadirn otros glbulos rojos. Algunos de estos merozotos sufren un proceso de diferenciacin en formas sexuales denominadas microgametocitos y macrogametocitos, que son los estadios infectantes para el mosquito vector.

A. RESPUESTA INMUNE FRENTE A Plasmodium sp.

Los mecanismos naturales de defensa del organismo parecen desempear un papel importante en el control y prevencin de la infeccin por Plasmodium. As, es bien conocido el papel del grupo sanguneo Duffy como estructura de membrana asociada al receptor de penetracin de los merozoitos y de la hemoglobina fetal para la limitacin de la infeccin y crecimiento intraeritrocitario del parsito. La respuesta inmunitaria del hospedador a los parsitos del genero Plasmodium sp. est determinada tanto por las reacciones inmunoespecficas como por las inespecficas. Las
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respuestas inmunitarias especficas para los antgenos del parsito fueron estudiadas principalmente en los sistemas experimentales, el ratn y el mono y con el plasmodio de la especie v.g., P.voelii en el ratn y P.knowlesi en el mono. En la malaria humana, las reacciones celulares y humorales participan en el desarrollo de la inmunidad contra el Plasmodium. La infeccin humana por Plasmodium, como la mayora de las infecciones naturales, se caracteriza por el desarrollo de un estado de resistencia designado inmunidad parcial o premunicin, en el cual el hospedador es capaz de controlar pero no de eliminar la infeccin. La presencia y mantenimiento de esta resistencia antiparasitaria por un largo periodo de tiempo depende tanto de grado de exposicin, como de la duracin en tiempo de la misma. As, los individuos que residen en las regiones donde la malaria surge espordicamente adquieren poca resistencia duradera de la infeccin. Los habitantes de reas holoendmicas desarrollan resistencia (premunicin) al paludismo, pero no inmunidad protectora especifica al Plasmodium sp. (inmunidad esterilizante). En los humanos la respuesta inmune especfica a los antgenos de Plasmodium sp. esta usualmente asociada a la produccin de anticuerpos sricos los que son detectados por diferentes pruebas in vitro, vg. , inmunofluorescencia, hemaglutinacin, precipitacin en gel, inmunocromatografia, etc. En los individuos residentes de las reas de hiperendemicidad malrica inmunes se han detectado anticuerpos sricos contra los esporozoitos, los cuales posiblemente ejercen un papel protector, tanto en los lactantes, por su transferencia placentaria, como en los adultos. Se han descrito igualmente, antgenos parasitarios solubles en la circulacin, que aparentemente desempean un papel importante en la inmunopatologa de la enfermedad. Sin embargo, una gran parte de la respuesta humoral que produce el organismo en el curso de la infeccin malrica no tiene una afinidad manifiesta para el organismo infectante, e incluye la aparicin de autoanticuerpos y anticuerpos heterfilos. Debe destacarse igualmente que la presencia de anticuerpos sricos, como queda evidenciado por las tcnicas in vitro, no es necesariamente indicativo de que ajerza un papel protector en el organismo infectado. Por tanto, su presencia no define la existencia de un estado inmunolgico de proteccin en el hospedador.

Plasmodium despliega uno de los modelos ms sofisticados para evadir la Respuesta Inmune (RI). Las variantes antignicas del parsito no se encuentran sobre la superficie del parsito, sino en la superficie de las clulas en donde P. falciparum se multiplica, el eritrocito. Los antgenos residen en protenas grandes (220-350 kDa) denominadas colectivamente como PfEMP1 (P. falciparum-infected erythrocyte membrane protein 1), que son codificadas por genes denominados var. Estas proteasas son secretadas por el parsito y encuentran su camino hacia la membrana del eritrocito, donde se concentran en estructuras que se conocen como botones (knobs). Estos botones se adhieren al endotelio vascular y evitan que los eritrocitos infectados sean destruidos en el bazo. Aunque este artificio evita su eliminacin en dicho rgano, no impide que los botones sean reconocidos por el Sistema Inmune (SI); no obstante, el Plasmodium usa la variacin antignica del PfEMP1 para minimizar las consecuencias de este ataque. El Plasmodium posee antgenos con repeticiones mltiples que pueden disminuir la maduracin y afinidad de los anticuerpos al actuar como superantgenos e inducir una respuesta humoral policlonal T independiente. Una protena de la superficie del merozoito (MSP-1) induce anticuerpos bloqueadores que se enlazan a la MSP-1, e impiden el enlace de anticuerpos con capacidad inhibidora. El mimetismo molecular que exhibe el parsito puede modular la RI celular, la liberacin de citocinas y estar involucrado en alguna de las manifestaciones patolgicas. La GPI

(Glicosilfosfatidilinositol) se ancla a las MSPs e induce en macrfagos un aumento del TNF- e IL-1, responsables de la fiebre y la produccin de protenas de fase aguda. Se ha reportado que algunos antgenos del Plasmodium pueden inducir inmunosupresin, aunque se desconocen los mecanismos responsables; no obstante, se ha sugerido que la acumulacin en macrfagos de hemozoina producida por el parsito puede, en parte, inhibir sus funciones accesorias. Un estudio de la RI frente al circumesporozoito (CSP) insina que algunas cepas de P. falciparum contienen variantes del CSP, las cuales previenen el enlace del eptopo original que reconocen las clulas T, a las molculas del sistema principal de histocompatibilidad (MHC), alterando las funciones efectoras de la clula T de memoria . Esto adquiere relevancia si consideramos que los linfocitos T citotxicos y la respuesta de memoria parecen ser esenciales para la proteccin y la inmunidad de larga duracin, respectivamente.

1.

RESPUESTA INMUNE HUMORAL

La respuesta inmunolgica en malaria es compleja y especfica para cada estado del parsito. El desarrollo de inmunidad protectiva puede ser lento y se evidencia slo despus que el individuo ha sido expuesto a infecciones repetidas a travs de los aos. Esto puede reflejar infecciones sucesivas por diferentes aislados del parsito expresando variantes antignicas y/o clones y a la existencia de mecanismos de evasin de la respuesta inmunolgica. La inmunidad contra el estado eritroctico de Plasmodium falciparum est asociada con anticuerpos protectores de ciertas clases y subclases. Hay evidencias del papel de la inmunoglobulina G (IgG) en la proteccin contra la malaria, especficamente los isotipos IgG1 e IgG3 son considerados citoflicos y protectores contra infecciones por P. falciparum . A pesar de que los anticuerpos son esenciales en la inmunidad, niveles elevados de IgG contra un amplio rango de antgenos de estados sanguneos de P. falciparum han mostrado ser pobres en la proteccin clnica. Sin embargo, algunos antgenos de los estados asexuales sanguneos de P. falciparum inducen, preferencialmente, anticuerpos citoflicos. Uno de ellos el MSP-1 (merozoite surface protein-1) que se asocia con la respuesta de IgG1 e IgG3, mientras que el MSP2 est restringido al estmulo de la sntesis de IgG3. Se ha encontrado que individuos con malaria aguda por P. falciparum y con inmunoglobulnas IgG anti-RESA (Ringinffected erithrocytes) o anti-GLURP (Glutamate-rich protein) respondieron efectivamente al tratamiento antimalrico, soportando la hiptesis de que la inmunidad adquirida aumenta la eficacia clnica de la terapia con drogas.

2.

RESPUESTA INMUNE CELULAR

La respuesta inmune en la fase preeritrocitaria se debe principalmente a la produccin de anticuerpos frente a protenas de membrana del esporozoito y a la activacin de linfocitos T citotxicos (CD8+) que destruyen los hepatocitos infectados. Otro factor importante en la proteccin de la infeccin heptica es la produccin de interfern gamma por clulas CD4+, natural killer y clulas . En lo que respecta a la proteccin frente a la fase eritrocitaria, es esencial la respuesta celular mediada por CD4+, capaz de activar a los macrfagos (para la destruccin de parsitos y de eritrocitos parasitados) y para generar diversos tipos de anticuerpos. Dentro de los anticuerpos fundamentales deben destacarse: los dirigidos frente a antgenos de los merozoitos (MSP-2, MSP-3), los dirigidos frente a la protena PfEMP (que impiden los fenmenos de citoadherencia y roseteo, responsables de las formas graves de malaria), los dirigidos frente a molculas txicas (principalmente GPI glucosilfosfatidilinositol) y los dirigidos frente a las formas sexuales. B. INMUNIDAD ADQUIRIDA Desde el trabajo publicado por Ruth Nussenzweig y colaboradores en 1967, en el que se inform que la inmunizacin de roedores con esporozotos de Plasmodium berghei irradiados los protega de la enfermedad, qued demostrado que la obtencin de una vacuna antimalrica, adems de necesaria, era factible. Despus de este suceso, se han realizado numerosos intentos por lograr la proteccin contra la infeccin por plasmodios, fundamentalmente la enfermedad causada por Plasmodium falciparum, en sus distintos estadios. Para esto, los investigadores de la vacuna evalan diferentes molculas proteicas que se presentas en las tres fases del ciclo de vida del Plasmodium, las cuales pueden estimular el sistema inmune a destruir o bloquear al parsito y que podra traducirse en la identificacin de un nmero importante de vacunas que ahora estn en ensayos clnicos o en las etapas tardas de preclnica. Entre las estrategias de vacunacin empleadas se encuentran:

1. Vacunas dirigidas contra la fase pre-eritroctica Estas vacunas estn diseadas para reducir la frecuencia y la gravedad de las manifestaciones clnicas de la enfermedad producida por el parsito. Tambin van
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dirigidas a evitar que el parsito entre o madure en las clulas del hgado de la persona infectada. Estas vacunas podran inducir una respuesta inmune que posiblemente evitara la infeccin o atacara las clulas del hgado si la infeccin ya ocurri.

2. Vacunas bloqueadoras de la transmisin Estas vacunas estn diseadas para bloquear la transmisin de la enfermedad, interrumpiendo el ciclo de vida del parsito por estimulacin de anticuerpos que evitan que el parsito madure en el mosquito Anopheles, despus de que este consuma la sangre de una persona vacunada. Estas vacunas no evitaran que una persona desarrolle la Malaria y por lo tanto los sntomas no disminuiran. Adems no confieren directamente proteccin a la persona inmunizada y para recibir los beneficios esperados se debera vacunar masivamente a toda la comunidad durante un prolongado periodo de tiempo.

3. Vacunas eritrocticas Estas vacunas actan en el estadio sanguneo, no bloqueando la infeccin, sino disminuyendo el nmero de parsitos en sangre y a su vez reduciendo la severidad de la enfermedad. Algunos estudios han sugerido que las personas que han sobrevivido a la exposicin regular a Malaria, desarrollan una inmunidad natural con el tiempo. La meta de una vacuna eritroctica es que el cuerpo desarrolle esta inmunidad natural con mucho menos riesgo de enfermar nuevamente.

4. Pptidos como candidatos a vacunas y Malaria Debido a la baja probabilidad de crear una vacuna dirigida contra un solo antgeno malrico y que permita una proteccin total (a la vez), la opcin es combinar varios antgenos provenientes de diversas etapas del parsito en una vacuna gradual y formada por mltiples componentes. Las tecnologas de fabricacin incluyen la aplicacin de protenas recombinantes, pptidos sintticos y vacunas de DNA, entre otros.

Una investigacin minuciosa se ha realizado sobre los antgenos proteicos presentes en las diferentes etapas del parsito, varios de los cuales se han considerado como candidatos promisorios a vacuna contra Malaria. El criterio para la seleccin de estos antgenos como componentes vacunales, se basa en su capacidad de inducir inmunidad

especfica celular o humoral y la propiedad de inducir proteccin al desafo experimental en modelos animales.

La identificacin, seleccin y el uso de antgenos purificados producidos por ingeniera molecular y sntesis qumica, han sido el blanco reciente en la bsqueda de inmunoensayos de mayor sensibilidad y especificidad. Antgenos recombinados y

purificados son reactivos potentes para los mtodos serolgicos, puesto que contienen un gran espectro de uniones que garantizan el reconocimiento por un mayor nmero de individuos, quienes tienen una gran diversidad de repuesta inmune genticamente condicionada.

Las vacunas actualmente desarrolladas se han concentrado en vacunas sintticas basadas en subunidades con multi-componentes, multi-estadios, porque se obtiene una apropiada respuesta inmune antimalrica dependiente en asegurar que varios pptidos en comn ataquen diferentes blancos parasitarios en combinacin con la mejora de los sistemas de entrega.

II.

Leishmania sp. La infeccin por Leishmania sp. generalmente induce una respuesta inmune muy compleja que vara dependiendo de diferentes factores: segn la forma clnica de la enfermedad, la especie de Leishmania implicada en el proceso infeccioso y la cronicidad de la enfermedad, se genera un espectro de respuestas inmunes que incluyen desde mecanismos de inmunidad inespecfica (por ejemplo: reacciones inflamatorias) hasta mecanismos de inmunidad especfica mediados por clulas o por anticuerpos. Sin embargo, los diferentes mecanismos de respuesta inmune implicados durante la

infeccin por Leishmania no siempre aparecen ni se desarrollan simultneamente. En trminos generales se ha observado una fuerte respuesta mediada por clulas T para las formas cutnea y mucosa de la enfermedad y ausencia de ella en las formas cutnea difusa y visceral. La respuesta de clulas T se ha evidenciado por reacciones de hipersensibilidad retardada y proliferacin de antgenos linfocitos in vitro frente a

de Leishmania. Al contrario, los ttulos de anticuerpos contra antgenos

especficos de Leishmania, principalmente de tipo IgG, por lo general son bajos en el suero de pacientes con leishmaniosis cutnea y mucosa mientras que son
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moderados o altos en

pacientes con

leishmaniosis cutnea difusa y visceral. La

produccin de IgE especfica se asocia con enfermedad cutnea crnica y mucosa y como marcador de enfermedad activa en leishmaniosis visceral, mientras que la produccin de IgA se asocia con enfermedad mucosa. Tanto la respuesta inmune mediada por clulas T como los ttulos de anticuerpos son mayores en individuos infectados con L. (V) braziliensis que en individuos infectados con L. (V) panamensis, independientemente del tiempo de duracin de la lesin y la forma clnica de la enfermedad. Sin embargo, los pacientes con lesiones cutneas crnicas o mucosas presentan mayores ndices de respuesta inmune humoral o celular a antgenos de Leishmania que los ndices de respuesta inmune mostrados por los pacientes con lesiones de corta duracin. Leishmania presenta un ciclo de vida heteroxeno, alternando entre un hospedador mamfero y un insecto vector. El hospedador mamfero suele ser un cnido, roedor, simio o el hombre. El vector encargado de la transmisin del parsito son las hembras hematfagas de insectos dpteros del gnero Phlebotomus en el Viejo Mundo, y Lutzomyia en el Nuevo Mundo, conocindoseles vulgarmente como moscas de la arena o moscas jorobadas. La forma infectiva del parsito es el promastigote metacclico, y este ingresa en el mamfero mediante la picadura del insecto. El parsito infecta clulas del sistema mononuclear fagoctico, incluyendo macrfagos, monocitos y clulas de Langerhans, en las que penetra a travs de la interaccin con receptores de membrana. Una vez dentro de la clula, el promastigote queda englobado en una vacuola parasitfora donde se transforma en la forma amastigote en respuesta a los estmulos que recibe. Los amastigotes, en el interior de las clulas, ponen en marcha toda una serie de mecanismos que les permiten eludir su destruccin por parte de la clula hospedadora, tales como: modulacin de la produccin de citocinas, inhibicin de la presentacin antignica y bloqueo de las molculas coestimuladoras necesarias para la activacin de clulas T especficas de antgeno. Los amastigotes se multiplican en el interior de la vacuola parasitfora hasta provocar la lisis de la clula hospedadora, propagndose as la infeccin. Cuando el mamfero infectado es picado de nuevo por un insecto vector, los macrfagos infectados pasan al intestino del insecto donde son destruidos, liberndose as los amastigotes que se diferencian en promastigotes procclicos. stos se multiplican activamente provocando
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la propagacin del parsito en el intestino del insecto. Tras 7-8 das, y despus de pasar por varios estados morfolgicos, los promastigotes migran hacia la faringe donde se transforman finalmente en promastigotes metacclicos no replicativos, pero con una elevada capacidad de infeccin. El ciclo se completa cuando las formas metacclicas son inoculadas en el mamfero mediante la picadura del insecto. Leishmania ha desarrollado mecanismos de defensa contra el efecto ltico de las clulas efectoras del sistema inmune celular gracias a esto pueden diferenciarse de

promastigotes a amastigotes y dividirse en el interior del macrfago hasta que este explote y los nuevos amastigotes infecten a otros macrfagos circundantes.

A. RESPUESTA INMUNE FRENTE A Leishmania sp.

A. LA RESPUESTA INFLAMATORIA EN LA INFECCIN POR Leishmania sp. El trauma ocasionado por la picadura del vector induce en el hospedero una respuesta inflamatoria que involucra la migracin de diferentes clulas, principalmente macrfagos y linfocitos, hacia el sitio del trauma con el fin de reorganizar el tejido daado e iniciar el proceso de cicatrizacin. Los dos tipos de clulas presentadoras de antgeno localizadas en la epidermis, las clulas de Langerhans y los queratinocitos, participan en el proceso inflamatorio al expresar molculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad Clase II y molculas de adhesin que son necesarias para la migracin y retencin de las clulas inflamatorias. En el sitio de la infeccin los macrfagos tisulares activados secretan abundantes citoquinas mediadoras de inflamacin, incluyendo el Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF), las interleuquinas (ILs) IL-1, IL-6 e IL-12, al igual que protenas C3 del Complemento. El TNF y la IL-1 actan como pirgenos endgenos y activan el endotelio vascular permitiendo la extravasacin de leucocitos a travs de la unidad perivascular drmica y la subsecuente migracin de estas clulas hacia el endotelio. La IL-6 participa en la respuesta de fase aguda y en el desarrollo de una respuesta inmune especfica mediada por clulas , mientras que la IL-12 constituye un potente activador de clulas asesinas naturales y estimula la diferenciacin de las clulas T ayudadoras a clulas Th1.

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B. EL PAPEL DEL COMPLEMENTO EN LOS PROCESOS DE LISIS Y FAGOCITOSIS DE Leishmania Una gran proporcin de los promastigotes inoculados por el vector es destruida por el complemento extracelular con lo que se reduce la probabilidad de establecer una infeccin inicial. As mismo, el complemento extracelular lisa los amastigotes liberados por macrfagos infectados y en esta forma se limita la invasin de nuevas clulas vecinas y se evita la perpetuacin de la infeccin y el desarrollo de enfermedad. Sin embargo, se ha demostrado que los promastigotes de L. (V.) panamensis y L. (V.) braziliensis en fase estacionaria de crecimiento y los promastigotes de varias especies resisten a la lisis por complemento. Por otro lado, los amastigotes de las diferentes especies de Leishmania fijan en su membrana protenas del complemento tales como C3b, favoreciendo as la entrada del parsito a la clula hospedera a travs de los receptores para complemento (CR1 y CR3) presentes en la membrana de dichas clulas. Al mismo tiempo, la entrada del parsito a travs de los receptores CR favorece su supervivencia dentro del macrfago, ya que la ocupacin de estos receptores no induce una respuesta oxidativa en los macrfagos. Es as como Leishmania no slo evita la activacin del complejo ltico del complemento sino que utiliza la protena C3 para invadir en forma silenciosa al macrfago.

C. PAPEL DE LAS CLULAS T CD4+ EN INFECCIN POR Leishmania

Luego del contacto con los antgenos del parsito, expresados en la membrana del macrfago infectado, y dependiendo del tipo de clula presentadora de antgeno, de los niveles de citoquinas endgenas y de la naturaleza del antgeno reconocido, las clulas T ayudadoras CD4+ proliferan y secretan un patrn de citoquinas definidas que las diferencia en subpoblaciones de clulas Th1 y Th2, cada una de ellas con funciones efectoras diferentes. Actualmente se desconocen los factores exactos que dirigen o determinan la expansin de una u otra subpoblacin de clulas Th. Sin embargo, se ha observado que cuando existe una gran cantidad de antgeno, cuando ste es soluble, o cuando el linfocito B se comporta como clula presentadora de antgeno, la respuesta es de tipo Th2. Al contrario, la respuesta es de tipo Th1 cuando hay presencia de poco antgeno o la clula presentadora de antgeno es el macrfago o las clulas dendrticas.

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De igual manera, el patrn de citoquinas presente en el sitio de la infeccin juega un papel decisivo en el desarrollo de clulas Th1/Th2. Las citoquinas de tipo Th1 participan en la regulacin del granuloma y en la activacin de macrfagos inflamatorios para aumentar su capacidad microbicida, mientras las citoquinas de tipo Th2 regulan la produccin de anticuerpos por los linfocitos B y el desarrollo de una respuesta inmune de tipo humoral. En la leishmaniosis, la eliminacin del parsito depende de la activacin de la clula hospedera; por lo tanto, la produccin de citoquinas activadoras de macrfagos se correlaciona con curacin, mientras

que la de citoquinas que desactivan el macrfago se correlaciona con enfermedad. En esta forma, el mecanismo por el cual se activan las clulas Th1 o Th2 es importante para dirigir la respuesta inmune hacia proteccin y patognesis. Los linfocitos Th1 son productores de IL-2, IFN y Linfotoxina (LT), mientras que los Th2 producen IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13. Sin embargo, a diferencia del modelo murino, la produccin de IL-2, IL-6, IL10 e IL-13 en el humano no est restringida a una subpoblacin de clulas T. Los estudios realizados en humanos para tratar de correlacionar los patrones de citoquinas producidas por clulas T y las formas clnicas de la leishmaniosis han mostrado un perfil mezclado de citoquinas. En los pacientes con leishmaniosis cutnea difusa hay un predominio de citoquinas tipo Th2, ya que no hay produccin de IFN, ni IL-2, pero s presentan significativos niveles de IL-5 y TNF. Sin embargo, el TNF no parece contribuir a la curacin de las lesiones en ausencia de una respuesta funcional de linfocitos T. La leishmaniosis cutnea se caracteriza por un patrn de citoquinas tipo Th1 con produccin de IL-2 e IFN en niveles significativos. La produccin de IL-5 es mucho ms baja que en los pacientes con leishmaniosis cutnea difusa y el TNF se produce en buena cantidad, lo que sugiere su participacin en la curacin de las lesiones. En la leishmaniosis mucosa se ha sugerido que el patrn de citoquinas es una mezcla de tipo Th1 y Th2; sin embargo, cuando se producen ambos patrones de citoquinas, la respuesta Th2 puede predominar sobre la Th1 y la enfermedad puede mantenerse en un estado crnico. Se ha observado que en esta forma clnica de la leishmaniosis se producen buenos niveles sricos de IL-2, IFN, TNF e IL-5. La respuesta inmunolgica mediada por clulas en la leishmaniosis visceral se caracteriza por una marcada disminucin en la respuesta linfoproliferativa y por ausencia de produccin de
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curacin o susceptibilidad y

IL-2 e IFN. Se ha observado adems, una moderada produccin de IL-4 la cual desaparece rpidamente, y altos niveles de IL-10. Un estudio reciente demuestra que existe una relacin directa entre la produccin de IFN, TNF e IL-10 en individuos con infeccin asintomtica y ausencia de dicha relacin en individuos con antecedentes de leishmaniosis recurrente. Estos hallazgos sugieren que la relacin observada en la produccin de citoquinas permitira distinguir una respuesta inmune efectiva o no, ms que la misma presencia o ausencia de una citoquina o citoquinas en particular.

D. PAPEL DE LAS CLULAS T CD8+ EN INFECCIN POR Leishmania

Tradicionalmente los linfocitos T CD8+ con funcin citotxica se han asociado con resistencia a infecciones virales. Sin embargo, actualmente existen evidencias que sugieren un papel importante en la respuesta inmune a Leishmania debido directamente a mecanismos citotxicos o a travs de la produccin de IFN y TNF, que son citoquinas activadoras de macrfagos y que por lo tanto favorecen la muerte del parsito en el interior de la clula. As mismo, los macrfagos, los linfocitos y otras clulas presentadoras de antgenos producen IL-12 la cual tiene mucho que ver con la regulacin de la respuesta Th1/Th2. La IL-12 induce la produccin de IFN por parte de los linfocitos y clulas NK al tiempo que aumenta la actividad citotxica de estas clulas y de los linfocitos T CD8+, induciendo una respuesta de tipo Th1.

E. LAS CLULAS ASESINAS NATURALES (NK)

El papel de las clulas NK en la respuesta inmune a infeccin por Leishmania se ha estudiado muy poco. Se ha observado que los ratones C57BL/6bg/bg que son deficientes en actividad de clulas NK son menos capaces de eliminar la infeccin por L. donovani que los ratones con fenotipo normal. Sin embargo, no se han observado diferencias en relacin con el control de la infeccin por L. major. Estos hallazgos sugieren un compromiso de las clulas NK en la respuesta inmune slo a leishmaniosis visceral. Estudios en humanos han demostrado que las biopsias de

piel de pacientes con leishmaniosis cutnea presentan un alto porcentaje de las clulas con el fenotipo de las NK. Sin embargo, an se desconoce su funcin.
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B. INMUNIDAD ADQUIRIDA

1. VACUNAS DE PRIMERA GENERACIN Este tipo de vacunas estn relacionadas a los llamados killedvaccines, compuesto por un crudo total de antgenos del parasito. Debido que el valor promedio de la eficacia de la vacuna fue relativamente baja (54,38%) el nmero de personas estudiadas fue grande. De acuerdo a la localizacin geogrfica en las vacunas se pueden utilizar un lisado por autoclavado de Leishmania amazonensis (ALA), en Amrica; mientras que un antgeno de un autoclavado de L. major (ALM), en Europa. En algunos estudios se demostr que al autoclavar el protozoario se destruye la mayor parte de protenas del parasito y la inmunogenicidad de la vacuna se pierde (LPG, es uno de los principales complejos de la superficie del parasito que resisten al autoclavado y ha sido implicado en la inmunogenicidad y inmunosupresin en ratones). Para la seleccin de candidatos de ensayos de vacunas se realiza una prueba cutnea de Leishmania (LST), observndose la presencia de eficacia de la vacuna en individuos que dieron positivo a esta prueba. A pesar de que los estudios varan en el uso de adyuvantes (por ejemplo BCG), se esta de acuerdo que la vacuna debe usarse en combinacin con la quimioterapia habitual, a fin de obtener mejores resultados. En base a esto, una vacuna de primera generacin ha sido registrada como complemento del tratamiento con antimonio en Brasil.

2. VACUNAS DE SEGUNDA GENERACIN a. Vacunas basadas en antgenos purificados de Leishmania En este tipo de vacunas se utilizan las protenas o lipofosfoglicanos para evaluar la inmunogenicidad. Uno de los primeros ensayos realizado con este principio se logro gracias a un preparado liofilizado de protenas semipurificadas de L. infantum, la cual mostr unos resultados paradjicos ya que se presento mayor incidencia en la muestra control. Una vacuna de este tipo es la MDP-LiESAp, que contiene una protena excretada de L. infantum, LiESAp, ms MDP. En estudios realizados en Francia, con ensayos en perros, presento una eficacia del 92%. Solo es til para la proteccin contra la infeccin.
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Uno de los resultados ms exitosos en este tipo de ensayos dio como resultado la Leishmune en Brasil, la cual tiene una preparacin de glicoprotenas enriquecida de promastigotes L. donovani, llamada FML (fucosa-manosa ligando), que se formulo con saponina de Quillija saponaria. La Leishmune fue considerada inmunognica, inmunoprofilctica e inmunoteraputico, en ratones, hmsters y perros. Presento proteccin contra la enfermedad grave debido a leishmaniasis visceral. Cuando se utiliza con una concentracin doble de adyuvante se vuelve un inmunoteraputico para los perros con infeccin natural o infectados experimentalmente con Leishmania chagasi. Esta vacuna reduce la infectividad en los perros, se llego a esta conclusin debido a las proporciones sostenidas de los niveles de linfocitos CD4 y CD21 en animales vacunados. La vacuna FML se considera una vacuna candidata de segunda generacin y fue presentado en la Cuarta Reunin de vacunas de segunda generacin Leishmania celebrada en Mrida mayo 2001. Esa la primera vacuna de segunda generacin de uso veterinario con licencia. III. Trypanosoma cruzi La Trypanosomiasis americana, Enfermedad de Chagas, es una zoonosis causada por Trypanosoma cruzi, y es una infeccin de gran importancia. Inicialmente estaba

confinada a la Regin de las Amricas, principalmente en Amrica Latina, pero en la actualidad se ha propagado a otros continentes. Trypanosoma cruzi es un protozoario hemoflagelado cuyo ciclo de vida involucra un husped mamfero e insecto hematfago de la subfamilia Triatominae, con ms de 15 especies de los gneros Triatoma, Rhodnius y el principal vector en el Per el Triatoma infestans ("Chirimacha"), posee hbitos domiciliario y peridomiciliario en la zona sur del pas. La infeccin se lleva a cabo cuando el insecto luego de picar al humano, deposita su materia fecal en la piel durante o despus de la alimentacin cerca del sitio de la picadura, con lo cual los tripomastigotos metacclicos (forma infectiva de T. cruzi) que estn en las heces logran penetrar a travs de la conjuntiva, membranas mucosas o abrasiones contaminadas. Esto se debe a que el hombre se rasca la herida de la picadura, llevando el parsito al interior.

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El parsito al penetrar al hospedero puede invadir gran variedad de clulas, donde se transforma para dar lugar al amastigote, el cul es la forma replicativa intracelular. Eventualmente, estas formas intracelulares dan lugar a las formas de tripomastigote que se encuentra frecuentemente en sangre, por medio de la cual se disemina a otras clulas y tejidos. Durante esta fase sangunea puede ser ingerido por el transmisor. T. cruzi puede infectar muchos tipos celulares; ste utiliza diferentes tipos de receptores de las clulas del hospedero, los que se caracterizan por tener una propiedad en comn: la presencia de cargas negativas. Sus principales clulas blanco son: las clulas fagocticas y en especial los macrfagos, que representan la primera lnea celular invadida, no obstante un mecanismo inusual de invasin se ha reportado en clulas no fagocticas tales como los fibroblastos y otros tipos celulares experimentales, como las clulas HeLa y MDCK (clulas epiteliales de rin canino Madin-Darby). El mecanismo por el cual los tripomastigotos ingresan a los macrfagos ha sido motivo de controversia. Mientras varios investigadores reportan que la entrada es bloqueada en la presencia de inhibidores de la polimerizacin de actina como la citocalasina B, otros reportan que no han encontrado inhibicin y concluyen que la invasin es activada en parte por el parsito. Hay estudios que presentan evidencia, de que la invasin de las clulas del hospedero por T. cruzi depende ms de la habilidad del parsito de reconocer receptores moleculares de la membrana del hospedero, como son los polipptidos de membrana de 32 y 34 KDa. Por otro lado, en el hospedero vertebrado, la forma de amastigoto se multiplica en clulas fagocticas y no fagocticas, como las pertenecientes a los tejidos muscular y nervioso y tiene la capacidad de infectar las clulas del hospedero una vez que se liberan al espacio extracelular. En sntesis, la habilidad de infectar clulas del hospedero no es exclusiva del tripomastigoto metacclico, sino que tambin es dado por las formas de amastigoto, lo cual favorece la diseminacin del parsito. A. RESPUESTA INMUNE FRENTE A Trypanosoma cruzi Los mecanismos de patogenicidad del Trypanosoma cruzi actualmente no son bien comprendidos, slo se sabe que la respuesta inmune humoral juega un rol muy importante en la resistencia y eliminacin de los parsitos de circulacin y que algunos

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epitopos del parsito pueden desarrollar una reaccin cruzada con antgenos propios, desencadenando un proceso autoinmune. En el husped infectado con T. cruzi la respuesta inmune protectora involucra principalmente la produccin de anticuerpos especficos y la activacin de clulas fagocticas por IFN. La respuesta humoral contra el T. cruzi se caracteriza por una mezcla compleja de antgenos, por lo que no es posible determinar las variaciones de las especificidades de anticuerpos en los diferentes estadios de la enfermedad: aguda, crnica e infeccin congnita. La produccin de anticuerpos contra los diferentes determinantes antignicos, depende del estado de la infeccin en que se encuentre el husped. De hecho los tripomastigotos metacclicos poseen invasinas o molculas de invasin celular, que son especficas de estado, por lo que la inmunidad inducida en un estadio no neutraliza las invasinas expresadas por la siguiente generacin de tripomastigotos. Una alta respuesta inmune especfica mantenida por aos, sugiere un estimulo antignico constante, por persistencia del parsito, adems se sabe que en los humanos la IL 4 induce el cambio de switch de inmunoglobulina IgM a IgG 1 o bien se produce IgG4 en la presencia de un estmulo persistente del antgeno. Se ha evidenciado que la patologa en la fase crnica de la enfermedad es de naturaleza auto inmune. Ello ha sido demostrado en estudios donde se observ que al transferir clulas T sin los parsitos de un animal infectado crnicamente a un ratn normal de una misma cepa da como resultado lesiones inflamatorias en el corazn y tejido nervioso. Existen al menos dos explicaciones para la generacin de autoinmunidad en la enfermedad de Chagas; primero que la infeccin con el parsito altera la inmunoregulacin dando como resultado la prdida de la tolerancia a los antgenos propios: segundo, el reconocimiento inmune de los antgenos de T. cruzi da reaccin cruzada con los determinantes antignicos de las clulas husped, dando como consecuencia la autoinmunidad. En la infeccin aguda, la induccin de la respuesta Th1 es llevada a cabo por la IL-12, que estimula la produccin de INF en clulas NK. La respuesta protectora Th1 est
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implicada en el dao tisular y en las alteraciones de la respuesta inmune observadas durante la infeccin, realizaron un estudio con cepas de ratones C3H y BALB/c, para seguir los niveles de las citocinas IL-12 y INF durante los diferentes estadios de infeccin con T. cruzi, cepa de Tulahuen, observando un rpido aumento de los niveles de IL-12 y IFN en la infeccin inicial en ambas cepas. No obstante se observ un incremento mayor en de los niveles de IFN en los ratones BALB/c, lo que hace pensar que la respuesta Th1 se relaciona con la asociacin husped - parsito. La respuesta de las citocinas en la infeccin y enfermedad producida por T. cruzi se ha asociado con la patologa cardiaca producida en el husped. En un estudio con dos cepas de ratones: B10.D2 con una afinidad a desarrollar una respuesta Th1 por produccin de INF en la infeccin por T. cruzi, y ratones DBA/2 con afinidad para desarrollar una respuesta Th2 con produccin de IL-4, se observ grandes diferencias en la miocarditis desarrollada por ambos, siendo mucho menor en los ratones B10.D12. Al igual que en la mayora de las enfermedades parasitarias o infecciosas por agentes patgenos, las citocinas o moduladores de la respuesta inmune, tienen como funcin inducir la multiplicacin y diferenciacin de otras clulas. En general son producidas por una gran variedad de clulas, pero principalmente por los linfocitos T. La respuesta Th1 y Th2 a los diferentes estmulos es promovida y regulada por estas sustancias; dependiendo del tipo de infeccin y respuesta de defensa inmune predominante, as ser la concentracin de algunas citocinas. Se ha observado que la IL-10 inhibe algunos aspectos de la activacin de macrfagos, lo cual incluye la muerte intracelular de parsitos protozoarios mediada por INF, de forma tal que en cepas de ratones susceptibles a la infeccin por T. cruzi se ha demostrado proteccin al administrar un Anti IL-10 neutralizante a los ratones. Trypanosoma cruzi se caracteriza por ser un parsito con una gran variabilidad antignica. Sus molculas de membrana cambian constantemente al pasar de un ciclo a otro, lo que demuestra una complejidad biolgica y complica el panorama de crear una vacuna eficaz. No obstante se han estudiado antgenos dominantes que determinan la respuesta en el husped y en algunos casos inducen una respuesta que es utilizada como mecanismo de evasin.

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El antgeno HSP70 es una protena de choque trmico, que se encuentra en la membrana del T. cruzi, que ha resultado ser un antgeno dominante en la infeccin humana, existiendo un alto nivel de anticuerpos frente a ste, en pacientes chagsicos. Por lo que sta es capaz de inducir una respuesta T CD8+ citotxica especfica de antgeno, en presencia de macrfagos peritoneales a travs de la secrecin activa de IFN y TNF. Se ha descrito que la HSP70 es un fuerte inmungeno capaz de actuar como

estimulador del sistema inmune a varios niveles, siendo particularmente eficiente en la activacin de los linfocitos T CD8+. Contrario a la protena HSP70 se ha descrito otro antgeno dominante, la protena de membrana denominada cruzipain, cuya respuesta en el husped es utilizada a favor del parsito. La respuesta humoral al antgeno cruzipain, el mayor antgeno de T. cruzi, est implicado en la patognesis de la Enfermedad de Chagas experimental. Se ha observado cmo, este antgeno incrementa el nmero de clulas del bazo de gran tamao, con niveles altos de IL-2 como IL-4. IL-5, IL-10, y niveles bajos de IFN y IL-12. Adems se da un incremento de la urea asociada a un decrecimiento de los niveles de nitrito. Al guiar el antgeno la respuesta con produccin de citocinas tipo 2, posiblemente consume arginasa en los macrfagos y promueva la susceptibilidad a los mecanismos de infeccin. Por lo tanto, puede ser que este antgeno sea usado por el parsito para llevar a cabo su esparcimiento dentro del husped.

B. INMUNIDAD ADQUIRIDA Las vacunas de cidos nucleicos tienen la capacidad de estimular respuestas inmunes protectoras a nivel humoral y celular; estimulando tanto poblaciones de linfocitos TCD4+ cooperadores como citotxicos TCD8+ despus de una dosis nica, sin emplear adyuvantes, de una forma duradera y persistiendo por largos perodos de tiempo en el husped sin integrarse al genoma. La aparente persistencia de la expresin de antgenos de dichas vacunas parece permitir su uso en diferentes enfermedades infecciosas entre otras. Esto hace de esta tecnologa, una herramienta poderossima en el estudio de los diferentes genes involucrados en la proteccin. El desarrollo de vacunas profilcticas y teraputicas frente a los parsitos y entre ellos T. cruzi, contina siendo un reto para los investigadores de todo el mundo; dado que an no existe una vacuna eficaz contra este
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parsito. El desarrollo de candidatos vacunales contra ste, a travs de la caracterizacin de genes que codifican antgenos que estimulan inmunidad protectora, y su transferencia a vectores establecidos no ha sido posible, pues la caracterizacin de genes que codifican protenas antignicas es una tarea an en desarrollo. 4. Respuesta inmune protectora citotxica mediada por linfocitos TCD8+ y auxiliadora mediada por linfocitos TCD4+ La inmunizacin con ADN consiste en la inoculacin de vectores plasmdicos o virales que contengan genes que codifican antgenos de inters vacunal los cuales son directamente inyectados en el msculo o en la piel con el propsito de obtener una respuesta contra el producto gnico expresado. Esta metodologa fue descrita por primera vez en 1992, pero a pesar de ello, ha tenido un desarrollo acelerado en los ltimos aos. Este tipo de vacunas estimulan respuestas inmunes protectoras a nivel humoral y celular; tanto de linfocitos TCD4 + cooperadores como citotxicos TCD8+ despus de una dosis nica, sin emplear adyuvantes, de una forma duradera y persistiendo por largos perodos de tiempo en el husped sin integrarse al genoma. La aparente persistencia de la expresin de antgenos de dichas vacunas parece permitir su uso en los recin nacidos de algunas especies, evadiendo los efectos destructores de los anticuerpos maternos y favoreciendo una respuesta celular especfica tipo T, con el consiguiente establecimiento de una memoria inmunolgica. Estas vacunas carecen de los riesgos que poseen las vacunas vivas atenuadas como reversin de la virulencia y produccin de enfermedades en individuos inmunodeficientes. Para lograr la induccin de una respuesta inmune se utilizan vectores que expresan la protena fornea en las clulas superiores y que contienen caractersticas especficas en dependencia del propsito final que nos hemos trazado. Estos vectores son diseados de tal manera que puedan ser manipulados de forma inicial en un hospedero unicelular, generalmente Escherichia coli. Ah son seleccionados por el nuevo fenotipo de resistencia a determinados antibiticos, que le confiere la presencia del plsmido. Los plsmidos son molculas de ADN de doble cadena, circulares y extra cromosomales, que existen en el interior de las bacterias y se replican de manera autnoma en la clula

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hospedera. Es posible separar e insertar en ellos mediante manipulacin gentica fragmentos de ADN que codifican antgenos forneos. En general las construcciones genticas utilizadas para este tipo de inmunizacin contienen un promotor funcional en las clulas eucariticas, el gen de inters que codifica un producto de importancia vacunal, orgenes de replicacin para E. coli adems, de un gen de resistencia a antibiticos generalmente kanamicina para seleccionar los transformantes. Esta construccin es administrada in vivo por va intramuscular, intradrmica o mucosa; algunos autores han reportado tambin la administracin endovenosa. 5. Inmunidad y vacunas experimentales en la Enfermedad de Chagas La infeccin por T. cruzi se puede diagnosticar por la deteccin de anticuerpos especficos dirigidos contra el parsito, esto pone de manifiesto su capacidad para estimular la respuesta inmunitaria. La infeccin aguda ocurre una vez, aunque se viva en zonas con alto riesgo de reinfeccin, esto nos indica que el parsito estimula mecanismos de resistencia. La lesin histopatolgica en el perodo crnico est caracterizada por infiltrados mononucleares y aparente ausencia de parsitos, lo que sugiere que la patologa es esencialmente inmunolgica. T. cruzi, similar a como ocurre con otros hemoparsitos, estimula un estado inmunitario que hace variar el curso de la enfermedad. Al inicio de la infeccin se puede constatar una parasitemia elevada con una duracin de varias semanas, que luego decrece hasta hacerse prcticamente indetectable. Esto est vinculado con la respuesta inmune que desarrolla el husped ante la infeccin. Durante la fase aguda de la enfermedad se han podido encontrar anticuerpos protectores y fijadores del complemento, especficos de la cepa, que contribuyen a la desaparicin de las formas sanguneas durante la fase aguda de la enfermedad. En esta parasitosis est presente el estado de premonicin, aunque adems la infeccin deja una fuerte inmunidad adquirida. Los anticuerpos especficos identificados son de tipo IgG e IgM, a los pocos das de producirse la infeccin los primeros en detectarse son del tipo IgM, para posteriormente ser sustituidos por los del tipo IgG, que se mantienen durante toda la vida pero con ttulos ms bajos que los alcanzados en el
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perodo agudo. Existen otros anticuerpos, cuya estimulacin es variable, capaces de interferir con la viabilidad del parsito circulante y que estn implicados en los mecanismos de resistencia. Se ha demostrado experimentalmente que solamente los sueros que poseen estos anticuerpos son capaces de proporcionar resistencia por transferencia pasiva. Ellos lisan al parsito por activacin del complemento (anticuerpos lticos), estimulan su captacin por los fagocitos (opsoninas), o median la accin citotxica de clulas tales como monocitos, neutrfilos y eosinfilos (anticuerpos citotxicos mediadores de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos); en conjunto, son los responsables del control relativo de la parasitemia que se establece al finalizar el perodo agudo de la infeccin. Estudios experimentales han demostrado que adems de la inmunidad humoral, la celular tiene un papel predominante, especialmente con la participacin activa de los macrfagos, aunque an no se ha establecido el mecanismo por el cual lo efectan. En la infeccin humana, la estimulacin de dicha respuesta se ha puesto en evidencia tanto en pruebas in vivo (pruebas cutneas) como in vitro (transformacin blstica). Se ha encontrado positiva la prueba de inhibicin de la migracin de los macrfagos (MIF). Pero estos estudios no permiten inferir el papel que esta respuesta tiene en el transcurso de la infeccin. Existen evidencias experimentales relacionadas con la participacin de factores, tales como el interfern, las clulas asesinas (NK) y los macrfagos en los mecanismos de resistencia. La citotoxicidad mediada por clulas T CD8+ constituye el mecanismo de eliminacin de las formas intracelulares del parsito, aunque citocinas como el IFN y el TNF liberadas por clulas T cooperadoras CD4+ (TH1), son importantes para mantener estos mecanismos de resistencia a la infeccin. Adems, los macrfagos activados por los linfocitos T sensibilizados y en presencia de anticuerpos opsonizantes, actuaran captando y destruyendo al parsito por medio de los productos derivados del metabolismo oxidativo (perxido de hidrgeno, oxgeno snglate, anin hidroxilo, anin superxido), a los cuales son sumamente sensibles tanto el tripomastigote como el amastigote, ya que carecen de las enzimas necesarias para actuar sobre ellos y provocar su inactivacin. El conocimiento actual es an muy pobre acerca de la responsabilidad que le pertenece al mapa gentico del husped en la evolucin de esta parasitosis, se ha comprobado experimentalmente que el hombre
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posee algunas variaciones individuales en lo que se refiere a la resistencia natural contra T. cruzi. Se conoce que la respuesta inmune estimulada por la infeccin natural no es eficiente para eliminar el parsito y que la persistencia de ste brinda inmunidad concomitante al husped. El equilibrio que alcanza esta relacin husped parsito, quizs se deba a que el parsito ha desarrollado estrategias evasivas a la respuesta inmune. La prevencin mediante la quimioprofilaxis y las vacunas no es posible realizarlas debido a que no existen para la Enfermedad de Chagas. Esto se ha visto dificultado por la cronicidad de la infeccin. El proceso de diferenciacin de T. cruzi es uno de los factores que dificultan la seleccin de antgenos eficientes para la obtencin de una inmunoprofilaxis prctica. Se han identificado diferentes molculas antignicas del parsito que podran ser utilizados como inmungenos protectores. Inmunoproteccin usando parsitos muertos por mtodos fsicos o qumicos. El uso de varias cepas de T. cruzi, cuya virulencia ha sido atenuada por varios pases en cultivo, por tratamiento con agentes farmacolgicos o por radiacin ionizante puede inducir resistencia adquirida a la fase aguda de la infeccin. Otra alternativa es la vacuna de antgenos purificados de T. cruzi. Se han probado experimentalmente algunas variantes entre ellas, la inmunizacin de ratones con bajas concentraciones de un antgeno purificado a partir de epimastigotes, acoplado a un adyuvante, indujo fuerte respuesta inmune humoral y celular y protegi del reto con una dosis letal del microorganismo. En los ltimos aos, el volumen de experimentos en busca de antgenos eficaces para el desarrollo de una inmunidad protectora contra T. cruzi va en aumento, particularmente con respecto a las glndulas salivales del vector Esos estudios parten del supuesto de que los tejidos ms adecuados del vector seran aquellos que ms contacto establecen con el hospedero o con la sangre de este. En el caso de la Enfermedad de Chagas, las glndulas salivales de los vectores pueden tener un atractivo especial, ya que son rganos que tienen un papel muy importante en la alimentacin del insecto. La inactivacin de protenas de las glndulas salivales inhibidoras de procesos tales como la coagulacin de la sangre y la agregacin plaquetaria, por anticuerpos del hospedero,

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pueden ser una forma eficaz de inmunoprofilaxis para el control del insecto y por tanto de la infeccin. Ms recientemente, algunos investigadores estudiaron la doble condicin de la protena cruzipain, la principal cisteino proteinasa de T. cruzi la cual, adems de ser utilizada para el diagnstico serolgico de la enfermedad, induce proteccin tanto sistmica, como en mucosas. Esta protena es expresada en todas la formas de desarrollo del parsito, estimulando una fuerte respuesta humoral y celular tanto durante la infeccin en humanos, como en ratones BALB/c. Adems, hay nuevas evidencias relacionadas a protenas asociadas con el ADN kinetoplastideo (kDNA), que estn relacionadas con los procesos esenciales de la vida del parsito, y que pudieran utilizarse como diana en la preparacin de drogas antiparasitarias o de vacunas. Se ha demostrado que la protena, llamada Tc52, liberada por T. cruzi est relacionada con la familia de las thiol-disulfide oxidoreductasas la cual es esencial en la virulencia y supervivencia del parsito e induce maduracin de la clulas dendrticas, confiriendo proteccin contra la infeccin letal. Tambin, se ha demostrado la eficacia de la inmunizacin con genes quimricos frente al reto con ste parsito, Garg y colaboradores indujeron proteccin contra el parsito por medio de la expresin de genes de inters vacunal transfectados en plsmidos. La utilizacin de la inmunizacin con cidos nucleicos de T. cruzi ha sido reportada por varios autores los cuales han trabajado con genes individuales. Ellos han demostrado la induccin de respuestas tipo B y T citotxica especfica despus de la inmunizacin con el gen que codifica para la principal cisteno proteinasa (cruzipain) del parsito adems, de comprobar en otros trabajos que esta misma protena induce proteccin en mucosa y a nivel sistmico contra T. cruzi. Encontraron una respuesta protectora tipo 1 despus de la inmunizacin con un plsmido que contena una protena de T. cruzi. Resultados semejantes fueron encontrados por otros autores al inmunizar ratones BALB/c con plsmidos que contenan las protenas ASP-1, ASP-2 y TSA-1 las cuales producen respuesta T citotxica especfica. Al inmunizar ratones con plsmidos que expresaban el gen que codifica para la trans-sialidasa (TS), antgeno de superficie de T. cruz), obtuvieron resultados semejantes. Se report la induccin de anticuerpos que inhiben la actividad enzimtica Trans-sialidasa al inmunizar con plsmidos que contienen genes para TS de T. cruzi. Por otro lado, Seplveda y colaboradores demostraron la existencia
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de proteccin en modelos murinos al inmunizar con un candidato vacunal compuesto por la protena reguladora complementaria (CRP) de T. cruzi. 6. Principales riesgos que se relacionan con el uso de vacunas de ADN

El empleo de vacunas en los seres humanos est normado por Instituciones reguladoras que evalan la seguridad y efectividad de todos los diversos preparados vacunales y ellas son las que autorizan o no su aplicacin. Las vacunas de ADN no estn eximidas de esto y los riesgos principales que se relacionan con ella son: El potencial de integracin del ADN plasmdico al genoma de la clula hospedadora. El potencial de induccin de tolerancia o autoinmunidad. El potencial de induccin de anticuerpos contra el ADN.

Es por ello que en todas las investigaciones especficas relacionadas con el desarrollo de vacunas, se requiere de un trabajo experimental sobre la probable eficacia futura antes de ser probado en la especie blanco. De esta manera los debates acerca de las posibles vacunas son realizados a partir de experimentos efectuados en modelos animales, generalmente en ratas y en primates, antes de intentar pruebas clnicas en humanos. Se han usado otros animales como el conejo. Las pruebas en primates han alcanzado hasta los monos Aotus, pero el chimpanc contina siendo el sistema de prueba ms apropiado. A pesar de ello, como hay que garantizar que no se sometan a un estrs excesivo y cada animal puede haber sido el modelo de un nmero de candidatos vacunales y retos, resulta difcil la interpretacin de los resultados obtenidos a partir de este sistema. No sucede as con Macaco rhesus, el cual constituye la base del trabajo en el VIH y su equivalente en simio VIS o el virus hbrido VIHS. IV. Toxoplasma gondii Toxoplasma gondii es el agente etiolgico de la toxoplasmosis, una zoonosis de distribucin mundial, es un protozoo apicomplexo del orden Coccidia, es decir, se trata de un organismo unicelular evolucionado: con ncleo verdadero, aparato de Golgi, mitocondria y, especialmente, una serie de orgnulos particulares, necesarios para la
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penetracin de la clula del hospedero. El parasito se presenta bajo tres formas diferentes de infeccin: Taquizoito (o trofozoito) que es la forma activa de replicacin rpida; el quiste que es la forma de resistencia, poseen una membrana qustica (derivada de componentes del parasito y del hospedero) y en su interior contienen miles de bradizoitos morfolgicamente semejante a los taquizoitos pero con una reproduccin ms lenta. El ooquiste que se encuentra en las heces de los gatos infectados y son inmaduros, dependiendo de las condiciones ambientales alcanzan su estado infectivo al da siguiente de su puesta o durante los cinco das posteriores y se mantienen viables por un ao o ms. Cada ooquiste esporulado (maduro) contiene dos esporoquistes y cuatro esporozoitos. Una vez esporulados son extremadamente resistentes, incluso a los desinfectantes ms potentes. Toxoplasma gondii tiene un ciclo de vida en el hospedero definitivo conocido como fase sexual y en el hombre y otros animales (hospederos intermediarios) hace un ciclo incompleto de reproduccin asexual invadiendo clulas musculares y del sistema nervioso central. Este ciclo asexual puede ocurrir tambin en el hospedero definitivo. En el hombre, los bradizoitos penetran y se multiplican dentro de los enterocitos (clulas epiteliales del intestino) y a continuacin los trofozoitos formados se diseminan por el torrente sanguneo o linftico y parasitan las clulas de una variedad de rganos, particularmente tejidos linfticos, msculo esqueltico, miocardio, retina, placenta y ms frecuentemente el sistema nervioso central; en ellas se multiplican y provocan la muerte de las clulas hospederas, siendo liberados nuevamente con capacidad de infectar otras clulas, provocan dao tisular e inflamaciones. Es en esta fase (aguda) de la infeccin donde el parasito es ms vulnerable a los frmacos. La penetracin en las clulas es tanto por penetracin activa o como por fagocitosis. Se ha comprobado que el parsito toma contacto con la membrana plasmtica celular y libera enzimas proteolticas (lizosimas y hialuronidasas) que la disuelven, y permite su entrada a las clulas no fagocticas en un tiempo mucho menor que el que invertira en ser incorporado por fagocitosis. La extensin de la necrosis tisular y la diseminacin dependen de la eficacia de los mecanismos inmunolgicos humorales y celulares del hospedero, pero incluso despus de la respuesta inmunolgica efectiva, no se erradican los microorganismos. Se forman algunos quistes en estos rganos desde la primera semana de la infeccin y permanecen
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latentes toda la vida del husped, si se produce una depresin de su sistema inmune, una proliferacin activa de los microorganismos puede causar la reactivacin de la enfermedad local y una diseminacin importante. No se conocen bien los factores que influencian la formacin de quistes intracelulares, aunque son ms numerosos en la fase crnica de la enfermedad cuando el hospedero ya ha desarrollado los mecanismos de inmunidad humoral y celular. Los quistes se encuentran con preferencia en las clulas del SNC, coriorretina y msculos (esqueltico y miocardio). El cerebro constituye un refugio especial de los quistes, debido al hecho de que est protegido de los anticuerpos por la barrera hematoenceflica, carece de un sistema linftico y presenta niveles muy bajos de expresin de molculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). A. RESPUESTA INMUNE FRENTE A T. gondii La respuesta inmune inducida por el T. gondii se caracteriza por una fuerte inmunidad celular que limita la replicacin de los taquizoitos durante la fase aguda de la infeccin y promueve el establecimiento de las formas latentes del parsito; no obstante, T. gondii tambin estimula la inmunidad innata. 1. RESPUESTA INMUNE INNATA

La activacin del sistema inmune innato es fundamental para limitar la replicacin de los taquizoitos durante el perodo en el cual an no se ha establecido la inmunidad adaptativa. Adems, la interaccin inicial de los parsitos con el sistema inmune innato es determinante en el direccionamiento hacia un patrn de citocinas tipo uno (Th1), caracterizado por altos niveles de IFN, TNF, IL-2 e IL-12. El IFN es una citocina central para la proteccin contra T. gondii. En experimentos realizados con anticuerpos neutralizantes anti-IFN o con ratones carentes del gen que codifica para el IFN se observa que la muerte sobreviene durante la fase aguda de la infeccin, mientras que en ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID), que carecen de linfocitos T y B pero que producen IFN a partir de clulas NK, se observa una sobrevida mayor. Es innegable la funcin esencial de las citoquinas proinflamatorias para la resolucin de la toxoplasmosis; sin embargo, su produccin excesiva es perjudicial para el hospedero y por tanto se requiere la secrecin de citoquinas reguladoras, provenientes de los propios macrfagos como son la IL-10 y el factor transformante de crecimiento (TGF29

). Los linfocitos con patrn de citoquinas Th2 tambin contribuyen a la modulacin de la respuesta inmune celular al T. gondii mediante la sntesis de IL-10 e IL-4. La IL-10 es una citocina fundamental en el control de la respuesta inmune celular y en la transicin hacia el estadio latente de la toxoplasmosis, puesto que inhibe la sntesis de IL-12 derivada de macrfagos y la produccin de IFN de las clulas NK. Los efectos de la IL-10 son potenciados por el TGF y por la IL-4. 2. RESPUESTA INMUNE CELULAR

La inmunidad celular durante la toxoplasmosis se caracteriza por la generacin de linfocitos T CD4+ y T CD8+. Estas clulas producen citoquinas y desarrollan funciones citotxicas. La principal funcin de los linfocitos T CD4+ es la secrecin de la IL-2 necesaria para la proliferacin de los linfocitos T CD8+, consideradas las clulas citotxicas por excelencia. Las T CD4+ tambin producen IFN necesario para los macrfagos. Los linfocitos no solamente controlan la replicacin de T. gondii durante la fase aguda de la infeccin, sino que adems previenen los episodios de reactivacin durante la infeccin crnica. 3. RESPUESTA INMUNE HUMORAL

El sistema inmune humoral participa en la respuesta contra T. gondii y la deteccin de los anticuerpos especficos es una de las estrategias ms utilizadas actualmente para el diagnstico de la infeccin. No obstante, la funcin de esos anticuerpos en el control de la replicacin parasitaria parece irrelevante puesto que en ratones la transferencia pasiva de anticuerpos especficos no logra proteger a los animales no inmunes contra la infeccin subsecuente con el parsito. Sin embargo, algunos estudios muestran que los ratones deficientes en linfocitos B son ms susceptibles a la infeccin por T. gondii que los animales control. En humanos, los anticuerpos IgM especficos son detectables a partir del sptimo da postinfeccin y pueden permanecer hasta por un ao. Estos anticuerpos probablemente son inducidos por determinantes antignicos tipo carbohidrato que estn presentes en la membrana de los taquizoitos.

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Los anticuepos IgG antitoxoplasma aparecen dos semanas despus de la infeccin, alcanzan su produccin mxima a las seis semanas, para luego reducirse hasta niveles que permanecen detectables durante toda la vida del individuo. Los anticuerpos IgG especficos, al parecer, se dirigen contra determinantes antignicos proteicos de la superficie del taquizoito. Los isotipos predominantes de IgG son IgG1, seguido de IgG2 e IgG3 y su capacidad para la fijacin de complemento resulta en un mecanismo de resistencia a la infeccin, puesto que los taquizoitos opsonizados son susceptibles a la destruccin por la va lisosomal en las clulas fagocticas. El tracto gastrointestinal es la puerta de entrada natural de T. gondii, de manera que las clulas linfoides asociadas al tejido intestinal constituyen la primera lnea de defensa contra este agente patgeno. En la toxoplasmosis aguda experimental, se observa aumento en el nmero de clulas en las placas de Peyer y en los ganglios linfticos mesentricos, lo cual refuerza el postulado sobre la participacin del sistema inmune asociado a mucosa digestiva (GALT) en el control inicial de la replicacin parasitaria. En la toxoplasmosis adquirida se observa predominio de anticuerpos IgA especficos contra diversos antgenos de superficie del taquizoito desde la segunda semana postinfeccin y se mantienen en niveles detectables durante varios meses o incluso hasta un ao despus. En la toxoplasmosis congnita, los anticuerpos IgA son de gran utilidad para el diagnstico, ya que las pruebas son ms sensibles para IgA que para IgM.

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T. gondii tiene capacidad para infectar cualquier clula nucleada, de tal manera que stas pueden expresar antgenos parasitarios en el contexto del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC I). Cuando la clula infectada se lisa como consecuencia de la replicacin masiva de los parsitos, stos quedan libres temporalmente en la circulacin y de esta forma quedan expuestos a la accin de las protenas del complemento y la fagocitosis por parte de los macrfagos y las clulas dendrticas. En la fase inicial de reconocimiento de los antgenos parasitarios, las clulas dendrticas son la principal clula presentadora de antgeno (APC) gracias a su capacidad fagoctica y a su elevada expresin de molculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (MHC II); adicionalmente, estas clulas secretan IL-12 que activa a las clulas asesinas naturales (NK) quienes por su parte liberan IFN que sirve para la activacin de los macrfagos. Los macrfagos y las clulas dendrticas son
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las APC por excelencia para activar a los linfocitos T dada su capacidad fagoctica, su expresin de MHC II y su liberacin de citoquinas proinflamatorias (IL-1, IL-12, IL-15, TNF), necesarias para la activacin de los linfocitos T. La inmunidad celular que inducen los taquizoitos en la fase inicial de control de la replicacin parasitaria involucra a los linfocitos T CD4+ con perfil de citoquinas Th1 (IL-2, IL-15, IFN) que favorece la proliferacin de los linfocitos T CD8+ y refuerza la activacin de los macrfagos. Una vez instaurado el perfil Th1 de citoquinas inflamatorias, se inicia la activacin de linfocitos T CD4+ con perfil de citoquinas Th2 (IL-4, IL-10) que estimula la respuesta inmune humoral y adems contribuye a la regulacin negativa de los macrfagos, con lo cual se garantiza una respuesta inmune efectiva y autolimitada. La fase efectora de la respuesta inmune celular inducida por el T. gondii se caracteriza por mecanismos citotxicos de los linfocitos TCD8+ y de las clulas NK, que garantizan el control de la replicacin de los taquizoitos y promueven la formacin de quistes tisulares que permanecen latentes durante toda la vida del hospedero y cuyo control depender de los linfocitos T CD4+ y T CD8+ de memoria que se generan durante este proceso. La produccin de anticuerpos IgM, IgG e IgA especficos contra el T. gondii ocurre como parte de la respuesta inmune al parsito y promueven la opsonizacin, la fagocitosis y la activacin del complemento, sin embargo no constituyen el mecanismo efector ms eficiente contra la replicacin del parsito. B. INMUNIDAD ADQURIDA Entre otras de las medidas para prevenir la infeccin en el hombre, est la posibilidad de una vacunacin para los gatos utilizando una cepa de Toxoplasma virulenta. Esta vacuna no es comercial, sino que est en fase experimental, aunque los intentos de tratar a los gatos para evitar la eliminacin de oocistos por las heces, no ha tenido xito. Asimismo, procurar el saneamiento ambiental y el control de cucarachas, moscas, etctera, por la posibilidad de actuar como vectores mecnicos. 1. Posibilidades de una Vacuna para Toxoplasmosis

La inmunidad protectora estimulada por una infeccin natural por T. gondii sugiere que el desarrollo de una vacuna efectiva es un objetivo alcanzable. Sin embargo, los taquizoitos muertos no protegen contra un reto experimental en modelos animales. Este protozoario es capaz de replicarse en todas las clulas nucleadas. Como parsito
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intracelular obligado, el proceso de invasin celular es fundamental para su supervivencia y diseminacin. Este es un proceso activo dirigido por el parsito y se basa en una serie de interacciones entre la membrana de superficie del parsito y las molculas localizadas en la superficie de la clula hospedera. Estas protenas de la membrana del parsito son los primeros candidatos para ser utilizados en la bsqueda de vacunas contra esta parasitosis.

La superficie del taquizoito de T. gondii est dominada por 5 protenas mayoritarias las cuales han sido implicadas como ligandos mediante los cuales se realiza el reconocimiento celular y la adhesin, de ellas la P30 y la P22 son las ms abundantes. Varios autores han tratado de dilucidar el potencial inmunoprotector de la protena P30 (SAG1) y la P22 (SAG2) con resultados contradictorios. Los antgenos de superficie de Toxoplasma conjugados con adyuvantes (ISCOM) han producido una buena respuesta inmune tanto celular como humoral y proveen alguna proteccin contra un reto letal en ratones. La falla de estas preparaciones para dar una proteccin completa a largo plazo puede deberse a su carcter temporal. En la infeccin natural, la latencia del parsito en los tejidos contina estimulando la inmunidad. Se han utilizado varias estrategias en el desarrollo de vacunas contra este parsito para tratar de producir una respuesta inmune protectora a largo plazo. Con este fin se han desarrollado cepas mutantes vivas y atenuadas en virulencia, entre ellas la TS-4 (ATCC 40.500), la S-48 y la T-263(ATTC 40.615). Sin embargo la manipulacin de estas cepas es muy dispendiosa y existe el riesgo de que con el tiempo puedan revertir a su estado de virulencia natural. Tambin se ha realizado inmunizacin con componentes del parsito como homogenizados crudos, SAG1, rSAG1, SAG2, rSAG2, SAG3, ESA (componentes secretorio sex cretorios), p24, GRA, plsmidos codificando la SAG1 (p1tPASAG1) as como la SAG1 conjugada con toxina colrica, logrndose proteccin parcial o completa y an resultados contradictorios, como sucedi con un esquema de P30 conjugada con coadyuvante de Freund que aument la mortalidad en los ratones inmunizados con esta preparacin. Un resumen de los ensayos experimentales se presenta en la Tabla 1.

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CONCLUCIONES Los parsitos han desarrollado sus propias estrategias de defensa contra el sistema inmunitario humano, ya que teniendo en cuenta la complejidad de mecanismos inmunitarios de defensa, de eficacia a menudo parcial e intrincada con componentes inmunopatognicos, es comprensible que las vacunas antiparasitarias se hagan esperar, a pesar de los esfuerzos internacionales. Aunque una vacuna contra la Malaria es tcnicamente viable, hacer una vacuna para proteger a las personas de un parsito es an un reto que se sigue modificando. Otra razn fundamental es que en el mundo an faltan recursos humanos y financieros para hacer una vacuna contra la Malaria. Actualmente slo las compaas farmacuticas gastan miles de millones de dlares para presentar una nica vacuna eficaz a travs de licencias, lo cual nos lleva a pensar en que se hace necesario el aumento de recursos para superar las barreras tcnicas y cientficas y dar un paso a vacunas viables y a bajo costo. La respuesta inmune frente al Paludismo es compleja y especfica de cada fase; es decir, si se quiere realizar vacunas contra este parsito se tendra que tomar en cuenta antgenos derivados de esporozoitos, merozoitos o gametocitos de cada fase en concreto; o bien optar por vacunas formadas por eptopos inmungenos combinados. La IgG1 e IgG3, subtipos de la IgG, son los que participan activamente en la inmunidad humoral frente a Plasmodium; pero su actividad se ve reducida por la variabilidad antignica del parsito. La inmunidad celular toma importancia en este contexto al combatir directamente con Plasmodium, quien tiene capacidad de infeccin intracelular. Los LT CD8+ desempean un papel importante en la inmunidad frente a las fases hepticas de la infeccin (secrecin de INF o proccin de xido ntrico); mientras que los LT CD4+ en la infeccin en la fase eritroctica. Es claro que el repertorio de clulas y molculas involucradas en la respuesta inmune a leishmania constituye un componente importante en el resultado de la infeccin. el conocimiento de los componentes que determinan la induccin de una respuesta inmune asociada con proteccin nos brinda la oportunidad de disponer de posibles blancos que permitirn el diseo de vacunas y estrategias

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teraputicas que conduzcan al control de la infeccin y por lo tanto se impida el desarrollo de la enfermedad. A pesar de la inmunidad humoral y celular, la infeccin por Trypanosoma cruzi puede persistir en el husped. El glicoinositolfosfolpidos puede estimular directamente las clulas NK y puede inducir la produccin de inmunoglobulinas en la ausencia de clulas T y clulas NK. Las clulas T CD8 son esenciales para el control de la infeccin por T. cruzi, siendo la ms importante la produccin de IFN, IL-12 tambin est involucrado en la proteccin contra el T. cruzi. Reduccin de la produccin de IFN por las clulas T CD8 se asocia con una mayor gravedad de la enfermedad de Chagas en humanos. Los estudios de la IL-12 indican que esta citocina puede actuar como un amplificador de ms selectiva de las clulas T. cruzi reactivo que el IL-2 lo hace. Mediante la mejora de parsito de antgenos especficos de la inmunidad, la IL12 podra ser potencialmente teraputicos, con la capacidad de controlar las infecciones por T. cruzi. El estadio circulante (tripomastigote) es resistente al complemento (a diferencia del epimastigote). Esta diferencia se la confieren, al menos en parte, el bajo nmero de receptores para C3 y el TDAF.

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APENDICE

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